BRPI0817202B1 - polipeptídeo purificado e método de detecção de anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídio do ehrlichia chaffeensis em uma amostra em teste - Google Patents

Description

(54) Título: POLIPEPTÍDEO PURIFICADO E MÉTODO DE DETECÇÃO DE ANTICORPOS QUE SE LIGAM ESPECIFICAMENTE A UM POLIPEPTÍDIO DO EHRLICHIA CHAFFEENSIS EM UMA AMOSTRA EM TESTE (73) Titular: IDEXX LABORATORIES, INC., Sociedade Norte-Americana. Endereço: One Indexx Drive, Westbrook, ME 04092, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: THOMAS PATRICK OOONNOR; EUGENE REGIS KRAH; JILL M. SLAUENWHITE.

Código de Controle: 7213D23AD20A4B1A 445F29E492172FDF

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 21/11/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 21/11/2018

Assinado digitalmente por:

Alexandre Gomes Ciancio

Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para POLIPEPTÍDEO PURIFICADO E MÉTODO DE DETECÇÃO DE ANTICORPOS QUE SE LIGAM ESPECIFICAMENTE A UM POLIPEPTÍDIO DO EHRLICHIA CHAFFEENSIS EM UMA AMOSTRA EM TESTE.

Prioridade

Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade do pedido de patente U.S. Serial N^o 60/974 196, depositado em 21 de setembro de 2007, cujo conteúdo é aqui incorporado em sua totalidade por referência neste pedido de patente.

Antecedentes da Invenção

Ehrlichia são agentes patogênicos intracelulares de forma oblonga que infectam linfócitos circulantes em hospedeiros mamíferos. Ehrlichia canis e Ehrlichia chaffeensis fazem parte do grupo do mesmo subgênero e são capazes de infectar cães e humanos e de causar, respectivamente, erliquiose monocítica canina (EMC) e erliquiose monocítica humana (EMH). A doença canina é caracterizada por febre, linfadenopatia, mialgia e leucopenia. A detecção e o tratamento precoces são importantes para o tratamento da erliquiose canina e da humana.

Ensaios indiretos de imunofluorescência (FA) e ensaios imunoenzimáticos indireto (ELISA) são utilizados frequentemente para auxiliar o diagnóstico destas doenças. Estes ensaios medem ou, de outra forma, detectam a ligação de anticorpos anti-Ehrlichia, presentes no sangue, plasma ou soro de um paciente, a células infectadas, lisados celulares ou a proteínas purificadas do Ehrlichia. No entanto, a utilidade de muitos ensaios destinados a detectar anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis, ou de fragmentos destes, é bastante restringida por questões referentes à sensibilidade e a especificidade, diretamente relacionadas ao grau de impureza do antígeno de Ehrlichia utilizado nesses testes. Adicionalmente, animais vacinados contra E. canis podem exibir resultado positivo quando testados para E. chaffeensis em decorrência de reação cruzada imunológica. Reagentes específicos altamente purificados são necessários para criar ensaios mais exatos. Sumário da Invenção

Uma concretização da invenção provê um polipeptídeo purificado,

Petição 870180056251, de 29/06/2018, pág. 10/20 compreendendo a SEQ ID NO: 3, em que o polipeptídeo é constituído por menos aproximadamente 50 aminoácidos contíguos, presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis; a SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídeo é constituído por menos de aproximadamente 50 aminoácidos contíguos, presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis; a SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídeo é constituído por menos de aproximadamente 50 aminoácidos contíguos, presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis. Os polipeptídeos purificados podem ser constituídos pela SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 ou a SEQ ID NO: 1. A invenção provê também polinucleotídeos isolados que codificam o polipeptídeo purificado da invenção.

Um polipeptídeo purificado da invenção pode ser unido a um reagente indicador, um espaçador aminoácido, um ligante aminoácido, uma sequência de sinalização, uma sequência de parada de transferência, um domínio transmembrana, uma proteína ligante de purificação, um polipeptídeo heterólogo e a um ou mais polipeptídeos adicionais compreendendo as SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou uma combinação destas. Um polipeptídeo purificado da invenção pode compreender um ou mais resíduos de aminoácido C no grupo amino terminal ou no grupo carbóxi terminal ou em ambos os grupos terminais do polipeptídeo.

Outra concretização da invenção provê um método de detecção de anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo do Ehrlichia chaffeensis em uma amostra em teste. O método compreende o contato de um polipeptídeo purificado, compreendendo a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5 ou 6, com a amostra em teste sob condições que permitam a formação de complexos polipeptídeo/anticorpo; em que o polipeptídeo purificado é constituído por menos de 50 aminoácidos contíguos, presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis; e a detecção dos complexos polipeptídeo/anticorpo. A detecção dos complexos polipeptídeo/anticorpo é indicativa de que anticorpos específicos contra Ehrlichia chaffeensis estão presentes na amostra em teste, e ausência dos complexos polipeptídeo/anticorpo é indicativa de que anticorpos específicos contra Ehrlichia chaffeensis não estão presentes na amostra em teste. Os complexos podem ser postos em contato com um rea gente indicador antes que seja conduzida a etapa de detecção. Em uma concretização da invenção, o polipeptídeo purificado possui as SEQ ID Nos: 1 -3, 5 ou 6, e o método não detecta anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo do Ehrlichia canis. A quantidade de anticorpo na amostra em teste pode ser detectada. O polipeptídeo purificado pode ser preso a um substrato. O polipeptídeo purificado pode ser unido a um reagente indicador, um espaçador aminoácido, um ligante aminoácido, uma sequência de sinalização, uma sequência de parada de transferência, um domínio transmembrana, uma proteína ligante de purificação, uma proteína heteróloga e a um ou mais polipeptídeos adicionais compreendendo as SEQ ID Nos: 1,2, 3, 4,

5, 6 ou uma combinação destas.

Ainda outra concretização da invenção provê um método de detecção de infecção por Ehrlichia chaffeensis em um indivíduo. O método compreende a obtenção de uma amostra biológica do indivíduo; o contato de um polipeptídeo purificado, compreendendo a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5 ou 6, com a amostra biológica sob condições que permitam a formação de complexos polipeptídeo/anticorpo; em que o polipeptídeo purificado é constituído por menos de aproximadamente 50 aminoácidos contíguos presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis; e a detecção dos complexos polipeptídeo/anticorpo. A detecção dos complexos polipeptídeo/anticorpo é indicativa de que o indivíduo apresenta infecção por Ehrlichia chaffeensis e a ausência dos complexos polipeptídeo/anticorpo, indicativa de que o indivíduo não apresenta infecção por Ehrlichia chaffeensis. Em uma concretização da invenção, o polipeptídeo purificado possui as SEQ ID NOs:1,2, 3, 5 ou a 6 e o método não detecta infecção por Ehrlichia canis no indivíduo.

Outra concretização da invenção provê um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo constituído pela SEQ ID NO: 1,2, 3, 5 ou

6. O anticorpo pode ser monoclonal, policlonal, fragmento de anticorpo de ligação a antígenos ou um anticorpo de cadeia única.

Ainda outra concretização da invenção provê um método de detecção de um polipeptídeo do Ehrlichia chaffeensis em uma amostra. O método compreende pôr em contato anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo constituído pela SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5 ou 6 com a amostra, sob condições que permitam a formação de complexos polipeptídeo/ anticorpo; e a detecção dos complexos polipeptídeo/anticorpo. A detecção dos complexos polipeptídeo/anticorpo é indicativa de que um polipeptídeo do Ehrlichia chaffeensis está presente na amostra, e a ausência dos complexos polipeptídeo/anticorpo é indicativa de que um polipeptídeo do Ehrlichia chaffeensis não está presente na amostra. Em uma concretização da invenção, o polipeptídeo purificado pode possuir as SEQ ID NOs:1, 2, 3, 5 ou a 6, e o método não detecta um polipeptídeo de Ehrlichia na amostra. Os anticorpos podem ser monoclonais, policlonais, fragmentos de anticorpo de ligação a antígenos ou anticorpo de cadeia única. Os anticorpos podem ser presos a um substrato.

Por conseguinte, a invenção provê composições e métodos para a detecção de E. chaffeensis.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1A e 1B apresentam os resultados de ensaios em soros de cachorros que foram infectados experimentalmente com E. chaffeensis. VLPT-1 (SEQ ID NO: 5) (mostrada como Peptídeo nas figuras) e VLPT-R (SEQ ID NO: 4, em que ο X na posição 112 é P) (mostrado como Proteína-r nas figuras) são ambos capazes de detectar anticorpos contra E. chaffeensis em 7 dias após a infecção.

Descrição Detalhada da Invenção

Polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis

Conforme utilizadas nesta exposição, as formas em singular um, uma e o e a incluem referências no plural, a não ser que do contexto dite claramente em contrário.

Polipeptídeo é um polímero formado por dois ou mais aminoácidos unidos covalentemente por ligações amida. Os polipeptídeos podem ser modificados após a tradução. Polipeptídeo purificado é um preparado de polipeptídeos substancialmente livre de material celular, outros tipos de polipeptídeos, precursores químicos, substâncias químicas utilizadas na síntese do polipeptídeo ou de combinações destes. Os preparados de polipeptídeo substancialmente livres de material celular, meio de cultura, precursores químicos, substâncias químicas utilizadas na síntese do polipeptídeo, etc., possuem menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, 1 % ou mais de outros polipeptídeos, meio de cultura, precursores químicos e/ou de outras substâncias químicas utilizadas na síntese. Por conseguinte, polipeptídeo purificado é aquele com aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais de pureza. Polipeptídeo purificado não inclui extratos celulares não purificados ou semipurificados ou misturas de polipeptídeos que sejam menos de 70% puros.

O termo polipeptídeos pode referir-se a um ou mais tipos de polipeptídeo (um conjunto de polipeptídeos). Polipeptídeos podem se referir também a misturas de dois ou mais tipos diferentes de polipeptídeos (uma mistura de polipeptídeos). Os termos polipeptídeos ou polipeptídeo podem significar individualmente um ou mais polipeptídeos.

Uma concretização da invenção provê um polipeptídeo do Ehrlichia chaffeensis, conforme apresentado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

XSDLHXXXXVELXXPSKEEVQXEXDXXXXXX SEQ ID NO:1 DSDLHGXFSVELFDPSKEEVQLESDLQQSSN SEQ ID NO: 2

NSDLHEXSFVELPGPSKEEVQFEDDAKNWY SEQ ID NO : 3

Para todas as sequências, X pode representar qualquer aminoácido. Em uma concretização da invenção, na SEQ ID NO: 1, ο X na posição 1 é D ou N, ο X na posição 6 é G ou E, ο X na posição 7 é P ou S, ο X na posição 8 é F ou S, ο X na posição 9 é S ou F, ο X na posição 13 é F ou P, o X na posição 14 é D ou G, ο X na posição 22 é L ou F, ο X na posição 24 é S ou D, ο X na posição 26 é L ou A, ο X na posição 27 é Q ou K, ο X na posição 28 é Q ou N, ο X na posição 29 é S ou V, ο X na posição 30 é S ou V, ο X na posição 31 é N ou Y. Para as SEQ ID NOs:2 e 3, ο X na posição 7 pode ser P ou S. Cada uma das SEQ ID NOs:1-3 podem ter um resíduo C no grupo N terminal. Alternativamente, o resíduo C no grupo N terminal pode estar ausente. O polipeptídeo VLPT-1 possui a SEQ ID NO: 2 com resíduo C no grupo amino terminal (ou seja, CDSDLHGPFSVELFDPSKEEVQLESDLQQSSN; SEQ ID NO: 5). O polipeptídeo VLPT-2 possui a SEQ ID NO: 3 com resíduo C no grupo amino terminal (ou seja, CNSDLHESSFVELPGPSKEEVQFEDDAKNVVY; SEQ ID NO: 6).

Outra concretização da invenção compreende um polipeptídeo purificado constituído pela SEQ ID NO: 4:

MSQFSEDNIG NIQMPFSNLQ ESSHLELPSL SEKVIHLESG LQQSSDSDSH EPSHLELPSL 60 SEEVIQLESD LQQSSNSDLH GSFSVELFDP FKEAVQLGND LQQSSDSDLH GXFSVELFDP 120 SKEEVQLESD LQQSSNSDLH ESSFVELPGP SKEEVQFEDD AKNWYGQDH VSLSELG 177

Ο X na posição 112 pode ser P ou S.

