CN112703197A - 嵌合免疫原性多肽 - Google Patents

Abstract

本文中提供了可用于例如针对查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)和/或犬埃立克体(Ehrlichia canis)的诊断或疫苗接种的嵌合多肽。

Description

嵌合免疫原性多肽

发明背景

本申请要求2018年7月27日提交的美国临时专利申请No.62/711,005的权益，其全部内容通过引用并入本文。

1.技术领域

本发明总体上涉及分子生物学和医学领域。更具体地，其涉及可用于诊断或疫苗接种目的的嵌合多肽。

2.相关领域的描述

人单核细胞埃立克体病(human monocytotropic ehrlichiosis，HME)是1类NIAID新兴疾病，并且病因物质查菲埃立克体(E.chaffeensis)被分类为C类优先病原体。HME是危及生命的未分化性发热疾病，临床诊断困难，并且明确诊断在大多数情况下通常是回顾性的(Walker and Dumler,1997；Walker et al.,2004；Dumler et al.,2007)。尽管截至2012年已向疾病控制中心报告了远远超过8,000例的病例，但这一数字可能将实际病例数低估了100倍(Olano et al.,2003)。由于与发作相关的非特异性症状，该疾病通常未确诊，但其导致病例中43％至62％的患者住院(Fishbein et al.,1994)。该疾病的进展可能导致致命的结果，并且经常涉及多系统衰竭，其中在许多致命病例中，急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratory distress syndrome，ARDS)和脑膜脑炎是常见的(Fishbein et al.,1994；Paparone et al.,1995)。对公共卫生的威胁随着新兴的埃立克体物质而提高，但尚无可用的人埃立克体病疫苗，并且治疗性的选择受到限制。已经开发出了新的信息和生物信息学预测工具，使得保护性免疫诊断/疫苗候选物的全基因组鉴定变得可行(He et al.,2010；Magnan et al.,2010)。

开发用于埃立克体(Ehrlichia)的有效亚基疫苗和免疫诊断的前景因许多因素而受到限制，其中不仅仅是小的已经在分子上限定的免疫反应性/保护性蛋白质库(McBrideand Walker,2010)。解决查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)的该问题所需知识中的缺口已经通过以下中的进展而缩小：理解保护性/病理性免疫机制(Feng and Walker2004；Nandi et al.,2007；Winslow et al.,2000)，一些疫苗/诊断抗原的免疫分子表征(Kuriakose et al.,2012；Li et al.,2002)，基因组、转录物组和蛋白质组谱(Kuriakoseet al.,2011；Lin et al.,2011)，新动物模型(Winslow et al.,1998；Sotomay et al.,2001)，以及其他技术进步。利用低通量方法限定查菲埃立克体的抗原性组分的研究已产生了一小组保护性抗原，其包括主要外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)，以及具有主要保护性线性抗体表位的分泌的串联重复蛋白(secreted tandem repeat protein，TRP)效应子家族(Kuriakose et al.,2012；Li et al.,2001)。然而，这些抗原可能代表了重要的但不完整的免疫反应性/保护性蛋白质库。另外，已经充分确定抗体介导的免疫对于针对查菲埃立克体感染的保护是必需的(Winslow et al.,2000；Li et al.,2002；Kuriakoseet al.,2012；Li et al.,2001；Racine et al.,2011；Yager et al.,2005)，并且抗体是用于人的最有效疫苗的基础。查菲埃立克体的消除至少部分地发生在感染的胞外阶段(Liand Winslow 2003)；然而，胞内免疫机制可能也是重要的，并且限定两种环境中均是保护性的抗原/抗体的特征对于有效开发疫苗至关重要。显然，需要用于查菲埃立克体和犬埃立克体(E.canis)的诊断和疫苗接种的新的和改进的方法。

发明内容

在一些方面中，本公开内容提供了用于查菲埃立克体和/或犬埃立克体(Ehrlichia canis)的诊断和疫苗接种的方法和组合物。在一些实施方案中，提供了嵌合免疫原性肽和多肽。在一些方面中，已经发现了不同免疫原性序列的连续重复可用于产生表现出对于针对查菲埃立克体和/或犬埃立克体的诊断和/或诱导免疫应答的改善的特性的肽或多肽。

如以下实例中所示，使用免疫反应性查菲埃立克体和/或犬埃立克体肽来产生嵌合埃立克体多肽。使用ELISA测试在人单核细胞埃立克体病(HME)阳性人和犬血清上验证了表2中包含的嵌合多肽是免疫反应性的。使用从患者获得的阳性HME血清的ELISA测试表明，以下构建体引起了显著响应，表明肽(例如，表1的)可用于产生嵌合多肽(例如，式I的或表2中的)，该嵌合多肽可用于诊断方法以检测查菲埃立克体或犬埃立克体引起的感染，或者可用于在对象(例如人或狗)中针对查菲埃立克体或犬埃立克体诱导免疫应答。

本发明的一个方面涉及分离的多肽，其中所述分离的多肽包含：(i)表1的至少两种免疫原性序列或具有至少90％同一性(优选至少95％同一性)的序列；并且(ii)其中免疫原性序列中的至少一种在多肽中连续重复。例如，在一些实施方案中，至少2、3、4、5、6或7种免疫原性序列在分离的多肽中连续重复。在一些实施方案中，表1的至少两种免疫原性序列或具有至少90％同一性的序列中的每一种在多肽中连续重复1、2、3、4、5、6或7次。在一些实施方案中，分离的多肽包含(SEQ ID NO:11至16或36至42)中的一个或更多个，其中(SEQ IDNO:11至16或36至42)中的一个或更多个连续重复0、1、2或3次。在一些实施方案中，免疫原性序列中的每一种在多肽中连续重复1至3次。在一些实施方案中，免疫原性序列中的每一种在多肽中连续重复1至2次。在一些实施方案中，分离的多肽包含以下免疫原性序列中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11种或全部：TRP120(SEQ ID NO:22)、TRP140(SEQ ID NO:23)、A34N1(SEQ ID NO:7)、TRP63(SEQ ID NO:18)、TRP47(SEQ ID NO:17)、TRP75(SEQ ID NO:19)、TRP28(SEQ ID NO:2)、TRP36R1(SEQ ID NO:3)、TRP36R2(SEQ ID NO:4)、TRP36R3(SEQID NO:6)、TRP36CO(SEQ ID NO:36)、TRP19(SEQ ID NO:1)、HSP(SEQ ID NO:24)，或具有至少90％同一性(优选至少95％同一性)的序列；其中免疫原性序列中的每一种在多肽中连续重复1至7次。分离的多肽可包含TRP36R1和TRP140。在一些实施方案中，TRP36R1连续重复4至8次，并且其中TRP140连续重复1至3次。多肽可包含TRP36R1的8个重复和TRP140的4个重复或由其组成。多肽可包含SEQ ID NO:27或由其组成。多肽可还包含TRP19。多肽可包含SEQID NO:26或由其组成。在一些实施方案中，分离的多肽包含以下免疫原性序列中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或全部：TRP32、TRP120、TRP36R1、TRP140、TRP28和/或HSP。在一些实施方案中，TRP36R1如果存在，则重复2至6次，并且其中其他免疫原性序列重复1至3次。在一些实施方案中，多肽包含TRP32、TRP120、TRP36(例如TRP36R1、TRP36R2、TRP36R3和/或TRP36CO)、TRP140、TRP28和HSP全部。多肽可包含SEQ ID NO:28或由其组成。在一些实施方案中，多肽包含TRP120、TRP36、TRP140和TRP28。多肽可包含SEQ ID NO:29或由其组成。在一些实施方案中，分离的多肽包含TRP32R1、TRP32R2、TRP32R3、TRP32R4、TRP120和A34N1中的至少三种、至少四种、至少五种或全部。在一些实施方案中，TRP120和A34N1各自连续重复1、2或3次。多肽可包含SEQ ID NO:25或由其组成。多肽可包含A34N1、TRP63、TRP47和/或TRP75中的至少两种、至少三种或全部。多肽可包含A34N1和TRP63。免疫原性序列中的每一种可连续重复1至2次。多肽可包含A34N1、TRP63和TRP75。多肽可包含SEQID NO:34或由其组成。在一些实施方案中，多肽包含A34N1、TRP63和TRP47。多肽可包含SEQID NO:33或由其组成。在一些实施方案中，多肽包含A34N1、TRP63、TRP47和/或TRP75中的至少两种、至少三种或全部。多肽可包含A34N1和TRP63。在一些实施方案中，免疫原性序列中的每一种连续重复1至2次。多肽可包含A34N1、TRP63和TRP75。多肽可包含SEQ ID NO:34或由其组成。多肽可包含A34N1、TRP63和TRP47。多肽可包含SEQ ID NO:33或由其组成。在一些实施方案中，多肽包含TRP120、A34N1、TRP47和/或TRP63中的至少两种、至少三种或全部。多肽可包含A34N1和TRP120。免疫原性序列中的每一种可连续重复1至2次。多肽可包含A34N1、TRP120和TRP63。多肽可包含SEQ ID NO:31或由其组成。多肽可包含A34N1、TRP120和TRP47。多肽可包含SEQ ID NO:32或由其组成。多肽可包含A34N1、TRP120、TRP47和TRP63。多肽可包含SEQ ID NO:30或由其组成。在一些实施方案中，多肽包含TRP36R1、TRP140、TRP95R和/或TRP95C中的至少两种、至少三种或全部。免疫原性序列中的每一种可连续重复1至2次。多肽可包含TRP36R1、TRP140、TRP95R和TRP95C。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:35或由其组成。多肽可包含(SEQ ID NO:25至35或43至44)中的任一个的多肽或由其组成。分离的多肽可包含以下免疫原性序列中的至少3、4、5、6、7、8、9种或全部：TRP120、A34N1、TRP63、TRP47、TRP75、TRP28、TRP36(例如TRP36R1、TRP36R2、TRP36R3和/或TRP36CO)、TRP19、TRP140和/或HSP。在一些实施方案中，多肽还包含TRP36R1、TRP36R2、TRP36R3和/或TRP36CO中的至少两种。多肽可包含TRP36R1、TRP36R2和TRP36R3。TRP36R1、TRP36R2和TRP36R3序列可被接头分开。在一些实施方案中，TRP36R1、TRP36R2和TRP36R3序列不被接头分开。多肽可包含TRP36R1-R2-R3(SEQ ID NO:11)、TRP36R1-R3-R2(SEQ ID NO:12)、TRP36R2-R1-R3(SEQ IDNO:13)、TRP36R2-R3-R1(SEQ ID NO:14)、TRP36R3-R1-R2(SEQ ID NO:15)或TRP36R3-R2-R1(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，多肽中的免疫原性序列中的每一种连续重复1、2或3次。免疫原性序列中的每一种可连续重复1或2次。在一些实施方案中，不同的免疫原性序列不被接头或间隔区分开。在一些实施方案中，不同的免疫原性序列被接头或间隔区(例如甘氨酸接头)分开。甘氨酸接头可以具有氨基酸序列–(G)_X–，其中X＝3至5。在一些实施方案中，多肽的长度小于500、小于450、小于400、小于350、小于300、小于250、小于200或小于150个氨基酸。

在一些实施方案中，多肽包含在药物制剂中。在一些实施方案中，药物制剂被配制用于肠胃外、静脉内、皮下、鼻内、舌下或皮内施用。在一些实施方案中，多肽连接至固体支持物(例如玻璃或塑料)或包含在诊断试剂盒中。在一些实施方案中，固体支持物包含在侧向流测定(lateral flow assay)中或微流体装置中。

本发明的另一方面涉及式I(A_s-B_t-C_u-D_v-E_w-F_x-G_y-H_z)_n的分离的多肽，其中A、B、C、D、E、F、G和H是选自SEQ ID NO:1至24和36至42的肽，或者与(SEQ ID NO:1至24或36至42)中的任一个具有至少90％同一性(优选至少95％同一性)的序列，其中s、t、u、v、x、y和z是0至8的整数，其中s至z中的至少两个(例如2、3、4、5、6、7或8个)≥1并且s至z中的至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)≥2，并且其中n是1至5的整数。在一些实施方案中，A是SEQ ID NO:8(TRP36R1)，并且B是SEQ ID NO:23(TRP140)。在一些实施方案中，s是4至8，t是2至4，并且n＝1。在一些实施方案中，u、v、x、y和z是零。在一些实施方案中，其中s＝8且t＝4。多肽可包含SEQ ID NO:27或由其组成。在一些实施方案中，s、t、u、v、x、y和z中的至少两个、三个、四个、五个或六个各自为2至3；并且其中n＝1。在一些实施方案中，A是TRP32(例如，SEQ IDNO:5的TRP32R3)，B是TRP120(SEQ ID NO:22)，C是TRP36R1(SEQ ID NO:8)，D是TRP140(SEQID NO:23)，E是TRP28(SEQ ID NO:2)，并且F是HSP(SEQ ID NO:24)。在一些实施方案中，z＝0。多肽可包含SEQ ID NO:28或由其组成。在一些实施方案中，多肽是表2或(SEQ ID NO:25至35或43至44)中任一个的多肽。

本发明的另一方面涉及药物制剂，其包含本文中公开的(例如，式I的或表2中的)或如上所述的多肽，以及可药用赋形剂。药物制剂可被配制用于肠胃外、静脉内、皮下、鼻内、舌下或皮内施用。可药用赋形剂可包含佐剂或由其组成。在一些实施方案中，佐剂是乳剂或脂质体，或者其中佐剂包含脂质。乳剂可以是水包油(O/W)乳剂或油包水(W/O)乳剂。在一些实施方案中，佐剂包含三萜类化合物、固醇、免疫调节剂、聚合物(例如，二乙基-氨基乙基(DEAE)-右旋糖酐、聚乙二醇或聚丙烯酸)和/或免疫刺激性寡核苷酸(例如，含CpG的ODN)。在一些实施方案中，佐剂包含DEAE右旋糖酐、免疫刺激性寡核苷酸和油例如矿物油，其中免疫刺激性寡核苷酸是含CpG的ODN，并且其中佐剂制剂是油包水(W/O)乳剂。在一些实施方案中，佐剂包含皂苷、固醇、季铵化合物、聚合物和ORN/ODN。在一些实施方案中，皂苷是Quil A或其纯化级分，固醇是胆固醇，季铵化合物是二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)，聚合物是聚丙烯酸，并且ORN/ODN是CpG。在一些实施方案中，皂苷以每剂量约1μg至约5,000μg的量存在，固醇以每剂量约1μg至约5,000μg的量存在，季铵化合物以每剂量约1μg至约5,000μg的量存在，并且聚合物以约0.0001％v/v至约75％v/v的量存在。在一些实施方案中，佐剂还包含糖脂，例如N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-β-D-吡喃型葡糖基)-N-十八烷基十二酰胺乙酸酯。在一些实施方案中，佐剂包含包含三萜类化合物皂苷、固醇、季铵化合物和聚丙烯酸聚合物。在一些实施方案中，皂苷是Quil A或其纯化级分，固醇是胆固醇，并且季铵化合物是二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)。在一些实施方案中，皂苷以每剂量约1mg至约5,000mg的量存在，固醇以每剂量约1mg至约5,000mg的量存在，季铵化合物以每剂量约1mg至约5,000mg的量存在，并且聚丙烯酸聚合物以约0.0001％v/v至约75％v/v的量存在。佐剂可包含油包水乳剂。油包水乳剂可包含油相和水相、聚阳离子载体(例如DEAE右旋糖酐)和含CpG的免疫刺激性寡核苷酸。在一些实施方案中，组合物还包含氢氧化铝凝胶。在一些实施方案中，聚阳离子载体是DEAE右旋糖酐。组合物可包含乳剂或水包油(O/W)乳剂。在一些实施方案中，乳剂包含水相，该水相包含烷基-聚丙烯酸(烷基-PAA)或者丙烯酸聚合物和二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)两者。在一些实施方案中，水包油乳剂的水相包含二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)和烷基-聚丙烯酸(烷基-PAA)。在一些实施方案中，烷基-PAA是癸基-PAA、辛基-PAA、丁基-PAA或甲基-PA。在一些实施方案中，丙烯酸聚合物是与聚烯丙基蔗糖交联的丙烯酸的聚合物。组合物可包含油包水(W/O)乳剂，所述油包水乳剂包含非矿物油和乳化剂(例如，二缩甘露醇一油酸乳化剂)。在一些实施方案中，佐剂是MF59、AS01、AS02、AS03、AS04、病毒微体、CAF01、CAF04、CAF05、丙烯酸聚合物/DDA乳剂、CpG/DEAE乳剂、皂苷/胆固醇/DDA佐剂或聚丙烯酸聚合物乳剂。在一些实施方案中，组合物还包含埃立克体细菌疫苗。细菌疫苗可以是例如热灭活的犬埃立克体、化学灭活的犬埃立克体、热灭活的查菲埃立克体或化学灭活的查菲埃立克体。在一些实施方案中，细菌疫苗是已用甲醛、福尔马林、双亚乙基胺、辐射、紫外线、β-丙内酯处理或甲醛灭活的化学灭活的细菌疫苗。

