CN101970463A - 用于检测恰菲埃里希氏体(vlpt)的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于恰菲埃里希氏体的检测的方法和组合物。

Description

用于检测恰菲埃里希氏体(VLPT)的方法和组合物
优先权
本申请要求2007年9月21日提交的U.S.Ser.No.60/974,196的权益，通过完全引用将其合并在此。
发明背景
埃里希氏体属是感染哺乳动物宿主中的循环淋巴细胞的专性细胞内的病原体。犬埃里希氏体(Ehrlichia canis)和恰菲埃里希氏体(Ehrlichia chaffeensis)是感染犬和人类的同一亚属组的成员，可以各自分别引起犬单核细胞埃里希氏体病(CME)和人类单核细胞埃里希氏体病(HME)。犬疾病的特征在于发烧、淋巴结病、体重损失和全血细胞减少。在人类中，疾病的特征在于发烧、头痛、mylagia和白血球减少。早期检测和治疗对于治疗犬和人类埃里希氏体病都是重要的。
间接的免疫荧光分析(IFA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)经常用作这些疾病的诊断中的辅助。这些分析测量或检测来自患者的血液、血浆或血清的抗埃里希氏体属抗体与受感染细胞、细胞溶胞产物或纯化的埃里希氏体属蛋白质的结合。然而，用于检测抗恰菲埃里希氏体抗体或其片段的许多分析在有用性方面是严重受限的，因为直接与这些测试中使用的埃里希氏体属抗原的不纯性质相关的敏感性和特异性问题。另外，对犬埃里希氏体接种的动物由于免疫交叉反应在测试恰菲埃里希氏体时显示阳性结果。需要高度纯化的、特异性的试剂来构建更精确的分析。
发明概述
本发明的一个实施方式提供了包含SEQ ID NO：3的纯化的多肽，其中所述多肽由少于约50个连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成；包含SEQ ID NO：2的纯化的多肽，其中所述多肽由少于约50个连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成；包含SEQ IDNO：1的纯化的多肽，其中所述多肽由少于约50个连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成。所述纯化的多肽可以由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1组成。本发明还提供了编码本发明的纯化的多肽的分离的多核苷酸。
本发明的纯化的多肽可以连接到指示物试剂、氨基酸间隔区、氨基酸接头、信号序列、终止转移序列、跨膜结构域、蛋白质纯化配体、异源多肽、包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6的一个或更多个另外的多肽，或其组合。本发明的纯化的多肽可以在多肽的氨基末端或羧基末端或两个末端包含一个或更多个C氨基酸残基。
本发明的另一个实施方式提供了检测特异性结合测试样品中的恰菲埃里希氏体多肽的抗体的方法。所述方法包括在容许多肽/抗体复合物形成的条件下使包含SEQ ID NO：1、2、3、5或6的纯化的多肽与所述测试样品接触；其中所述纯化的多肽由少于约50个连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成；和检测所述多肽/抗体复合物。所述多肽/抗体复合物的检出是所述测试样品中存在特异于恰菲埃里希氏体的抗体的指示，没有所述多肽/抗体复合物是所述测试样品中不存在特异于恰菲埃里希氏体的抗体的指示。所述复合物可以在进行检测步骤之前接触指示物试剂。在本发明的一个实施方式中，所述纯化的多肽是SEQ ID NO：1-3、5或6，所述方法不检测特异性结合犬埃里希氏体多肽的抗体。可以测定测试样品中抗体的量。纯化的多肽可以附着到基质上。纯化的多肽可以连接到指示物试剂、氨基酸间隔区、氨基酸接头、信号序列、终止转移序列、跨膜结构域、蛋白质纯化配体、异源蛋白质、包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的一个或更多个另外的多肽，或其组合。
本发明的再另一个实施方式提供了检测受试者中恰菲埃里希氏体感染的方法。所述方法包括从所述受试者获得生物样品；在容许多肽/抗体复合物形成的条件下使包含SEQ ID NO：1、2、3、5或6的纯化的多肽与所述生物样品接触；其中所述纯化的多肽由少于约50个连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成；和检测所述多肽/抗体复合物。所述多肽/抗体复合物的检出是所述受试者具有恰菲埃里希氏体感染的指示，没有所述多肽/抗体复合物是所述受试者没有恰菲埃里希氏体感染的指示。在本发明的一个实施方式中，所述纯化的多肽是SEQ ID NO：1、2、3、5或6，所述方法不检测所述受试者中的犬埃里希氏体感染。
本发明的另一个实施方式提供了特异性结合由SEQ ID NO：1、2、3、5或6组成的多肽的抗体。所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、抗原结合抗体片段或单链抗体。
本发明的又一个实施方式提供了检测样品中的恰菲埃里希氏体多肽的方法。所述方法包括在容许多肽/抗体复合物形成的条件下使特异性结合由SEQ ID NO：1、2、3、5或6组成的多肽的抗体与样品接触；和检测所述多肽/抗体复合物。所述多肽/抗体复合物的检出是恰菲埃里希氏体多肽存在于所述样品中的指示，没有所述多肽/抗体复合物是恰菲埃里希氏体多肽不存在于所述样品中的指示。在本发明的一个实施方式中，所述纯化的多肽可以是SEQ ID NO：1、2、3、5或6，所述方法不检测所述样品中的埃里希氏体属多肽。所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、抗原结合抗体片段或单链抗体。所述抗体可以附着到基质上。
因而，本发明提供了用于恰菲埃里希氏体的检测的组合物和方法。
附图的简要描述
附图1A和1B显示了实验上用恰菲埃里希氏体感染的狗的血清分析的结果。VLPT-1(SEQ ID NO：5)(在附图中显示为“肽”)和VLPT-R(SEQ ID NO：4，其中在位置112的X是P)(在附图中显示为“r-蛋白质”)不迟于感染后第7天都能够检测恰菲埃里希氏体抗体。
发明的详细说明
恰菲埃里希氏体多肽
如在此使用的，单数形式“一”、和“该”包括复数的对象，除非上下文中明确地另外指示。
多肽是通过酰胺键共价连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。多肽可以被翻译后修饰。纯化的多肽是基本上没有细胞材料、其他类型的多肽、化学物质前体、多肽的合成中使用的化学物质、或其组合的多肽制品。基本上没有细胞材料、培养基、化学物质前体、用于多肽合成的化学物质等的多肽制品具有低于约30％、20％、10％、5％、1％或更低的其他多肽、培养基、化学物质前体和/或用于合成的其他化学物质。因而，纯化的多肽是大约70％、80％、90％、95％、99％或更纯的。纯化的多肽不包括低于70％纯度的未纯化的或半纯化的细胞提取物或多肽的混合物。
术语“多肽”可以指一个或更多个一种类型的多肽(一组多肽)。“多肽”还可以指两种或更多种不同类型多肽的混合物(多肽的混合物)。术语“多肽(单数或复数)”也可以各自指“一种或更多种多肽”。
本发明的一个实施方式提供了如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中所示的纯化的恰菲埃里希氏体多肽。
XSDLHXXXXVELXXPSKEEVQXEXDXXXXXX    SEQ ID NO：1
DSDLHGXFSVELFDPSKEEVQLESDLQQSSN    SEQ ID
NO：2
NSDLHEXSFVELPGPSKEEVQFEDDAKNVVY    SEQ ID NO：3
对于所有序列，X代表任何氨基酸。在本发明的一个实施方式中，在SEQ ID NO：1中，位置1的X是D或N，位置6的X是G或E、位置7的X是P或S、位置8的X是F或S、位置9的X是S或F、位置13的X是F或P、位置14的X是D或G、位置22的X是L或F、位置24的X是S或D、位置26的X是L或A、位置27的X是Q或K、位置28的X是Q或N、位置29的X是S或V、位置30的X是S或V、位置31的X是N或Y。对于SEQ ID NO：2和3，位置7的X可以是P或S。SEQ ID NO：1-3的每一个可以具有N-末端C残基。做为选择，N-末端C残基可以是没有的。多肽VLPT-1是具有氨基末端C残基的SEQ ID NO：2(即，CDSDLHGPFSVELFDPSKEEVQLESDLQQSSN；SEQ ID NO：5)。多肽VLPT-2是具有氨基末端C残基的SEQ ID NO：3(即，CNSDLHESSFVELPGPSKEEVQFEDDAKNVVY；SEQ ID NO：6)。
本发明的另一个实施方式包含纯化的多肽，所述多肽包含SEQ IDNO：4：
MSQFSEDNIG NIQMPFSNLQ ESSHLELPSL SEKVIHLESG LQQSSDSDSH EPSHLELPSL 60
SEEVIQLESD LQQSSNSDLH GSFSVELFDP FKEAVQLGND LQQSSDSDLH GXFSVELFDP 120
SKEEVQLESD LQQSSNSDLH ESSFVELPGP SKEEVQFEDD AKNVVYGQDH VSLSELG    177
位置112的X可以是P或S。