Uma concretização provê um polipeptídeo purificado compreendendo a SEQ ID NO: 1-6, em que o polipeptídeo é constituído aproximadamente por menos de 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 34, 33, 32 ou 31 (ou qualquer intervalo entre aproximadamente 31 e aproximadamente 175) aminoácidos contínuos, presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis (ou seja, o polipeptídeo purificado não abrange o polipeptídeo VLPT, presente naturalmente no Ehrlichia chaffeensis). Aminoácidos naturalmente presentes no Ehrlichia chaffeensis são quaisquer polipeptídeos naturalmente produzidos por um organismo Ehrlichia chaffeensis. Ou seja, um polipeptídeo purificado compreendendo um polipeptídeo mostrado nas SEQ ID NOs: 1-6, porém que é constituído por aproximadamente menos de 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 ou 35 aminoácidos contíguos, presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis.

O fato de as SEQ ID NOs:1-3 e 5-6 dos polipeptídeos serem menores do que a extensão completa do polipeptídeo VPLT do Ehrlichia chaffeensis é importante, uma vez que ensaios com peptídeos menores podem exibir maior especificidade e/ou sensibilidade do que aqueles com peptídeos em extensão completa. Adicionalmente, o custo para produção destes polipeptídeos menores pode ser menor, e estes podem ser obtidos com maior grau de pureza do que o polipeptídeo em extensão completa.

Uma concretização da invenção provê um polipeptídeo purificado contendo aproximadamente menos de 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 ou 35 aminoácidos contíguos, presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis, e aproximadamente mais de 10, 20, 25 ou 30 aminoácidos contíguos das SEQ ID NOs:1-6.

Uma concretização da invenção provê um polipeptídeo purificado compreendendo pelo menos aproximadamente 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50 ou mais aminoácidos contíguos das SEQ ID NOs:1-6. Por conseguinte, um polipeptídeo da invenção pode conter, por exemplo, aproximadamente 35 a aproximadamente 40; aproximadamente 35 a aproximadamente 50; aproximadamente 35 a aproximadamente 1000; aproximadamente 35 a aproximadamente 150 aminoácidos em extensão. Em uma concretização da invenção, o polipeptídeo compreende de aproximadamente 120 resíduos de aminoácidos a aproximadamente 177 resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; de aproximadamente 130 resíduos de aminoácidos a aproximadamente 170 resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; ou de aproximadamente 135 resíduos de aminoácidos a aproximadamente 168 resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

Polipeptídeos variantes podem ser pelo menos aproximadamente 80% ou aproximadamente 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idênticos às sequências do polipeptídeo mostradas nas SEQ ID NOs:1-6, e são também polipeptídeos da invenção. Por exemplo, um polipeptídeo variante das SEQ ID NOs:1-3 pode ser pelo menos aproximadamente 97% (aproximadamente 1 alteração em aminoácido), 94% (aproximadamente 2 alterações em aminoácido), 90% (aproximadamente 3 alterações em aminoácido), 87% (aproximadamente 4 alterações em aminoácido), 84% (aproximadamente 5 alterações em aminoácido) ou 81% (aproximadamente 6 alterações em aminoácido) idêntico às SEQ ID NOs:1-3. Um polipeptídeo variante das SEQ ID NOs:5-6 pode ser pelo menos aproximadamente 97% (aproximadamente 1 alteração em aminoácido), 94% (aproximadamente 2 alterações em aminoácido), 91% (aproximadamente 3 alterações em aminoácido), 88% (aproximadamente 4 alterações em aminoácido), 84% (aproximadamente 5 alterações em aminoácido) ou 81% (aproximadamente 6 alterações em aminoácido) idêntico às SEQ ID NOs:5-6. Polipeptídeos variantes exibem uma ou mais variações conserva8 doras de aminoácidos ou outras modificações mínimas e reterem atividade biológica, ou seja, são equivalentes biologicamente funcionais. Um equivalente biologicamente ativo possui função substancialmente equivalente quando comparado ao polipeptídeo do tipo selvagem. Em uma concretização da invenção, um polipeptídeo possui aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou menos substituições conservadoras de aminoácidos.

Percentual de identidade de sequências possui um significado reconhecido na técnica, e há alguns métodos para determinar a identidade entre duas sequências de polipeptídeos ou de polinucleotídeos. Consultar, por exemplo, Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, (1987); e Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Iniciador, M Stockton Press, New York, (1991). Métodos para alinhamento de polinucleotídeos ou polipeptídeos são codificados em programas de computador, incluindo o pacote do programa GCG (Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), os programas BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990)) e o programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711), os quais fazem uso do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Adv. App. Math., 2:482-489 (1981)). Por exemplo, o programa de computador ALIGN que emprega o algoritmo FASTA pode ser utilizado, com pesquisa de intervalo affine com penalidade para abertura de intervalo de -12 e penalidade para extensão de intervalo de -2.

Quando se usa qualquer um dos programas de alinhamento de sequências para determinar se determinada sequência é ou não, por exemplo, aproximadamente 95% idêntica a uma sequência de referência, os parâmetros são definidos de forma que o percentual de identidade seja calculado sobre a extensão completa do polinucleotídeo de referências e que in9 tervalos em identidade de até 5% do número total de nucleotídeos no polinucleotídeo de referência sejam permitidos.

Polipeptídeos variantes podem geralmente ser identificados, modificando-se uma das sequências de polipeptídeo da invenção e avaliando-se as propriedades do polipeptídeo modificado para determinar se este é um equivalente biológico. Variante é um equivalente biológico que reage substancialmente da mesma forma que um polipeptídeo da invenção em um ensaio como do tipo imuno-histoquímico, ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), rádio-imunoensaio (RIA), ensaio imunoenzimático ou ensaio pela técnica de Western Blotting, por exemplo, possui 90-110% da atividade do polipeptídeo original. Em uma concretização, o ensaio é do tipo competitivo, em que o polipeptídeo biologicamente equivalente é capaz de reduzir a ligação do polipeptídeo da invenção a um antígeno reativo correspondente ou a anticorpo em aproximadamente 80, 95, 99 ou 100%. Um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo correspondente do tipo selvagem também se liga especificamente ao polipeptídeo variante.

Substituição conservadora é aquela na qual um aminoácido é substituído por outro aminoácido com propriedades semelhantes, do tipo que qualquer técnico versado na técnica da química de peptídeos esperaria que a estrutura secundária e a natureza hidropática do polipeptídeo não teriam sido alteradas. Em geral, os seguintes grupos de aminoácidos representam alterações conservadoras: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) Vai, ile, leu, met, ala, phen; (4) lys, arg, his e (5) phe, tyr, trp, his.

Um polipeptídeo da invenção pode compreender ainda uma sequência de sinalização (ou líder) que direciona, antes ou após a tradução, a transferência da proteína. O polipeptídeo pode compreender também um ligante ou outra sequência para facilitar a síntese, purificação ou identificação do polipeptídeo (por exemplo, poli-His), ou para intensificar a ligação do polipeptídeo a um suporte sólido. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado à região Fc de uma imunoglobulina ou a albumina sérica bovina.

Um polipeptídeo pode ser unido por ligação covalente ou não a uma sequência de aminoácido à qual o polipeptídeo não está normalmente associado na natureza, ou seja, uma sequência heteróloga de aminoácidos. Uma sequência heteróloga de aminoácidos pode ser aquela de um organismo diferente de Ehrlichia chaffeensis, uma sequência sintética ou uma sequência do Ehrlichia chaffeensis não usualmente situada no carbóxi ou amino terminal de um polipeptídeo da invenção. Adicionalmente, um polipeptídeo pode estar unido por ligação covalente ou não a constituído s ou moléculas diferentes de aminoácidos, assim como reagentes indicadores. Um polipeptídeo pode estar unido por ligação covalente ou não a um espaçador aminoácido, um ligante aminoácido, uma sequência de sinalização, uma sequência de parada de transferência, um domínio transmembrana, uma proteína ligante de purificante ou a uma combinação destes. Um polipeptídeo pode estar unido a um grupamento (ou seja, um grupo funcional que pode ser um polipeptídeo ou outro constituído) que intensifica o aparecimento de resposta imune (por exemplo, citocinas como IL-2), um grupamento que facilita a purificação (por exemplo, etiquetas) de afinidade, como etiquetas de seis histidinas, trpE, glutationa, proteína de ligação a maltose) ou a grupamento que facilita a estabilidade do polipeptídeo (por exemplo, polietilenoglicol, grupos de proteção do amino terminal, como acetila, propila, succinila, benzila, benziloxicarbonila ou t-butiloxicarbonila; grupos de proteção da carboxila terminal, como amida, metilamida e etilamida). Em uma concretização da invenção, uma proteína ligante de purificação pode ser um ou mais resíduos C de aminoácidos no grupo, por exemplo, amino terminal ou carbóxi terminal ou em ambos os grupos terminais de um polipeptídeo da invenção. Um espaçador aminoácido é uma sequência de aminoácidos que não está associada a um polipeptídeo da invenção na natureza. Um espaçador aminoácido pode compreender aproximadamente 1, 5, 10, 20, 100 ou 1.000 aminoácidos.

Se desejado, um polipeptídeo da invenção pode ser parte de uma proteína de fusão contendo outras sequências de aminoácidos, assim como ligantes aminoácidos, espaçadores aminoácidos, sequências de sinalização, sequências de parada de transferência TMR, domínios transmem11 branas, bem como ligantes úteis na purificação de proteínas como, por exemplo, glutationa-S transferase, tag de histidina e proteína estafilocócica A. Mais de um polipeptídeo da invenção pode estar presente em uma proteína de fusão da invenção. Um polipeptídeo da invenção pode ser ligado operacionalmente a proteínas não pertences ao Ehrlichia chaffeensis ou a proteínas VLPT não pertencentes ao Ehrlichia chaffeensis para formar proteínas de fusão. Uma proteína de fusão da invenção pode compreender um ou mais polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis da invenção, fragmentos ou combinações destes. Uma proteína de fusão não ocorre na natureza. O termo operacionalmente ligado significa que o polipeptídeo da invenção e os outros polipeptídeos são fundidos entre si in-frame com o N-terminal ou com o C-terminal do polipeptídeo da invenção.

Polipeptídeos da invenção podem estar em forma multimérica. Ou seja, um polipeptídeo pode compreender uma ou mais cópias de um polipeptídeo do Ehrlichia chaffeensis da invenção ou uma combinação destes. Um polipeptídeo multimérico pode ser um antígeno peptídico múltiplo (MAP). Consultar, por exemplo, TAM, J. Immunol. Methods, 196:17-32 (1996).

Os polipeptídeos da invenção podem compreender um antígeno reconhecido por um anticorpo específico contra Ehrlichia chaffeensis. O antígeno pode compreender um ou mais epítopos (ou seja, determinantes antigênicos). Um epítopo pode ser linear, em sequência ou conformacional. Epítopos contidos em um polipeptídeo da invenção podem ser identificados por vários métodos. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N² 4 554 101; Jameson & Wolf, CABIOS 4:181-186 (1986). Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser isolado e classificado. Uma série de peptídeos curtos, abrangendo, juntos, a sequência completa de um polipeptídeo, pode ser preparada por clivagem proteolítica. Iniciando, por exemplo, com fragmentos polipeptídeos de 30 mer (ou fragmentos menores), é possível testar cada fragmento quanto à presença de epítopos reconhecidos em ensaio ELISA. Por exemplo, em um ensaio ELISA, um polipeptídeo do Ehrlichia chaffeensis, como um fragmento polipeptídico de 30 mer, é preso a um suporte sólido, como as poços de uma placa plástica de múltiplas poços. Uma popula ção de anticorpos é marcada, adicionada ao suporte sólido e permitida a sua ligação ao antígeno não marcado, sob condições em que absorção não específica é bloqueada, e qualquer anticorpo não ligado e outras proteínas são lavados e separados. A ligação do anticorpo é detectada, por exemplo, por uma reação que converte um substrato incolor a um produto da reação que tenha cor. Progressivamente, fragmentos menores e sobrepostos podem ser testados, então, a partir de um identificado de 30 meros para construir um mapa do epítopo de interesse.