本发明的另一方面涉及编码本文中提供的(例如，式1的或表2中的多肽)或如上所述的多肽的核酸。核酸可以是DNA片段。核酸可包含在表达载体中。

本发明的另一方面涉及包含本文中提供的(例如，式1的或表2中的多肽)或如上所述的核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，细胞表达核酸。

本发明的另一方面涉及在受试样品中检测特异性结合埃立克体生物体的抗体的方法，其包括：(a)接触本文中提供的(例如，式1的或表2中的多肽)或如上所述的分离的多肽；(b)检测肽-抗体复合体；其中肽-抗体复合体的检出指示在受试样品中存在对埃立克体生物体具有特异性的抗体，并且其中肽-抗体复合体的不存在指示在受试样品中不存在对埃立克体生物体具有特异性的抗体。埃立克体生物体可以是查菲埃立克体生物体或犬埃立克体生物体。检测步骤可以包括进行酶联免疫测定、放射免疫测定、免疫沉淀、荧光免疫测定、化学发光测定、免疫印迹测定、侧向流测定、流式细胞术测定、多重免疫测定、质谱测定或基于颗粒的测定。检测步骤可以包括侧向流测定或酶联免疫测定，其中酶联免疫测定是ELISA。

本发明的另一方面涉及在哺乳动物对象中鉴定埃立克体感染的方法，其包括：(a)在允许形成肽-抗体复合体的条件下，使来自对象的生物样品与本文中提供的(例如，式1的或表2中的多肽)或如上所述的分离的多肽接触；以及(b)检测肽-抗体复合体；其中肽-抗体复合体的检出指示对象患有埃立克体感染。检测步骤可以包括进行酶联免疫测定、放射免疫测定、免疫沉淀、荧光免疫测定、化学发光测定、免疫印迹测定、侧向流测定、流式细胞术测定、多重免疫测定、浸棒测试(dipstick test)或基于颗粒的测定。在一些实施方案中，对象是人或狗。

本发明的另一方面涉及试剂盒，其包含：(a)本文中公开的或如上所述的分离的多肽(例如，式1的或表2中的多肽)，(b)与报道分子连接的抗狗或抗人二抗；以及(c)用于检测报道分子的合适试剂。肽可以固定在膜或微量滴定板上。报道分子可以选自萤光素酶、辣根过氧化物酶、发光纳米粒、P-半乳糖苷酶和荧光标记。发光纳米粒可以是铝酸锶纳米粒。试剂盒可还包含用于狗或人血清的稀释缓冲液。试剂盒可包含侧向流免疫测定或侧向流免疫色谱测定。在一些实施方案中，试剂盒包含酶联免疫吸附测定(ELISA)。

本发明的另一方面涉及在哺乳动物对象中诱导免疫应答的方法，其包括向对象施用有效量的包含本文中提供的多肽(例如，式1的或表2中的多肽)的药物制剂或如上所述的药物制剂。对象可以是人或狗。药物制剂可以通过皮下、肌内、鼻、通过吸入或气雾剂递送或皮内施用。

本发明的另一方面涉及在对象中治疗查菲埃立克体或犬埃立克体感染的方法，其包括：(a)在允许形成肽-抗体复合体的条件下，使来自对象的生物样品与本文中提供的(例如，式1的或表2中的多肽)或如上所述的分离的多肽接触；(b)检测肽-抗体复合体；其中肽-抗体复合体的检出指示对象患有查菲埃立克体或犬埃立克体感染；以及(c)在对象中施用治疗性化合物以治疗埃立克体感染。检测步骤可以包括进行酶联免疫测定、放射免疫测定、免疫沉淀、荧光免疫测定、化学发光测定、免疫印迹测定、侧向流测定、流式细胞术测定、多重免疫测定、浸棒测试或基于颗粒的测定。对象可以是狗或人。治疗性化合物可以是抗生素(例如，多西环素)。

本文中使用的术语“连续重复”当用于描述核酸序列或氨基酸序列时，表示该序列在多肽中以从N端至C端方向重复。例如，对于氨基酸序列–X₁–，如果该序列重复零次，则其作为–X₁–不重复地包含在多肽中。如果序列–X₁–连续重复一次，则多肽包含–X₁–X₁–。如果序列–X₁–连续重复两次，则多肽包含–X₁–X₁–X₁–。序列–X₁–的连续重复数可以用式–(X₁)_(n+1)–描述，其中_(n+1)是指连续重复数。优选地，连续重复的序列进行重复而没有任何接头或间隔区序列将连续重复的序列分开。然而，在一些实施方案中，间隔区或接头(例如，甘氨酸接头，例如–G–、–GG–或–GGG–)可用于分开连续重复的序列。在一些优选的实施方案中，不同的连续重复序列被间隔区或接头(例如，甘氨酸接头，例如–G–、–GG–或–GGG–)分开；例如，在序列–X₁–X₁–GG–X₂–X₂–X₂–中，序列–X₁–连续重复一次，并且序列–X₂–连续重复两次，其中不同的连续重复序列被甘氨酸接头–GG–分开。

本文中使用的术语“多肽”涵盖包含至少50个氨基酸残基，并且更优选至少100个氨基酸残基的氨基酸链，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本文中使用的“抗原性多肽”或“免疫反应性多肽”是这样的多肽：当其被引入脊椎动物中时可以刺激脊椎动物中抗体的产生(即是抗原性的)，并且其中该抗体可以选择性地识别和/或结合该抗原性多肽。抗原性多肽可包含以下或由以下组成：如本文中所述源自免疫反应性埃立克体蛋白的免疫反应性序列；例如表1、表2和式I)中的多肽，并且多肽可包含一个或更多个另外的序列。在一些实施方案中，另外的序列可以源自天然埃立克体抗原，并且可以是异源的，并且这样的序列可以(但不需要)是免疫原性的。在一些实施方案中，抗原性多肽或免疫反应性多肽可以共价结合至固体基底，例如在免疫测定(例如侧向流测试)等中。

如本文中所述(例如，表2或式I中)的埃立克体免疫反应性多肽可以是重组多肽、合成多肽、纯化的多肽、固定的多肽、可检测地标记的多肽、包封的多肽或载体表达的多肽。在多个实施方案中，本文中提供的埃立克体免疫反应性多肽可以是截短的或可包含缺失突变，而不会消除所得肽或多肽的免疫反应性。本文中公开的免疫反应性肽或多肽也可包含在配制用于向人或犬对象施用的药物组合物(例如疫苗组合物)中。

本文中使用的“细菌疫苗”是指可以用作疫苗或免疫原性组合物的组分的一种或更多种杀伤的细菌。细菌疫苗可包含在悬浮液中。在一些优选的实施方案中，细菌疫苗是热灭活的埃立克体(例如，热灭活的犬埃立克体)或化学灭活的埃立克体(例如，化学灭活的犬埃立克体)。

本文中使用的“佐剂”是指提高针对抗原的体液免疫应答或细胞免疫应答的任何物质。在一些实施方案中，佐剂用于允许抗原从疫苗注射部位受控释放以及刺激接受疫苗组合物的对象的免疫系统两种情况。

本文中使用的“基本上不含”就指定组分而言在本文中用于意指该指定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。由组合物的任何意外污染引起的指定组分的总量优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分的量的组合物。

如本文中在说明书中所使用的，没有数量词修饰的名词可以意指一个/种或更多个/种。如本文中在权利要求中所使用的，当与词“包括/包含”结合使用时，没有数量词修饰的名词可以意指一个/种或更多个/种。

虽然本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义，但是权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥。本文中使用的“另外的”可意指至少第二或更多。

在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括用于确定值的装置、用于确定值的方法的固有变化或误差，或者在研究对象或样品之间存在的变化。

通过以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，尽管表明了本发明的一些优选实施方案，但是详细描述和具体实施例仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得明显。

附图说明

以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或更多个结合本文中提出的一些具体实施方案的详细描述可更好地理解本发明。

图1：查菲埃立克体嵌合体TRP32/TRP120/A34(组合＝SEQ ID NO:25)的纯化和表征。TRP32R1＝SEQ ID NO:3；TRP32R2＝SEQ ID NO:4；TRP32R3＝SEQ ID NO:5；TRP32R4＝SEQ ID NO:6；TRP120＝SEQ ID NO:22；A34N1＝SEQ ID NO:7。

图2：查菲埃立克体嵌合体TRP140/TRP36/TRP19(组合＝SEQ ID NO:26)的纯化和表征。TRP19＝SEQ ID NO:1；TRP36＝SEQ ID NO:8；TRP140＝SEQ ID NO:23。

图3：犬埃立克体嵌合体TRP36/TRP140(组合＝SEQ ID NO:27)的纯化和表征。TRP36＝SEQ ID NO:8；TRP140＝SEQ ID NO:23。

图4：查菲埃立克体和犬埃立克体嵌合体TRP32/TRP120/TRP36/TRP140/HSP(组合＝SEQ ID NO:28)的纯化和表征。TRP32＝SEQ ID NO:5；TRP120＝SEQ ID NO:22；TRP36＝SEQ ID NO:8；TRP140＝SEQ ID NO:23；P28＝SEQ ID NO:2；HSP＝SEQ ID NO:24。

图5：查菲埃立克体和犬埃立克体嵌合体TRP120/TRP140/TRP36/TRP28(组合＝SEQID NO:29)的纯化和表征。TRP120＝SEQ ID NO:22；TRP140＝SEQ ID NO:23；TRP36＝SEQ IDNO:8；P28＝SEQ ID NO:2。

图6：另外的埃立克体嵌合多肽。

具体实施方式

在一些实施方案中，本文中所述的免疫反应性多肽(例如式I的多肽或表2中的多肽)可以用作诊断或预防工具，以用于埃立克体感染的检测或免疫接种。在一些具体的实施方案中，本文中公开的免疫反应性多肽可用于液相测定中，或者其中将分离的免疫反应性多肽固定在支持基底的表面上的测定中。或者，如本文中所述的免疫反应性多肽可包含在疫苗制剂中，以在对象中诱导保护性免疫应答或针对查菲埃立克体的免疫应答。本文中所述的一种或更多种免疫反应性多肽可以使用本领域通常已知的方法通过共价连接、封装或吸附被固定在表面上，并且可以包括使用肽可与之偶联、缀合或交联的交联剂、捕获分子等。

I.嵌合多肽

如前述概述中所述的，本公开内容的某些方面涉及嵌合埃立克体多肽，例如包含表1的至少两种肽或表2的多肽的或由其组成的多肽。可以产生嵌合多肽以包含表1的至少两种肽，其可以在多肽中连续重复(例如2至8次，优选2至6次，或者甚至更优选2至4次)。嵌合多肽可包含上述免疫原性肽中的3、4、5种或更多种。每一种免疫原性肽可以在嵌合多肽中重复0、1、2、3、4、5、6、7或8次。示例性构型包括但不限于2x2、2x2x2、2x2x2x2、3x2、2x3、3x2x2、2x3x2、2x2x3、3x2x2x2、2x3x2x2、2x2x3x2、2x2x2x3、3x3、3x3x3、3x3x2、2x2x3、3x3x3x3、3x3x3x6和2x2x4x2x2x2。

表1：埃立克体免疫原性肽。

在一些实施方案中，预期在嵌合多肽内TRP36R1、TRP36R2和TRP36R3可转换。例如，在一些实施方案中，可以将嵌合多肽中的TRP36R1序列转换为TRP36R2或TRP36R3。在一些实施方案中，可以将嵌合多肽中的TRP36R1、TRP36R2或TRP36R3序列转换为TRP36CO。在一些实施方案中，已经观察到TRP36R1、TRP36R2、TRP36R3和/或TRP36CO可以连续地位于嵌合多肽中，例如，如SEQ ID NO:11至16和38至43中所示。在一些实施方案中，TRP36R1、TRP36R2、TRP36R3和/或TRP36CO中的2种、3种或全部可以连续地位于嵌合多肽中。类似地，预期在一些实施方案中，在嵌合多肽内TRP32R1、TRP32R2、TRP32R3和TRP32R4可转换。在一些实施方案中，TRP32R1、TRP32R2、TRP32R3和/或TRP32R4中的2种、3种或全部可以连续地位于嵌合多肽中(例如，其中多肽包含-TRP32R1-TRP32R2-TRP32R3-或-TRP32R1-TRP32R2-TRP32R3-TRP32R4-等)。

可以产生嵌合多肽以包含上述肽中的至少两种，其可以在多肽中连续重复(例如，一次，2至8次，优选2至6次，或者甚至更优选2至4次)。嵌合多肽可包含来自表1的上述免疫原性肽中的3、4、5或更多种。每一种免疫原性肽可以在嵌合多肽中重复1、2、3、4、5、6、7或8次。多肽构建体中的肽可以被接头分开。接头可以是聚甘氨酸接头(例如，GG、GGG、GGGG或GGGGG)。多肽构建体可包含热激蛋白(heat shock protein，HSP)序列(SEQ ID NO:24)。由如下所列(例如，表2)的上述免疫原性肽产生构建体，并且示例性的嵌合多肽在图1至5中示出。

在一些实施方案中，嵌合多肽可包含至少两种或三种免疫原性肽同种型。例如，可以通过以表1所列的多种构型连接TRP36R1、TRP36R2、TRP36R3和/或TRP36CO来产生多肽，所述构型包括TRP36R1-R2-R3、TRP36R1-R3-R2、TRP36R2-R1-R3、TRP36R2-R3-R1、TRP36R3-R1-R2、TRP36R3-R2-R1、TRP36CO-R1、TRP36R1-CO、TRP36CO-R3、TRP36R3-CO、TRP36R1-R3和TRP36R3-R1。可以通过将TRP95R和TRP95C连接为TRP95R-C或TRP95C-R来产生多肽。在一些实施方案中，可以通过以多种构型连接TRP32R1、TRP32R1、TRP32R3和/或TRP32R4来产生多肽。

在一些实施方案中，嵌合构建体可具有如下式I所述的序列：

式I：(A_s-B_t-C_u-D_v-E_w-F_x-G_y-H_z)_n，

其中A至H包含选自SEQ ID NO:1至24和36至42的肽，s至z是0至8的整数，其中s至z中的至少两个≥1并且s至z中的至少一个≥2，并且n是1至5的整数。肽A至H可以各自独立地选自SEQ ID NO:1至24和36至42。优选地，嵌合构建体可以具有式I的序列，其中s至z中的至少两个≥2。嵌合构建体可包含接头或间隔区以分开式I的肽A至H。

式I的示例性衍生物可以包括但不限于：

A₂-B₂-C₂；

A₁-B₃-C₃；

A₃-B₃-C₃；

A₂-B₂-C₂-D₂；

A₃-B₂-C₂-D₂；

A₃-B₃-C₆-D₃；

(A₁-B₂-C₁)₃；

A₈-B₄；和

A₂-B₂-C₄-D₂-E₂-F₂。

在一些实施方案中，式I的多肽包含SEQ ID NO：11至16或38至42中的任一个或由其组成。在一些实施方案中，式I的多肽包含表2的多肽或由其组成。

表2：嵌合埃立克体多肽

在一些实施方案中，预期与表2的多肽或式I的多肽具有至少90％，更优选至少95％、97.5％或至少99％序列同一性的、保留其至少一些免疫反应性的多肽可以用于本文中所述的多个实施方案中(例如，在诊断测试中，或者以在对象中诱导针对埃立克体的免疫应答，用于包含在疫苗组合物中)。在一些实施方案中，多肽可用于产生选择性结合蛋白质的抗体，并且该抗体可用于例如诊断测定中；例如，在一些实施方案中，抗体被标记或连接至固体基底(例如，在侧向流测试中)。