一个实施方式提供了包含SEQ ID NO：1-6的纯化的多肽，其中所述多肽由低于约175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、35、34、33、32或31个(或约31和约175之间的任何范围)连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成。在本发明的一个实施方式中，纯化的多肽由超过约31、32、33、34、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150或175个(或约31和约175之间的任何范围)连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成(即，所述纯化的多肽不包含完整的天然存在的恰菲埃里希氏体VLPT多肽)。天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸是由恰菲埃里希氏体生物体天然地产生的任何多肽。也就是说，纯化的多肽包含SEQ ID NO：1-6中显示的多肽，但是由少于约175、150、125、100、90、80、70、60、50、40或35个连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成。
多肽SEQ ID NO：1-3和5-6小于全长恰菲埃里希氏体多肽VPLT的事实是重要的，因为更小的多肽可以具有比全长多肽分析的更大的特异性和/或敏感性。另外，这些更小的多肽可能是制造上更便宜的，可以以比全长多肽更大的纯度获得。
本发明的一个实施方式提供了少于约175、150、125、100、90、80、70、60、50、40或35个连续的天然恰菲埃里希氏体氨基酸和SEQID NO：1-6的大于约10、20、25或30个连续氨基酸的纯化的多肽。
本发明的一个实施方式提供了包含SEQ ID NO：1-6的至少约10、20、25、30、35、40、50或更多个连续的氨基酸的纯化的多肽。因而，本发明的多肽的长度可以是，例如，约35到约40；约35到约50；约35到约100；或约35到约150个氨基酸。在本发明的一个实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO：4的约氨基酸残基120到约氨基酸残基177；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基130到约氨基酸残基170；或SEQ ID NO：4的约氨基酸残基135到约168。
变体多肽至少约80％、或约81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98约或99％相同于SEQ ID NO：1-6中所示的多肽序列，并且也是本发明的多肽。例如，SEQ ID NO：1-3的变体多肽可以是约至少97％(约1个氨基酸变化)、94％(约2个氨基酸变化)、90％(约3个氨基酸变化)、87％(约4个氨基酸变化)、84％(约5个氨基酸变化)或81％(约6个氨基酸变化)相同于SEQ ID NO：1-3。SEQ ID NO：5-6的变体多肽可以是约至少97％(约1个氨基酸变化)、94％(约2个氨基酸变化)、91％(约3个氨基酸变化)、88％(约4个氨基酸变化)、84％(约5个氨基酸变化)或81％(约6个氨基酸变化)相同于SEQ ID NO：5-6。变体多肽具有一个或更多个保守的氨基酸变异或其他较小的修饰，并保持了生物学活性，即，是生物学功能等效物。生物学活性等效物当与相应的野生型多肽比较时，具有基本上相等的功能。在本发明的一个实施方式中，多肽具有约1、2、3、4、5、10、20、30、40、50个或更少的保守性氨基酸替换。
序列同一性百分比具有本领域公认的含义，存在着许多方法来测量两个多肽或多核苷酸序列之间的同一性。参见，例如Lesk，Ed.，Computational Molecular Biology，Oxford University Press，New York，(1988)；Smith，Ed.，Biocomputing：Informatics And Genome Projects，Academic Press，New York，(1993)；Griffin & Griffin，Eds.，ComputerAnalysis Of Sequence Data，Part I，Humana Press，New Jersey，(1994)；von Heinje，Sequence Analysis In Molecular Biology，Academic Press，(1987)；和Gribskov & Devereux，Eds.，Sequence Analysis Primer，MStockton Press，New York，(1991)。比对多核苷酸或多肽的方法被编码在计算机程序中，包括GCG程序包(Devereux et al.，Nuc.Acids Res.12：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul et al，J.Molec.Biol.215：403(1990))和Bestfit程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)其使用了Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.App.Math，2：482-489(1981))。例如，可以使用采用了FASTA算法的计算机程序ALIGN，使用缺口开放罚分-12和缺口延伸罚分-2的仿射(affine)缺口搜索。
当利用任何序列比对程序来确定特定的序列是否例如约95％相同于参考序列时，设置参数从而同一性的百分比在参考多核苷酸的全长上计算，以及在同一性方面容许最多5％的参考多核苷酸的核苷酸总数的缺口。
变体多肽一般通过修饰本发明的多肽序列之一、评估修饰的多肽的性质来确定它是否是生物学等效的来鉴定。如果变体在分析例如免疫组织化学分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫酶分析或Western印迹分析中与本发明的多肽基本上相同地起作用，例如，具有原始多肽的90-110％的活性，变体是生物学等效的。在一个实施方式中，分析是竞争分析，其中该生物学等效的多肽能够降低本发明的多肽与相应的反应性抗原或抗体的结合约80、95、99或100％。特异性结合相应的野生型多肽的抗体也特异性结合变体多肽。
保守性替换是其中氨基酸替换具有相似性质的另一个氨基酸的替换，从而肽化学领域的技术人员将预计多肽的二级结构和亲水性质基本上不变。一般地，以下组的氨基酸代表了保守的改变：(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)cys，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。
本发明的多肽可以进一步包含信号(或前导区)序列，其在翻译同时地或翻译后地指导蛋白质的转移。多肽还可以包含便于多肽的合成、纯化或鉴定(例如，聚-His)、或增强多肽与固相支持物的结合的接头或其他序列。例如，多肽可以缀合到免疫球蛋白Fc区域或牛血清白蛋白。
多肽可以共价地或非共价地连接到氨基酸序列，所述氨基酸序列是所述多肽在自然中通常不相关的，即，异源氨基酸序列。异源氨基酸序列可以来自非恰菲埃里希氏体生物体、合成的序列或通常不位于本发明的多肽的羧基或氨基末端的恰菲埃里希氏体序列。另外，多肽可以共价地或非共价地连接到氨基酸以外的化合物或分子，例如指示物试剂。多肽可以共价地或非共价地连接到氨基酸间隔区、氨基酸接头、信号序列、终止转移序列、跨膜结构域、蛋白质纯化配体或其组合。多肽可以连接到增强免疫反应(例如，细胞因子，如IL-2)的部分(即，可以是多肽或其他化合物的官能团)、便于纯化的部分(例如，亲和标签，如六-组氨酸标签、trpE、谷胱甘肽、麦芽糖结合蛋白)或促进多肽的稳定性的部分(例如，聚乙二醇；氨基末端保护基团例如乙酰基、丙基、琥珀酰基、苯甲基、苯甲氧羰基或t-丁氧基羰基；羧基末端保护基团，例如，酰胺、甲酰胺和乙酰胺)。在本发明的一个实施方式中，蛋白质纯化配体可以是处在例如本发明的多肽的氨基末端或羧基末端或两个末端的一个或更多个C氨基酸残基。氨基酸间隔区是在自然中与本发明的多肽不相关的氨基酸序列。氨基酸间隔区可以包含约1、5、10、20、100或1000个氨基酸。
如果希望，本发明的多肽可以是融合蛋白的部分，所述融合蛋白含有其他氨基酸序列，例如，氨基酸接头、氨基酸间隔区、信号序列、TMR终止转移序列、跨膜结构域，以及在蛋白质纯化中有用的配体，例如，谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签和葡萄球菌属蛋白A。本发明的超过一种多肽可以存在于本发明的融合蛋白中。本发明的多肽可以可操作连接非恰菲埃里希氏体蛋白质或非恰菲埃里希氏体VLPT蛋白质来形成融合蛋白。本发明的融合蛋白可以包含本发明的一个或更多个恰菲埃里希氏体多肽、其片段或其组合。融合蛋白不在自然中存在。术语“可操作连接的”是指本发明的多肽和其他多肽按阅读框相互融合到本发明的多肽的N-末端或C-末端。
本发明的多肽可以处于多聚的形式。也就是说，多肽可以包含本发明的恰菲埃里希氏体多肽的一个或更多个拷贝或其组合。多聚的多肽可以是多抗原肽(MAP)。参见，例如Tam，J.Immunol.Methods，196：17-32(1996)。