Um polipeptídeo da invenção pode ser produzido por recombinação. Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção pode ser introduzido em um vetor de expressão recombinante, o qual pode ser expresso em um sistema celular hospedeiro adequado de expressão, empregando técnicas bem conhecidas na técnica. Há disponível uma variedade de sistemas de expressão de bactérias, leveduras, plantas, mamíferos e insetos na técnica, e qualquer um destes sistemas de expressão pode ser utilizado. Opcionalmente, um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo pode ser traduzido em um sistema celular de tradução livre. Um polipeptídeo pode ser também sintetizado quimicamente ou obtido a partir de células do Ehrlichia chaffeensis.

Um polipeptídeo imunogênico da invenção pode compreender uma sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOs:1-6, ou fragmentos destas. Um polipeptídeo imunogênico pode induzir o aparecimento de anticorpos ou outros tipos de resposta imune (por exemplo, respostas de células T do sistema imune) que reconheçam epítopos de um polipeptídeo tendo as SEQ ID NOs:1-6. Um polipeptídeo imunogênico da invenção pode ser também um fragmento de um polipeptídeo com sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOs:1-6. O fragmento de um polipeptídico imunogênico da invenção pode conter aproximadamente 6, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 170 (ou qualquer intervalo entre 6 e 170) ou mais aminoácidos em extensão. O fragmento de um polipeptídeo imunogênico da invenção pode conter aproximadamente 170, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 6 ou menos aminoácidos em extensão (ou qual13 quer intervalo entre 170 e 6).

Polinucleotídeos do Ehrlichia chaffeensis

Os polinucleotídeos da invenção contêm menos do que todo o genoma microbiano e pode ser ácidos nucleicos de fita simples ou dupla. Um polinucleotídeo pode ser RNA, DNA, cDNA, DNA genômico, RNA ou DNA sintetizados quimicamente, ou combinações destes. Os polinucleotídeos podem ser purificados, livres de outros componentes como, por exemplo, proteínas, lipídeos ou outros polinucleotídeos. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser 50%, 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% puro. Uma molécula de ácido nucleico, existente entre milhares a milhões de outras moléculas de ácido nucleico incluídas, por exemplo, em bibliotecas de cDNA ou genômico, ou cortes de gel contendo DNA genômico restringido por digestão, não deve ser considerado um polinucleotídeo isolado.

Os polinucleotídeos da invenção codificam os polipeptídeos da invenção descritos acima. Em uma concretização da invenção, os polinucleotídeos VLPT codificam um polipeptídeo mostrado nas SEQ ID NOs:1-6, ou fragmentos destes.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser constituídos por menos de aproximadamente 530, 500, 400, 300, 250, 150, 100 ou 90 (ou qualquer intervalo entre 90 e 530) polinucleotídeos contíguos, presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis. Os polinucleotídeos da invenção podem ser constituídos por mais de aproximadamente 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 530 (ou qualquer intervalo entre 90 e 530) ou mais polinucleotídeos contíguos, presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis. Os polinucleotídeos purificados podem compreender nucleotídeos heterólogos adicionais (ou seja, nucleotídeos que são não provenientes de Ehrlichia chaffeensis) e até mesmo aminoácidos adicionais de Ehrlichia chaffeensis, desde que não ocorram naturalmente com polinucleotídeos VLPT de Ehrlichia chaffeensis. Os polinucleotídeos da invenção podem compreender outras sequências de nucleotídeos, tais como sequências que codificam ligantes, sequências de sinalização, sequências de parada de transferência TMR, domínios transmembranas ou ligantes úteis na purificação de proteínas, como glutationa-S transferase, etiqueta de histidina e proteína estafilocócica A. Uma concretização da invenção provê uma polinucleotídeo purificado, compreendendo pelo menos aproximadamente 6, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 ou mais nucleotídeos contíguos, codificadores das SEQ ID NOs:1-6.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser isolados. Polinucleotídeo isolado é aquele de ocorrência natural que não é imediatamente contíguo a uma ou ambas as sequências 5' e 3' flanqueadoras à qual está naturalmente associado. Polinucleotídeo isolado pode ser, por exemplo, uma molécula de DNA recombinante de qualquer extensão, desde que as sequências de ácidos nucleicos naturalmente encontrados imediatamente ao lado da molécula de DNA recombinante, em um genoma de ocorrência natural, sejam removidas ou estejam ausentes. Polinucleotídeos isolados incluem também moléculas de ácidos nucleicos que não ocorrem naturalmente.

Os polinucleotídeos da invenção podem compreender também fragmentos que codificam polipeptídeos imunogênicos. Os polinucleotídeos da invenção são capazes de codificar polinucleotídeos em extensão completa, fragmentos de polipeptídeos e polipeptídeos variantes ou de fusão.

Sequências degeneradas de nucleotídeos que codificam polipeptídeos da invenção, bem como sequências homólogas de nucleotídeos que são pelo menos aproximadamente 80 ou aproximadamente 90, 96, 98 ou 99% idênticas às sequências de polinucleotídeos da invenção e os complementos destas são também polinucleotídeos da invenção. O percentual de identidade das sequências pode ser calculado como descrito na seção de Polipeptídeos. Sequências degeneradas de nucleotídeos são polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo da invenção, ou fragmentos deste, porém diferem em sequência de ácidos nucleicos da sequência de polinucleotídeos do tipo selvagem, devido à degeneração do código genético. Moléculas complementares do DNA (cDNA), homólogos de espécies e variantes de polinucleotídeos do Ehrlichia chaffeensis que codificam polipeptídeos biologicamente funcionais do Ehrlichia chaffeensis são também polinucleotídeos do Ehrlichia chaffeensis.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser isolados de sequências de ácidos nucleicos presentes em, por exemplo, uma amostra biológica, assim como de sangue, soro, saliva ou tecido, de um indivíduo infectado. Polinucleotídeos podem ser também sintetizados no laboratório, por exemplo, utilizando um sintetizador automático. Um método de amplificação, como PCR, pode ser utilizado para amplificar polinucleotídeos a partir de DNA genômico ou de cDNA codificador dos polipeptídeos.

Os polinucleotídeos da invenção podem compreender sequências de codificação para polipeptídeos de ocorrência natural ou pode codificar sequências alteradas que não ocorrem na natureza. Se desejado, os polinucleotídeos podem ser clonados em um vetor de expressão, compreendendo elementos de controle de expressão, incluindo, por exemplo, origens de replicação, promotores, reforçadores ou outros elementos de regulação que direcionam a expressão dos polinucleotídeos da invenção em células hospedeiras. Um vetor de expressão pode ser, por exemplo, um plasmídeo, assim como pBR322, PUC ou ColE1, ou um vetor de adenovírus, assim como vetor de adenovírus Tipo 2 ou Tipo 5. Opcionalmente, outros vetores podem ser utilizados, incluindo, entre outros, o vírus Sindbis, vírus símio 40, vetores de alfavírus, vetores de poxvírus e vetores de citomegalovírus e de retrovírus, como vírus do sarcoma murino, vírus do tumor mamário de camundongos, vírus da leucemia murina de Moloney e vírus do sarcoma de Rous. Minicromossomos como MC e MC1, bacteriófagos, fagemídeos, cromossomos artificiais de leveduras, cromossomos artificiais de bacterianas, partículas virais, partículas semelhantes a vírus, cosmídeos (plasmídeos nos quais sítios cos de fagos lambda foram inseridos) e replicons (elementos genéticos capazes de replicação sob o seu próprio controle em uma célula) podem ser utilizados também.

Métodos para o preparo de polinucleotídeos ligados operacionalmente a uma sequência de controle da expressão e para a sua expressão em célula hospedeira são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N² 4 366 246. Um polinucleotídeo da invenção é ligado operacionalmente quando está posicionado adjacente ou próximo a um ou mais elementos de controle da expressão orientam a transcrição direta e/ou a tradução do polinucleotídeo.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser utilizados, por exemplo, como sondas ou iniciadores, por exemplo, iniciadores de PCR, para detectar a presença de polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra em teste, assim como uma amostra biológica. Sondas são moléculas capazes de interagir com um ácido nucleico-alvo, tipicamente em maneira sequência específica, por exemplo, por meio de hibridização. Os iniciadores são um subconjunto de sondas capazes de suportar manipulação enzimática e que podem se hibridizar com um ácido nucleico-alvo, de modo que a manipulação enzimática ocorra. É possível produzir um iniciador a partir de qualquer combinação de nucleotídeos ou de derivados ou análogos de nucleotídeos, disponíveis na técnica, que não interferem com a manipulação enzimática.

Uma sonda ou iniciador pode conter aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos contíguos que codificam polipeptídeos mostrados nas SEQ ID NOs: 1-6.

A hibridização de ácidos nucleicos é bem entendida na técnica e nela discutida. Tipicamente, uma sonda pode ser produzida a partir de qualquer combinação de nucleotídeos ou de derivados ou análogos de nucleotídeos disponíveis na técnica. A capacidade destas sondas e destes iniciadores de se hibridizarem especificamente com sequências de polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis possibilitará o seu uso para detectar a presença de sequências complementares em uma determinada amostra em teste. Sondas e iniciadores de polinucleotídeos da invenção podem hibridizar-se com sequências complementares em uma amostra em teste, como uma amostra biológica, incluindo de saliva, escarro, sangue, plasma, soro, urina, fezes, líquido cérebro-espinhal, líquido amniótico, exsudato de ferimento ou de tecido. Os polinucleotídeos da amostra podem ser, por exemplo, submetidos à eletroforese em gel ou outras técnicas de separação por tamanho, ou podem ser imobilizados sem separação por tamanho. As sondas ou iniciadores de polinucleotídeos podem ser marcadas. Marcações e métodos adequados para marcação de sondas e iniciadores, são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, marcações radioativas incorporadas de acordo com o método Nick translation ou por quinase, marcações por biotina, marcações fluorescentes, marcações quimioluminescentes, marcações bioluminescentes, marcações por quelante de metal e marcações enzimáticas. Os polinucleotídeos da amostra são postos em contato com as sondas ou iniciadores, sob condições de hibridização de rigor adequado.

Dependendo da aplicação, a variação das condições de hibridização para ser utilizada para serem obtidos graus variados de seletividade da sonda ou do iniciador para a sequência-alvo. Para aplicações que requeiram alta seletividade, condições relativamente rigorosas podem ser utilizadas, como condições de baixa presença de sal e/ou de alta temperatura, como as fornecidas por concentração de sal de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M em temperaturas de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C. Para aplicações que requeiram menos seletividade, condições de hibridização menos rigorosas podem ser utilizadas. Por exemplo, condições de concentração de sal de aproximadamente 0,14 M a aproximadamente 0,9 M, em temperaturas variando de aproximadamente 20°C a aproximadamente 55°C. A presença de um complexo hibridizado, compreendendo a sonda ou o iniciador e um polinucleotídeo complementar proveniente da amostra em teste, indica a presença de polinucleotídeo de Ehrlichia chaffeensis na amostra.

Anticorpos

Os anticorpos da invenção são moléculas de anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis da invenção, polipeptídeos variantes da invenção ou fragmentos destes. Um anticorpo da invenção pode ser específico para um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis, por exemplo, um anticorpo específico para uma ou mais SEQ ID NOs:1-6. Em outra concretização da invenção, um anticorpo é específico para um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis e não é específico para um polipeptídeo de Ehrlichia canis (por exemplo, um anticorpo específico para SEQ ID NOs:1-6). Qualquer técnico versado na área pode determinar facil18 mente se um anticorpo é específico para um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis, usando os ensaios descritos acima. Um anticorpo da invenção pode ser monoclonal, policlonal, anticorpo de cadeia única (scFV) ou um fragmento de ligação a antígenos do anticorpo. Os fragmentos de ligação a antígenos do anticorpo são uma porção de um anticorpo intacto, compreendendo o sítio de ligação a antigeno ou região variável de um anticorpo intacto, em que a porção não contém os domínios constantes de cadeia pesada da região Fc do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de ligação a antígenos de anticorpos incluem os fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂ e F_v.