在一些方面中，特定肽的连续重复可包含免疫原性肽的两种或更多种同种型。例如，连续重复可包含TRP32R1、TRP32R2、TRP32R3和/或TRP32R4。另一个连续重复可包含TRP95C和TRP95R，或TRP36的不同同种型，包括TRP36R1、TRP36R2、TRP36R3和/或TRP36CO。因此，在一些实施方案中，蛋白质的相同或不同同种型可以因此连续重复而不通过间隔区或甘氨酸间隔区分开。

在一些实施方案的嵌合埃立克体多肽中可以使用多种接头或间隔区。在一些实施方案中，接头或间隔区可以是一个或更多个氨基酸(例如2、3、4、5、10、15或20个氨基酸)的随机串。在另一些实施方案中，接头具有特定序列。例如，在一些实施方案中，接头或间隔区可以是聚甘氨酸接头(例如，GG、GGG或GGGG；在本文中也称为甘氨酸接头)。可以在多个实施方案中使用的其他接头或间隔区包括，例如218(GSTSGSGKPGSGEGSTKG；SEQ ID NO:45)、HL(EAAAK；SEQ ID NO:46)和G₄S(GGGGS；SEQ ID NO:47)接头。在一些优选的实施方案中，不同的连续重复序列的组在多肽中通过接头或间隔区例如甘氨酸接头分开(例如，–X₁–X₁–X₁–GGG–X₂–X₂–显示氨基序列–X₁–连续重复两次，氨基酸序列–X₂–连续重复一次，并且不同的连续重复序列通过聚甘氨酸接头–GGG–分开)。

在一些实施方案中，可以将本文中提供的免疫反应性多肽(例如，源自表1中的两种或更多种肽或表2中的多肽)固定在支持物或固体基底的表面上；例如，可以通过偶联、交联、吸附、包封或通过本领域已知的任何合适的方法直接或间接地固定免疫反应性多肽。作为非限制性实例，通过使肽在合适的缓冲液中与孔表面接触合适的时间，可以实现本文中公开的免疫反应性多肽通过吸附与微量滴定板中的孔或与膜的结合。接触时间可以随温度而变化，但是当使用的肽量为约50ng至约1mg，并且优选约250至700ng或约450至550ng时，接触时间通常为约1小时至1天。

在一些实施方案中，通过首先使支持物与将与支持物和肽上的官能团(例如羟基或氨基)发生化学反应(即，交联)的试剂接触，将本文中公开的免疫反应性多肽共价连接至支持基底。例如，免疫反应性多肽可通过肽的任一端上的胺或羧基与表面交联，并且肽可通过多肽每一端上的基团交联(即头尾交联)。这样的肽(即头尾交联的或以其他方式固定的肽)可用在本公开内容的诊断和治疗方法二者中。

在一些实施方案中，分离的多肽包含式I多肽或表2多肽的序列，其中分离的肽或多肽固定在支持基底的表面上。在一些实施方案中，多肽选自表2。用于肽固定的许多支持基底是本领域中已知的，其可以与本文中公开的免疫反应性多肽一起使用，由诸如胶乳、聚苯乙烯、尼龙、硝酸纤维素、纤维素、二氧化硅、琼脂糖、无机聚合物、脂质、蛋白质、糖或磁性树脂的物质形成。本领域普通技术人员可以选择适合于给定应用的支持基底。在一些具体的实施方案中，支持基底可以是反应室、微板孔、膜、过滤器、纸、乳剂、珠、微珠、微球、纳米晶体、纳米球、浸棒、卡片、玻璃载片、微载片、侧向流装置、微芯片、梳状物(comb)、二氧化硅颗粒、磁性颗粒、纳米粒或自组装单层。

II.可检测地标记的免疫反应性多肽

免疫反应性多肽(例如，包含表1的两种或更多种肽，或表2的多肽)可缀合或连接至可检测标记，例如放射性同位素、非放射性同位素、颗粒标记、荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、酶标记或比色标记。可检测地标记的多肽可以例如用于诊断或预防方法和组合物中。在某些实施方案中，可检测地标记的免疫反应性多肽的多肽部分可以固定在支持基底的表面上。在另一些实施方案中，可检测标记可用于将可检测地标记的免疫反应性肽固定至支持基底的表面。

本文中使用的“可检测标记”是由于其特定的功能特性和/或化学特征而可以被检测的化合物和/或元素，其的使用允许其连接的肽可以被检测和/或如果需要的话进一步被量化。

在一些实施方案中，探针是光致发光探针，例如荧光团或纳米粒，例如铝酸锶纳米粒(例如，参见Paterson et al.,2014)。示例性的标记包括，但不限于：颗粒标记，例如胶体金；放射性同位素，例如砹²¹¹、¹⁴碳、⁵¹铬、³⁶氯、⁵⁷钴、⁵⁸钴、铜⁶⁷、¹⁵²Eu、镓⁶⁷、³氢、碘¹²³、碘¹²⁵、碘¹³¹、铟¹¹¹、⁵⁹铁、³²磷、铼l86、铼l88、⁷⁵硒、³⁵硫、锝-99、锝-99m或钇⁹⁰；比色标记，例如二硝基苯、丹酰氯、丹磺酰氯(dabsyl chloride)，偶氮、花色素苷或三嗪染料中的任一种，或发色团，其在美国专利5.470,932、5,543,504或6,372,445(其全部通过引用并入本文)中公开；顺磁性标记，例如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)；荧光标记，例如Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade蓝、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、俄勒冈绿(Oregon Green)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明和/或德克萨斯红(Texas Red)、或萤虫黄(Lucifer Yellow)；酶标记，例如脲酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶；或化学发光标记，例如鲁米诺(luminol)、双酮酞嗪等，以及美国专利4,373,932、4,220,450、5,470,723和美国专利申请2007/0264664(其全部通过引用并入本文)中的任一个中公开的其他物质。

III.产生免疫反应性多肽的方法

如本文中所述的免疫反应性多肽可以使用体外转录和翻译(in vitrotranscription and translation，IVTT)方法来产生，可以使用多种细胞类型(例如细菌细胞、哺乳动物细胞、大肠杆菌(E.coli)、酵母和昆虫细胞等)重组产生，或者在一些情况下可以合成(例如使用固相合成)。在一些实施方案中，IVTT和合成方法可以提供相对于重组方法的某些优点，因为所得多肽可以以高度纯的形式产生，而不含当使用重组蛋白时可导致假阳性反应的污染性细菌或其他蛋白质。因此，IVTT和合成方法的优点是缺少许多通常与重组方法有关的昂贵且费力的纯化操作。

多种IVTT方法在本领域中是已知的，并且可以在多个实施方案中使用。IVTT通常涉及由DNA产生或合成蛋白质的无细胞方法。用于蛋白质产生的无细胞系统可以使用例如大肠杆菌提取物、原生动物提取物、酵母提取物、人细胞提取物、麦胚芽提取物、哺乳动物提取物、培养的人细胞系提取物、兔网织红细胞裂解物、昆虫细胞提取物，或者重组和纯化的大肠杆菌组分。多种试剂盒是可商购的，包括例如RTS(FivePrime，San Francisco，CA)、Expressway^TM(Life Technologies)；S30 T7 high yield(Promega)、One-step human IVT(Thermo Scientific)、

(CellFree Sciences)、

coupled(Promega)、RTS CECF(5PRIME)、

Coupled(Promega)、Retic lysate IVT^TM(LifeTechnologies)；

T7(Promega)、EasyXpress Insect kit(Qiagen/RiN A)、

(New England Biolabs)和

(BioComber)。如果需要的话，这样的方法可用于将非天然氨基酸并入到蛋白质中。例如，在Zemella et al.,2015中也描述了可用于多个实施方案的无细胞表达系统。

在一些实施方案中，可以使用有机化学领域中已知的适当方法来产生本文中公开的分离的免疫反应性蛋白质。例如，可以使用本领域中公知的已建立的固相肽合成技术之一来产生肽。在一些实施方案中，可以使用可从商业供应商(例如Perkin Elmer(FosterCity，CA))广泛可获得的用于自动肽合成的设备来合成肽，或者可以使用液相技术(例如在Carpino et al.,2003或美国专利申请2009/0005535中描述的那些)来化学地合成肽。在一些实施方案中，可以例如使用固相肽合成(solid-phase peptide synthesis，SPPS)、t-Boc固相肽合成或Fmoc固相肽合成来合成肽或较短的蛋白质。

在一些实施方案中，如本文中所述的免疫反应性蛋白质可以由编码肽的核酸重组制备。这样的核酸可以与表达载体可操作地连接。作为非限制性实例，免疫反应性蛋白质可以由载体表达并且从包含载体的宿主细胞的生长培养基中分离。在一些实施方案中，免疫反应性蛋白质可以在无细胞系统中由编码肽的核酸产生。

本文中公开的固定的免疫反应性蛋白质可以直接或间接地缀合、交联或吸附到支持基底的表面上。在一些实施方案中，可以将固定的免疫反应性蛋白质或肽合成到支持基底上。

预期本领域已知的不影响所公开的肽的结构或功能的几乎任何蛋白质或肽固定方法都可以用于固定本文中公开的免疫反应性蛋白质或肽。例如，肽固定可以使用例如以下的交联剂或偶联剂实现：甲基-对羟基苯甲亚胺酸酯、N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯、使用磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(sSMCC)、N-[马来酰亚胺基己酰基氧基]磺基琥珀酰亚胺酯(sEMCS)、N-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)、双-重氮联苯胺(BDB)或N-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯(NAHT)，以及美国专利5,853,744、5,891,506、6,210,708、6,617,142、6,875,750、6,951,765、7,163,677和7,282,194(各自通过引用并入本文)中的任一个中公开的其他物质。免疫反应性蛋白质可以直接或间接缀合至具有表面涂层的任何市售支持基底，所述表面涂层包含交联剂、偶联剂、巯基或羟基衍生剂、羧基或胺反应性基团(例如马来酸酐)(例如，Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook,atA12-A13,1991)。

在一些实施方案中，本发明的蛋白质还可以使用金属螯合络合作用，使用例如与抗体连接的有机螯合剂，例如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；EDTA；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(美国专利No.4,472,509和4,938,948，各自通过引用并入本文)来固定。蛋白质和肽还可以通过与固定在表面上或存在于固定缓冲液(例如戊二醛或高碘酸盐)中的其他肽或缩合基团偶联来固定。与荧光标志物的缀合物也可以在这样的试剂的存在下或通过与异硫氰酸酯反应来制备。肽可以通过与亲和结合剂(例如生物素、链霉亲和素、多糖例如藻酸类、凝集素等)缀合、交联或结合而连接至表面。

通常，无论制备方法或固定状态如何，本文中公开的免疫反应性蛋白质优选以基本上纯的形式制备。优选地，免疫反应性蛋白质为至少约80％纯，更优选至少约90％纯，并且最优选至少约99％纯。

IV.生物功能等同物

优选的免疫反应性多肽或其类似物特异性地或优先地结合查菲埃立克体或犬埃立克体特异性抗体。确定特定免疫反应性多肽或其类似物是否或以何种程度可以结合查菲埃立克体或犬埃立克体特异性抗体可以使用例如以下的体外测定来评估：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、免疫染色、乳胶凝集(latex agglutination)、间接血凝测定(indirect hemagglutination assay，IHA)、补体结合(complement fixation)、间接免疫荧光测定(FA)、比浊法、流式细胞术测定、化学发光测定、侧向流免疫测定、u-捕获测定、质谱测定、基于颗粒的测定、抑制测定和/或亲合力测定。

本公开内容的免疫反应性多肽可以被修饰以包含不改变其与抗埃立克体抗体结合区的各自相互作用的氨基酸替换、插入和/或缺失。来源于埃立克体蛋白质的免疫反应性多肽的这样的生物功能等同物可以是具有相似特征或在其他方面期望的特征(即埃立克体特异性抗体的结合)的分子。作为一个非限制性实例，在本文中公开的免疫反应性多肽中某些氨基酸可以被替换成其他氨基酸而没有可感知的相互作用能力损失，如通过抗体结合可检测地未改变所表明的。因此，考虑在序列和/或结构上被修饰但是其生物学效用或活性未改变的本文中公开的免疫反应性多肽(或编码这样的多肽的核酸)仍在本发明的范围之内。免疫反应性多肽可以与野生型查菲埃立克体多肽具有例如至少90％、95％或99％的序列同一性，并且在一些实施方案中，与相应的野生型查菲埃立克体多肽相比，免疫反应性蛋白质可以具有1、2、3、4、5或更多个氨基酸替换、插入和/或缺失。在一些实施方案中，突变是保守替换。

技术人员还充分理解的是，生物功能等同肽的定义所固有的是这样的概念：存在对可在分子的限定部分中做出同时仍然维持可接受水平的等同生物活性的改变的数量的限制。因此，本文中将生物功能等同多肽定义为其中某些(不是大部分或所有)氨基酸可被替换的那些肽。当然，根据本发明可容易地制备和使用多种具有不同替换的不同肽。

技术人员还意识到，在显示某些残基(例如在特定表位中的残基)对肽的生物或结构特性特别重要的情况下，这样的残基通常可不进行交换。预期本文中公开的免疫反应性肽或多肽中的突变可导致物种特异性的丧失，并且进而降低所得肽用于产生抗埃立克体免疫应答的方法的效用。因此，抗原性的(即，特异性结合抗埃立克体抗体)并且包含保守氨基酸替换的多肽被理解为包含在本公开内容的方面中。保守替换最不可能显著地改变蛋白质的活性。“保守氨基酸替换”是指将氨基酸用化学上相似的氨基酸替换，即将非极性氨基酸用其他非极性氨基酸替换；将极性氨基酸用其他极性氨基酸替换，将酸性残基用其他酸性氨基酸替换，等。

氨基酸替换，例如可用于修饰本文中公开的免疫反应性多肽的那些，通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。对氨基酸侧链取代基的尺寸、形状和类型的分析揭示，精氨酸、赖氨酸和组氨酸全部是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸全部具有相似尺寸；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸全部具有大致相似的形状。因此，基于这些考虑，本文中将以下定义为生物功能等同物：精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。

本发明还考虑了本文中公开的查菲埃立克体免疫反应性多肽的同种型。同种型包含与本文中公开的查菲埃立克体多肽相同数目和种类的氨基酸，但同种型具有不同的分子结构。本公开内容所考虑的同种型是与本文中所述的本发明肽具有相同特性的那些。

可通过对现有氨基酸进行化学修饰或通过从头合成本文中公开的多肽在蛋白质中并入非标准氨基酸。非标准氨基酸是指与由遗传密码所编码的二十种标准氨基酸在化学结构上不同的氨基酸，并且多种非标准氨基酸在本领域中是公知的。

在一些选定的实施方案中，本公开内容考虑了本文中公开的免疫反应性多肽的化学衍生物。“化学衍生物”是指具有一个或更多个通过功能性侧基的反应而化学衍生化的残基并且保留生物活性和效用的肽。这样的衍生化多肽包括，例如，其中游离氨基已被衍生化以形成特定盐或通过烷基化和/或酰化来衍生对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基、甲酰基或乙酰基等的那些。游离羧基可被衍生化以形成有机或无机盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼并且优选酰胺(伯胺或仲胺)。化学衍生物可包括包含二十种标准氨基酸中的一种或更多种天然存在氨基酸衍生物的多肽。例如，可将4-羟脯氨酸替换为丝氨酸；以及可将鸟氨酸替换为赖氨酸。