本发明的多肽可以包含被特异于恰菲埃里希氏体的抗体识别的抗原。抗原可以包含一个或更多个表位(即，抗原决定簇)。表位可以是线性表位、连续表位或构象表位。本发明的多肽内的表位可以通过几种方法鉴定。参见，例如，美国专利4,554,101；Jameson & Wolf，CABIOS4：181-186(1988)。例如，本发明的多肽可以被分离和筛选。组合在一起跨越整个多肽序列的一系列短肽可以通过蛋白水解裂解来制备。从例如30-mer多肽片段(或更小的片段)开始，每个片段可以在ELISA中测试被识别的表位的存在。例如，在ELISA分析中，恰菲埃里希氏体多肽，例如30-mer多肽片段，附着到固相支持物，例如，塑料多孔平板的反应孔上。抗体的群体被标记、添加到固相支持物上，容许在非特异性吸附被阻断的条件下结合于未标记的抗原，任何未结合的抗体和其他蛋白质被洗去。通过例如将无色底物转化成有色的反应产物的反应来检测抗体结合。然后从鉴定的30-mer测试逐渐更小的和重叠的片段来对感兴趣的表位作图。
本发明的多肽可以重组地产生。编码本发明的多肽的多核苷酸可以导入到重组表达载体中，其可以利用本领域公知的技术在适合的表达宿主细胞系统中表达。各种细菌、酵母、植物、哺乳动物和昆虫表达系统是本领域可获得的，可以使用任何这样的表达系统。任选的，编码多肽的多核苷酸可以在无细胞翻译系统中翻译。多肽还可以化学地合成或从恰菲埃里希氏体细胞获得。
本发明的免疫原性多肽可以包含SEQ ID NO：1-6中所示的氨基酸序列或其片段。免疫原性多肽可以引发抗体或其他免疫反应(例如，免疫系统的T细胞反应)，其识别具有SEQ ID NO：1-6的多肽的表位。本发明的免疫原性多肽还可以是具有SEQ ID NO：1-6所示氨基酸序列的多肽的片段。本发明的免疫原性多肽片段长度可以是约6、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、170(或6和170之间的任何范围)或更多个氨基酸。本发明的免疫原性多肽片段长度可以是约170、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、6或更少的氨基酸(或170和6之间的任何范围)。
恰菲埃里希氏体多核苷酸
本发明的多核苷酸含有少于完整的微生物基因组，可以是单链或双链的核酸。多核苷酸可以是RNA、DNA、cDNA、基因组DNA、化学合成的RNA或DNA或其组合。多核苷酸可以纯化的，没有其他成分，例如，蛋白质、脂质和其他多核苷酸。例如，多核苷酸可以是50％、75％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的。处在例如cDNA或基因组文库、或含有基因组DNA限制性消化物的凝胶片中的、在数百到数百万个其他核酸分子中存在的核酸分子不被认为是分离的多核苷酸。
本发明的多核苷酸编码上文描述的本发明的多肽。在本发明的一个实施方式中，VLPT多核苷酸编码SEQ ID NO：1-6中所示的多肽或其片段。
本发明的多核苷酸可以由少于约530、500、400、300、250、200、150、100或90个(或90和530之间的任何范围)连续的、天然存在的恰菲埃里希氏体多核苷酸组成。本发明的多核苷酸可以由大于约90、100、150、200、250、300、400、500、530个(或90和530之间的任何范围)或更多连续的、天然存在的恰菲埃里希氏体多核苷酸组成。纯化的多核苷酸可以包含其他异源的核苷酸(也就是说，不是来自恰菲埃里希氏体的核苷酸)和甚至其他恰菲埃里希氏体氨基酸，只要它们不是与恰菲埃里希氏体VLPT多核苷酸邻接地天然存在的。本发明的多核苷酸可以包含其他核苷酸序列，例如，编码接头、信号序列、TMR终止转移序列、跨膜结构域或在蛋白质纯化中有用的配体，例如，谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签和葡萄球菌属蛋白A的序列。本发明的一个实施方式提供了包含编码SEQ ID NO：1-6的至少约6、10、15、20、25、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或更多个连续核苷酸的纯化的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以被分离。分离的多核苷酸是一种天然存在的多核苷酸，其与与之天然相关的5′和3′侧翼基因组序列之一或两者不是直接邻接的。分离的多核苷酸可以是，例如，任何长度的重组DNA分子，条件是在天然存在的基因组中天然发现直接侧翼于所述重组DNA分子的核酸序列被除去或不存在。分离的多核苷酸还包括非天然存在的核酸分子。
本发明的多核苷酸还可以包含编码免疫原性多肽的片段。本发明的多核苷酸可以编码全长的多肽、多肽片段和变体或融合多肽。
编码本发明的多肽的简并核苷酸序列，以及至少约80％、或约90％、96％、98％或99％相同于本发明的多核苷酸序列的同源核苷酸序列以及其互补物也是本发明的多核苷酸。序列同一性百分比可以如“多肽”部分所描述的计算。简并核苷酸序列是编码本发明的多肽或其片段的多核苷酸，但是由于遗传密码的简并性在核酸序列上不同于野生型多核苷酸序列。编码生物学功能性的恰菲埃里希氏体多肽的恰菲埃里希氏体多核苷酸的互补DNA(cDNA)分子、物种同源物和变体也是恰菲埃里希氏体多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以分离自例如生物样品，如来自感染个体的血液、血清、唾液或组织中存在的核酸序列。多核苷酸还可以在实验室中合成，例如，利用自动合成仪。扩增方法例如PCR可以用于从编码多肽的基因组DNA或cDNA扩增多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以包含天然存在的多肽的编码序列，或可以编码自然中不存在的改变的序列。如果希望，多核苷酸可以克隆到包含表达控制元件的表达载体中，所述表达控制元件包括例如复制起点、启动子、增强子或驱动本发明的多核苷酸在宿主细胞中表达的其他调控元件。表达载体可以是，例如，质粒，如pBR 322、pUC或ColEl，或是腺病毒载体，例如，2型腺病毒载体或5型载体。任选的，可以使用其他载体，包括但不限于，Sindbis病毒、猿猴病毒40、甲病毒载体、痘病毒载体和巨细胞病毒以及逆转录病毒载体，例如，鼠肉瘤病毒、小鼠乳瘤病毒、Moloney鼠白血病病毒和劳氏肉瘤病毒。也可以使用微型染色体例如MC和MC1、噬菌体、噬菌粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体、病毒颗粒、病毒样粒子、粘粒(其中插入了噬菌体lambda cos位点的质粒)和复制子(能够在它们自主控制下在细胞中复制的遗传元件)。
制备与表达控制序列可操作连接的多核苷酸和在寄主细胞中表达它们的方法是本领域公知的。参见，例如，U.S.专利号4,366,246。本发明的多核苷酸当位于一个或更多个指导该多核苷酸的转录和/或翻译的表达控制元件邻近或附近时是可操作连接的。
本发明的多核苷酸可以用作，例如，探针或引物，例如，PCR引物，来检测测试样品如生物样品中恰菲埃里希氏体多核苷酸的存在。探针是能够例如通过杂交与目标核酸通常以序列特异性的方式相互作用的分子。引物是探针的子集，其可以支持酶的操作，并且可以与目标核酸杂交从而发生酶操作。引物可以从不干扰酶操作的、本领域可获得的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制得。
探针或引物可以是编码SEQ ID NO：1-6中所示多肽的约10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个连续的核苷酸。
核酸的杂交是本领域公知的，并且在此讨论。典型地，探针可以从本领域可获得的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合来制得。这样的探针和引物与恰菲埃里希氏体多核苷酸序列特异性杂交的能力将允许它们在检测给定测试样品中互补序列的存在中是有用的。本发明的多核苷酸探针和引物可以与测试样品例如生物样品，包括唾液、痰、血液、血浆、血清、尿、粪、脑脊髓液、羊水、伤口渗出液或组织中的互补序列杂交。来自样品的多核苷酸可以，例如，经历凝胶电泳或其他大小分离技术或可以被固定化而不大小分离。多核苷酸探针或引物可以被标记。适当的标记物以及标记探针和引物的方法是本领域已知的，包括，例如，通过切口平移或通过激酶掺入的放射性标记物、生物素标记物、荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物、金属螯合标记物和酶标记物。来自样品的多核苷酸在适合的严格度的杂交条件下与探针或引物接触。
取决于应用，改变杂交的条件可以用于实现探针或引物对目标序列的不同程度的选择性。对于需要高选择性的应用，可以使用相对严格的条件，例如，低盐和/或高温条件，例如，由约0.02M到约0.15M盐的盐浓度、在约50℃到约70℃的温度下所提供的。对于需要较低选择性的应用，可以使用较低严格的杂交条件。例如，约0.14M到约0.9M盐的盐条件、在约20℃到约55℃的温度下。从测试样品中包含探针或引物和互补的多核苷酸的杂交复合物的存在表明该样品中恰菲埃里希氏体多核苷酸的存在。
抗体
本发明的抗体是特异性结合本发明的恰菲埃里希氏体多肽、本发明的变体多肽或其片段的抗体分子。本发明的抗体可特异于恰菲埃里希氏体多肽，例如，对SEQ ID NO：1-6的一个或更多个有特异性的抗体。在本发明的另一个实施方式中，抗体特异于恰菲埃里希氏体多肽，不特异于犬埃里希氏体多肽(例如，特异于SEQ ID NO：1-6的抗体)。本领域的技术人员可以利用在此描述的分析容易地确定抗体是否特异于恰菲埃里希氏体多肽。本发明的抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)或抗体的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段是完整抗体的一部分，其包含完整抗体的抗原结合位点或可变区，其中所述部分没有完整抗体的Fc区域的恒定重链结构域。抗原结合抗体片段的实例包括Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2和Fv片段。