Um anticorpo da invenção pode ser de qualquer classe, incluindo, por exemplo, IgG, IgM, IGA, IgD e IgE. Um anticorpo ou seu fragmento liga-se a um epítopo de um polipeptídeo da invenção. Um anticorpo pode ser produzido in vivo em animais de laboratório ou in vitro empregando técnicas de DNA recombinante. Meios para o preparo e a caracterização de anticorpos são bens conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn et al., Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright et al., Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992). Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos pela administração de um polipeptídeo da invenção a um animal, assim como um ser humano ou outro primata, camundongo, rato, coelho, cobaia, cabra, porco, vaca, ovelha, burro ou cavalo. O soro do animal imunizado é coletado, e os anticorpos são purificados do plasma, por exemplo, por precipitação com sulfato de amônio, seguido por cromatografia, como cromatografia por afinidade. Técnicas para produção e processamento de anticorpos clonais são conhecidas na técnica.

Liga-se especificamente, especificamente ligado ou específico para significam que um primeiro antigeno, por exemplo, um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis, reconhece e liga-se a um anticorpo da invenção com maior afinidade do que para outras moléculas não específicas. Liga-se especificamente, especificamente ligado ou específico para significam também um primeiro anticorpo, por exemplo, um anticorpo criado contra as SEQ ID NOs:1-6, reconhece e liga-se às SEQ ID NOs:1-6, com maior afinidade do que para outras moléculas não específicas. Uma molécula não específica é um antígeno que não compartilha um antígeno comum com o primeiro antígeno. Em uma concretização preferida da invenção, uma molécula não específica não é derivada de Ehrlichia sp. e, em especial, não é derivada de Ehrlichia chaffeensis ou Ehrlichia canis. Ehrlichia sp. refere-se a todas as espécies do gênero Ehrlichia. Por exemplo, um anticorpo criado contra um primeiro antígeno (por exemplo, um polipeptídeo) ao qual se liga mais eficientemente do que a um antígeno não específico pode ser descrito como ligado especificamente ao primeiro antígeno. Em uma concretização, um anticorpo ou sua porção de ligação a antígeno liga-se especificamente a um polipeptídeo das SEQ ID NOs:1-6, ou a fragmentos deste, quando se liga com afinidade de ligação K_a de 10⁷ l/mol ou mais. A ligação específica pode ser testada utilizando, por exemplo, um ensaio imunoenzimático (ELISA), um rádio-imunoensaio (RIA) ou um ensaio pela técnica de Western Blotting, empregando uma metodologia bem conhecida na técnica.

Os anticorpos da invenção incluem anticorpos e seus fragmentos de ligação a antígenos que (a) competem com um anticorpo de referência pela ligação às SEQ ID NOs:1-6, ou com fragmentos destes de ligação a antígeno; (b) se ligam ao mesmo epítopo de SEQ ID NOs:1-6, ou fragmentos de ligação a antígenos destas, como um anticorpo de referência; (c) se ligam a SEQ ID NOs:1-6, ou fragmentos de ligação a antígenos destas, com substancialmente a mesma K_d de um anticorpo de referência; e/ou (d) se ligam a um polipeptídeo das SEQ ID NOs:1-6 ou fragmentos de ligação a antígenos destas com afinidade de ligação K_a de 10⁷ l/mol ou mais.

Adicionalmente, anticorpos monoclonais direcionados contra epítopos presentes em um polipeptídeo da invenção podem ser também rapidamente produzidos. Por exemplo, células B normais de um mamífero, como camundongo, que foi imunizado com um polipeptídeo da invenção, podem ser fundidas a, por exemplo, células de mieloma de camundongos sensíveis a HAT para produção de hibridomas. Hibridomas produtores de anticorpos específicos contra Ehrlichia podem ser identificados por RIA ou ELISA, e isolados por clonagem em Agar semisólido ou por diluição limitante. Clones produtores de anticorpos específicos contra Ehrlichia são isolados por outra rodada de classificação. Anticorpos monoclonais podem ser classificados quanto à especificidade empregando técnicas padrão, por exemplo, por ligação de um polipeptídeo da invenção a uma placa de microtitulação e medição da ligação do anticorpo monoclonal por um ensaio ELISA. Técnicas para produção e processamento de anticorpos monoclonais são conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975). Isotipos especiais de um anticorpo monoclonal podem ser preparados diretamente, pela seleção a partir da fusão inicial, ou preparados secundariamente a partir de um hibridoma original que secreta um anticorpo monoclonal de um isótipo diferente, utilizando uma técnica de seleção sib para isolar variantes de classe trocada. Consultar Steplewski et al., P.N.A.S. U.S.A. 82:8653,1985; Spria et al., J. Immunolog. Meth. 74:307, 1984. Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser também monoclonais recombinantes. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N² 4 474 893 e a Patente U.S. N² 4 816 567. Os anticorpos da invenção podem também ser construídos quimicamente. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N² 4 676 980.

Os anticorpos da invenção podem ser quiméricos (consultar, por exemplo, a Patente U.S. N² 5 482 856), humanizados (consultar, por exemplo, Jones et al., Nature 321:522 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992)), caninizados, caninos ou humanos. Anticorpos humanos podem ser produzidos, por exemplo, por imortalização direta, exibição em fagos, camundongos transgênicos ou metodologia com Trimera, consultar, por exemplo, Reisener et al., Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998).

Anticorpos que se ligam especificamente a Ehrlichia chaffeensis são especialmente úteis para detecção da presença de antígenos de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra, como amostra de soro, sangue, plasma, célula, tecido, urina, fezes ou saliva de um animal. Um imunoensaio pode ser utilizado para um ou vários anticorpos. Um imunoensaio pode utilizar, por exemplo, um anticorpo monoclonal específico para um epítopo, uma combinação de anticorpos monoclonais específicos para epítopos de um polipeptídeo, anticorpos monoclonais específicos para epítopos de diferentes polipeptídeos, anticorpos policlonais específicos para o mesmo antígeno, anticorpos policlonais específicos para diferentes antígenos ou uma combinação de anticorpos monoclonais e policlonais. Protocolos de imunoensaios podem ser à base de, por exemplo, competição, reação direta, ou ensaios do tipo intercalado utilizando, por exemplo, anticorpo marcado. Os anticorpos da invenção podem ser marcados com qualquer tipo de marcação conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, por fluorescência, quimioluminescência, radiatividade, enzima marcada, metal coloidal marcado, radioisótopo e por bioluminescência. Em uma concretização da invenção, os anticorpos da invenção se ligam especificamente a antígenos do Ehrlichia chaffeensis e não se ligam especificamente a antígenos do Ehrlichia canis.

Os anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação a antígenos podem ser ligados a um suporte e utilizados para detectar a presença de antígenos do Ehrlichia chaffeensis. Os suportes incluem, por exemplo, de vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, náilon, amilases, celulases naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magletita.

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados ainda para isolar organismos Ehrlichia chaffeensis ou antígenos por colunas de imunoafinidade. Os anticorpos podem ser fixados a um suporte sólido, por exemplo, por adsorção ou por ligação covalente de modo que os anticorpos retenham a sua atividade imunosseletiva. Opcionalmente, grupos espaçadores podem ser incluídos de modo que o sítio de ligação a antígenos do anticorpo permaneça acessível. Os anticorpos imobilizados podem ser então utilizados para ligar organismos Ehrlichia chaffeensis ou antígenos do Ehrlichia chaffeensis de uma amostra, como uma amostra biológica incluindo de saliva, soro, escarro, sangue, urina, fezes, líquido cérebro-espinhal, líquido amniótico, exsudato de ferimento ou tecido. Os organismos Ehrlichia ou antígenos do Ehrlichia ligados são recuperados da matriz da coluna, por exemplo, por alteração em pH.

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados também em estudos de imunocolonização para analisar a presença e distribuição de um polipeptídeo da invenção durante vários eventos celulares ou condições fisiológicas. Os anticorpos podem ser utilizados também para identificar moléculas envolvidas em imunização passiva e para identificar moléculas envolvidas na biossíntese de antígenos não proteicos. A identificação destas moléculas pode ser útil no desenvolvimento de vacinas. Os anticorpos da invenção, incluindo, por exemplo, anticorpos monoclonais e anticorpos de cadeia única, podem ser utilizados para monitorar o curso da melhora de uma doença causada por Ehrlichia chaffeensis. A medição do aumento ou da diminuição de anticorpos específicos para Ehrlichia chaffeensis, em uma amostra em teste de um animal, permite determinar se um regime terapêutico específico, visando melhorar o transtorno, é eficaz. Os anticorpos podem ser detectados e/ou quantificados por ensaios de ligação direta, tais como RIA, ELISA ou ensaio pela técnica de Western Blotting.

Métodos de detecção

Os métodos da invenção podem ser utilizados para detectar anticorpos ou fragmentos de ligação a antígenos de anticorpos específicos contra antígenos do Ehrlichia chaffeensis ou polinucleotídeos do Ehrlichia chaffeensis em uma amostra em teste, como uma amostra biológica, uma amostra ambiental ou uma amostra de laboratório. Uma amostra em teste pode compreender potencialmente polinucleotídeos de Ehrlichia sp., polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis, polinucleotídeos de Ehrlichia canis, polipeptídeos de Ehrlichia sp., polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis, polipeptídeos de Ehrlichia canis, anticorpos específicos contra Ehrlichia sp., anticorpos específicos contra Ehrlichia chaffeensis e/ou anticorpos específicos contra Ehrlichia canis, polinucleotídeos e polipeptídeos não relacionados, combinações destes ou nenhum dos acima. Uma amostra biológica pode incluir, por exemplo, de soros, sangue, células, plasma, saliva, urina, fezes ou tecido de um mamífero, como cavalo, gato, cachorro ou humano. A amostra em teste pode ser não tratada, precipitada, fracionada, separada, diluída, concentrada ou purificada.

Em uma concretização, os métodos da invenção compreendem pôr em contato um ou mais polipeptídeos da invenção com uma amostra em teste sob condições que permitam a formação de complexos polipeptídeo/anticorpo, ou seja, imunocomplexos. Em outras palavras, os polipeptídeos da invenção se ligam especificamente a anticorpos específicos contra antígenos do Ehrlichia chaffeensis, situados na amostra. Em uma concretização da invenção, um ou mais polipeptídeos da invenção se ligam especificamente a anticorpos que são específicos contra antígenos do Ehrlichia chaffeensis e não se ligam especificamente a antígenos do Ehrlichia canis. Uma pessoa versada na técnica está familiarizada com ensaios e condições, utilizados para detectar a ligação de complexos anticorpo/polipeptídeo. A formação de um complexo entre polipeptídeos e anticorpos na amostra é detectada. A formação de complexos anticorpo/polipeptídeo é indicativa de que polipeptídeos do Ehrlichia chaffeensis estão presentes na amostra. A falta de detecção dos complexos polipeptídeo/anticorpo é indicativa de que polipeptídeos do Ehrlichia chaffeensis não estão presentes na amostra.

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados em um método diagnóstico de infecção por Ehrlichia chaffeensis, obtendo-se uma amostra para teste de, por exemplo, um ser humano ou animal com suspeita de infecção por Ehrlichia chaffeensis. A amostra em teste é posta em contato com anticorpos da invenção, sob condições que permitem a formação dos complexos anticorpo-antígeno (ou seja, imunocomplexos). Uma pessoa versada na técnica está ciente das condições que permitem e que são apropriadas para a formação de complexos antígeno/anticorpo. Um nível mais alto do que o formado em uma amostra de controle negativo indica infecção por Ehrlichia chaffeensis. Uma amostra de controle negativo é aquela que não compreende quaisquer polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis e/ou de Ehrlichia canis ou anticorpos específicos contra Ehrlichia chaffeensis e/ou Ehrlichia canis. Em uma concretização da invenção, o controle negativo não contém polipeptídeos de Ehrlichia sp. ou anticorpos específicos contra Ehrlichia sp. Em uma concretização da invenção, um anticorpo é específico contra antígenos do Ehrlichia chaffeensis e não é específico contra antígenos do

Ehrlichia canis. Alternativamente, um polipeptídeo da invenção pode ser posto em contato com uma amostra em teste. Anticorpos específicos contra Ehrlichia chaffeensis, em amostra em teste positiva, formarão complexos antígeno-anticorpo sob condições adequadas. A quantidade de complexos anticorpo-antígeno pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica.