应注意，所有氨基酸残基序列在本文中均用其左右取向为氨基末端至羧基末端的常规方向的式来表示。此外，应注意，在氨基酸残基序列的起点或末端的短划线表示与具有一个或更多个氨基酸残基的另外序列的肽键。本文中所述的氨基酸优选是“L”异构体形式。然而，“D”异构体形式中的残基可被替换为任何L-氨基酸残基，只要蛋白质保留本文中所述的期望功能特性即可。与标准蛋白质命名法一致，氨基酸残基的缩写在本领域中是已知的。

除了以上讨论的生物功能等同物之外，考虑了可以配制结构相似的化合物以模拟本文中公开的免疫反应性肽的关键部分。这样的化合物可被称为肽模拟物，其可以以与本文中公开的免疫反应性肽相同的方式使用，并且因此也是功能等同物。用于产生特定结构的方法公开于例如Mizuno et al.,2017以及美国专利5,446,128、5,710,245、5,840,833、5,859,184、5,440,013、5,618,914和5,670,155中。

V.检测埃立克体感染的方法

人中的埃立克体病通常是指由无形体科(Anaplasmataceae)(主要是埃立克体和无形体(Anaplasma)属)中的专性胞内细菌引起的感染。人埃立克体病(HE)的大多数病例是由3种不同的物种引起的：查菲埃立克体是其中主要的(Dumler et al.,2007)。动物中的埃立克体感染也称为埃立克体病，以及由来自埃立克体、无形体、新立克次体(Neorickettsia)和考德里体(Cowdria)属的多种病原体组造成的多种疾病(Dumler etal.,2007)。埃立克体感染主要在单核细胞或粒细胞中持续存在，并且研究表明抗体在针对埃立克体感染的免疫应答中起着至关重要的作用(Feng and Walker,2004；Winslow etal.,2003；Winslow et al.,2000；Yager et al.,2005)。

因此，本公开内容的一些选定实施方案提供了在样品中检测特异性结合埃立克体生物体的抗体的方法。这样的方法可包括在允许肽-抗体复合体形成的条件下，使包含表1的至少两种肽或表2的多肽的分离的埃立克体免疫反应性多肽与受试样品接触，以及检测肽-抗体复合体。在这些实施方案中，肽-抗体复合体的检出指示在受试样品中存在对埃立克体生物体具有特异性的抗体，并且肽-抗体复合体的不存在指示在受试样品中不存在对埃立克体生物体具有特异性的抗体。

在多个实施方案中，与埃立克体特异性抗体结合的本文中公开的免疫反应性多肽(即，肽-抗体复合体)的检测可以使用以下实现：酶联免疫测定(例如，夹心ELISA或竞争性ELISA)、放射免疫测定、免疫沉淀、荧光免疫测定、化学发光测定、免疫印迹测定、侧向流测定、流式细胞术测定、质谱测定、乳胶凝集、间接血凝测定(IHA)、补体结合、抑制测定、亲合力测定、浸棒测定或基于颗粒的测定。在一些优选的实施方案中，使用酶联免疫测定、侧向流测定或基于颗粒的测定来检测本文中所述的肽-抗体复合体。

本文中使用的“样品”是包含或被怀疑包含抗体的任何样品。优选地，样品是全血、痰、血清、血浆、唾液、脑脊液或尿。在一些实施方案中，样品是获自对象或患者的血液、血清或血浆样品。

在人中由查菲埃立克体感染引起的埃立克体病表现出发热、发冷、头痛和肌肉疼痛的流感样症状。在更严重的情况下，还可观察到恶心、食欲减退、体重减轻、腹痛、咳嗽、腹泻和精神状态改变。人中的埃立克体病是潜在致命的。

在狗中，埃立克体病最常由查菲埃立克体或犬埃立克体引起，并且以三个阶段进展：急性阶段、亚临床阶段和慢性阶段。急性阶段通常在感染后延续数周，并且以类似于人埃立克体病的那些的症状(例如发热、嗜睡、食欲减退、气短、关节痛和僵硬)为特征，并且还可包括更严重的症状，例如贫血、抑郁、挫伤、以及增大的淋巴结、肝和脾。亚临床阶段可持续数年，并且尽管可检测到针对埃立克体抗原的抗体，但很多时候不表现出症状。埃立克体感染的慢性阶段通常以体重减轻、贫血、神经功能障碍、出血、眼部炎症、腿部水肿和发热的复发性症状为特征，并且呈现出通常导致对白血病的误诊的血液谱。进展至疾病慢性阶段的埃立克体感染通常是致命的。

埃立克体感染的非特异性症状及其与轻度和重度流感症状的相似性使得难以在人和狗中诊断埃立克体病。诊断可进一步受到当前针对埃立克体感染的实验室测试操作的阻碍，该测试操作不是即时(point-of-care)测试，也就是说，该测试在患者可接受治疗的大多数医院、诊所以及医师或兽医办公室中不可用。

因此，本公开内容的一些选定实施方案提供了在哺乳动物对象中鉴定埃立克体感染的方法。这样的方法可包括在允许形成肽-抗体复合体的条件下，使来自对象的样品与本文中公开的分离的免疫反应性多肽(例如，包含表1的至少两种肽或更优选地表2的多肽)接触，以及检测肽-抗体复合体。在这些实施方案中，肽-抗体复合体的检出指示对象患有埃立克体感染。埃立克体生物体可以是查菲埃立克体生物体或犬埃立克体生物体。在一些实施方案中，对象是人或狗。与本文中公开的其他方法一样，检测步骤可以使用本领域已知的任何适当类型的测定来实现，并且可以优选地使用侧向流测定或ELISA来实现。

术语“对象”和“患者”在本文中可互换使用，并且可以指哺乳动物，特别是人或狗。在某些实施方案中，“对象”或“患者”是指哺乳动物埃立克体宿主(即，被埃立克体生物体感染的动物)。埃立克体宿主可以是例如人或非人灵长类、牛、犬、山羊、cavine、乌鸦(corvine)、epine、马、猫、hircine、兔、野兔(leporine)、狼、鼠、绵羊、猪、racine、狐狸等，包括牲畜、动物标本、外来物种以及伴侣动物、宠物以及在兽医的照料下的任何动物。对象可被或可不被埃立克体生物体感染，并且对象可以是被怀疑被埃立克体生物体感染的哺乳动物。

不希望受到理论的束缚，本文中公开的埃立克体免疫反应性多肽各自包含在人和动物中导致物种特异性免疫原性的主要埃立克体表位的至少一部分。术语“表位”在本文中用于表示免疫原性物质的被宿主免疫系统的抗体或细胞表面受体特异性鉴定、识别和结合的部分，其已经引起针对免疫原性物质的免疫应答，如通过本领域已知的任何方法所确定的(参见例如Geysen et al.,1984)。因此，“物种特异性”的表位是可用于将埃立克体属的一个物种与另一个埃立克体物种区分开的表位。

一些具体实施方案涉及确定对象是否已经针对埃立克体进行了免疫接种或者正在被埃立克体生物体活动性感染。在这些实施方案中，所述方法包括使来自对象的样品与不是埃立克体疫苗组分的表1的至少一种分离的免疫反应性肽或更优选地表2的多肽接触，以及检测样品中的抗体是否与分离的埃立克体免疫反应性多肽特异性结合。根据该方法，如果样品中的抗体与分离的埃立克体免疫反应性多肽特异性结合，则对象患有活性埃立克体感染，并且如果抗体不与分离的埃立克体免疫反应性肽特异性结合，则对象先前用埃立克体疫苗进行了免疫接种或未被埃立克体生物体感染。埃立克体生物体可以是查菲埃立克体生物体或犬埃立克体生物体。

可使用多种方法或试剂盒来将埃立克体免疫反应性多肽(例如，包含表1的至少两种肽或表2的多肽)用于结合埃立克体特异性抗体或查菲埃立克体特异性抗体。因此，抗体与本公开内容的免疫反应性肽之间的特异性结合可以通过本领域已知的任何适当方法来评估，所述方法包括但不限于：酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心ELISA、竞争性ELISA、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、乳胶凝集、间接血凝测定(IHA)、补体结合、间接免疫荧光测定(FA)、比浊法、流式细胞术测定、化学发光测定、侧向流免疫测定、u-捕获测定、质谱测定、基于颗粒的测定、抑制测定和亲合力测定。检测埃立克体特异性抗体与本文中公开的埃立克体免疫反应性多肽的结合的示例性方法可以包括，例如在微板中进行的ELISA，使用浸棒或侧向流装置进行的侧向流测试，或使用

系统(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)进行的基于颗粒的悬浮阵列测定。

A.ELISA

在某些实施方案中，本文中所述的肽-抗体复合体的检测使用酶联免疫吸附测定(ELISA)完成。该测定可以通过以下进行：首先将已经固定在固体支持物(通常是微量滴定板的孔)上的埃立克体免疫反应性多肽(例如，包含表1的至少两种肽或表2的多肽)与样品接触，使得对样品中的肽具有特异性的抗体能够与固定的肽结合。然后从固定的肽中除去未结合的样品，然后添加能够结合固定的抗体-多肽复合体的检测试剂。然后使用适合于特定检测试剂的方法确定与固体支持物结合的检测试剂的量。

在一些实施方案中，检测试剂包含与报道分子基团或标记缀合或共价连接的结合剂(例如蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白、凝集素或游离抗原)。示例性的报道分子基团或标记包括酶(例如辣根过氧化物酶)、底物、辅因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团和生物素。结合剂与报道分子基团或标记的缀合可以使用本领域普通技术人员已知的标准方法来实现。也可以从许多商业来源(例如，Zymed Laboratories,San Francisco,CA；以及Pierce,Rockford,IL.)购买与多种报道分子基团缀合的常见结合剂。

在本公开内容的一个方面中，可以通过将从样品中的报道分子基团或标记检测的信号的水平与对应于对照样品的信号水平或预定截止值进行比较来确定样品中存在或不存在埃立克体特异性抗体。在某些实施方案中，截止值可以是当固定的埃立克体免疫反应性肽与来自未被感染的对象的样品一起孵育时获得的平均信号。截止值可以使用统计方法或计算机程序来确定。

B.侧向流测试

侧向流测试也可以称为免疫色谱条(immunochromatographic strip，ICS)测试或简称为条测试。通常，侧向流测试是其中测试样品通过毛细作用或者作为替代在流体控制下沿着固体基底侧向流的一种测定形式。这样的测试通常是廉价的，需要非常少量(例如，一滴)的样品，并且通常可以在最少的训练下可重复地进行。许多侧向流测试形式的经济简便性和稳健性使得这些类型的测试对于即时鉴定埃立克体(例如查菲埃立克体或犬埃立克体)感染是理想的，当对象是例如在可治疗的感染急性期期间表现出可检测抗体的人或狗时，这可以是特别重要的。

示例性的侧向流装置形式包括但不限于浸棒、卡片、芯片、微载片和盒，并且在本领域中广泛证明了形式的选择在很大程度上取决于特定测定的特征。因此，侧向流装置现在在人和兽医医学中是普遍存在的，并且变化很大，为普通技术人员使用侧向流测定在样品中检测肽-抗体复合体提供了许多选择(参见美国专利7,344,893、7,371,582、6,136,610以及美国专利申请2005/0250141和2005/0047972或Koczula et al.(2016)中的任一个，各自通过引用并入本文)。作为一个非限制性实例，将来自被怀疑患有埃立克体感染的对象的样品应用于包含至少样品区和结合区的侧向流装置。样品可以是血清样品，并且可以从样品区侧向排除至结合区，所述结合区包含固定于侧向流装置的表面的本文中公开的埃立克体免疫反应性多肽(例如，包含表1的至少两种肽或表2的多肽)。在该实例中，侧向流装置上固定的埃立克体免疫反应性多肽的结合指示在来自对象的样品中存在埃立克体特异性抗体，指示对象中的埃立克体感染，例如对象中的查菲埃立克体感染。

在相关的实施方案中，如上所述的ELISA测定可以以快速流通、侧向流或条测试形式进行，其中抗原固定在膜上，例如硝酸纤维素膜上。在这种流通测试中，当样品通过膜时，样品中的埃立克体抗体与固定的埃立克体免疫反应肽结合。当包含检测试剂(例如用金、荧光团或发色团标记的蛋白A)的溶液流过膜时，检测试剂与肽-抗体复合体结合。然后可以根据所使用的检测试剂来检测与检测试剂结合的肽-抗体复合体(例如，基于存在或不存在可见的可检测颜色或荧光标记、纳米粒、发光稀土纳米粒、发光纳米粒、铝酸锶纳米粒(例如，参见Paterson et al.,2014；和Wang et al.,2017,etc.)。

在一个方面中，可以进行流通形式ELISA，其中膜的固定有埃立克体免疫反应性肽(例如，包含表1的至少两种肽或表2的多肽)的一端可以浸入包含样品的溶液中，或者可以将样品添加至膜一端的区域(即样品区)。样品沿着膜迁移通过包含检测试剂的区域(即标记区)，并且流至包含固定的埃立克体免疫反应性肽的区域(即结合区)。检测试剂在结合区的积累表明样品中存在埃立克体特异性抗体。

通常，流通ELISA可以以可视觉地读取的图案(例如线)应用于测试条的检测试剂为特征。与其他侧向流测试一样，不存在这样的图案通常指示阴性结果。普通技术人员能够选择用于固定在膜上的埃立克体免疫反应性多肽的量，当生物样品包含足以在标准形式ELISA中产生阳性信号的抗体水平时，该量可以产生视觉上可辨别的图案。优选地，固定在膜上的肽的量为约25ng至约1mg。

C.基于颗粒的测定

通常，基于颗粒的测定使用包被在颗粒(例如微珠、晶体、芯片或纳米粒)的表面上的捕获结合伴侣，例如在免疫测定的情况下的抗体或抗原。通过在单个测定中并入荧光标记的颗粒或不同尺寸的颗粒(各自包被或缀合一个或更多个标记的捕获结合伴侣)，可以将基于颗粒的测定有效地多路复用或修改以测定许多目的变量。灵敏的检测和扩增技术与本领域已知的基于颗粒的测定平台一起使用已经导致在执行本文中所述的方法中进行选择的众多灵活且灵敏的测定系统。例如，多路复用的基于颗粒的测定(例如可获自Bio-RadLaboratories,Inc(Hercules,CA)和Luminex,Inc.(Austin,TX)的悬浮液阵列

测定系统)可用于鉴定样品中的埃立克体抗体。

在一个方面中，本公开内容考虑了将分离的埃立克体免疫反应性多肽(例如，包含表1的至少两种肽或表2的多肽)固定在颗粒表面上，以用于基于颗粒的免疫测定。如本文中所述，将肽固定在支持物表面上的方法是本领域中公知的。在一个优选的实施方案中，将本文中公开的标记的免疫反应性多肽固定在颗粒的表面上，并且根据建立的方案将肽-颗粒复合体用于ELISA或流式细胞术测定中。

VI.埃立克体疫苗和免疫原性组合物

先前的研究表明，诱导抗体应答的埃立克体蛋白质可提供保护性免疫应答；因此，在一些实施方案中，本文中提供的埃立克体蛋白质(例如，式I的多肽或表2的多肽)可包含在药物组合物例如疫苗组合物中，以用于向哺乳动物或人对象施用。例如，已经在体外模型和动物模型中用针对OMP和TRP的表位特异性抗体证明了针对查菲埃立克体的保护(Kuriakose et al.,2012；Li et al.,2002；Li et al.,2001)，证明引起针对线性表位的强烈抗体应答的埃立克体蛋白质是保护性的。

在一些选定的实施方案中，考虑了式I的埃立克体免疫反应性多肽或表2的多肽可包含在疫苗组合物中并且施用于对象(例如人或狗)以在对象中诱导可显著预防或改善埃立克体生物体(例如查菲埃立克体或犬埃立克体)在对象中的感染的保护性免疫应答。用于对象中的药物用途的疫苗组合物可包含式I的免疫反应性多肽或表2的多肽以及可药用载体。

短语“药物的”、“可药用的”或“药理学上可接受的”是指当在适当时向动物(例如人)施用时不产生不良反应、变态反应或其他不利反应的分子实体和组合物。本文中使用的“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、这样的类似材料，及其组合，如本领域普通技术人员已知的(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版.MackPrintingCompany,1289-1329,1990，通过引用并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则其在本公开内容的疫苗组合物中的使用在考虑之中。