本发明的抗体可以是任何抗体种类，包括例如，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体或其片段结合本发明的多肽的表位。抗体可以利用重组DNA技术在适合的实验动物体内或在体外制备。制备和表征抗体的方法是本领域公知的。参见，例如Dean，Methods Mol.Biol.80：23-37(1998)；Dean，Methods Mol.Biol.32：361-79(1994)；Baileg，Methods Mol.Biol.32：381-88(1994)；Gullick，Methods Mol.Biol.32：389-99(1994)；Drenckhahn et al.Methods Cell.Biol.37：7-56(1993)；Morrison，Ann.Rev.Immunol.10：239-65(1992)；Wright et al.Crit.Rev.Immunol.12：125-68(1992)。例如，多克隆抗体可以通过向动物，例如人或其他灵长类、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、山羊、猪、狗、牛、绵羊、驴子或马施用本发明的多肽来产生。来自免疫的动物的血清被收集，通过例如用硫酸铵沉淀、随后通过层析，例如亲和层析来从血浆纯化抗体。产生和加工多克隆抗体的技术是本领域已知的。
“特异性结合”或“特异于”是指第一抗原，例如恰菲埃里希氏体多肽，以比其他非特异性分子更大的亲和力识别并结合本发明的抗体。“特异性结合”或“特异于”还指第一抗体，例如，针对SEQ IDNO：1-6产生的抗体，以比其他非特异性分子更大的亲和力识别和结合SEQ ID NO：1-6。非特异性分子是与第一抗原不享有共同表位的抗原。在本发明的优选的实施方式中，非特异性分子不来自埃里希氏体属物种，特别是不来自恰菲埃里希氏体或犬埃里希氏体。“埃里希氏体属物种”是指埃里希氏体属的所有物种。例如，针对第一抗原(例如，多肽)产生的抗体，与对非特异性抗原相比对第一抗原更有效率地结合，可以被描述为特异性结合第一抗原。在一个实施方式中，当以107l/mol或更高的结合亲和力Ka结合时，抗体或其抗原结合部分特异性地结合SEQ ID NO：1-6的多肽或其片段。特异性结合可以利用，例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或western印迹分析，利用本领域公知的方法来测试。
本发明的抗体包括抗体和其抗原结合片段，其(a)与参考抗体竞争对SEQ ID NO：1-6或其抗原结合片段的结合；(b)结合SEQ IDNO：1-6或其抗原结合片段的、与参考抗体相同的表位；(c)以与参考抗体基本上相同的Kd结合SEQ ID NO：1-6或其抗原结合片段；和/或(d)以与参考抗体基本上相同的解离速率结合SEQ ID NO：1-6或其片段，其中所述参考抗体是以107l/mol或更高的结合亲和力Ka特异性结合SEQ ID NO：1-6的多肽或其抗原结合片段的抗体或其抗原结合片段。
另外的，针对本发明的多肽上存在的表位的单克隆抗体也可以容易产生。例如，来自用本发明的多肽免疫的哺乳动物例如小鼠的正常B细胞可以与例如HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤。产生埃里希氏体属特异性抗体的杂交瘤可以利用RIA或ELISA鉴定，通过在半固体琼脂中克隆或通过有限稀释来分离。生产埃里希氏体属特异性抗体的克隆通过另一轮筛选来分离。单克隆抗体可以利用标准技术来筛选特异性，例如，通过将本发明的多肽结合到微量滴定板上并通过ELISA分析来测量单克隆抗体的结合。生产和加工单克隆抗体的技术是本领域已知的。参见，例如Kohler & Milstein，Nature，256：495(1975)。单克隆抗体的特定同种型可以通过从初始的融合物选择来直接制备，或通过利用sib选择技术来分离种类变化变体从分泌不同同种型的单克隆抗体的亲本杂交瘤中次级地制备。参见Steplewski et al.P.N.A.S.U.S.A.82：86531985；Spria et al，J.Immunolog.Meth.74：307，1984。本发明的单克隆抗体还可以是重组单克隆抗体。参见，例如，美国专利NO.4,474,893；美国专利NO.4,816,567。本发明的抗体还可以化学地构建。参见，例如，美国专利NO.4,676,980。
本发明的抗体可以是嵌合的(参见，例如，美国专利NO.5,482,856)，人源化的(参见，例如Jones et al，Nature 321：522(1986)；Reichmann et al，Nature 332：323(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol 2：593(1992))、犬源化的、犬的或人类的抗体。人抗体可以通过例如，直接immortilization、噬菌体展示、转基因小鼠或Trimera方法来产生，参见，例如Reisener et al，Trends Biotechnol.16：242-246(1998)。
特异性结合恰菲埃里希氏体的抗体对于检测样品例如来自动物的血清、血液、血浆、细胞、组织、尿、粪或唾液样品中恰菲埃里希氏体抗原的存在是特别有用的。免疫测定可以利用一种抗体或几种抗体。免疫测定可以使用，例如，特异于一种表位的单克隆抗体、特异于一种多肽的复数种表位的复数种单克隆抗体的组合、特异于不同多肽的复数种表位的复数种单克隆抗体、特异于同一抗原的复数种多克隆抗体、特异于不同抗原的复数种多克隆抗体、或单克隆抗体和多克隆抗体的组合。免疫测定方案可以基于，例如，利用例如标记的抗体的竞争、直接反应或夹层型分析。本发明的抗体可以用本领域已知的任何类型的标记物来标记，包括，例如，荧光的、化学发光的、放射性的、酶的、胶态金属的、放射性同位素的和生物发光的标记物。在本发明的一个实施方式中，本发明的抗体特异性结合恰菲埃里希氏体抗原，不特异性结合犬埃里希氏体抗原。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以结合到支持物，用于检测恰菲埃里希氏体抗原的存在。支持物包括，例如，玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖酐、尼龙、淀粉酶、天然的和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。
本发明的抗体可以进一步用于通过免疫亲和柱分离恰菲埃里希氏体有机体或抗原。抗体可以通过例如吸附，或通过共价键来固定到固体支持物上，从而抗体保持它们的免疫选择活性。任选的，可以包括间隔区基团，从而抗体的抗原结合位点保持可以接近的。然后，固定的抗体可以用于从样品中结合恰菲埃里希氏体有机体或恰菲埃里希氏体抗原，所述样品例如生物样品，包括唾液、血清、痰、血液、尿、粪、脑脊髓液、羊水、伤口渗出液或组织。结合的埃里希氏体属有机体或埃里希氏体属抗原通过例如pH值的改变来从柱基质上回收。
本发明的抗体还可以用于免疫定位研究来分析本发明的多肽在各种细胞事件或生理状况期间的存在和分布。抗体还可以用于鉴定被动免疫中涉及的分子，和鉴定非蛋白质抗原的生物合成中涉及的分子。这样的分子的鉴定在疫苗开发中是有用的。本发明的抗体，包括，例如，单克隆抗体和单链抗体，可以用于监视由恰菲埃里希氏体引起的疾病的改善的过程。通过测量来自动物的测试样品中特异于恰菲埃里希氏体的抗体的提高或降低，可以确定目的在于改善病症的特定治疗方案是否是有效的。抗体可以利用例如，直接结合分析如RIA、ELISA或western印迹分析来检测和/或定量。
检测的方法
本发明的方法可以用于检测测试样品例如生物样品、环境样品或实验室样品中特异于恰菲埃里希氏体抗原的抗体或抗原结合抗体片段或恰菲埃里希氏体多核苷酸。测试样品可能潜在地包含埃里希氏体属物种多核苷酸、恰菲埃里希氏体多核苷酸、犬埃里希氏体多核苷酸、埃里希氏体属物种多肽、恰菲埃里希氏体多肽、犬埃里希氏体多肽、特异于埃里希氏体属物种的抗体、特异于恰菲埃里希氏体的抗体和/或特异于犬埃里希氏体的抗体，不相关的多核苷酸和多肽、其组合，或不包含上述。生物样品可以包括，例如，来自哺乳动物如马、猫、狗或人的血清、血液、细胞、血浆、唾液、尿、粪或组织。测试样品可以是未处理的、沉淀的、分级的、分离的、稀释的、浓缩的或纯化的。
在一个实施方式中，本发明的方法包括在容许多肽/抗体复合物，即免疫复合物形成的条件下使本发明的一种或更多种多肽与测试样品接触。也就是说，本发明的多肽特异性地结合位于样品中的特异于恰菲埃里希氏体抗原的抗体。在本发明的一个实施方式中，本发明的一种或更多种多肽特异性地结合特异于恰菲埃里希氏体抗原、但不特异性结合犬埃里希氏体抗原的抗体。本领域技术人员对于检测抗体/多肽复合物结合中使用的分析和条件是熟悉的。检测多肽和样品中抗体之间的复合物的形成。抗体/多肽复合物的形成是恰菲埃里希氏体多肽存在于样品中的指示。没有多肽/抗体复合物的检出的是恰菲埃里希氏体多肽不存在于样品中的指示。