Em uma concretização da invenção, a infecção por Ehrlichia chaffeensis pode ser detectada em um indivíduo. Uma amostra biológica é obtida do indivíduo. Um ou mais polipeptídeos purificados compreendendo as SEQ ID NOs:1-6 ou outros polipeptídeos da invenção são postos em contato com a amostra biológica sob condições que permitam a formação de complexos polipeptídeo/anticorpo. Os complexos polipeptídeo/anticorpo são detectados. A detecção dos complexos polipeptídeo/anticorpo é indicativa de que o mamífero apresenta infecção por Ehrlichia chaffeensis. A falta de detecção dos complexos polipeptídeo/anticorpo é indicativa de que o mamífero não apresenta infecção por Ehrlichia chaffeensis.

Em uma concretização da invenção, a infecção por Ehrlichia chaffeensis pode ser detectada em um indivíduo em aproximadamente 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias ou mais após o indivíduo ter adquirido a infecção por Ehrlichia chaffeensis. Em uma concretização da invenção, a infecção por Ehrlichia chaffeensis pode ser detectada em um indivíduo em aproximadamente 21 dias, 20 dias, 19 dias, 18 dias, 17 dias, 16 dias, 15 dias, 14 dias, 13 dias, 12 dias, 11 dias, 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias ou menos após o indivíduo ter adquirido a infecção por Ehrlichia chaffeensis.

Em uma concretização da invenção, o complexo polipeptídeo/anticorpo é detectado quando um reagente indicador, como um conjugado enzimático, ligado ao anticorpo catalisa uma reação detectável. Opcionalmente, um reagente indicador compreendendo um composto gerador de sinal pode ser aplicado ao complexo polipeptídeo/anticorpo sob condições que permitam a formação de um complexo polipeptídeo/anticorpo/ indicador.Opcionalmente, o polipeptídeo ou o anticorpo pode ser marcado com um reagente indicador antes da formação de um complexo polipeptídeo/anticorpo. O método pode compreender opcionalmente um controle positivo ou negativo.

Em uma concretização da invenção, um ou mais anticorpos da invenção são unidos a uma fase ou substrato sólido. Uma amostra em teste, compreendendo potencialmente uma proteína contendo um polipeptídeo da invenção, é adicionada ao substrato. Um ou mais anticorpos que se ligam especificamente a polipeptídeos da invenção são adicionados. Os anticorpos podem ser os mesmos utilizados na fase sólida ou podem ser de origem ou espécie diferente e podem estar unidos a um reagente indicador, como um conjugado enzimático. Etapas de lavagem podem ser realizadas antes de cada adição. Um cromóforo ou substrato enzimático é adicionado e é permitido que a cor se desenvolva. A reação de coloração é interrompida, e a cor pode ser quantificada usando, por exemplo, um espectrofotômetro.

Em outra concretização da invenção, um ou mais anticorpos da invenção são presos a uma fase ou substrato sólido. Uma amostra em teste compreendendo potencialmente uma proteína contendo um polipeptídeo da invenção é adicionada ao substrato. São adicionados segundos anticorpos antiespécie que se ligam especificamente a polipeptídeos da invenção. Estes segundos anticorpos são de espécie diferente daquela dos anticorpos da fase sólida. Terceiros anticorpos antiespécie são adicionados que se ligam especificamente aos segundos anticorpos e que não se ligam especificamente aos anticorpos da fase sólida. Os terceiros anticorpos podem compreender um reagente indicador, como um conjugado enzimático. Etapas de lavagem podem ser realizadas antes de cada adição. Um cromóforo ou substrato enzimático é adicionado, e é permitido que a cor se desenvolva. A reação de coloração é interrompida, e a cor pode ser quantificada usando, por exemplo, um espectrofotômetro.

Os ensaios da invenção incluem, entre outros, aqueles à base de competição, reação direta ou ensaios do tipo intercalado, incluindo entre outros, ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), pela técnica de Western

Blotting, IFA, rádio-imunoensaio (RIA), hemaglutinação (HÁ), imunoensaio de fluorescência por polarização (FPIA) e ensaios com placas de microtitulação (qualquer ensaio efetuado em um ou mais poços de uma placa de microtitulação). Um ensaio da invenção compreende um ensaio de ligação por cromatografia de fluxo reversível, por exemplo, ensaio SNAP®. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N² 5 726 010.

Os ensaios podem fazer uso de fases ou substratos sólidos ou podem ser realizados por imunoprecipitação ou quaisquer outros métodos que não fazem uso de fases sólidas. Se uma fase ou substrato for utilizado, um ou mais polipeptídeos da invenção são presos direta ou indiretamente a um suporte ou substrato sólido, como uma placa de microtitulação, partícula magnética, partícula não magnética, coluna, matriz, membrana, material fibroso composto por fibras sintéticas ou naturais (por exemplo, materiais à base de vidro ou celulose ou polímeros termoplásticos, como polietileno, propileno ou poliéster), estrutura sinterizada composta por materiais particulados (por exemplo, vidro ou vários polímeros termoplásticos) ou película moldada composta por nitrocelulose, náilon, polissulfona ou os assemelhados (geralmente sintéticos por natureza). Em uma concretização da invenção, um substrato é partículas finas sinterizadas de polietileno, comumente conhecidas como polietileno poroso, por exemplo, polietileno poroso de ΙΟΙ 5 micra da Chromex Corporation (Albuquerque, NM). Todos estes materiais de substrato podem ser utilizados em formas adequadas, como filmes, lâminas ou placas, ou podem revestir ou serem unidos ou laminados a veículos inertes apropriados, como papel, vidro, filmes plásticos ou materiais têxteis. Métodos adequados para imobilização de peptídeos sobre fases sólidas incluem interações iônicas, hidrofóbicas, covalentes e semelhantes.

Em um tipo de formato de ensaio, um ou mais polipeptídeos podem ser revestidos sobre uma fase ou substrato sólido. Uma amostra em teste com suspeita de conter anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis, ou seus fragmentos de ligação a antígenos, é incubada com um reagente indicador, compreendendo um composto gerador de sinal, conjugado a anticorpos ou fragmentos de anticorpos específicos contra Ehrlichia chaffeensis, por um tempo e sob condições suficientes para a formação de complexos antíge no/anticorpo por anticorpos da amostra em teste com os polipeptídeos da fase sólida, ou pelo composto reagente indicador conjugado a um anticorpo específico para Ehrlichia chaffeensis com os polipeptídeos da fase sólida. A redução na ligação do composto reagente indicador a anticorpos antiEhrlichia chaffeensis com a fase sólida pode ser medida quantitativamente. Uma redução mensurável no sinal comparado ao sinal gerado de, por exemplo, uma amostra teste negativa confirmada para Ehrlichia chaffeensis indica a presença de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis na amostra em teste. Este tipo de ensaio é capaz de determinar a quantidade de anticorpos antiEhrlichia chaffeensis em uma amostra em teste.

Em outro tipo de formato de ensaio, um ou mais polipeptídeos da invenção são revestidos sobre um suporte ou substrato. Um polipeptídeo da invenção é conjugado a um reagente indicador e adicionado a uma amostra em teste. Essa mistura é aplicada ao suporte ou substrato. Se estiverem presentes na amostra em teste, os anticorpos contra Ehrlichia chaffeensis se ligarão ao único ou mais polipeptídeos conjugados a um reagente indicador e ao único ou mais polipeptídeos imobilizados sobre o suporte. O complexo polipeptídeo/anticorpo/indicador pode então ser detectado. Este tipo de ensaio é capaz de determinar a quantidade de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis em uma amostra em teste.

Em outro tipo de formato de ensaio, um ou mais polipeptídeos da invenção são revestidos sobre um suporte ou substrato. A amostra em teste é aplicada ao suporte ou substrato e incubada. Componentes não ligados da amostra são removidos por lavagem com uma solução apropriada. Se estiverem presentes na amostra em teste, os anticorpos específicos contra Ehrlichia chaffeensis se ligarão ao polipeptídeo revestido sobre a fase sólida. Esse complexo polipeptídeo/anticorpo pode ser detectado, utilizando um segundo anticorpo específico contra a espécie, conjugado a um reagente indicador. O complexo polipeptídeo/anticorpo/anticorpo indicador antiespécie pode ser então detectado. Este tipo de ensaio é capaz de determinar a quantidade de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis em uma amostra em teste.

A formação de um complexo polipeptídeo/anticorpo ou um complexo polipeptídeo/anticorpo/indicador pode ser detectada, por exemplo, por métodos de radiometria, colorimetria, fluorometria, separação por tamanho ou de precipitação. Opcionalmente, a detecção de um complexo polipeptídeo/anticorpo é pela adição de um anticorpo secundário, acoplado a um reagente indicador compreende um composto gerador de sinal. Reagentes indicadores compreendendo constituído s geradores de sinal (marcações) associados a um complexo polipeptídeo/anticorpo podem ser detectados utilizando os métodos descritos acima, e incluem agentes cromogênicos, catalisadores, como conjugados enzimáticos, constituídos fluorescentes, como fluoresceína e rodamina, constituídos quimioluminescentes, como dioxetanos e constituído s à base de acridínio, fenantridínio, rutênio e luminol, elementos radioativos, constituídos marcados de visualização direta, bem como cofatores, inibidores, partículas magnéticas e os semelhantes. Exemplos de conjugados enzimáticos incluem fosfatase alcalina, peroxidase do rábano silvestre, beta-galactosidase e os semelhantes. A seleção de uma marcação em particular não é essencial, porém deverá ser capaz de produzir um sinal, quer por si própria ou em conjunto com uma ou mais substâncias adicionais.

A formação do complexo é indicativa da presença de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis em uma amostra em teste. Por conseguinte, os métodos da invenção podem ser utilizados para diagnosticar infecção por Ehrlichia chaffeensis em um animal.

Os métodos da invenção podem indicar também a quantidade de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis em uma amostra em teste. Com muitos reagentes indicadores, como conjugados enzimáticos, a quantidade de anticorpo presente é proporcional ao sinal gerado. Dependendo do tipo, a amostra em teste pode ser diluída com reagente tampão adequado, concentrada ou posta em contato com uma fase sólida sem qualquer manipulação. Por exemplo, é geralmente preferido testar amostras de soro ou plasma que foram previamente diluídas, ou espécimes concentrados, como urina, a fim de determinar a presença e/dou a quantidade de anticorpo presente.

A invenção compreende ainda kits de ensaio (por exemplo, artigos manufaturados) para detecção de anticorpos ou fragmentos de ligação a antígenos de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis ou polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra. Um kit compreende um ou mais polipeptídeos da invenção e destina-se à determinação da ligação do polipeptídeo a anticorpos ou fragmentos de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis na amostra. Um kit ou artigo fabricado pode compreender também um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpos da invenção e destina-se à determinação da ligação dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos a polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis na amostra. Um kit pode compreender um dispositivo contendo um ou mais polipeptídeos ou anticorpos da invenção e instruções para uso do único ou mais polipeptídeos ou anticorpos para, por exemplo, a identificação de uma infecção por Ehrlichia chaffeensis em um mamífero. O kit pode compreender também material de embalagem compreendendo uma bula que indique o único ou mais polipeptídeos ou anticorpos do kit podem ser utilizados para a identificação de infecção por Ehrlichia chaffeensis. Outros componentes, como tampões, controles e os semelhantes, conhecidos por qualquer técnico versado na técnica, podem ser incluídos nestes kits de teste. Os polipeptídeos, anticorpos, ensaios e kits da invenção são úteis, por exemplo, no diagnóstico de casos individuais de infecção por Ehrlichia chaffeensis em um paciente, bem como em estudos epidemiológicos de surtos de Ehrlichia chaffeensis.

Os polipeptídeos e ensaios da invenção podem ser combinados a outros polipeptídeos ou ensaios para detectar a presença de Ehrlichia chaffeensis junto com outros organismos. Por exemplo, os polipeptídeos e ensaios da invenção podem ser combinados a reagentes que detectem verme do coração (Dirofilaria immitis) e/ou Borrelia burgdorferi e/ou Ehrlichia canis e/ou Anaplasma platys e/ou Anaplasma phagocytophilum.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser utilizados para detectar a presença de polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra. Os polinucleotídeos podem ser utilizados para detectar polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra por uma reação simples de hibridização, e podem ser utilizados em, por exemplo, reações em cadeia da polimerase (PCR), como reação de PCR em tempo real. Métodos e composições da invenção podem ser utilizados também para detectar diferenciadamente a presença de Ehrlichia chaffeensis da de outras Ehrlichia sp., tais como Ehrlichia canis.