本文中使用的“保护性免疫应答”是指哺乳动物宿主的免疫系统对埃立克体抗原的应答，其导致哺乳动物宿主的免疫系统在随后暴露于埃立克体病原体之后提高抗原识别和抗体产生。保护性免疫应答可以显著减轻或预防由于随后暴露于查菲埃立克体或犬埃立克体而导致的症状。

在一些实施方案中，本公开内容的疫苗组合物可包含免疫反应性多肽(例如，具有与式I的多肽或表2的多肽具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列)。在一些实施方案中，包含免疫反应性多肽的疫苗组合物可以用于诱导针对查菲埃立克体的保护性免疫应答(例如，在人或狗对象中)。

医学领域普通技术人员将理解，向动物或人患者施用的疫苗组合物的实际剂量可由物理和生理因素(例如体重、病症的严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时的治疗性干预、患者的特发病和施用途径)决定。在任何情况下，负责施用的从业人员均将确定组合物中活性成分的浓度和用于个体对象的合适剂量。

在某些实施方案中，疫苗组合物可包含例如至少约0.1％的埃立克体免疫反应性多肽，该埃立克体免疫反应性多肽包含式I或表2的多肽或由其组成。在另一些实施方案中，活性化合物可例如占单位重量的约2％至约75％，或约25％至约60％，以及可从其中来源的任何范围。与许多疫苗组合物一样，施用频率以及剂量将以免疫学领域技术人员可预测的方式因动物群或人群中的成员而改变。作为非限制性实例，药物组合物和疫苗可通过注射(例如，皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如，通过吸入)或经口施用。可在1至36周的时间内施用1至3个剂量。在一些实施方案中，以3至4个月的间隔施用3个剂量，并且在此之后可定期给予加强疫苗接种。

在一些实施方案中，“合适的剂量”是免疫反应性多肽的量，当如上所述施用时，该量能够在经免疫接种的患者中引起足以保护对象在随后暴露于埃立克体生物体时免受埃立克体感染的免疫应答。通常，以合适剂量存在(或通过一定剂量的核酸原位产生)的肽的量可以为每kg宿主约1pg至约500mg，通常未约10pg至约10mg，优选约100pg至约1mg，并且更优选约100pg至约100微克。

本公开内容的疫苗组合物可包含不同类型的载体，这取决于其是否以固体、液体或气雾剂形式施用，以及对于例如注射的施用途径是否需要是无菌的。本文中公开的疫苗组合物可如下施用：肌内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹腔内、结膜下、囊内(intravesicularlly)、经黏膜、心包内、局部、经口、鼻内或者通过吸入、注射、输注、连续输注、灌洗或局部灌注。还可通过导管、在乳膏中(in cremes)、在脂质组合物中、通过弹道颗粒递送(ballistic particulate delivery)或通过其他方法或上述方法的任意组合来向对象施用疫苗组合物，如本领域普通技术人员知晓的(参见例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第21版.Lippincott Williams and Wilkins,2005，通过引用并入本文)。

尽管本领域普通技术人员已知的任何合适载体均可用于本发明的疫苗组合物，但是载体的类型将根据施用模式而变化。对于肠胃外施用(例如皮下注射)，载体优选地包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于经口施用，可使用任何上述载体或固体载体，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解的微球(例如，聚乳酸半乳糖(polylactic galactide))也可用作本发明的药物组合物的载体。例如在美国专利4,897,268和5,075,109中公开了合适的生物可降解微球。

在一些实施方案中，特别感兴趣的是可通过微结构化经皮或弹道颗粒递送来施用的疫苗组合物。作为疫苗制剂的载体的微结构是用于疫苗应用的理想构造，并且是本领域中广泛已知的(例如，美国专利5,797,898、5,770,219和5,783,208，以及美国专利申请2005/0065463)。配制成用于弹道颗粒递送的这样的疫苗组合物可包含固定在支持基底表面上的表1、2或3的分离的免疫反应性多肽。在这些实施方案中，支持基底可包括但不限于微囊、微粒、微球、纳米囊、纳米粒、纳米球、或其组合。

用作本文中公开的埃立克体免疫反应性多肽的支持基底的微结构或弹道颗粒可包含生物可降解材料和非生物可降解材料，并且这样的支持基底可包含合成聚合物、二氧化硅、脂质、碳水化合物、蛋白质、凝集素、离子试剂、交联剂和本领域可获得的其他微结构组分。用于使本发明肽固定至由这样的材料构成的支持基底的方案和试剂是在商业上和本领域中可广泛获得的。

在另一些实施方案中，疫苗组合物包含固定的或包封的式I的免疫反应性多肽或表2的多肽以及支持基底。在这些实施方案中，支持基底可包括但不限于脂质微球、脂质纳米粒、醇质体(ethosome)、脂质体、泡囊(niosome)、磷脂、鞘脂体(sphingosome)、表面活性剂、转移体(transferosome)、乳剂、或其组合。脂质体和其他脂质纳米载体制剂和脂质微载体制剂的形成和使用通常是本领域普通技术人员已知的，并且脂质体、微粒、纳米囊等的使用已在治疗剂的递送方面得到广泛应用(例如，美国专利5,741,516，特别地通过引用整体并入本文)。已经综述了作为潜在药物载体的脂质体和脂质体样制剂的许多方法，其包括肽包封(美国专利5,567,434、5,552,157、5,565,213、5,738,868和5,795,587，其各自特别地通过引用整体并入)。

除本文中所述的递送方法之外，还考虑了许多替代技术用于施用所公开的疫苗组合物。作为非限制性实例，疫苗组合物可通过以下施用：已在美国专利5,656,016中使用并描述的用于增强药物渗透进入并通过循环系统的速率和效力的超声波导入法(sonophoresis)(即超声)、骨内注射(美国专利5,779,708)、或反馈控制递送(美国专利5,697,899)，并且本段中的每个专利都特别地通过引用整体并入本文。

多种佐剂中的任一种可用于本发明的疫苗以非特异性地增强免疫应答。大多数佐剂包含被设计成保护抗原免受迅速分解代谢的物质(例如氢氧化铝或矿物油)和免疫应答的非特异性刺激物，例如脂质A、百日咳鲍特菌(Bortadella pertussis)或结核分枝杆菌。合适的佐剂可商购获得，如例如弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)以及Merck佐剂65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)。其他合适的佐剂包括明矾、生物可降解微球、单磷酰脂质A和quil A。

多肽可以以中性或盐形式配制到组合物中。可药用盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的这样的有机酸形成。与游离羧基形成的盐也可来源于无机碱(例如钠、钾、铵、钙或三价铁的氢氧化物)和例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。

在任何情况下，组合物可包含多种抗氧化剂以延迟一种或更多种组分的氧化。此外，通过防腐剂可产生对微生物作用的防止，所述防腐剂例如多种抗细菌剂和抗真菌剂，其包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

无菌可注射溶液通过使所需量的活性肽与以上列举的多种其他成分(如有需要的话)并入合适的溶剂中、随后过滤灭菌来制备。通常来说，通过将多种经灭菌活性成分并入包含基本分散介质(basic dispersion medium)和/或其他成分的无菌载剂中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液剂、混悬剂或乳剂的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，这由其经先前无菌过滤的液体介质产生活性成分加任何另外期望成分的粉末。如果必要的话，液体介质应被适当地缓冲，并且在用足够的盐水或葡萄糖注射之前先使液体稀释物等张。用于直接注射的高度浓缩组合物的制剂也在考虑之中，其中预见使用DMSO作为溶剂以实现极其迅速的渗透，从而使高浓度的活性剂递送至小区域。

组合物在制造和储存条件下必须是稳定的，并且防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。将理解，内毒素污染应在安全水平下保持最低，例如小于0.5ng/mg蛋白质。

在一些具体实施方案中，通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或其组合)，可实现可注射组合物的延长吸收。

A.埃立克体细菌疫苗

在一些实施方案中，本文中公开的免疫原性或疫苗组合物包含埃立克体细菌疫苗，例如犬埃立克体细菌疫苗或查菲埃立克体细菌疫苗。可以通过将埃立克体细菌热灭活或化学灭活来制备犬埃立克体细菌疫苗。

可以使用多种方法来产生查菲埃埃立克体或犬埃立克体细菌疫苗。例如，可以通过加热或在紫外线的存在下的补骨脂素将细菌灭活以产生细菌疫苗。灭活的埃立克体细菌疫苗的有效免疫接种量可以根据所选择的一种或更多种菌株而变化。预期单独的或与(i)本文中公开的嵌合多肽(例如式I或表2的多肽)和/或(ii)佐剂组合的埃立克体细菌疫苗的足以引起保护性免疫应答的任何量都可用在多个实施方案中(例如，以在对象中诱导保护性免疫应答)。在一些实施方案中，可以使用包含至少约1×10⁴TCID₅₀的灭活查菲埃立克体和/或犬埃立克体细菌疫苗的剂量单位。可用于产生埃立克体细菌疫苗的其他方法包括但不限于用热、甲醛、福尔马林、双亚乙基胺、辐射和/或β-丙内酯处理来处理查菲埃立克体或犬埃立克体。预期可以通过可获得的任何合适方法将细菌疫苗灭活。可用于产生埃立克体或犬埃立克体细菌疫苗的其他方法包括例如在WO2005087803、EP2433646、Vega et al.,2007或Stuen et al.,2015中描述的那些。

在一些实施方案中，埃立克体细菌疫苗包含基于灭活的查菲埃立克体和/或犬埃立克体细菌的灭活的粗制抗原。例如，在一些实施方案中，可获得包含查菲埃立克体或犬埃立克体的冷冻的血沉棕黄层(buffy coat)(例如，10ml的冷冻的血沉棕黄层)，并且在室温下使用0.3％甲醛将材料灭活48小时。此后，可以通过体外方法或通过使用体内动物模型测试该材料的感染性的缺乏。在Tollersrud et al.,2001中进一步描述了用于使用甲醛来将细菌灭活的方法。所得的埃立克体细菌疫苗可与(i)如本文中所述(例如，如表2中所述)的1、2、3或更多种嵌合免疫原性蛋白质或肽和/或(ii)佐剂一起被包含在内，以形成免疫原性或疫苗组合物。例如，可以将灭活的犬埃立克体细菌疫苗制成悬浮液，然后将其包含在乳剂佐剂中，例如如下所述。

B.佐剂

在一些方面中，包含一种或更多种本文中公开的嵌合多肽(例如，式I或表2的多肽)的免疫原性组合物还包含佐剂。在一些实施方案中，组合物是药物制剂或疫苗组合物。可被包含在内的多种佐剂是已知的。例如，在一些实施方案中，可以使用佐剂例如MF59、AS01、AS02、AS03、AS04、病毒微体、CAF01、CAF04、CAF05、Montanide ISA^TM 720或MontanideISA^TM 51(例如，Bonam et al.,2017)。

在一些实施方案中，免疫原性或疫苗组合物包含佐剂，其包含三萜类化合物、固醇、免疫调节剂、聚合物和/或Th2刺激剂。例如，在一些实施方案中，佐剂包含DEAE右旋糖酐、免疫刺激性寡核苷酸和油(例如，轻质矿物油)，其中免疫刺激性寡核苷酸是含CpG的ODN，并且其中佐剂制剂是油包水(W/O)乳剂。疫苗佐剂可任选地包含埃立克体细菌疫苗(例如热灭活的犬埃立克体或查菲埃立克体)和/或本文中公开的嵌合肽(例如，式I或表2的)。在一些实施方案中，免疫原性或疫苗组合物包含抗原组分和佐剂制剂，所述佐剂制剂包含皂苷(例如，以每剂量约1μg至约5,000μg的量存在)、固醇(例如，以每剂量约1μg至约5,000μg的量存在)、季铵化合物(例如，以每剂量约1μg至约5,000mu.g的量存在)、聚合物(例如，以约0.0001％v/v至约75％v/v的量存在)和ORN/ODN；皂苷可以是Quil A或其纯化级分，固醇可以是胆固醇，季铵化合物可以是二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)，聚合物可以是聚丙烯酸，并且ORN/ODN可以是CpG。佐剂可包含糖脂，例如N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-β-D-吡喃型葡糖基)-N-十八烷基十二酰胺乙酸酯。佐剂可包含免疫刺激性寡核苷酸、聚丙烯酸聚合物和以下中的至少两种：(a)二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)；(b)固醇；和/或(c)N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-β-D-吡喃型葡糖基)-N-十八烷基十二酰胺乙酸酯。例如，疫苗组合物可包含佐剂，如例如美国专利10,238,736、美国专利8,580,280或美国公开2019/0008953中所述的。

在一些实施方案中，免疫原性或疫苗组合物包含抗原组分和佐剂制剂，所述佐剂制剂包含三萜类化合物皂苷、固醇、季铵化合物和聚丙烯酸聚合物，其中抗原组分包含埃立克体细菌疫苗(例如热灭活的犬埃立克体)和/或本文中公开的嵌合多肽(例如式I或表2的多肽)，或由其组成。在一些实施方案中，皂苷以每剂量约1mg至约5,000mg的量存在，固醇以每剂量约1mg至约5,000mg的量存在，季铵化合物以每剂量约1mg至约5,000mg的量存在，并且聚丙烯酸聚合物以约0.0001％v/v至约75％v/v的量存在。例如，疫苗组合物可包含佐剂，如例如美国专利9,662,385中所述的。

在一些方面中，本文中公开的免疫原性或疫苗组合物包含基于油的佐剂，其包含埃立克体细菌疫苗(例如热灭活的犬埃立克体或查菲埃立克体)和/或一种或更多种本文中公开的嵌合多肽(例如，式I或表2的多肽)。例如，佐剂制剂可包含油相和水相、聚阳离子载体(例如DEAE右旋糖酐)和含CpG的免疫刺激性寡核苷酸，其中疫苗是油包水乳剂。佐剂可以任选地还包含氢氧化铝凝胶。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激性寡核苷酸以每剂量约50至约400μg的量存在，并且DEAE右旋糖酐以每剂量约10至约300mg的量存在。佐剂制剂可以在油乳剂中包含免疫刺激性寡核苷酸、聚阳离子载体、固醇、皂苷、季胺、TLR-3激动剂、糖脂和/或MPL-A(或其类似物)。例如，疫苗组合物可包含佐剂，如例如美国专利10,117,921或US 2019/0038737中所述的。

在一些实施方案中，免疫原性组合物是乳剂，其包含(i)埃立克体细菌疫苗(例如热灭活的犬埃立克体或查菲埃立克体)，和/或(ii)一种或更多种本文中公开的嵌合多肽(例如，式I或表2的多肽)。例如，乳剂组合物可在水相中包含佐剂，例如丙烯酸聚合物和/或二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)。在一些实施方案中，可以通过将包含抗原(例如，犬埃立克体细菌疫苗，例如热灭活的犬埃立克体，和/或一种或更多种嵌合多肽(例如，式I或表2的多肽))和佐剂的水相在乳化剂的存在下与油相混合来制备乳剂。在一些实施方案中，佐剂组分包含水包油乳剂，其中水包油乳剂的水相包含二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)和/或烷基-聚丙烯酸(烷基-PAA)。在一些实施方案中，水包油乳剂中的油是矿物油、萜烯油、大豆油、橄榄油或丙二醇衍生物。佐剂可还包含佐剂组分，其还包含CpG DNA、脂多糖和/或单磷酰脂质A。疫苗可还包含一种或更多种乳化剂。例如，疫苗组合物可包含佐剂，如例如美国专利9,545,439或美国专利8,980,288中所述的。