通过从例如怀疑具有恰菲埃里希氏体感染的人或动物获得测试样品，本发明的抗体可以用于诊断恰菲埃里希氏体感染的方法。测试样品在允许抗体-抗原复合物(即，免疫复合物)的形成的条件下与本发明的抗体接触。本领域技术人员了解允许和适合于抗原/抗体复合物形成的条件。抗体-抗原复合物的量可以通过本领域已知的方法来测定。高于阴性对照样品中形成的水平的水平表明恰菲埃里希氏体感染。阴性对照样品是不包含任何恰菲埃里希氏体和/或犬埃里希氏体多肽、或特异于恰菲埃里希氏体和/或犬埃里希氏体的抗体的样品。在本发明的一个实施方式中，阴性对照不包含埃里希氏体属物种多肽或特异于埃里希氏体属物种的抗体。在本发明的一个实施方式中，抗体特异于恰菲埃里希氏体抗原，并且不特异于犬埃里希氏体抗原。作为选择，本发明的多肽可以与测试样品接触。阳性测试样品中特异于恰菲埃里希氏体的抗体将在适合的条件下形成抗原-抗体复合物。抗体-抗原复合物的量可以通过本领域已知的方法测定。
在本发明的一个实施方式中，恰菲埃里希氏体感染可以在受试者中检测。从受试者获得生物样品。包含SEQ ID NO：1-6的一种或更多种纯化的多肽或本发明的其他多肽在容许多肽/抗体复合物形成的条件下与生物样品接触。检测多肽/抗体复合物。多肽/抗体复合物的检出是哺乳动物具有恰菲埃里希氏体感染的指示。没有多肽/抗体复合物的检出是哺乳动物不具有恰菲埃里希氏体感染的指示。
在本发明的一个实施方式中，恰菲埃里希氏体感染可以在不迟于受试者获得恰菲埃里希氏体感染之后约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天或更久在受试者中检出。在本发明的一个实施方式中，恰菲埃里希氏体感染可以在不迟于受试者获得恰菲埃里希氏体感染之后约21天、20天、19天、18天、17天、16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天或更短在受试者中检出。
在本发明的一个实施方式中，在结合到抗体的指示物试剂，例如酶缀合物催化可检测的反应时，检测多肽/抗体复合物。任选的，包含信号生成化合物的指示物试剂可以在容许多肽/抗体/指示物复合物的形成的条件下应用于多肽/抗体复合物。检测多肽/抗体/指示物复合物。任选的，多肽或抗体可以在多肽/抗体复合物的形成之前用指示物试剂标记。所述方法任选地包括阳性或阴性对照。
在本发明的一个实施方式中，一种或更多种本发明的抗体附着到固相或基质上。潜在地包含蛋白质的测试样品被添加到基质，所述蛋白质包含本发明的多肽。添加特异性结合本发明的多肽的一种或更多种抗体。所述抗体可以是与固相上使用的相同的抗体，或可以来自不同的来源或物种，并且可以连接到指示物试剂，例如酶缀合物。可以在每次添加之前进行洗涤步骤。添加发色团或酶底物，容许产生颜色。停止颜色反应，颜色可以利用例如分光光度计来定量。
在本发明的另一个实施方式中，一种或更多种本发明的抗体附着到固相或基质上。潜在地包含蛋白质的测试样品被添加到基质，所述蛋白质包含本发明的多肽。添加特异性结合本发明的多肽的第二种抗-物种抗体。这些第二抗体来自与固相抗体不同的物种。添加特异性结合第二抗体、不特异性结合固相抗体的第三种抗-物种抗体。第三抗体可以包含指示物试剂，例如酶缀合物。可以在每次添加之前进行洗涤步骤。添加发色团或酶底物，容许产生颜色。停止颜色反应，颜色可以利用例如分光光度计来定量。
本发明的测定包括但不限于基于竞争的那些、直接反应或夹心型测定，包括但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)、western印迹、IFA、放射免疫测定(RIA)、血细胞凝集(HA)、荧光偏振免疫测定(FPIA)和微量滴定板测定(任何测定在微量滴定板的一个或更多个反应孔中进行)。本发明的分析包括可逆的流动层析结合分析，例如，
Figure GPA00001139548000181
分析。参见，例如，美国专利NO.5,726,010。
分析可以使用固相或基质，或可以通过免疫沉淀或不利用固相的任何其他方法来进行。当使用固相或基质时，一种或更多种本发明的多肽直接或间接地附着于固体支持物或基质，例如微量滴定孔、磁珠、非磁性珠子、柱、基质、膜、由合成的或天然的纤维组成的纤维片(例如，基于玻璃或纤维素的材料或热塑性聚合物，例如聚乙烯、聚丙烯或聚酯)、由颗粒材料(例如，玻璃或各种热塑性聚合物)组成的烧造的结构、或由硝化纤维、尼龙、聚砜等等(一般天然合成的)组成的浇铸的薄膜。在本发明的一个实施方式中，基质是聚乙烯的烧制的细颗粒，一般称为多孔聚乙烯，例如，来自Chromex Corporation(Albuquerque，NM)的10-15微米多孔聚乙烯。所有这些基质材料可以在适合的形状中使用，例如，薄膜、薄片或平板，或者它们可以包被到、或结合到或层压到适当的惰性载体上，例如纸、玻璃、塑料膜或织物。将肽固定到固相上的适合的方法包括离子的、疏水的、共价的相互作用，等等。
在一种类型的分析形式中，一种或更多种多肽可以包被到固相或基质上。怀疑含有抗恰菲埃里希氏体抗体或其抗原结合片段的测试样品在一定条件下与指示物试剂孵育一定时间，所述指示物试剂包含缀合到特异于恰菲埃里希氏体的抗体或抗体片段的信号生成化合物，所述时间和条件足以形成测试样品的抗体与固相的多肽的抗原/抗体复合物、或缀合到特异于恰菲埃里希氏体的抗体的指示物试剂化合物与固相的多肽的抗原/抗体复合物。缀合到抗恰菲埃里希氏体抗体的指示物试剂与固相的结合方面的降低可以定量地测量。与从例如证实的阴性恰菲埃里希氏体测试样品产生的信号相比，在信号方面可测量的降低表明测试样品中抗恰菲埃里希氏体抗体的存在。这种类型的分析可以定量测试样品中抗恰菲埃里希氏体抗体的量。
在另一种分析形式中，一种或更多种本发明的多肽包被在支持物或基质上。本发明的多肽缀合到指示物试剂并添加到测试样品中。这种混合物施加到支持物或基质。如果特异于恰菲埃里希氏体的抗体存在于测试样品中，它们将结合缀合到指示物试剂的所述一种或更多种多肽，和结合到支持物上固定的所述一种或更多种多肽。然后可以检测多肽/抗体/指示物复合物。这种类型的分析可以定量测试样品中抗恰菲埃里希氏体抗体的量。
在另一种分析形式中，一种或更多种本发明的多肽包被在支持物或基质上。测试样品施加到支持物或基质并孵育。通过用洗涤溶液洗涤固体支持物从样品上洗去未结合的成分。如果恰菲埃里希氏体特异性抗体存在于测试样品中，它们将结合包被在固相上的多肽。这种多肽/抗体复合物可以利用缀合到指示物试剂的第二物种特异性抗体来检测。然后可以检测多肽/抗体/抗-物种抗体指示物复合物。这种类型的分析可以定量测试样品中抗恰菲埃里希氏体抗体的量。
多肽/抗体复合物或多肽/抗体/指示物复合物的形成可以通过，例如，放射测量的、比色的、荧光测量的、大小分离或沉淀方法来检测。任选的，多肽/抗体复合物的检测是通过添加第二抗体，所述第二抗体偶联到包含信号生成化合物的指示物试剂。包含信号生成化合物(标记物)、与多肽/抗体复合物缔合的指示物试剂可以利用上文描述的方法来检测，包括显色剂，催化剂，例如酶缀合物、荧光化合物，例如荧光素和罗丹明，化学发光化合物，例如dioxetanes、acridiniums、phenanthridiniums、钌和鲁米诺，放射性元素，直接可视标记物，以及辅助因子、抑制物、磁性颗粒，等等。酶缀合物的实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、beta-半乳糖苷酶，等等。特定标记物的选择不是关键的，但是它将能够通过自身或与一个或更多个另外的物质一起产生信号。
复合物的形成是测试样品中抗恰菲埃里希氏体抗体存在的指示。因此，本发明的方法可以用于诊断动物中的恰菲埃里希氏体感染。
本发明的方法还可以表明测试样品中抗-抗-恰菲埃里希氏体抗体的量。使用许多指示物试剂，例如，酶缀合物，存在的抗体的量与产生的信号成比例。取决于测试样品的类型，它可以用适合的缓冲试剂稀释，浓缩，或与固相接触而没有任何操作。例如，通常优选的是测试早先已经稀释的血清或血浆样品、或浓缩的样品例如尿液，来确定存在的抗体的存在性和/或量。
本发明进一步包括分析试剂盒(例如，制备物品)，用于检测样品中的抗-恰菲埃里希氏体抗体或抗原结合抗体片段、或恰菲埃里希氏体多肽。试剂盒包含一种或更多种本发明的多肽和用于测定所述多肽与样品中的抗恰菲埃里希氏体抗体或抗体片段的结合的工具。试剂盒或制备物品还可以包含本发明的一种或更多种抗体或抗体片段，以及用于测定所述抗体或抗体片段与样品中的恰菲埃里希氏体多肽结合的工具。试剂盒可以包含设备，所述设备含有本发明的一种或更多种多肽或抗体，以及所述一种或更多种多肽或抗体用于例如哺乳动物中恰菲埃里希氏体感染的鉴定的使用说明。所述试剂盒还可以包括包含标签的包装材料，所述标签指明所述试剂盒的一种或更多种多肽或抗体可以用于恰菲埃里希氏体感染的鉴定。本领域普通技术人员已知的其他成分例如缓冲剂、对照物等等，可以被包括在这样的测试试剂盒中。本发明的多肽、抗体、分析和试剂盒，在例如患者中恰菲埃里希氏体感染的个体案例的诊断、以及恰菲埃里希氏体爆发的流行病学研究中是有用的。
本发明的多肽和分析可以与其他多肽或分析组合来检测恰菲埃里希氏体和其他有机体的存在。例如，本发明的多肽和分析可以与检测犬恶丝虫和/或伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)和/或犬埃里希氏体和/或Anaplasma platys和/或嗜吞噬细胞无形体(Anaplasmaphagocytophilum)的试剂组合。
本发明的多核苷酸可以用于检测样品中恰菲埃里希氏体多核苷酸的存在。所述多核苷酸可以通过简单的杂交反应用于检测样品中的恰菲埃里希氏体多核苷酸，还可以用于，例如，聚合酶链式反应(PCR)，例如，实时PCR反应。本发明的方法和组合物还可以用于从其他埃里希氏体属物种例如犬埃里希氏体区分地检测恰菲埃里希氏体的存在。