Ensaios por PCR são bem descritos na técnica, incluindo, por exemplo, as Patentes U.S. N— 4 683 195, 4 683 202 e 4 965 188. Geralmente, iniciadores de polinucleotídeos são aneladas para fitas desnaturadas de um ácido nucleico-alvo. Produtos da extensão do iniciador são formados por polimerização de trifosfatos desoxinucleotídeos por uma polimerase. A PCR envolve então ciclos repetidos de desnaturação do molde de ácido nucleico, anelamento do iniciador e extensão dos iniciadores anelados pela ação de uma polimerase termoestável. O processo resulta em amplificação exponencial dos ácidos nucléicos-alvo de Ehrlichia chaffeensis na amostra em teste, possibilitando a detecção de polinucleotídeos-alvos, existentes em concentrações muito baixas em uma amostra.

Ensaios de PCR em tempo real têm como base a detecção de um sinal, por exemplo, sinal repórter fluorescente. Este sinal aumenta em proporção direta à quantidade de produto formado pela PCR em uma reação. A PCR em tempo real é qualquer técnica de amplificação que torna possível monitorar a evolução de duma reação de amplificação em andamento. Consultar, Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection, Perkin Elmer Applied Biosystems (1999); PCR Prtocols (Academic Press New York, 1989). Pelo registro da quantidade de emissão fluorescente em cada ciclo, é possível monitorar a reação de PCR durante a fase exponencial, em que o primeiro aumento significativo na quantidade de produto formado por PCR correlaciona-se com a quantidade inicial de molde-alvo. Quanto maior o número inicial de cópias, tanto mais rápido um aumento significativo em fluorescência é observado.

Uma concretização da invenção provê um método para detecção e/ou quantificação de polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra em teste. Iniciadores sense e iniciadores antissenso podem ser adi cionados a uma amostra em teste, sob condições adequadas para reação em cadeia da polimerase. Os iniciadores hibridizam com polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis, de modo que um produto amplificado é formado se polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis estiverem presentes na amostra em teste. Os produtos amplificados são detectados, e a presença e/ou a quantidade de polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis são determinados. Os produtos amplificados podem ser detectados com uma sonda de polinucleotídeos que hibridiza, sob condições adequadas para reação em cadeia da polimerase, com a sequência de polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis. O produto amplificado pode ser quantificado medindo-se um sinal de detecção emitido pela sonda, e comparando-se o referido sinal de detecção a um segundo sinal de detecção de sonda de um padrão de quantificação. O padrão de quantificação pode ser extraído em paralelo com a amostra em teste.

Métodos de tratamento, de melhora ou de prevenção de uma doença causada por E. chaffensis

Os polipeptídeos, polinucleotídeos e anticorpos da invenção podem ser utilizados para tratar, melhorar ou prevenir uma doença causada por Ehrlichia chaffeensis.

Por exemplo, um anticorpo, como um anticorpo monoclonal da invenção ou fragmentos de ligação a antígenos deste, pode ser administrado a um animal, como um humano ou cachorro. Em uma concretização da invenção, um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígenos é administrado a um animal em uma composição farmacêutica, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou de seus fragmentos de ligação a antígenos. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela eficaz em aliviar os sintomas de infecção por Ehrlichia chaffeensis ou em reduzir a quantidade de organismos E. chaffeensis em um indivíduo.

Os polipeptídeos ou polinucleotídeos da invenção podem estar presentes em uma composição imunogênica e serem utilizados para provocar uma resposta imune em um hospedeiro. Uma composição imunogênica ou imunógeno é capaz de induzir uma resposta imune em um animal. Uma composição imunogênica de polipeptídeos ou polinucleotídeos da invenção é especialmente útil em sensibilizar um sistema imune de um animal, de modo que, como resultado, uma resposta imune é produzida que melhore ou previna o efeito de uma infecção por E. chaffeensis. A indução de resposta imune em modelo animal pode servir para determinar, por exemplo, doses mais adequadas ou vias de administração. A indução de resposta imune pode ser utilizada também para tratar, prevenir ou melhorar uma doença ou infecção causada por E. chaffeensis. Resposta imune inclui respostas imunes humorais ou respostas imunes mediadas por células, ou uma combinação destas. Resposta imune pode compreender também a promoção de uma resposta generalizada do hospedeiro, por exemplo, promovendo a produção de defensinas.

Uma concretização da invenção provê um imunógeno que compreende um polipeptídeo da invenção e uma ou mais regiões ou grupamentos adicionais, ligados covalentemente ao polipeptídeo na carboxila terminal ou amino terminal. Cada região ou grupamento pode, por exemplo, intensificar a resposta imune, facilitar a purificação do imunógeno ou facilitar a estabilidade do polipeptídeo.

A geração, por um animal, de título de anticorpos contra E. chaffeensis pode ser importante para proteger ou eliminar a infecção. A detecção e/ou quantificação de títulos de anticorpos, após liberação de um polipeptídeo ou polinucleotídeo, pode ser utilizada para identificar epítopos, especialmente eficazes em induzir títulos de anticorpos. Epítopos responsáveis por uma resposta forte de anticorpos contra E. chaffeensis podem ser identificados, induzindo anticorpos direcionados contra polipeptídeos de E. chaffeensis de diferentes extensões. Anticorpos induzidos por um epítopo polipeptídico em particular podem ser então testados, empregando, por exemplo, um ensaio ELISA para determinar quais são os polipeptídeos que contêm epítopos mais eficazes em gerar uma resposta forte. Os polipeptídeos ou proteínas de fusão contendo estes epítopos ou polinucleotídeos que codifiquem os epítopos podem ser construídos, em seguida, e utilizados para induzir uma resposta forte de anticorpos.

Um polipeptídeo, polinucleotídeo ou anticorpo da invenção pode ser administrado a um mamífero, como camundongo, coelho, cobaia, macaco, babuíno, chimpanzé, ser humano, vaca, ovelha, porco, cavalo, cachorro, gato, ou a animais como galinhas ou patos, para induzir anticorpos in vivo. A injeção de um polinucleotídeo possui as vantagens práticas de simplicidade de construção e modificação. Ademais, a injeção de um polinucleotídeo resulta na síntese de um polipeptídeo no hospedeiro. Desse modo, o polipeptídeo é apresentado ao sistema imune do hospedeiro com modificações, estrutura e conformação nativas pós-traducionais. Um polinucleotídeo pode ser liberado a um indivíduo em forma de DNA puro.

A administração de um polinucleotídeo, polipeptídeo ou anticorpo pode ocorrer por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo injeção intramuscular, intravenosa, intrapulmonar, intradérmica, intraperitoneal ou subcutânea, aerossol, intranasal, bomba de infusão, supositório, mucosa, tópica e oral, incluindo injeção empregando uma arma biobalística (arma de genes). Um polinucleotídeo, polipeptídeo ou anticorpo pode estar acompanhado por uma proteína transportada para administração oral. Uma combinação de métodos de administração pode ser também utilizada para induzir uma resposta imune. Os anticorpos podem ser administrados em dose diária de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 200 mg. Em uma concretização da invenção, os anticorpos são administrados em dose diária de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 mg.

Veículos e diluentes farmaceuticamente aceitáveis e veículos e diluentes veterinariamente aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica e estão descritos em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mackd Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. (1985)). O veículo não deve por si mesmo induzir a produção de anticorpos nocivos para o hospedeiro. Estes veículos incluem, entre outros, macromoléculas grandes de metabolização lenta, como proteínas, polissacarídeos, como látex funcionalizado SEPHAROSE®, agarose, celulose, partículas de celulose e os semelhantes, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméri cos, como ácido poliglutâmico, polilisina e os semelhantes, copolímeros de aminoácidos, peptoides, lipitoides e partículas virais ou células bacterianas inativas sem virulência. Lipossomos, hidrogéis, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradáveis e bioadesivos podem ser utilizados também como veículo para uma composição da invenção.

Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados também em composições da invenção, por exemplo, sais de minerais, como cloridratos, bromidratos, fosfatos ou sulfatos, bem como sais de ácidos orgânicos, como acetatos, propionatos, malonatos ou benzoatos. Substratos proteicos especialmente úteis são albuminas séricas, hemocianina do molusco keyhole limpet, moléculas de imunoglobulinas, tiroglobulina, ovalbumina, toxoide tetânico e outras proteínas bem conhecidas daqueles versados na técnica. As composições da invenção também podem conter líquidos ou excipientes, como água, solução salina, solução salina com tampão fosfato, soluça de Ringer, solução de Hank, glicose, glicerol, dextrose, malodextrina, etanol ou os semelhantes, isoladamente ou em combinação, bem como substâncias como agentes umectantes, agentes emulsionantes, agentes ajustadores da tonicidade, detergente ou agentes tamponantes do pH. Agentes ativos adicionais, como agentes bactericidas, podem ser utilizados também.

Se desejado, moléculas coestimuladoras, que melhoram a apresentação do imunógeno a linfócitos, como B7-1 ou B7-2, ou citocinas como MIP1a, GM-CSF, IL-2 e IL-12, podem ser incluídas em uma composição da invenção. Opcionalmente, adjuvantes podem ser incluídos também em uma composição. Adjuvantes são substâncias que podem ser utilizadas para aumentar de modo não específico uma resposta imune específica. Geralmente, um adjuvante e um polipeptídeo da invenção misturados antes de sua apresentação ao sistema imune, ou são apresentados separadamente, porém no mesmo sítio do animal. Adjuvantes podem incluir, por exemplo, adjuvantes oleosos (por exemplo, adjuvantes completos e incompletos de Freund), sais minerais (por exemplo, Alk(SO₄)₂, AINa(SO₄)_2> Sílica, Alume, AI(OH)₃ e Ca₃(PO₄)₂), polinucleotídeos (ou seja, ácidos poli IC e poli AU) e certas substâncias naturais (por exemplo, cera D de Mycobacterium tuberculosis, bem como substâncias encontradas em Cornynebacteríum parvum, Bordetella pertussis e membros do gênero Brucella). Adjuvantes que podem ser utilizados incluem, entre outros, MF59-0, hidróxido de alumínio, N-acetil-muramilL-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referida como nor-MD), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-(r-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforilóxi)-etilamina (CGP 19835A, referida como MTP-PE) e RIBI, o qual contém três componentes extraídos de bactérias, monofosforil lipídeo A, dimicolato de trealose e esqueleto da parede celular (MPL + TDM + CWS) em emulsão de esqualeno a 2%/TWEEN® 80 (polissorbato).

As composições da invenção podem ser formuladas em comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, lâminas, formulações injetáveis, enxaguatórios bucais, dentrifícios e os semelhantes. O percentual de um ou mais polipeptídeos, polinucleotídeos ou anticorpos da invenção, nestas composições e preparados, pode variar de 0,1% a 60% do peso unitário.

A administração de polipeptídeos, polinucleotídeos ou anticorpos é capaz de induzir uma resposta imune no animal com duração de pelo menos 1 semana, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano ou mais. Opcionalmente, é possível manter uma resposta imune em um animal aplicando-se uma ou mais injeções de reforço do polipeptídeo, polinucleotídeo ou anticorpos em 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano ou mais após a primeira aplicação. Se desejado, moléculas coestimuladoras ou adjuvantes podem ser também fornecidas antes, após ou junto com as composições.

Uma composição da invenção, compreendendo um polipeptídeo, polinucleotídeo, anticorpo ou uma combinação destes, é administrada em maneira compatível com a composição especificamente utilizada e em quantidade eficaz para induzir uma resposta imune, conforme detectada, por exemplo, por ELISA. Um polinucleotídeo pode ser injetado por via intramuscular em um mamífero, como babuíno, chimpanzé, cachorro ou humano, em dose de 1 ng/kg, 10 ng/kg, 100 ng/kg, 1000 ng/kg, 0,001 mg/kg, 0,1 mg/kg ou 0,5 mg/kg. Um polipeptídeo ou anticorpo pode ser injetado por via intra muscular em um mamífero em dose de 0,01; 0,05; 0,05; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 5 ou 10 mg/kg.