佐剂可以是脂质体或乳剂制剂。脂质体可以是单层的、多层的或多囊的。在一些实施方案中，免疫原性或疫苗组合物包含脂质或含脂质的佐剂。在一些实施方案中，脂质体是阳离子脂质体。在多个实施方案中，可以使用佐剂，例如MF59(例如，Calabro et al.(2013)Vaccine 31:3363–3369)、AS01(Didierlaurent,et al.(2014)J.Immunol.193,1920–1930)、AS02(

and Van Mechelen(2011)Expert Rev.Vaccines 10,471–486)、AS03(Morel,S.et al.(2011)Vaccine 29,2461–2473)、AS04(Didierlaurent,et al.(2009)J.Immunol.183:6186–6197.)、病毒微体(Künzi,et al.(2009)Vaccine 27,3561–3567)、CAF01(Tandrup Schmidt,et al.(2016)Pharmaceutics 8,7.)、CAF04(Billeskov,et al.(2016)PLoS One 11,e0161217)、CAF05(Billeskov,et al.(2016)PLoS One 11,e0161217)、Montanide ISA^TM 720(Aucouturier,et al.(2002)Expert Rev.Vaccines 1,111–118)或Montanide ISA^TM 51(Aucouturier,et al.(2002)Expert Rev.Vaccines 1,111–118)。表3提供了可用于多个实施方案的示例性含佐剂的制剂的列表。

表3：示例性含佐剂的制剂

VII.埃立克体检测和疫苗试剂盒

本公开内容的多个实施方案涉及用于在样品中检测特异性结合埃立克体生物体(例如查菲埃立克体或犬埃立克体)的抗体的试剂盒。该试剂盒因此可以用于在对象中诊断或鉴定埃立克体感染。在另一些实施方案中，本发明提供了用于确定对象是否已经针对埃立克体进行了免疫接种或者正在被埃立克体生物体活动性感染的试剂盒。在另一些实施方案中，提供了用于针对查菲埃立克体感染对对象进行疫苗接种的试剂盒，并且在一些实施方案中，预期该组合物可用于提供针对犬埃立克体感染的保护性免疫应答。

在一些选定的实施方案中，本公开内容的试剂盒可用于执行本文中公开的方法。例如，试剂盒可以适合于在样品中检测埃立克体抗体，鉴定埃立克体感染个体，确定对象是否已经针对埃立克体进行了免疫接种或者正在被埃立克体生物体活动性感染，或者针对埃立克体生物体对对象进行免疫接种。在这些实施方案中，一种或更多种免疫反应性肽(例如，包含式I的多肽或表2的多肽，或者与式I的多肽或表2的多肽具有至少约95％或更高的序列同一性的多肽)可包含在试剂盒中。试剂盒中的埃立克体免疫反应性多肽可以被可检测地标记或固定在也包含在试剂盒中的支持基底的表面上。免疫反应性多肽可以例如以合适的形式(例如无菌、冻干或两者)在试剂盒中提供。

本发明的试剂盒中包含的支持基底可以基于待执行的方法来选择。作为非限制性实例，支持基底可以是多孔板或微板、膜、过滤器、纸、乳剂、珠、微珠、微球、纳米珠、纳米球、纳米粒、醇质体、脂质体、泡囊、转移体、浸棒、卡片、赛璐珞条(celluloid strip)、玻璃载片、微载片、生物传感器、侧向流装置、微芯片、梳状物、二氧化硅颗粒、磁性颗粒或自组装单层。

与所执行的方法相适应，试剂盒还可包含一个或更多个用于将组合物递送至对象或用于以其他方式处理本发明组合物的装置。作为非限制性实例，试剂盒可包括作为以下的装置：注射器、滴眼器、弹道颗粒施加器(例如，在美国专利5,797,898、5,770,219和5,783,208以及美国专利申请2005/0065463中公开的施加器)、匙(scoopula)、微载片盖、测试条保持器或盖子，等。

用于标记试剂盒组分的检测试剂可任选地包含在用于执行本公开内容的方法的试剂盒中。在一些具体实施方案中，标记或检测试剂选自包含本领域中通常使用的试剂并且包括但不限于以下的组：放射性元素、酶、吸收UV范围内的光的分子以及荧光团(例如荧光素、罗丹明、金胺(auramine)、德克萨斯红、AMCA蓝和萤虫黄)。在另一些实施方案中，提供了包含一个或更多个容器装置和已经用检测试剂标记的BST蛋白试剂的试剂盒，所述检测试剂选自包含以下的组：放射性元素、酶、吸收UV范围内的光的分子和荧光团。

在一些具体的实施方案中，本公开内容提供了用于在样品中检测抗埃立克体抗体的试剂盒，该试剂盒可还用于在对象中鉴定埃立克体感染，和/或确定对象是否已经针对埃立克体进行了免疫接种或者正在被埃立克体生物体活动性感染。这样的试剂盒可包含一种或更多种免疫反应性多肽(例如，包含式I的多肽或表2的多肽，或者与包含式I的多肽或表2的多肽的多肽具有至少约95％或更高的序列同一性)，并且所述肽可以被可检测地标记和固定在试剂盒中包含的一种或更多种支持基底上。

在一些实施方案中，试剂盒包含免疫反应性多肽，所述免疫反应性多肽包含式I的多肽或表2的多肽，或者与包含式I的多肽或表2的多肽的多肽具有约95％或更高的序列同一性。肽可以固定于一个或更多个独立的侧向流测定装置，例如硝酸纤维素测试条。在这些实施方案中，每个测试条可还包含检测试剂，例如生色团标记的蛋白A。这样的试剂盒可还包含一个或更多个用于样品材料的容器，一种或更多种用于样品稀释的稀释剂和一个或更多个用于比较的对照指示条。

当试剂盒包含的试剂和/或组分以冻干形式(冻干物)或作为干粉末提供时，冻干物或粉末可通过添加合适的溶剂来重构。在一些具体实施方案中，溶剂可以是无菌的可药用缓冲剂和/或其他稀释剂。预期这样的溶剂也可以作为试剂盒的一部分提供。

当试剂盒的组分在一种和/或更多种液体溶液中提供时，作为非限制性实例，液体溶液可以是无菌水溶液。组合物还可配制成施用组合物。在这种情况下，容器装置自身可以是注射器、吸移管、局部施加器等，从其中可将制剂施加至身体的受影响区域、注射到对象中、和/或施加至试剂盒的其他组分或与其混合。

IV.实施例

包括以下实施例以示出本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中工作良好的技术，并因此可被认为构成用于实施本发明的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，可对所公开的一些具体实施方案作出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果而不脱离本发明的精神和范围。

实施例1

方法

嵌合体构建和克隆

商业合成(GenScript)了代表五种埃立克体表位嵌合体的序列。将嵌合序列克隆到pET-14中，并且在大肠杆菌BL21(DE)或BL21-AI(Invitrogen)中表达重组的嵌合蛋白(表1)。

表1.埃立克体嵌合体

嵌合体表达和纯化

使用Roche cOmplete^TM His-Tag蛋白质纯化方案在天然条件下纯化埃立克体嵌合体重组蛋白。简言之，将大肠杆菌细胞沉淀物重悬于裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，150mMNaCl，2mMDTT，2mM MgCl2，5mM EDTA和5mM咪唑)中，并且在冰上声处理5分钟，然后通过在4℃下以12,000×g离心1小时使裂解物澄清。通过与his-树脂(his-resin)一起孵育30分钟来纯化His标记的蛋白质，并将其用洗涤缓冲液(裂解缓冲液中10mM咪唑)洗涤3次，并用洗脱缓冲液(裂解缓冲液中250mM咪唑)洗脱蛋白质。

Western印迹

将用于Western免疫印迹分析的蛋白质样品通过SDS-PAGE解析，转移至硝酸纤维素膜，在含有5％脱脂干乳的Tris缓冲盐水(TBS)中封闭。蛋白质与狗抗犬埃立克体或抗查菲埃立克体血清(1:500)反应。将印迹与在TBS中稀释(1:5000)的磷酸酶标记的山羊抗狗IgG(Kirkegaard&Perry,Gaithersburg,MA)一起孵育，并且在添加碱性磷酸酶底物(Kirkegaard&Perry)之后使蛋白质反应性可视化。

ELISA

使用来自感染有查菲埃立克体的人患者和感染有犬埃立克体的狗的血清来评价埃立克体嵌合体免疫反应性。通过在96孔ELISA板(PolySorp,Nunc)中孵育50ng/孔的于PBS中稀释的嵌合蛋白来进行ELISA，并且在4℃下孵育过夜。将板用TBS中的0.2％Tween 20(TBST)洗涤3次，用100ul封闭缓冲液(TBST中的10％马血清)封闭，并且在室温下摇动孵育1小时。将板用TBST洗涤3次，并且将在封闭缓冲液中以1:100稀释的50ul第一抗体在室温下摇动孵育1小时。将板用TBST洗涤3次，添加在封闭缓冲液中稀释的50ul二抗AP-缀合物，并且在室温下摇动孵育1小时。添加底物并且在室温下在黑暗中摇动孵育30分钟，并且使用ELISA板读取仪在650nm下测定OD。

结果

在大肠杆菌中表达了五种埃立克体嵌合构建体，并且纯化了重组蛋白(图1至5)。纯化的犬埃立克体或查菲埃立克体特异性嵌合蛋白与狗抗犬埃立克体或抗查菲埃立克体中的抗体反应(图1至3)。类似地，犬埃立克体/查菲埃立克体组合嵌合蛋白与抗犬埃立克体和抗查菲埃立克体狗血清二者均强烈反应，证明了嵌合体中所代表的物种特异性表位的功能(图4和图5)。用一组恢复期的抗查菲埃立克体患者血清进行ELISA以证明嵌合蛋白与抗体的免疫反应性。查菲埃立克体TRP32/TRP120/A34嵌合体与10份HME患者血清强烈反应，表明与所有HME患者血清的高免疫反应性(图1)。两种犬埃立克体嵌合体(TRP140/TRP36/TRP19和TRP36/TRP140)均与来自天然感染有犬埃立克体的狗的10份血清反应。来自犬埃立克体感染的狗的所有血清均与嵌合构建体强烈反应(图2和图3)。用狗抗犬埃立克体血清和人抗查菲埃立克体患者血清测试了查菲埃立克体/犬埃立克体组合嵌合体免疫反应性。两种嵌合体均与抗犬埃立克体和抗查菲埃立克体抗体强烈反应，证明了具有犬埃立克体和查菲埃立克体抗体的嵌合体中代表的物种特异性表位的功能(图4和图5)。

***

根据本公开内容，本文中公开且要求保护的所有方法均可在没有过度实验的情况下做出和执行。虽然本发明的组合物和方法已根据一些优选实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员而言明显的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下可对本文中所述方法以及本文中所述方法的步骤或步骤顺序作出改变。更具体地，明显的是，在化学和生理两方面都相关的某些试剂可替代本文中所述的试剂同时实现相同或类似的结果。对本领域技术人员而言明显的所有这样的类似替代和修改被认为在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念之内。

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<120> 嵌合免疫原性多肽

<130> CLFR.P0465WO

<150> US 62/711,005

<151> 2018-07-27

<160> 47

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 犬埃立克体（Ehrlichia canis）

<400> 1

His Phe Thr Gly Pro Thr Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser Glu Glu Glu

1 5 10 15

Lys Met Glu Leu Gln Glu Val Ser

20

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 2

Ala Lys Glu Glu Lys Asn Ala Thr Ala Lys Thr Phe Gln Leu Lys Gly

1 5 10 15

Asp Trp Asp Gly Ala

20

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体（Ehrlichia chaffeensis）

<400> 3

Ser Asp Leu His Glu Ser Ser Phe Val Glu Leu Pro Gly Pro Ser Lys

1 5 10 15

Glu Glu Val Gln Phe Glu Asp Asp Ala Lys Asn Val Val Tyr

20 25 30

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 4

Ser Asp Leu His Gly Ser Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Ser Lys

1 5 10 15

Glu Glu Val Gln Leu Glu Ser Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asn

20 25 30

<210> 5

<211> 30

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 5

Ser Asp Leu His Gly Ser Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Phe Lys

1 5 10 15

Glu Ala Val Gln Leu Gly Asn Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asp

20 25 30

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 6

Ser Asp Ser His Glu Pro Ser His Leu Glu Leu Pro Ser Leu Ser Glu

1 5 10 15

Glu Val Ile Gln Leu Glu Ser Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asn

20 25 30

<210> 7

<211> 26

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 7

Val Arg Ser Ile Thr Asp Pro Arg Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp

1 5 10 15

Gln Gln Gln Glu Val Gln Gln Gln Ala Asp

20 25

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 8

Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 9

Ala Ser Val Val Pro Glu Ala Glu

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 10

Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr Ala

1 5

<210> 11

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 11

Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Ala Ser Val Val Pro Glu Ala

1 5 10 15

Glu Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr Ala

20 25

<210> 12

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 12

Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala

1 5 10 15

Thr Ala Ala Ser Val Val Pro Glu Ala Glu

20 25

<210> 13

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 13

Ala Ser Val Val Pro Glu Ala Glu Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro

1 5 10 15

Ala Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr Ala

20 25

<210> 14

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 14

Ala Ser Val Val Pro Glu Ala Glu Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr

1 5 10 15

Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala

20 25

<210> 15

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 15

Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala

1 5 10 15

Pro Ala Ala Ser Val Val Pro Glu Ala Glu

20 25

<210> 16

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 16

Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr Ala Ala Ser Val Val Pro Glu Ala

1 5 10 15

Glu Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala

20 25

<210> 17

<211> 19

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 17

Ala Ser Val Ser Glu Gly Asp Ala Val Val Asn Ala Val Ser Gln Glu

1 5 10 15

Thr Pro Ala

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 18

Ser Leu Phe Thr Glu Glu Glu Lys Ile Leu Ala Ile Leu Ser Ala Arg

1 5 10 15

Phe Ile Cys Lys

20

<210> 19

<211> 18

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 19

Asp Val Lys Asp Asn Lys Pro Ser Asp Val Lys Leu Pro Val Ile Lys

1 5 10 15

Ala Glu

<210> 20

<211> 24

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 20

Asp Asp Ser Lys Leu Pro Val Ile Lys Val Glu Asp Lys Ser Lys Leu

1 5 10 15

Gln Asp Thr Lys Asp Lys Lys Arg

20

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 21

Lys Lys Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Asp Tyr Thr Ile Thr Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Asp Asp Asp

<210> 22

<211> 22

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 22

Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp

1 5 10 15

Leu Gln Asp Val Ala Ser

20

<210> 23

<211> 25

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 23

Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys

1 5 10 15

Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala

20 25

<210> 24

<211> 21

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 24

Tyr Gly Ala Pro Glu Ile Thr Lys Asp Gly Tyr Lys Val Ile Lys Ser

1 5 10 15

Ile Lys Pro Glu Asp

20

<210> 25

<211> 264

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 25

Ser Asp Leu His Glu Ser Ser Phe Val Glu Leu Pro Gly Pro Ser Lys

1 5 10 15

Glu Glu Val Gln Phe Glu Asp Asp Ala Lys Asn Val Val Tyr Ser Asp

20 25 30

Leu His Gly Ser Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Ser Lys Glu Glu

35 40 45

Val Gln Leu Glu Ser Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asn Ser Asp Leu His

50 55 60

Gly Ser Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Phe Lys Glu Ala Val Gln

65 70 75 80

Leu Gly Asn Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asp Ser Asp Ser His Glu Pro

85 90 95

Ser His Leu Glu Leu Pro Ser Leu Ser Glu Glu Val Ile Gln Leu Glu

100 105 110

Ser Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asn Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr

115 120 125

Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp Leu Gln Asp Val Ala Ser Lys Val

130 135 140

Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp Leu Gln Asp

145 150 155 160

Val Ala Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile

165 170 175

Lys Asp Leu Gln Asp Val Ala Ser Val Arg Ser Ile Thr Asp Pro Arg

180 185 190

Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp Gln Gln Gln Glu Val Gln Gln Gln

195 200 205

Ala Asp Ser Val Arg Ser Ile Thr Asp Pro Arg Ile Val Val Gln Gln

210 215 220

Glu Ala Asp Gln Gln Gln Glu Val Gln Gln Gln Ala Asp Ser Val Arg

225 230 235 240

Ser Ile Thr Asp Pro Arg Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp Gln Gln

245 250 255

Gln Glu Val Gln Gln Gln Ala Asp

260

<210> 26

<211> 201

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 26

His Phe Thr Gly Pro Thr Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser Glu Glu Glu

1 5 10 15

Lys Met Glu Leu Gln Glu Val Ser Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro

20 25 30

Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Glu His Ser Ser Ser Glu

35 40 45

Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu

50 55 60

Val Lys Ala His Phe Thr Gly Pro Thr Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser

65 70 75 80

Glu Glu Glu Lys Met Glu Leu Gln Glu Val Ser Thr Glu Asp Ser Val

85 90 95

Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Glu His Ser

100 105 110

Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn

115 120 125

Thr Pro Glu Val Lys Ala His Phe Thr Gly Pro Thr Ser Phe Glu Val

130 135 140

Asn Leu Ser Glu Glu Glu Lys Met Glu Leu Gln Glu Val Ser Thr Glu

145 150 155 160

Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala

165 170 175

Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys

180 185 190

Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala

195 200

<210> 27

<211> 172

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 27

Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala

1 5 10 15

Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val

20 25 30

Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp

35 40 45

Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr

50 55 60

Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly

65 70 75 80

Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys

85 90 95

Ala Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser

100 105 110

Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu His Ser Ser Ser Glu

115 120 125

Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu

130 135 140

Val Lys Ala Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu

145 150 155 160

Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala

165 170

<210> 28

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 28

Ser Asp Leu His Gly Ser Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Phe Lys

1 5 10 15

Glu Ala Val Gln Leu Gly Asn Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asp Ser Asp

20 25 30

Leu His Gly Ser Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Phe Lys Glu Ala

35 40 45

Val Gln Leu Gly Asn Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asp Ser Lys Val Glu

50 55 60

Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp Leu Gln Asp Val

65 70 75 80

Ala Ser Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile

85 90 95

Lys Asp Leu Gln Asp Val Ala Ser Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro

100 105 110

Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser

115 120 125

Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Glu His Ser Ser

130 135 140

Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr

145 150 155 160

Pro Glu Val Lys Ala Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val

165 170 175

Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala Ala Lys

180 185 190

Glu Glu Lys Asn Ala Thr Ala Lys Thr Phe Gln Leu Lys Gly Asp Trp

195 200 205

Asp Gly Ala Ala Lys Glu Glu Lys Asn Ala Thr Ala Lys Thr Phe Gln

210 215 220

Leu Lys Gly Asp Trp Asp Gly Ala Tyr Gly Ala Pro Glu Ile Thr Lys

225 230 235 240

Asp Gly Tyr Lys Val Ile Lys Ser Ile Lys Pro Glu Asp Tyr Gly Ala

245 250 255

Pro Glu Ile Thr Lys Asp Gly Tyr Lys Val Ile Lys Ser Ile Lys Pro

260 265 270

Glu Asp

<210> 29

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 29

Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp

1 5 10 15

Leu Gln Asp Val Ala Ser Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro

20 25 30

Glu Val Leu Ile Lys Asp Leu Gln Asp Val Ala Ser Ser Lys Val Glu

35 40 45

Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp Leu Gln Asp Val

50 55 60

Ala Ser Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr

65 70 75 80

Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu His Ser Ser Ser

85 90 95

Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro

100 105 110

Glu Val Lys Ala Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser

115 120 125

Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala Thr Glu Asp

130 135 140

Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr

145 150 155 160

Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro

165 170 175

Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser

180 185 190

Ala Pro Ala Ala Lys Glu Glu Lys Asn Ala Thr Ala Lys Thr Phe Gln

195 200 205

Leu Lys Gly Asp Trp Asp Gly Ala Ala Lys Glu Glu Lys Asn Ala Thr

210 215 220

Ala Lys Thr Phe Gln Leu Lys Gly Asp Trp Asp Gly Ala Ala Lys Glu

225 230 235 240

Glu Lys Asn Ala Thr Ala Lys Thr Phe Gln Leu Lys Gly Asp Trp Asp

245 250 255

Gly Ala

<210> 30

<211> 183

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 30

Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp

1 5 10 15

Leu Gln Asp Val Ala Ser Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro

20 25 30

Glu Val Leu Ile Lys Asp Leu Gln Asp Val Ala Ser Gly Gly Gly Val

35 40 45

Arg Ser Ile Thr Asp Pro Arg Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp Gln

50 55 60

Gln Gln Glu Val Gln Gln Gln Ala Asp Val Arg Ser Ile Thr Asp Pro

65 70 75 80

Arg Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp Gln Gln Gln Glu Val Gln Gln

85 90 95

Gln Ala Asp Gly Gly Gly Ser Leu Phe Thr Glu Glu Glu Lys Ile Leu

100 105 110

Ala Ile Leu Ser Ala Arg Phe Ile Cys Lys Ser Leu Phe Thr Glu Glu

115 120 125

Glu Lys Ile Leu Ala Ile Leu Ser Ala Arg Phe Ile Cys Lys Gly Gly

130 135 140

Gly Ala Ser Val Ser Glu Gly Asp Ala Val Val Asn Ala Val Ser Gln

145 150 155 160

Glu Thr Pro Ala Ala Ser Val Ser Glu Gly Asp Ala Val Val Asn Ala

165 170 175

Val Ser Gln Glu Thr Pro Ala

180

<210> 31

<211> 142

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 31

Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp

1 5 10 15

Leu Gln Asp Val Ala Ser Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro

20 25 30

Glu Val Leu Ile Lys Asp Leu Gln Asp Val Ala Ser Gly Gly Gly Val

35 40 45

Arg Ser Ile Thr Asp Pro Arg Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp Gln

50 55 60

Gln Gln Glu Val Gln Gln Gln Ala Asp Val Arg Ser Ile Thr Asp Pro

65 70 75 80

Arg Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp Gln Gln Gln Glu Val Gln Gln

85 90 95

Gln Ala Asp Gly Gly Gly Ser Leu Phe Thr Glu Glu Glu Lys Ile Leu

100 105 110

Ala Ile Leu Ser Ala Arg Phe Ile Cys Lys Ser Leu Phe Thr Glu Glu

115 120 125

Glu Lys Ile Leu Ala Ile Leu Ser Ala Arg Phe Ile Cys Lys

130 135 140

<210> 32

<211> 140

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 32

Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp

1 5 10 15

Leu Gln Asp Val Ala Ser Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro

20 25 30

Glu Val Leu Ile Lys Asp Leu Gln Asp Val Ala Ser Gly Gly Gly Val

35 40 45

Arg Ser Ile Thr Asp Pro Arg Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp Gln

50 55 60

Gln Gln Glu Val Gln Gln Gln Ala Asp Val Arg Ser Ile Thr Asp Pro

65 70 75 80

Arg Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp Gln Gln Gln Glu Val Gln Gln

85 90 95

Gln Ala Asp Gly Gly Gly Ala Ser Val Ser Glu Gly Asp Ala Val Val

100 105 110

Asn Ala Val Ser Gln Glu Thr Pro Ala Ala Ser Val Ser Glu Gly Asp

115 120 125

Ala Val Val Asn Ala Val Ser Gln Glu Thr Pro Ala

130 135 140

<210> 33

<211> 136

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 33

Val Arg Ser Ile Thr Asp Pro Arg Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp

1 5 10 15

Gln Gln Gln Glu Val Gln Gln Gln Ala Asp Val Arg Ser Ile Thr Asp

20 25 30

Pro Arg Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp Gln Gln Gln Glu Val Gln

35 40 45

Gln Gln Ala Asp Gly Gly Gly Ser Leu Phe Thr Glu Glu Glu Lys Ile

50 55 60

Leu Ala Ile Leu Ser Ala Arg Phe Ile Cys Lys Ser Leu Phe Thr Glu

65 70 75 80

Glu Glu Lys Ile Leu Ala Ile Leu Ser Ala Arg Phe Ile Cys Lys Gly

85 90 95

Gly Gly Ala Ser Val Ser Glu Gly Asp Ala Val Val Asn Ala Val Ser

100 105 110

Gln Glu Thr Pro Ala Ala Ser Val Ser Glu Gly Asp Ala Val Val Asn

115 120 125

Ala Val Ser Gln Glu Thr Pro Ala

130 135

<210> 34

<211> 134

<212> PRT

<213> 查菲埃立克体

<400> 34

Val Arg Ser Ile Thr Asp Pro Arg Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp

1 5 10 15

Gln Gln Gln Glu Val Gln Gln Gln Ala Asp Val Arg Ser Ile Thr Asp

20 25 30

Pro Arg Ile Val Val Gln Gln Glu Ala Asp Gln Gln Gln Glu Val Gln

35 40 45

Gln Gln Ala Asp Gly Gly Gly Ser Leu Phe Thr Glu Glu Glu Lys Ile

50 55 60

Leu Ala Ile Leu Ser Ala Arg Phe Ile Cys Lys Ser Leu Phe Thr Glu

65 70 75 80

Glu Glu Lys Ile Leu Ala Ile Leu Ser Ala Arg Phe Ile Cys Lys Gly

85 90 95

Gly Gly Asp Val Lys Asp Asn Lys Pro Ser Asp Val Lys Leu Pro Val

100 105 110

Ile Lys Ala Glu Asp Val Lys Asp Asn Lys Pro Ser Asp Val Lys Leu

115 120 125

Pro Val Ile Lys Ala Glu

130

<210> 35

<211> 163

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 35

Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala

1 5 10 15

Pro Ala Gly Gly Gly Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val

20 25 30

Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu His

35 40 45

Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu

50 55 60

Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala Gly Gly Gly Asp Asp Ser Lys Leu Pro

65 70 75 80

Val Ile Lys Val Glu Asp Lys Ser Lys Leu Gln Asp Thr Lys Asp Lys

85 90 95

Lys Arg Asp Asp Ser Lys Leu Pro Val Ile Lys Val Glu Asp Lys Ser

100 105 110

Lys Leu Gln Asp Thr Lys Asp Lys Lys Arg Gly Gly Gly Lys Lys Ile

115 120 125

Lys Glu Tyr Asp Glu Asp Tyr Thr Ile Thr Tyr Tyr Tyr Asp Asp Asp

130 135 140

Lys Lys Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Asp Tyr Thr Ile Thr Tyr Tyr Tyr

145 150 155 160

Asp Asp Asp

<210> 36

<211> 28

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 36

Glu Ala Ser Val Val Pro Ala Ala Glu Ala Pro Gln Pro Ala Gln Gln

1 5 10 15

Thr Glu Asp Glu Phe Phe Ser Asp Gly Ile Glu Ala

20 25

<210> 37

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 37

Glu Ala Ser Val Val Pro Ala Ala Glu Ala Pro Gln Pro Ala Gln Gln

1 5 10 15

Thr Glu Asp Glu Phe Phe Ser Asp Gly Ile Glu Ala Thr Glu Asp Ser

20 25 30

Val Ser Ala Pro Ala

35

<210> 38

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 38

Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Glu Ala Ser Val Val Pro Ala

1 5 10 15

Ala Glu Ala Pro Gln Pro Ala Gln Gln Thr Glu Asp Glu Phe Phe Ser

20 25 30

Asp Gly Ile Glu Ala

35

<210> 39

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 39

Glu Ala Ser Val Val Pro Ala Ala Glu Ala Pro Gln Pro Ala Gln Gln

1 5 10 15

Thr Glu Asp Glu Phe Phe Ser Asp Gly Ile Glu Ala Thr Glu Asp Pro

20 25 30

Val Ser Ala Thr Ala

35

<210> 40

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 40

Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr Ala Glu Ala Ser Val Val Pro Ala

1 5 10 15

Ala Glu Ala Pro Gln Pro Ala Gln Gln Thr Glu Asp Glu Phe Phe Ser

20 25 30

Asp Gly Ile Glu Ala

35

<210> 41

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 41

Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala

1 5 10 15

Thr Ala

<210> 42

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 42

Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala

1 5 10 15

Pro Ala

<210> 43

<211> 96

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 43

Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala

1 5 10 15

Pro Ala Gly Gly Gly Ala Ser Val Val Pro Glu Ala Glu Ala Ser Val

20 25 30

Val Pro Glu Ala Glu Gly Gly Gly Glu Ala Ser Val Val Pro Ala Ala

35 40 45

Glu Ala Pro Gln Pro Ala Gln Gln Thr Glu Asp Glu Phe Phe Ser Asp

50 55 60

Gly Ile Glu Ala Glu Ala Ser Val Val Pro Ala Ala Glu Ala Pro Gln

65 70 75 80

Pro Ala Gln Gln Thr Glu Asp Glu Phe Phe Ser Asp Gly Ile Glu Ala

85 90 95

<210> 44

<211> 39

<212> PRT

<213> 犬埃立克体

<400> 44

Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala

1 5 10 15

Pro Ala Gly Gly Gly Thr Glu Asp Ser Pro Ser Ala Thr Ala Thr Glu

20 25 30

Asp Ser Pro Ser Ala Thr Ala

35

<210> 45

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成接头

<400> 45

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成接头

<400> 46

Glu Ala Ala Ala Lys

1 5

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成接头

<400> 47

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims (142)

1.分离的多肽，其中所述分离的多肽包含：

(i)表1的至少两种免疫原性序列或具有至少90％同一性的序列；并且

(ii)其中所述免疫原性序列中的至少一种在所述多肽中连续重复。

2.权利要求1所述的分离的多肽，其中表1的至少两种免疫原性序列或具有至少90％同一性的序列中的每一种在所述多肽中连续重复1、2、3、4、5、6或7次。

3.权利要求1至2中任一项所述的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含(SEQ ID NO:11至16或36至42)中的一个或更多个，其中所述(SEQ ID NO:11至16或36至42)中的一个或更多个连续重复0、1、2或3次。

4.权利要求1至3中任一项所述的分离的多肽，其中所述免疫原性序列中的每一种在所述多肽中连续重复1至3次。

5.权利要求4所述的分离的多肽，其中所述免疫原性序列中的每一种在所述多肽中连续重复1至2次。

6.权利要求1至3中任一项所述的分离的肽，其中所述分离的多肽包含以下免疫原性序列中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11种或全部：TRP120(SEQ ID NO:22)、TRP140(SEQ IDNO:23)、A34N1(SEQ ID NO:7)、TRP63(SEQ ID NO:18)、TRP47(SEQ ID NO:17)、TRP75(SEQID NO:19)、TRP28(SEQ ID NO:2)、TRP36R1(SEQ ID NO:3)、TRP36R2(SEQ ID NO:4)、TRP36R3(SEQ ID NO:6)、TRP36CO(SEQ ID NO:36)、TRP19(SEQ ID NO:1)、HSP(SEQ ID NO:24)或具有至少90％同一性的序列；其中所述免疫原性序列中的每一种在所述多肽中连续重复1至7次。

7.权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述分离的多肽包含TRP36R1和TRP140。

8.权利要求7所述的多肽，其中所述TRP36R1连续重复4至8次，并且其中所述TRP140连续重复1至3次。

9.权利要求8所述的多肽，其中所述多肽包含TRP36R1的8个重复和TRP140的4个重复或由其组成。

10.权利要求9所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:27或由其组成。

11.权利要求7所述的多肽，其中所述多肽还包含TRP19。

12.权利要求11所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:26或由其组成。

13.权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述分离的多肽包含以下免疫原性序列中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或全部：TRP32、TRP120、TRP36(例如TRP36R1、TRP36R2、TRP36R3或TRP36CO)、TRP140、TRP28和/或HSP。

14.权利要求13所述的多肽，其中所述TRP36R1如果存在，则重复2至6次，并且其中其他免疫原性序列重复1至3次。

15.权利要求14所述的多肽，其中所述多肽包含TRP32、TRP120、TRP36、TRP140、TRP28和HSP全部。

16.权利要求15所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:28或由其组成。

17.权利要求13所述的多肽，其中所述多肽包含TRP120、TRP36、TRP140和TRP28。

18.权利要求17所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:29或由其组成。

19.权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述分离的多肽包含TRP32R1、TRP32R2、TRP32R3、TRP32R4、TRP120和A34N1中的至少三种、至少四种、至少五种或全部。

20.权利要求19所述的多肽，其中TRP120和A34N1各自连续重复1至3次。

21.权利要求20所述的多肽，其中TRP120和A34N1各自连续重复2次。

22.权利要求21所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:25或由其组成。

23.权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含A34N1、TRP63、TRP47和/或TRP75中的至少两种、至少三种或全部。