PCR分析是本领域中很好地描述的，包括，例如，美国专利NO.4,683,195；美国专利NO.4,683,202；美国专利NO.4,965,188。一般地，多核苷酸引物与目标核酸的变性的链退火。引物延伸产物通过由聚合酶的脱氧核苷三磷酸的聚合来形成。然后，PCR涉及模板核酸变性、引物退火以及退火的引物在热稳定聚合酶的作用下的延伸的重复循环。所述过程引起测试样品中目标恰菲埃里希氏体核酸的指数式扩增，其容许检测在样品中以极低浓度存在的目标多核苷酸。
实时PCR分析基于信号，例如，荧光报告物信号的检测。这种信号与反应中PCR产物的量成正比地提高。实时PCR是使得可能监视正在进行的扩增反应的进度的任何扩增技术。参见，Quantitation ofDNA/RNA Using Real-Time PCR Detection，Perkin Elmer AppliedBiosystems(1999)；PCR Protocols(Academic Press New York，1989)。通过记录每个循环中荧光发射的量，有可能在指数期期间监视PCR反应，在此时PCR产物的量的首次显著提高与目标模板的初始量相关。核酸目标的起始拷贝数越高，越快观察到荧光显著提高。
本发明的一个实施方式提供了检测和/或定量测试样品中的恰菲埃里希氏体多核苷酸的方法。正义引物和反义引物可以在适合于聚合酶链式反应的条件下添加到测试样品中。引物与恰菲埃里希氏体多核苷酸杂交，从而如果恰菲埃里希氏体多核苷酸存在于测试样品中，形成扩增产物。检测扩增产物，确定恰菲埃里希氏体多核苷酸的存在和/或量。扩增产物可以用在适合于聚合酶链式反应的条件下与恰菲埃里希氏体多核苷酸序列杂交的多核苷酸探针来检测。扩增产物可以通过测量来自探针的检测信号、比较所述检测信号和来自定量标准物的第二探针检测信号来定量。定量标准物可以与测试样品并行地提取。恰菲埃里希氏体引起的疾病的治疗、改善或预防的方法本发明的多肽、多核苷酸和抗体可以用于治疗、改善或预防由恰菲埃里希氏体引起的疾病。
例如，本发明的抗体如单克隆抗体或其抗原结合片段，可以施用给动物，例如人或狗。在本发明的一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段在包含药学上可接受的载体的药物组合物中施用给动物。药物组合物包含治疗有效量的抗体或其抗原结合片段。治疗有效量是在减轻恰菲埃里希氏体感染的症状或降低受试者中恰菲埃里希氏体有机体的量方面有效的量。
本发明的多肽或多核苷酸可以在免疫原性组合物中存在并用于在宿主中引发免疫反应。免疫原性组合物或免疫原能够在动物中诱导免疫反应。本发明的免疫原性多肽或多核苷酸组合物在敏化动物的免疫系统方面是特别有用的，从而作为结果，产生了改善或防止恰菲埃里希氏体感染的影响的免疫反应。在动物模型中免疫反应的引发对于确定例如最佳的剂量或施用途径是有用的。免疫反应的引发还可以用于治疗、预防或改善恰菲埃里希氏体引起的疾病或感染。免疫反应包括体液免疫反应或细胞介导的免疫反应，或其组合。免疫反应还可以包含，例如，通过促进防卫素的产生来促进一般化的宿主响应。
本发明的一个实施方式提供了免疫原，其包含本发明的多肽和与所述多肽在羧基末端或氨基末端共价连接的一个或更多个其他区域或部分。每个区域或部分可以，例如，增强免疫反应、方便免疫原的纯化或促进多肽稳定性。
动物针对恰菲埃里希氏体的抗体滴度的产生在感染的保护和感染的清除方面是重要的。在多肽或多核苷酸的递送之后抗体滴度的检测和/或定量可以用于鉴定在引发抗体滴度方面特别有效的表位。对于针对恰菲埃里希氏体的强抗体反应负责的表位可以通过引发针对不同长度的恰菲埃里希氏体多肽的抗体来鉴定。然后，由特定多肽表位引发的抗体可以利用，例如ELISA分析来测试，以确定哪些多肽含有在产生强反应方面最有效的表位。然后，含有这些表位的多肽或融合蛋白或编码所述表位的多核苷酸可以被构建并用于引发强抗体反应。
本发明的多肽、多核苷酸或抗体可以被施用给哺乳动物，例如，小鼠、兔子、豚鼠、猕猴、狒狒、黑猩猩、人、牛、绵羊、猪、马、狗、猫，或施用给动物例如鸡或鸭，来在体内引发抗体。多核苷酸的注射具有构建和修改的简便性的实际优点。进一步的，多核苷酸的注射引起宿主中多肽的合成。因而，多肽被呈递给宿主免疫系统，具有天然的翻译后修饰、结构和构象。多核苷酸可以作为“裸DNA”递送给受试者。
多核苷酸、多肽或抗体的施用可以通过本领域已知的任何方式，包括肌肉内的、静脉内的、肺内的、肌肉内的、皮内的、腹膜内的或皮下的注射，气溶胶、鼻内的、输液泵、栓剂、粘膜的、局部的和口服的，包括利用生物弹道枪(“基因枪”)的注射。多核苷酸、多肽或抗体可以伴随着蛋白质载体用于口服施用。施用方法的组合也可以用于引发免疫反应。抗体可以以约0.5mg到约200mg的日剂量施用。在本发明的一个实施方式中，抗体以约20到约100mg的日剂量施用。
用于治疗用途的药学上可接受的载体和稀释剂和兽医可接受的载体和稀释剂是本领域公知的，在例如Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro ed.(1985))中描述了。载体本身应当不诱导对宿主有害的抗体的产生。这样的载体包括，但不限于，大的缓慢代谢的大分子，例如，蛋白质、聚糖，如乳胶功能化的
Figure GPA00001139548000221
琼脂糖、纤维素、纤维素珠子等，聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸，例如，聚谷氨酸、聚赖氨酸，等等，氨基酸共聚物、类肽、类脂(lipitoid)和失活的无毒病毒颗粒或细菌细胞。脂质体、水凝胶、环化糊精、可生物降解的纳米胶囊和生物粘附剂也可以用作本发明的组合物的载体。
药学上可接受的盐也可以用于本发明的组合物，例如，矿物盐，例如，氢氯化物、氢溴化物、磷酸盐或硫酸盐，以及有机酸的盐，例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。特别有用的蛋白质基质是血清白蛋白、钥孔血蓝素、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素和本领域技术人员公知的其他蛋白质。本发明的组合物还可以含有液体或赋形剂，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、Ringer′s溶液、Hank′s溶液、葡萄糖、甘油、右旋糖、malodextrin、乙醇等等，单独或组合地，以及物质例如润湿剂、乳化剂、渗涨度调节试剂、洗涤剂或pH缓冲试剂。也可以使用其他活性试剂，例如杀细菌试剂。
如果希望，改善向淋巴细胞的免疫原呈递的共-刺激分子，例如B7-1或B 7-2或细胞因子，例如MlPlα、GM-CSF、IL-2和IL-12可以被包括在本发明的组合物中。任选地，佐剂也可以被包括在组合物中。佐剂是可以用于非特异性增大特异性免疫应答的物质。一般的，本发明的佐剂和多肽在呈递给免疫系统之前混合，或单独地呈递，但是呈递到动物的同一位置。佐剂可以包括，例如，油性佐剂(例如，弗氏完全和不完全佐剂)、矿物盐(例如，AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)、硅石、明矾、Al(OH)3和Ca3(PO4)2)、多核苷酸(即，聚IC和聚AU酸)和某些自然物质(例如，来自结核分枝杆菌(Corynebacterium parvum)的wax D，以及在小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、百日咳包特氏菌(Bordetella pertussis)和布鲁氏菌属(Brucella)的成员中发现的物质。可以使用的佐剂包括，但不限于，MF 59-0、氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-nor-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637)，称为nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2′-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)和RIBI，其含有在2％角鲨烯
Figure GPA00001139548000231
(聚山梨酯)乳剂中的从细菌提取的三种成分，单磷酰基脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
本发明的组合物可以配制到可摄取的片剂、口腔片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片、可注射制剂、嗽口水、牙粉(dentrifices)，等等。本发明的一种或更多种多肽、多核苷酸或抗体在这样的组合物和制品中的百分比可以是单位重量的0.1％到60％。
多肽、多核苷酸或抗体的施用可以在动物中引发免疫反应持续至少1周、1个月、3个月、6个月、1年或更久。任选的，通过在初次注射后1个月、3个月、6个月、1年或更久提供多肽、多核苷酸或抗体的一次或更多次强化注射，免疫反应可以在动物中维持。如果希望，也可以在组合物之前、之后或与组合物一起提供共同刺激分子或佐剂。
包含多肽、多核苷酸、抗体或其组合的本发明的组合物按照与所使用的特定组合物相容的方式、以对于引发免疫反应有效的量来施用，所述免疫反应由例如ELISA来检测。多核苷酸可以以1ng/kg、10ng/kg、100ng/kg、1000ng/kg、0.001mg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg的剂量肌肉内地注射到哺乳动物，例如狒狒、黑猩猩、狗或人中。多肽或抗体可以以0.01、0.05、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5或10mg/kg的剂量肌肉内地注射到哺乳动物中。