Os polipeptídeos, polinucleotídeos ou anticorpos, ou uma combinação destes, podem ser administrados a um animal que não esteja infectado por E. chaffeensis, ou pode ser administrado a um animal infectado por E. chaffeensis. Quantidade imunologicamente eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz significa a administração daquela quantidade a um indivíduo, seja em dose única ou como parte de uma série, que é eficaz para tratamento, melhora ou prevenção de infecção por E. chaffeensis. As doses específicas de polinucleotídeo, polipeptídeos ou anticorpos em uma composição dependerão de muitos fatores, incluindo, entre outros, a espécie, idade, sexo, medicação concomitante, condição geral do mamífero ao qual a composição é administrada e o modo de administração da composição. Uma quantidade eficaz da composição da invenção pode ser rapidamente determinada com somente experimentação de rotina.

Todas as patentes, pedidos de patentes e outros artigos científicos ou técnicos citados nesta exposição são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. A invenção descrita ilustrativamente nesta exposição pode ser adequadamente posta em prática na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não tenham sido especificamente expostos neste pedido de patente. Desse modo, por exemplo, em cada circunstância em que qualquer um dos termos compreendendo, constituído essencialmente por e constituído por pode ser substituída por qualquer um dos outros dois termos, embora retendo seus significados comuns. Os termos e expressões que foram empregados são utilizados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção de que, no uso destes termos e expressões, sejam excluídos quaisquer equivalentes das características apresentadas e descritas ou de partes destas, porém é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Por conseguinte, deve ser entendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente exposta por concretizações, características opcionais, modificação e variação dos conceitos aqui expostos podem ser escolhidas por aqueles versados na técnica, e que estas modificações e variações são consideradas abrangidas pelo escopo desta invenção, conforme definida pela descrição e as reivindicações anexadas.

Ademais, onde características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos de Markush ou outros agrupamentos de alternativas, aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção é também com isso descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush ou de outro grupo.

Exemplos

Exemplo 1

Placas e protocolos do ensaio ELISA direto

Os polipeptídeos mostrados nas SEQ ID Nos:5 e 6 foram conjugados a BSA, e os conjugados foram revestidos sobre 4 placas IMMULON®. O tampão de revestimento foi carbonato de sódio a 0,05 M, pH 9,6. Com uma pipeta, 100 μΙ/poço de polipeptídeo diluído foram colocados sobre as placas. As placas foram cobertas e incubadas durante a noite a 2°C - 8°C. A solução do polipeptídeo foi aspirada das placas, e as placas foram lavadas 4X com tampão de lavagem HW PetCheck® (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook ME). Foram adicionados 300 μΙ/poço de BSA a 1% em Tris a 0,1 M, pH 7,6, às placas. As placas foram incubadas, cobertas, por 6 horas em temperatura ambiente (RT). A BSA foi aspirada, e 300 μΙ/poço de sacarose a 2,5% em Tris a 0,1 M, pH 7,6, foram adicionados às placas. As placas foram incubadas, cobertas, durante a noite a 2°C - 8°C. A sacarose foi aspirada das placas que foram levemente batidas para retirar o excesso de líquido. As placas foram secas em câmara de vácuo por 4 horas. Foram armazenadas com dessecantes em bolsas plásticas duplas a 2°C - 8°C.

Os polipeptídeos mostrados nas SEQ ID NOs:1 e 2 foram conjugados a HRPO. Polipeptídeo diluído:HRPO foi adicionado a cada poço (100 μΙ/poço), e amostras (limpas) de controle e de soro foram adicionadas (100 μΙ/poço). Um controle positivo para E. chaffeensis foi utilizado junto com um controle negativo. As placas foram batidas levemente e incubadas por 1 hora em RT. As placas foram lavadas 6X com tampão de lavagem HW PetChek®. Foram adicionados 100 μΙ/poço de substrato TMB às poços, e as placas foram incubadas por 10 min. 50 μΙ/poço de solução de parada foram adicionados às poços. Foi efetuada a leitura das placas a A650. O limite de corte negativo foi determinado como 2 χ o valor de O.D. do controle negativo. Exemplo 2

Placas e protocolos do ensaio ELISA indireto

Os polipeptídeos mostrados nas SEQ ID NOs:4, 5 e 6 foram revestidos sobre placas Immulon® 1. O tampão de revestimento foi carbonato de sódio a 0,05 M, pH 9,6. Foram adicionados 100 μΙ/poço de peptídeo diluído às placas, e as placas foram incubadas, cobertas, durante a noite em temperatura ambiente (RT). Os polipeptídeos foram aspirados e as placas, lavadas 2X com tampão de lavagem HW PetChek®. Foram adicionados 200 μΙ/poço de polipeptídeo de TWEEN® 2% (polissorbato) 20/sacarose a 2,5% em Tris a 0,1 M, pH 7,6, aos poços, e as placas foram incubadas, cobertas, por 2 horas em TA. A solução de bloqueio foi aspirada e as placas, levemente batidas para retirar o excesso de líquido. As placas foram secas em bolsas tipo mylar durante a noite em RT, com 2 (27 g) dessecantes/6 placas. As placas foram armazenadas a 2°C d- 8°C.

Amostras diluídas de controle e de soro foram introduzidas com pipetas nos poços em 100 μΙ/poço. Um controle positivo para E. chaffeensis foi utilizado junto com um controle negativo. As placas foram incubadas por 30 min. em RT. Foram lavadas 5X com solução de lavagem HW PetChek®. Foram adicionados 50 μΙ/poço de substrato TMB às placas que foram incubadas por 10 min. 50 μΙ/poço de solução de parada foram adicionados. Foi efetuada a leitura das placas a A650. O limite de corte negativo foi determinado como 2xo valor de O.D. do controle negativo.

As condições finais mais adequadas das placas, para os formatos de ensaio indireto (a espécie) e direto (Ag:Ag), são apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1.

Analito	Peptídeo	Formato de ensaio indireto	Formato de ensaio direto
		Revestimento [pg/ml]	Diluição da amostra	Diluição do conjugado	Revestimento [pg/ml]	Conjugado [pg/ml]
E. chaffensis	VLPT-1	1,0	1:50	1:1000	1,0	0,5
E. chaffensis	VLPT-R	0,15	1:100	1:1000	na	na

Exemplo 3

Ensaios de polipeptídeos VLPT

VLPT-1 (SEQ ID NO: 5) e VLPT-2 (SEQ ID NO: 6) foram utiliza5 dos em ensaio indireto, conforme descrito acima, para detectar infecção por

E. chaffeensis em cachorros infectados e não infectados por E. chaffeensis.

As amostras positivas (designadas por (+)), na Tabela 2, foram amostras coletadas em campo que eram positivas para E. chaffeensis, porém negativas para E. canis. A diluição da amostra foi de 1:1000, e a diluição do anti10 corpo anticachorro de coelho foi de 1:2000. Os resultados são apresentados na Tabela 2. VLPT-1 e VLPT-2 detectaram E. chaffensis com exatidão no controle positivo, e não forneceram resultados positivos para as amostras negativas e o controle negativo. VLPT-1 forneceu resultado positivo em 6 das 7 amostras positivas. VLPT-2 forneceu resultado positivo em 5 das 7 15 amostras positivas.

Tabela 2.

	Amostra	0,25	VLPT-1 0,5	1	0,25	VLPT-2 0,5	1
CP	21349M	0,628	0,669	0,765	0,157	0,193	0,176
CN	21172M	0,038	0,034	0,036	0,034	0,040	0,039
	21802F	0,212	0,286	0,352	0,261	0,305	0,314
	22110F	0,162	0,210	0,200	0,044	0,063	0,053
	21565F	0,340	0,522	0,597	0,068	0,096	0,064
(+)	21553F	0,123	0,160	0,182	0,111	0,155	0,132
	22043F	0,063	0,075	0,078	0,037	0,040	0,038
	22130F	0,200	0,250	0,275	0,089	0,115	0,109
	22438M	0,433	0,656	0,765	0,141	0,165	0,187

	Amostra	0,25	VLPT-1 0,5	1	VLPT-2
0,25	0,5	1
	0349M	0,039	0,039	0,036	0,038	0,046	0,045
(-)	20934F	0,047	0,047	0,042	0,042	0,050	0,051
	21608F	0,041	0,042	0,040	0,046	0,044	0,041

VLPT-1 (SEQ ID NO: 5) e VLPT-2 (SEQ ID NO: 6) foram utilizados em um ensaio direto, conforme descrito acima, para detectar infecção por E. chaffeensis em cachorros infectados e não infectados por E. chaffeensis. As amostras positivas (designadas por (+)), na Tabela 3, foram a5 mostras coletadas em campo que eram positivas para E. chaffeensis, porém negativas para E. canis. As placas foram revestidas em 0,5 e 1,0 pg/ml, o polipeptídeo:HRPO foi testado em 0,5 e 1,0 pg/ml. Os resultados são apresentados na Tabela 3. VLPT-1 e VLPT-2 detectaram E. chaffensis com exatidão no controle positivo, e não forneceram resultados positivos para as 10 amostras negativas e o controle negativo. Tanto o VLPT-1 como o VLPT-2 forneceram resultado positivo em 6 das 6 amostras positivas.

Tabela 3.

	[Conj.] Amostra	VLPT-1	VLPT-2
0,5	1	0,5	1
0,5	1	0,5	1	0,5	1	0,5	1
CP	21349M	3,404	3,675	2,641	3,093	2,247	2,340	1,973	1,648
CN	21172M	0,038	0,041	0,049	0,046	0,040	0,043	0,049	0,043
	1177:21 A	0,419	0,528	0,363	0,463	1,300	1,438	1,322	1,077
	1177:63D	3,222	3,560	3,080	3,262	1,901	2,205	1,960	1,653
(+)	22438M	1,893	2,049	1,697	1,843	1,152	1,486	1,154	1,311
22110F	0,588	0,691	0,545	0,583	0,108	0,121	0,105	0,117
	21846F	0,263	0,301	0,244	0,282	0,433	0,426	0,357	0,337
	22130F	0,372	0,463	0,381	0,391	0,425	0,486	0,403	0,385
(-)	3818:57B	0,042	0,042	0,063	0,053	0,038	0,041	0,048	0,044
3818:58H	0,035	0,041	0,051	0,049	0,037	0,038	0,036	0,037

VLPT-1 (SEQ ID NO: 5) foi utilizado em um ensaio direto, conforme descrito acima, para testar amostras de cachorros vacinados contra E.

canis. Este ensaio foi realizado para determinar se VLPT-1 fornecería resultado positivo em cachorros vacinados contra E. canis. As amostras em teste foram coletadas de cachorros após a aplicação do segundo reforço da vacina. As placas foram revestidas em 1,0 pg/ml, o polipeptídeo:HRPO foi utilizado em concentração de 0,5 pg/ml. O ensaio SNAP® 4Dx® foi utilizado para mostrar que uma resposta de anticorpo anti-E-canis foi induzida nos cachor5 ros vacinados. Este ensaio investiga a presença de antígeno de verme do coração, anticorpo contra Ehrlichia canis, anticorpo contra Borrelia burgdorferi e anticorpo contra Anaplasma phagocytophilum. Os resultados são apresentados na Tabela 4. Resultados positivos para anticorpo contra E. canis, no teste SNAP® 4Dx® indicam que uma resposta de anticorpos foi induzida 10 após a vacina. VLPT-1 não fornece resultado positivo quando testado com amostras de cachorros vacinados contra E. canis em ensaios diretos. Portanto, VLPT-1 (SEQ ID NO;5) é específico para infecção por E. chaffeensis e não reage com soros de cachorros vacinados contra E. canis.

Tabela 4.