24.权利要求23所述的多肽，其中所述多肽包含A34N1和TRP63。

25.权利要求24所述的多肽，其中所述免疫原性序列中的每一种连续重复1至2次。

26.权利要求25所述的多肽，其中所述多肽包含A34N1、TRP63和TRP75。

27.权利要求25所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:34或由其组成。

28.权利要求25所述的多肽，其中所述多肽包含A34N1、TRP63和TRP47。

29.权利要求25所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:33或由其组成。

30.权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含A34N1、TRP63、TRP47和/或TRP75中的至少两种、至少三种或全部。

31.权利要求30所述的多肽，其中所述多肽包含A34N1和TRP63。

32.权利要求31所述的多肽，其中所述免疫原性序列中的每一种连续重复1至2次。

33.权利要求32所述的多肽，其中所述多肽包含A34N1、TRP63和TRP75。

34.权利要求32所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:34或由组成。

35.权利要求32所述的多肽，其中所述多肽包含A34N1、TRP63和TRP47。

36.权利要求32所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:33或由其组成。

37.权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含TRP120、A34N1、TRP47和/或TRP63中的至少两种、至少三种或全部。

38.权利要求37所述的多肽，其中所述多肽包含A34N1和TRP120。

39.权利要求38所述的多肽，其中所述免疫原性序列中的每一种连续重复1至2次。

40.权利要求39所述的多肽，其中所述多肽包含A34N1、TRP120和TRP63。

41.权利要求39所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:31或由其组成。

42.权利要求39所述的多肽，其中所述多肽包含A34N1、TRP120和TRP47。

43.权利要求39所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:32或由其组成。

44.权利要求39所述的多肽，其中所述多肽包含A34N1、TRP120、TRP47和TRP63。

45.权利要求39所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:30或由其组成。

46.权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含TRP36R1、TRP140、TRP95R和/或TRP95C中的至少两种、至少三种或全部。

47.权利要求46所述的多肽，其中所述免疫原性序列中的每一种连续重复1至2次。

48.权利要求46至47中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含TRP36R1、TRP140、TRP95R和TRP95C。

49.权利要求48所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:35或由其组成。

50.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:25至35的多肽。

51.权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述分离的多肽包含以下免疫原性序列中的3、4、5、6、7、8、9种或全部：TRP120、A34N1、TRP63、TRP47、TRP75、TRP28、TRP36、TRP19、TRP140和/或HSP。

52.权利要求1至51中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含TRP36R1、TRP36R2、TRP36R3和/或TRP36CO中的至少两种。

53.权利要求52所述的多肽，其中所述多肽包含TRP36R1、TRP36R2和TRP36R3。

54.权利要求53所述的多肽，其中所述TRP36R1、TRP36R2和TRP36R3序列被接头分开。

55.权利要求53所述的多肽，其中所述TRP36R1、TRP36R2和TRP36R3序列不被接头分开。

56.权利要求52所述的多肽，其中所述多肽包含TRP36R1-R2-R3(SEQ ID NO:11)、TRP36R1-R3-R2(SEQ ID NO:12)、TRP36R2-R1-R3(SEQ ID NO:13)、TRP36R2-R3-R1(SEQ IDNO:14)、TRP36R3-R1-R2(SEQ ID NO:15)或TRP36R3-R2-R1(SEQ ID NO:16)。

57.权利要求6至7或11至56中任一项所述的多肽，其中所述免疫原性序列中的每一种连续重复1、2或3次。

58.权利要求57所述的多肽，其中所述免疫原性序列中的每一种连续重复1或2次。

59.权利要求1至58中任一项所述的多肽，其中不同的免疫原性序列不被接头或间隔区分开。

60.权利要求1至58中任一项所述的多肽，其中不同的免疫原性序列被接头或间隔区分开。

61.权利要求60所述的多肽，其中所述接头是甘氨酸接头。

62.权利要求61所述的多肽，其中所述甘氨酸接头具有氨基酸序列–(G)_X–，其中X＝3至5。

63.权利要求1至62中任一项所述的多肽，其中所述多肽的长度小于500、小于450、小于400、小于350、小于300、小于250、小于200或小于150个氨基酸。

64.权利要求1至63中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含在药物制剂中。

65.权利要求64所述的药物制剂，其中所述药物制剂被配制用于肠胃外、静脉内、皮下、鼻内、舌下或皮内施用。

66.权利要求1至63中任一项所述的多肽，其中所述多肽连接至固体支持物或包含在诊断试剂盒中。

67.权利要求66所述的多肽，其中所述固体支持物是玻璃或塑料。

68.权利要求66所述的多肽，其中所述固体支持物包含在侧向流测定或微流体装置中。

69.式I(A_s-B_t-C_u-D_v-E_w-F_x-G_y-H_z)_n的分离的多肽，

其中A、B、C、D、E、F、G和H是选自SEQ ID NO：1至24和36至42的肽，或者与(SEQ ID NO：1至24或36至42)中的任一个具有至少90％同一性的序列，

其中s、t、u、v、x、y和z是0至8的整数，其中s至z中的至少两个≥1并且s至z中的至少一个之2，并且

其中n是1至5的整数。

70.权利要求69所述的多肽，其中A是SEQ ID NO：8(TRP36R1)，并且B是SEQ ID NO：23(TRP140)。

71.权利要求70所述的多肽，其中s是4至8，t是2至4，并且n＝1。

72.权利要求71所述的多肽，其中u、v、x、y和z是零。

73.权利要求71至72中任一项所述的多肽，其中s＝8且t＝4。

74.权利要求73所述的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：27。

75.权利要求69所述的多肽，其中s、t、u、v、x、y和z中的至少两个、三个、四个、五个或六个各自为2至3；并且其中n＝1。

76.权利要求75所述的多肽，其中A是TRP32(例如，SEQ ID NO：5的TRP32R3)，B是TRP120(SEQ ID NO：22)，C是TRP36R1(SEQ ID NO：8)，D是TRP140(SEQ ID NO：23)，E是TRP28(SEQID NO：2)，并且F是HSP(SEQ ID NO：24)。

77.权利要求75所述的多肽，其中z＝0。

78.权利要求75所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：28或由其组成。

79.权利要求69所述的多肽，其中所述多肽包含表2(SEQ ID NO：25至35或43至44)中的任一个或由其组成。

80.药物制剂，其包含权利要求1至63或69至79中任一项所述的多肽和可药用赋形剂。

81.权利要求80所述的药物制剂，其中所述药物制剂被配制用于肠胃外、静脉内、皮下、鼻内、舌下或皮内施用。

82.权利要求1所述的药物制剂，其中所述可药用赋形剂包含佐剂或由其组成。

83.权利要求82所述的药物制剂，其中所述佐剂是乳剂或脂质体，或者其中所述佐剂包含脂质。

84.权利要求82所述的药物制剂，其中所述乳剂是水包油(O/W)乳剂或油包水(W/O)乳剂。

85.权利要求82所述的药物制剂，其中所述佐剂包含三萜类化合物、固醇、免疫调节剂、聚合物和/或免疫刺激性寡核苷酸。

86.权利要求85所述的药物制剂，其中所述聚合物是二乙基-氨基乙基(DEAE)-右旋糖酐、聚乙二醇或聚丙烯酸。

87.权利要求85至86中任一项所述的药物制剂，其中所述免疫刺激性寡核苷酸是含CpG的ODN。

88.权利要求85至87中任一项所述的药物制剂，其中所述佐剂包含DEAE右旋糖酐、免疫刺激性寡核苷酸和油例如矿物油，其中所述免疫刺激性寡核苷酸是含CpG的ODN，并且其中所述佐剂制剂是油包水(W/O)乳剂。

89.权利要求82所述的药物制剂，其中所述佐剂包含皂苷、固醇、季铵化合物、聚合物和ORN/ODN。

90.权利要求89所述的药物制剂，其中所述皂苷是QuilA或其纯化级分，所述固醇是胆固醇，所述季铵化合物是二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)，所述聚合物是聚丙烯酸，并且所述ORN/ODN是CpG。

91.权利要求90所述的药物制剂，其中所述皂苷以每剂量约1μg至约5,000μg的量存在，所述固醇以每剂量约1μg至约5,000μg的量存在，所述季铵化合物以每剂量约1μg至约5,000μg的量存在，并且所述聚合物以约0.0001％v/v至约75％v/v的量存在。

92.权利要求90至91中任一项所述的药物制剂，其中所述佐剂还包含糖脂。

93.权利要求92所述的药物制剂，其中所述糖脂是N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-β-D-吡喃型葡糖基)-N-十八烷基十二酰胺乙酸酯。

94.权利要求82所述的药物制剂，其中所述佐剂包含三萜类化合物皂苷、固醇、季铵化合物和聚丙烯酸聚合物。

95.权利要求94所述的药物制剂，其中所述皂苷是QuilA或其纯化级分，所述固醇是胆固醇，并且所述季铵化合物是二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)。

96.权利要求94至95中任一项所述的药物制剂，其中所述皂苷以每剂量约1mg至约5,000mg的量存在，所述固醇以每剂量约1mg至约5,000mg的量存在，所述季铵化合物以每剂量约1mg至约5,000mg的量存在，并且所述聚丙烯酸聚合物以约0.0001％v/v至约75％v/v的量存在。

97.权利要求82所述的药物制剂，其中所述佐剂包含油包水乳剂。

98.权利要求97所述的药物制剂，其中所述油包水乳剂包含油相和水相、聚阳离子载体(例如DEAE右旋糖酐)和含CpG的免疫刺激性寡核苷酸。

99.权利要求98所述的药物制剂，其中所述组合物还包含氢氧化铝凝胶。

100.权利要求98至99中任一项所述的药物制剂，其中所述聚阳离子载体是DEAE右旋糖酐。

101.权利要求82所述的药物制剂，其中所述组合物包含乳剂或水包油(O/W)乳剂。

102.权利要求101所述的药物制剂，其中所述乳剂包含水相，所述水相包含烷基-聚丙烯酸(烷基-PAA)或者丙烯酸聚合物和二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)两者。

103.权利要求102所述的药物制剂，其中所述水包油乳剂的水相包含二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)和烷基-聚丙烯酸(烷基-PAA)。

104.权利要求103所述的药物制剂，其中所述烷基-PAA是癸基-PAA、辛基-PAA、丁基-PAA或甲基-PA。

105.权利要求102至104中任一项所述的药物制剂，其中所述丙烯酸聚合物是与聚烯丙基蔗糖交联的丙烯酸的聚合物。

106.权利要求82所述的药物制剂，其中所述组合物包含油包水(W/O)乳剂，所述油包水乳剂包含非矿物油和乳化剂。

107.权利要求106所述的药物制剂，其中所述乳化剂是二缩甘露醇一油酸乳化剂。

108.权利要求82所述的药物制剂，其中所述佐剂是MF59、AS01、AS02、AS03、AS04、病毒微体、CAF01、CAF04、CAF05、丙烯酸聚合物/DDA乳剂、CpG/DEAE乳剂、皂苷/胆固醇/DDA佐剂或聚丙烯酸聚合物乳剂。

109.权利要求80至108中任一项所述的药物制剂，其中所述组合物还包含埃立克体(Ehrlichia)细菌疫苗。

110.权利要求109所述的药物制剂，其中所述细菌疫苗是热灭活的犬埃立克体(E.canis)或化学灭活的犬埃立克体。

111.权利要求109所述的药物制剂，其中所述细菌疫苗是热灭活的查菲埃立克体(E.chaffeensis)或化学灭活的查菲埃立克体。

112.权利要求109所述的药物制剂，其中所述细菌疫苗是已用甲醛、福尔马林、双亚乙基胺、辐射、紫外线、β-丙内酯处理或甲醛灭活的化学灭活的细菌疫苗。

113.核酸，其编码权利要求1至63或69至78中任一项所述的多肽。

114.权利要求113所述的核酸，其中所述核酸是DNA片段。

115.权利要求114所述的核酸，其中所述核酸包含在表达载体中。

116.宿主细胞，其包含权利要求113至115中任一项所述的核酸。

117.权利要求49所述的宿主细胞，其中所述细胞表达所述核酸。

118.在受试样品中检测特异性结合埃立克体生物体的抗体的方法，其包括：(a)接触权利要求1至63或69至79中任一项所述的分离的多肽；(b)检测肽-抗体复合体；其中所述肽-抗体复合体的检出指示在所述受试样品中存在对埃立克体生物体具有特异性的抗体，并且其中所述肽-抗体复合体的不存在指示在所述受试样品中不存在对埃立克体生物体具有特异性的抗体。

119.权利要求118所述的方法，其中所述埃立克体生物体是查菲埃立克体(Ehrlichiachaffeensis)生物体。

120.权利要求118所述的方法，其中所述埃立克体生物体是犬埃立克体(Ehrlichiacanis)生物体。

121.权利要求118至120中任一项所述的方法，其中所述检测步骤包括进行酶联免疫测定、放射免疫测定、免疫沉淀、荧光免疫测定、化学发光测定、免疫印迹测定、侧向流测定、流式细胞术测定、多重免疫测定、质谱测定或基于颗粒的测定。

122.权利要求121所述的方法，其中所述检测步骤包括侧向流测定或酶联免疫测定，其中所述酶联免疫测定是ELISA。

123.在哺乳动物对象中鉴定埃立克体感染的方法，其包括：(a)在允许形成肽-抗体复合体的条件下，使来自所述对象的生物样品与权利要求1至63或69至78中任一项所述的分离的多肽接触；以及(b)检测所述肽-抗体复合体；其中所述肽-抗体复合体的检出指示所述对象患有埃立克体感染。

124.权利要求123至15中任一项所述的方法，其中所述检测步骤包括进行酶联免疫测定、放射免疫测定、免疫沉淀、荧光免疫测定、化学发光测定、免疫印迹测定、侧向流测定、流式细胞术测定、多重免疫测定、浸棒测试或基于颗粒的测定。

125.权利要求123所述的方法，其中所述对象是人。

126.权利要求123所述的方法，其中所述对象是狗。

127.试剂盒，其包含：(a)权利要求1至63或69至79中任一项所述的分离的多肽，(b)与报道分子连接的抗狗或抗人二抗；以及(c)用于检测所述报道分子的合适试剂。

128.权利要求127所述的试剂盒，其中所述肽固定在膜或微量滴定板上。

129.权利要求127至128中任一项所述的试剂盒，其中所述报道分子选自萤光素酶、辣根过氧化物酶、发光纳米粒、P-半乳糖苷酶和荧光标记。

130.权利要求129所述的试剂盒，其中所述发光纳米粒是铝酸锶纳米粒。

131.权利要求127至130中任一项权利要求所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于狗或人血清的稀释缓冲液。

132.权利要求127至131中任一项权利要求所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含侧向流免疫测定或侧向流免疫色谱测定。

133.权利要求127至132中任一项权利要求所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含酶联免疫吸附测定(ELISA)。

134.在哺乳动物对象中诱导免疫应答的方法，其包括向所述对象施用有效量的药物制剂，所述药物制剂包含权利要求1至63或69至79中任一项所述的多肽或权利要求80至112中任一项所述的药物组合物。

135.权利要求134至44中任一项所述的方法，其中所述对象是人或狗。

136.权利要求134至135中任一项所述的方法，其中所述药物制剂通过皮下、肌内、鼻、通过吸入或气雾剂递送或皮内施用。

137.在对象中治疗查菲埃立克体或犬埃立克体感染的方法，其包括：

(a)在允许形成肽-抗体复合体的条件下，使来自所述对象的生物样品与权利要求1至63或69至79中任一项所述的分离的多肽接触；

(b)检测所述肽-抗体复合体；其中所述肽-抗体复合体的检出指示所述对象患有查菲埃立克体或犬埃立克体感染；以及

(c)在所述对象中施用治疗性化合物以治疗埃立克体感染。

138.权利要求137所述的方法，其中所述检测步骤包括进行酶联免疫测定、放射免疫测定、免疫沉淀、荧光免疫测定、化学发光测定、免疫印迹测定、侧向流测定、流式细胞术测定、多重免疫测定、浸棒测试或基于颗粒的测定。

139.权利要求137所述的方法，其中所述对象是狗。

140.权利要求137所述的方法，其中所述对象是人。

141.权利要求137至140中任一项所述的方法，其中所述治疗性化合物是抗生素。

142.权利要求141所述的方法，其中所述抗生素是多西环素。

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