多肽、多核苷酸、抗体或其组合可以施用给未受恰菲埃里希氏体感染的动物，或可以施用给恰菲埃里希氏体感染的动物。免疫有效量或治疗有效量是指以单一剂量或作为系列的部分施用该量给个体，对于恰菲埃里希氏体感染的治疗、改善或预防是有效的。在组合物中多核苷酸、多肽或抗体的特定剂量将取决于许多因素，包括，但不限于物种、年龄、性别、同时的药疗法、施用该组合物的哺乳动物的一般状况以及该组合物的施用方式。本发明的组合物的有效量可以仅利用常规的实验来容易确定。
在此任何地方引用的所有的专利、专利申请和其他科学或技术著述通过将它们完全引用来合并。在此说明性地描述的本发明可以在没有此处所没有特别公开的任何单种或复数种元素、单种或复数种限制的情况下适当地实现。因而，例如，在此处的每种情况下，“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”的任何术语可以用另两个术语的任一个替换，而保持它们的普通含义。已经被采用的术语和表述被用作描述的术语而不是限制的术语，在使用这样的术语和表述时不意图排除所显示和描述的特征的任何等价物或其部分，但是认识到的是，在本发明所要求的范围内的各种修改是可能的。因而，要理解的是，虽然已经通过实施方式具体地公开了本发明，在此公开的概念的任选的特征、修改和变体可以被本领域技术人员借助，并且这样的修改和变体被认为处于由说明书和附随的权利要求所定义的本发明的范围之内。
另外，当本发明的特征或方面以马库什组或其他可选方式的分组来描述时，本领域技术人员将认识到，本发明由此也按照马库什组或其他组的任何单独成员或成员的子组的方式来描述。
实施例
实施例1
直接ELISA分析平板和方案
SEQ ID NO：5和6中所示的多肽缀合到BSA，缀合物包被在
Figure GPA00001139548000251
4平板上。包被缓冲液是0.05M碳酸钠、pH9.6。100μl/孔的稀释的多肽吸移到平板上。覆盖平板，在2℃-8℃孵育过夜。从平板上吸取多肽溶液，平板用HW
Figure GPA00001139548000252
洗涤缓冲液(IDEXXLaboratories，Inc.，Westbrook ME)洗涤4次。300μl/孔的在0.1M TrispH 7.6中的1％BSA添加到平板。在室温下孵育、覆盖平板6小时。吸出BSA，300μl/孔的在0.1M Tris pH7.6中的2.5％蔗糖添加到平板。孵育平板，覆盖，在2℃-8℃过夜。蔗糖从平板上吸出，轻敲平板来除去过量的液体。平板在真空仓中干燥4小时。平板在2℃-8℃与干燥剂保存在双塑料袋中。
SEQ ID NO：1和2中显示的多肽缀合到HRPO。稀释的多肽：HRPO添加到每个反应孔(100μl/孔)，添加对照和血清样品(纯的)(50μl/孔)。恰菲埃里希氏体的阳性对照与阴性对照一起使用。轻轻敲打平板，在室温孵育1小时。平板用HW
Figure GPA00001139548000253
洗涤缓冲液洗涤6次。100μl/孔的TMB底物添加到反应孔，平板孵育10分钟。50μl/孔的停止溶液添加到反应孔。平板在A650读取。阴性截断值被确定为2×阴性对照O.D.值。
实施例2
间接ELISA分析平板和方案
SEQ ID NO：4、5和6中显示的多肽包被到
Figure GPA00001139548000261
平板上。包被缓冲液是0.05M碳酸钠，pH9.6。100μl/孔稀释的肽添加到平板，平板在室温下(RT)孵育、覆盖过夜。吸去多肽，平板用HW
Figure GPA00001139548000262
洗涤缓冲液洗涤2次。200μl/孔的0.1M Tris pH7.6中的2％(聚山梨酯)20/2.5％蔗糖添加到反应孔，平板在室温孵育、覆盖2小时。吸去阻断溶液，轻敲平板来除去过量液体。平板在室温下用2份(27g)干燥剂/6个平板在聚酯薄膜(mylar)袋子中干燥过夜。平板在2℃-8℃保存。
稀释的对照和血清样品以100μl/孔吸移到反应孔中。恰菲埃里希氏体的阳性对照与阴性对照一起使用。平板在室温孵育30分钟。平板用HW洗涤缓冲液洗涤5次。100μl/孔稀释的兔抗狗：HRPO添加到反应孔中并在室温孵育30分钟。平板用HW
Figure GPA00001139548000265
洗涤缓冲液洗涤5次。50μl/孔TMB底物添加到平板，孵育10分钟。添加50μl/孔的停止溶液。平板在A650读取。阴性截断值被确定为2×阴性对照O.D.值。
间接(α物种)和直接(Ag:Ag)分析形式的最终的最佳平板条件在表1中示出。
表1
Figure GPA00001139548000266
实施例3
VLPT多肽分析
VLPT-1(SEQ ID NO：5)和VLPT-2(SEQ ID NO：6)被用于上文描述的间接分析来检测恰菲埃里希氏体感染的和非感染的狗中的恰菲埃里希氏体感染。表2中的阳性样品(由“(+)”表明)是对恰菲埃里希氏体阳性的、但是对犬埃里希氏体阴性的野外样品。样品稀释度是1∶100，兔抗狗抗体稀释度是1∶2000。结果在表2中显示。VLPT-1和VLPT-2精确地检测阳性对照中的恰菲埃里希氏体，对于阴性样品和阴性对照不提供阳性结果。VLPT-1在7个阳性样品的6个中产生了阳性结果。VLPT-2在7个阳性样品的5个中产生了阳性结果。
表2.
Figure GPA00001139548000271
VLPT-1(SEQ ID NO：5)和VLPT-2(SEQ ID NO：6)如上文描述的在直接分析中使用，来检测恰菲埃里希氏体感染的和未感染的狗中的恰菲埃里希氏体感染。表3中的阳性样品(由“(+)”表明)是对恰菲埃里希氏体阳性、但是对犬埃里希氏体阴性的野外样品。平板以0.5和1.0μg/ml包被，多肽：HRPO在0.5和1.0μg/ml测试。结果在表3中示出。VLPT-1和VLPT-2精确地检测阳性对照中恰菲埃里希氏体，对于阴性样品和阴性对照不提供阳性结果。VLPT-1和VLPT-2在6个阳性样品的6个中产生阳性结果。
表3
Figure GPA00001139548000281
VLPT-1(SEQ ID NO：5)用于上文描述的直接分析，来分析犬埃里希氏体接种的狗样品。进行该分析来确定VLPT-1是否将在犬埃里希氏体接种的狗中提供阳性结果。在第二次强化接种后从狗采集测试样品。平板以1.0μg/ml包被，多肽：HRPO在0.5μg/ml的浓度下使用。
Figure GPA00001139548000282
分析被用于显示抗犬埃里希氏体抗体反应在接种的狗中被诱导。该分析筛选了犬恶丝虫抗原、犬埃里希氏体抗体、伯氏疏螺旋体抗体和嗜吞噬细胞无形体抗体。结果在表4中示出。
Figure GPA00001139548000283
测试中犬埃里希氏体抗体的阳性结果表明抗体反应在接种后被诱导。当在直接分析中用来自犬埃里希氏体接种的狗的样品测试时，VLPT-1不提供阳性结果。因而，VLPT-1(SEQ ID NO：5)是对恰菲埃里希氏体感染特异性的，不与来自犬埃里希氏体接种的狗的血清反应。
表4
Figure GPA00001139548000291
VLPT-1(SEQ ID NO：5)和VLPT-R(SEQ ID NO：4，其中位置112的X是P)在如上所述的间接分析中使用来实验性分析犬埃里希氏体感染的狗样品。进行这项分析来确定VLPT-1和VLPT-R是否将产生犬埃里希氏体感染的狗中的阳性结果。平板以0.15μg/ml(VLPT-R)和1μg/ml(VLPT-1)包被。样品稀释度是VLPT-R为1∶100，和VLPT-1为1∶50。兔抗狗：HRPO缀合物在1∶1000稀释度下使用。结果在表5中示出。
表5.
Figure GPA00001139548000301
一般地，VLPT-1(SEQ ID NO：5)和VLPT-R(SEQ ID NO：4，其中位置112的X是P)当用来自犬埃里希氏体感染的狗的样品测试时没有提供阳性结果。然而，VLPT-R和VLPT-1都有单个样品在延长的时点显示了轻微提高的水平。然而，这些阳性信号与阳性对照相比是微弱的，信号不在接种后随时间提高，如果发生与犬埃里希氏体的交叉反应这将是预期的。因而，VLPT-1和VLPT-R特异于恰菲埃里希氏体，不特异于犬埃里希氏体。
VLPT-1(SEQ ID NO：5)和VLPT-R(其中位置112的X是P的SEQ ID NO：4)用于间接分析来测试在感染后几个时点来自恰菲埃里希氏体实验性感染的狗的血清。对于VLPT-R，平板以0.15μg/mL包被，对于VLPT-1以1μg/mL包被。样品稀释度VLPT-R为1∶100，VLPT-1是1∶50。兔抗狗：HRPO缀合物在1∶1000稀释度下使用。结果在表6和附图1A和1B中示出。VLPT-R和VLPT-1都能够在至少不迟于感染后第7天检测恰菲埃里希氏体抗体。
表6.
VLPT-1用于直接分析中来测试来自亚利桑那州当地的狗的已知阳性和阴性的野外血清样品，其中发现了犬埃里希氏体，但是没有恰菲埃里希氏体。平板以1μg/ml包被，多肽：HRPO在0.5μg/ml的浓度下使用。结果在表7中示出。VLPT-1对犬埃里希氏体阳性样品或犬埃里希氏体阴性样品没有显示阳性结果。因而，VLPT-1特异于恰菲埃里希氏体抗体，不特异于犬埃里希氏体抗体。
表7
阳性样品：                        阴性样品：
Figure GPA00001139548000321
序列表
<110>O′Connor，Thomas P
     Slauenwhite，Jill
     Krah，Eugene R
 