	SNAP® 4Dx® para Ab contra E.	canis
	Amostra	Sinal mínimo de fundo	VLPT-1 direto
CVYDEH Ribi	Dia 70 Dia 105 Dia 112 Dia 126	N 0,07 (vw+) 0,17 0,18	0,039 0,045 0,036 0,0,5
	Dia 70	0,08	0,036
CWMBDC	Dia 105	0,45	0,036
Ribi	Dia 112	0,40	0,037
	Dia 126	0,30	0,039
	Dia 70	N	0,035
CVXCSM	Dia 105	N	0,037
Ribi	Dia 112	0,14	0,035
	Dia 126	0,23	0,034

	SNAP® 4Dx® para Ab contra E.	canis
	Amostra	Sinal mínimo de fundo	VLPT-1 direto
	Dia 70	0,07 (vw+)	0,035
CWMAXK
	Dia 105	0,26	0,035
Hibi + BCG
	Dia 112	0,36	0,035
	Dia 126	0,34	0,035
	Dia 70	0,10 (w+)	0,034
CVSCVA
	Dia 105	0,51	0,037
Ribi + BCG
	Dia 112	0,45	0,040
	Dia 126	0,47	0,036
	Dia 70	N	0,035
CVXCAP	Dia 105	0,51	0,034
Ribi + BCG	Dia 112	0,42	0,037
	Dia 126	0,48	0,035

VLPT-1 (SEQ ID NO: 5) e VPLT-R (SEQ ID NO: 4, na qual ο X na posição 112 é P) foram utilizados em ensaio indireto, conforme descrito acima, para testar experimentalmente amostras de cachorros infectados por E. canis. Este ensaio foi conduzido para determinar se VLPT-1 e VLPT-R 5 forneceríam resultado positivo em cachorros infectados por E. canis. As placas foram revestidas em 0,15 pg/ml (VLPT-R) e 1 pg/ml (VLPT-1). A diluição da amostra foi de 1:10, para VLPT-R, e de 1:50 para VLPT-1. O conjugado anti-cachorro:HRPO de coelho foi utilizado em diluição de 1:1000. Os resultados são apresentados na Tabela 5.

Tabela 5.

	Amostra	Placa (A650)
VLPT-R	VLPT-1
(CP)	1177:21 A	2,298	0,379
21172M	0,046	0,048
(CN)
Corte	0,092	0,096
E1	d3	0,046	0,044

	Amostra	Placa (A650)
VLPT-R	VLPT-1
	d21	0,047	0,046
	d35	0,061	0,063
	d3	0,054	0,040
E2	d21	0,105	0,059
	d35	0,217	0,056
	d3	0,060	0,044
E3	d21	0,065	0,043
	d35	0,072	0,052
	d3	0,066	0,047
E4	d21	0,051	0,049
	d35	0,064	0,035
	d3	0,046	0,042
E5	d21	0,057	0,038
	d35	0,057	0,040
	d3	0,049	0,045
E6	d21	0,046	0,075
	d35	0,083	0,111

Em geral, VLPT-1 (SEQ ID NO: 5) e VLPT-R (SEQ ID NO: 4, na qual ο X na posição 112 é P) não fornecem resultado positivo quando testados com amostras de cachorros infectados por E. canis. No entanto, o VLPT-R e o VLPT-1 mostram uma amostra única que exibem níveis ligeira5 mente aumentados em instantes ampliados de tempo. Contudo, estes sinais positivos foram fracos, comparado ao controle positivo, e não aumentaram com o tempo após a vacinação, conforme seria esperado se estivesse ocorrendo uma verdadeira reação cruzada com E. canis. Por conseguinte, VLPT1 e VLPT-R são específicos para E. chaffeensis e não para E. canis.

VLPT-1 (SEQ ID NO: 5) e VLPT-R (SEQ ID NO: 4, na qual ο X na posição 112 é P) foram utilizados em um ensaio direto para testar o soro de cachorros infectados experimentalmente com E. chaffeensis, em vários instantes após a infecção. As placas foram revestidas em 0,15 pg/ml, para

VLPT-R, e em 1 pg/ml para VLPT-1. A diluição da amostra, para VLPT-R, foi de 1:100 e de 1:50 para VLPT-1. O anti-cachorro:HRPO de coelho foi utilizado em diluição de 1:1000. Os resultados são apresentados na Tabela 6 e nas Figuras 1A e 1B. O VLPT-R e o VLPT-1 foram capazes de detectar anti5 corpos contra E. chaffeensis pelo menos em 7 dias após a infecção.

Tabela 6.

	Amostra	VLPT-R	VLPT-1
A650	Resultado	A650	Resultado
	Pré-sangria	0,034	N	0,78	N
	Dia 7	0,562	+	0,482	+
	Dia 14	1,436	+	0,989	+
	Dia 21	1,192	+	0,926	+
	Dia 28	1,018	+	0,951	+
	Dia 35	0,782	+	0,594	+
CTUALJ	Dia 42	0,559	+	0,779	+
	Dia 49	0,449	+	0,897	+
	Dia 56	0,422	+	0,743	+
	Dia 63	0,225	+	0,619	+
	Dia 77	0,497	+	0,285	+
	Dia 96	1,470	+	1,318	+
	Pré-sangria	0,044	N	0,044	N
	Dia 7	0,113	+	0,163	+
	Dia 14	0,292	+	0,293	+
	Dia 21	0,717	+	0,562	+
	Dia 28	0,721	+	0,665	+
CURALIN	Dia 35	0,509	+	0,559	+
	Dia 42	0,437	+	0,510	+
	Dia 49	0,403	+	0,448	+
	Dia 63	0,452	+	0,601	+
	Dia 82	1,117	+	1,305	+

VLPT-1 foi utilizado em ensaios diretos para testar amostras de soro positivas e negativas coletadas em campo de cachorros em um local do

Arizona onde E.canis é encontrado, porém E. chaffeensis é ausente. As placas foram revestidas em 1 pg/ml, e o peptídeo/HRPO foi utilizado em concentração de 0,5 pg/ml. Os resultados são apresentados na Tabela 7. VLPT1 não exibiu resultados positivos, para as amostras positivas para E. canis, 5 ou as negativas para E. canis. Portanto, VLPT-1 é específico para anticorpos contra E. chaffeensis, e não é específico para anticorpos contra E. canis.

Tabela 7.

Amostras positivas: Amostras negativas:

Amostra	VLPT A650	-1 Ech Resultado	Amostra	VLPT- A650	1 Ech Resultado
HP-300	0,028	N	HP-302	0,051	N
HP-301	0,030	N	HP-303	0,030	N
HP-307	0,039	N	HP-304	0,030	N
HP-315	0,030	N	HP-305	0,033	N
HP-317	0,031	N	HP-306	0,039	N
HP-319	0,034	N	HP-308	0,034	N
HP-322	0,040	N	HP-309	0,038	N
HP-326	0,032	N	HP-310	0,034	N
HP-330	0,034	N	HP-311	0,034	N
HP-331	0,033	N	HP-312	0,035	N
HP-332	0,034	N	HP-313	0,033	N
HP-333	0,036	N	HP-314	0,033	N
HP-336	0,031	N	HP-316	0,032	N
HP-342	0,034	N	HP-318	0,030	N
HP-344	0,034	N	PH-320	0,035	N
HP-349	0,037	N	HP-321	0,038	N
HP-350	0,035	N	HP-323	0,035	N
HP-354	0,037	N	HP-324	0,037	N
HP-356	0,036	N	HP-325	0,037	N
HP-357	0,040	N	HP-28	0,034	N
HP-358	0,038	N	HP-329	0,034	N
HP-361	0,034	N	HP-334	0,037	N

Amostras positivas: Amostras negativas:

Amostra	VLP7 A650	’-1 Ech Resultado	Amostra	VLPT- A650	1 Ech Resultado
HP-362	0,036	N	HP-338	0,032	N
HP-363	0,034	N	HP-339	0,038	N
HP-365	0,034	N	HP-340	0,034	N
HP-366	0,037	N	HP-341	0,045	N
HP-367	0,037	N	HP-343	0,035	N
HP-368	0,037	N	HP-345	0,037	N
HP-370	0,036	N	HP-346	0,036	N
			HP-347	0,035	N
			HP-348	0,038	N
			HP-351	0,041	N
			HP-352	0,036	N
			HP-353	0,034	N
			HP-359	0,037	N
			HP-360	0,038	N
			HP-364	0,036	N
			HP-369	0,09	N

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Polipeptídeo purificado, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) SEQ ID NO: 3, em que o polipeptídio consiste em menos de aproximadamente 50 aminoácidos contíguos presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis;

   (b) SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídio consiste em menos de aproximadamente 50 aminoácidos contíguos presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis;

   (c) SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídio consiste em menos de aproximadamente 50 aminoácidos contíguos presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis;

   em que o polipeptídio purificado é ligado a um reagente indicador, um espaçador de aminoácido, um ligante de aminoácido, uma sequência de sinalização, sequência de parada de transferência, domínios transmembranas, um ligante de purificação de proteínas, um polipeptídio heterólogo, um ou mais polipeptídios adicionais compreendendo SEQ ID Nos:

   1,2, 3, 4, 5, 6 ou combinações das mesmas.
2. 2. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídio purificado de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Polipeptídio purificado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio é constituído pela SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 1.
4. 4. Polipeptídio purificado, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) SEQ ID NO:3, em que o polipeptídio consiste em menos que cerca de 50 aminoácidos contíguos presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis;

   (b) SEQ ID NO:2, em que o polipeptídio consiste em menos que cerca de 50 aminoácidos contíguos presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis;

   (c) SEQ ID NO:1, em que o polipeptídio consiste em menos que

   Petição 870180056251, de 29/06/2018, pág. 11/20 cerca de 50 aminoácidos contíguos presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis;

   em que o polipeptídio purificado compreende um ou mais resíduos de aminoácido C no grupo amino terminal ou grupo carbóxi terminal ou em ambos os grupos terminais do polipeptídio.
5. 5. Método de detecção de anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídio do Ehrlichia chaffeensis em uma amostra em teste, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) o contato de um polipeptídio purificado, compreendendo a SEQ ID NO:

   1,2, 3, 5 ou 6, com a amostra em teste, sob condições que permitam a formação de complexos polipeptídio/anticorpo; em que o polipeptídeo purificado é constituído por menos de aproximadamente 50 aminoácidos contíguos presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis;

   (b) a detecção dos complexos polipeptídio/anticorpo;

   em que a detecção dos complexos polipeptídio/anticorpo é indicativa de que anticorpos específicos contra Ehrlichia chaffeensis estão presentes na amostra em teste, e em que a ausência dos complexos polipeptídio/anticorpo é indicativa de que anticorpos específicos contra Ehrlichia chaffeensis não estão presentes na amostra em teste.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que ainda compreende contatar os complexos da etapa (a) com um reagente indicador principal ao desempenho da etapa (b).
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio purificado é constituído pela SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5 e em que o método não detecta anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídio do Ehrlichia canis.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a quantidade de anticorpo na amostra em teste é determinada.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio purificado é preso a um substrato.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo

    Petição 870180056251, de 29/06/2018, pág. 12/20 fato de que o polipeptídio purificado é unido a um reagente indicador, um espaçador aminoácido, uma sequência de sinalização, uma sequência de parada de transferência, um domínio transmembrana, uma proteína ligante de purificação, uma proteína heteróloga, um ou mais polipeptídios adicionais compreendendo as SEQ ID NOS:1,2, 3, 4, 5, 6 ou uma combinação destas.
11. 11. Método de detecção de infecção por Ehrlichia chaffeensis em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:

    (a) a obtenção de uma amostra biológica do indivíduo;

    (b) o contato de um polipeptídio purificado, compreendendo as SEQ ID NO:

    1,2, 3, 5 ou 6, com a amostra biológica, sob condições que permitam a formação de complexos polipeptídio/anticorpo; em que o polipeptídio purificado é constituído por menos de aproximadamente 50 aminoácidos contíguos presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis;

    (c) a detecção dos complexos polipeptídio/anticorpo;

    em que a detecção dos complexos polipeptídio/anticorpo é indicativa de que o indivíduo apresenta infecção por Ehrlichia chaffeensis e em que a ausência dos complexos polipeptídio/anticorpo é um indicador de que o indivíduo não apresenta infecção por Ehrlichia chaffeensis.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio purificado é SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5 e em que o método não detecta infecção por Ehrlichia canis no indivíduo.
13. 13. Polipeptídio purificado, caracterizado pelo fato de que compreende:

    (a) SEQ ID NO: 3, em que o polipeptídio consiste em menos que cerca de 50 aminoácidos contíguos presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis;

    (b) SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídio consiste em menos que cerca de 50 aminoácidos contíguos presentes naturalmente no Ehrlichia chaffeensis;

    (c) SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídio consiste em menos que cerca de 50 aminoácidos contíguos presentes naturalmente no Ehrlichia

    Petição 870180056251, de 29/06/2018, pág. 13/20 chaffeensis;

    em que o polipeptidio purificado é anexado a um substrato.

    Petição 870180056251, de 29/06/2018, pág. 14/20

    1/1

    Estudo de infecção por E. chaffeensis CTUALJ canino

    E3 Proteína-r □ Peptídeo