<120>用于检测恰菲埃里希氏体(VLPT)的方法和组合物
 
<130>07-885-US
 
<150>60/974,196
<151>2007-09-21
 
<160>6
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>恰菲埃里希氏体
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>X可以是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<400>1
 
Xaa Ser Asp Leu His Xaa Xaa Xaa Xaa Val Glu Leu Xaa Xaa Pro Ser
1               5                   10                  15
Lys Glu Glu Val Gln Xaa Glu Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
 
<210>2
<211>31
<212>PRT
<213>恰菲埃里希氏体
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<400>2
 
Asp Ser Asp Leu His Gly Xaa Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Ser
1               5                   10                  15
Lys Glu Glu Val Gln Leu Glu Ser Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asn
            20                  25                  30
 
<210>3
<211>31
<212>PRT
<213>恰菲埃里希氏体
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<400>3
 
Asn Ser Asp Leu His Glu Xaa Ser Phe Val Glu Leu Pro Gly Pro Ser
1               5                   10                  15
Lys Glu Glu Val Gln Phe Glu Asp Asp Ala Lys Asn Val Val Tyr
            20                  25                  30
 
<210>4
<211>177
<212>PRT
<213>恰菲埃里希氏体
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(112)..(112)
<223>X可以是任何氨基酸
 
<400>4
 
Met Ser Gln Phe Ser Glu Asp Asn Ile Gly Asn Ile Gln Met Pro Phe
1               5                   10                  15
Ser Asn Leu Gln Glu Ser Ser His Leu Glu Leu Pro Ser Leu Ser Glu
            20                  25                  30
Lys Val Ile His Leu Glu Ser Gly Leu Gln Gln Ser Ser Asp Ser Asp
        35                  40                  45
Ser His Glu Pro Ser His Leu Glu Leu Pro Ser Leu Ser Glu Glu Val
    50                  55                  60
Ile Gln Leu Glu Ser Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asn Ser Asp Leu His
65                  70                  75                  80
Gly Ser Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Phe Lys Glu Ala Val Gln
                85                  90                  95
Leu Gly Asn Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asp Ser Asp Leu His Gly Xaa
            100                 105                 110
Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Ser Lys Glu Glu Val Gln Leu Glu
        115                 120                 125
Ser Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asn Ser Asp Leu His Glu Ser Ser Phe
    130                 135                 140
Val Glu Leu Pro Gly Pro Ser Lys Glu Glu Val Gln Phe Glu Asp Asp
145                 150                 155                 160
Ala Lys Asn Val Val Tyr Gly Gln Asp His Val Ser Leu Ser Glu Leu
                165                 170                 175
Gly
 
<210>5
<211>32
<212>PRT
<213>恰菲埃里希氏体
 
<400>5
 
Cys Asp Ser Asp Leu His Gly Pro Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro
1               5                   10                  15
Ser Lys Glu Glu Val Gln Leu Glu Ser Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asn
            20                  25                  30
 
<210>6
<211>32
<212>PRT
<213>恰菲埃里希氏体
 
<400>6
Cys Asn Ser Asp Leu His Glu Ser Ser Phe Val Glu Leu Pro Gly Pro
1               5                   10                  15
Ser Lys Glu Glu Val Gln Phe Glu Asp Asp Ala Lys Asn Val Val Tyr
            20                  25                  30

Claims (19)

1.一种纯化的多肽，包含：
(a)SEQ ID NO：3，其中所述多肽由少于约50个连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成；
(b)SEQ ID NO：2，其中所述多肽由少于约50个连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成；
(c)SEQ ID NO：1，其中所述多肽由少于约50个连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成。
2.编码权利要求1的纯化的多肽的分离的多核苷酸。
3.权利要求1的纯化的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO：3、SEQID NO：2或SEQ ID NO：1组成。
4.权利要求1的纯化的多肽，其中所述纯化的多肽连接到指示物试剂、氨基酸间隔区、信号序列、终止转移序列、跨膜结构域、蛋白质纯化配体、异源多肽、一种或更多种包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6的其他多肽，或其组合。
5.权利要求1的纯化的多肽，其中所述纯化的多肽包含在所述多肽的氨基末端或羧基末端或两个末端的一个或更多个C氨基酸残基。
6.一种检测测试样品中特异性结合恰菲埃里希氏体多肽的抗体的方法，包括：
(a)在容许多肽/抗体复合物形成的条件下使包含SEQ ID NO：1、2、3、5或6的纯化的多肽与测试样品接触；其中所述纯化的多肽由少于约50个连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成；
(b)检测所述多肽/抗体复合物；
其中所述多肽/抗体复合物的检出是特异于恰菲埃里希氏体的抗体存在于所述测试样品中的指示，其中没有多肽/抗体复合物是特异于恰菲埃里希氏体的抗体不存在于所述测试样品中的指示。
7.权利要求6的方法，进一步包括在进行步骤(b)之前使步骤(a)的复合物与指示物试剂接触。
8.权利要求6的方法，其中所述纯化的多肽包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5，其中所述方法不检测特异性结合犬埃里希氏体多肽的抗体。
9.权利要求6的方法，其中测定所述测试样品中抗体的量。
10.权利要求6的方法，其中所述纯化的多肽附着到基质上。
11.权利要求6的方法，其中所述纯化的多肽连接到指示物试剂、氨基酸间隔区、信号序列、终止转移序列、跨膜结构域、蛋白质纯化配体、异源蛋白质、一种或更多种包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的其他多肽，或其组合。
12.一种检测受试者中恰菲埃里希氏体感染的方法，包括：
(a)从所述受试者获得生物样品；
(b)在容许多肽/抗体复合物形成的条件下使包含SEQ ID NO：1、2、3、5或6的纯化的多肽与生物样品接触；其中所述纯化的多肽由少于约50个连续的天然存在的恰菲埃里希氏体氨基酸组成；
(c)检测所述多肽/抗体复合物；
其中所述多肽/抗体复合物的检出是所述受试者具有恰菲埃里希氏体感染的指示。
13.权利要求12的方法，其中所述纯化的多肽是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5，其中所述方法不检测所述受试者中的犬埃里希氏体感染。
14.特异性结合由SEQ ID NO：1、2、3、5或6组成的多肽的抗体。
15.权利要求14的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、抗原结合抗体片段或单链抗体。
16.一种检测样品中的恰菲埃里希氏体多肽的方法，包括：
(a)在容许多肽/抗体复合物形成的条件下使特异性结合由SEQ ID NO：1、2、3、5或6组成的多肽的抗体与所述样品接触；
(b)检测所述多肽/抗体复合物；
其中所述多肽/抗体复合物的检出是恰菲埃里希氏体多肽存在于样品中的指示。
17.权利要求16的方法，其中所述多肽是SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：5，和其中所述方法不检测所述样品中的犬埃里希氏体多肽。
18.权利要求16的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、抗原结合抗体片段或单链抗体。
19.权利要求16的方法，其中所述抗体附着到基质上。
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