BR102019004148A2 - Polipeptídeo ligbnid de leptospira spp. para uso como imunobiológico - Google Patents

Abstract

polipeptídeo ligbnid de leptospira spp. para uso como imunobiológico. a presente invenção refere-se ao isolamento de uma molécula de dna, originalmente derivada do gene ligb de l. interrogans, que codifica para o polipeptídeo ligbnid, apresentando massa molecular de aproximadamente 54 kda, que poderá ser usado para a prevenção da leptospirose como vacina ou componente vacinal, ou como componente no diagnóstico da leptospirose. o polipeptídeo recombinante é fortemente reconhecido pelo soro de pacientes com leptospirose, ou seja, é um marcador sorológico da infecção. a vacina baseada na proteína rligbnid induziu imunidade protetora (80-100%) e esterilizante contra leptospirose letal em hamsters. de acordo com a presente invenção o polipeptídeo ligbnid, bem como a sequência que a codifica, poderão ser usados no diagnóstico e prevenção de leptospirose em humanos e animais.

Description

POLIPEPTÍDEO LIGBNID DE LEPTOSPIRA SPP. PARA USO COMO IMUNOBIOLÓGICO CAMPOS DA INVENÇÃO (Setor técnico)

[001] A presente invenção, enquadrada nas categorias A61B;A61B 10/00; A61B 90/00; A61K; A61K 38/00; A61K 39/00; A61K 39/02; A61K 39/395; A61K 47/42; A61K 48/00; A61P; A61P 43/00; A61P 39/00; A61P 31/00; G01N 33/48; G01N 33/53, refere ao processo de obtenção do polipeptídeo LigBNID, o qual é codificado por uma molécula de DNA (ácido desoxirribonucleico) presente no genoma da bactéria Leptospira sp. As futuras invenções se referem à utilização deste polipeptídeo terapeuticamente, como vacina ou componente de formulações vacinais, bem como, em testes de diagnóstico da infecção, visando, portanto, a prevenção e/ou tratamento da leptospirose em humanos e animais.

Fundamentos para a invenção e estado da técnica

[002] A leptospirose, uma doença infecciosa emergente e negligenciada, é causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira[1-4]. Atualmente são descritos mais de 1 milhão de casos de leptospirose em humanos com 58 mil mortes[5]. As infecções ocorrem principalmente em regiões pobres, com falta de saneamento adequado e períodos de enchentes. Em países desenvolvidos a doença está relacionada à prática de esportes aquáticos [6].

[003] A doença é considerada a zoonose mais difundida no mundo [3,7,8] devido à capacidade do patógeno de induzir um estado de portador em uma variedade de animais silvestres e domésticos [9,10] e de sobreviver fora do hospedeiro, uma característica única entre as espiroquetas [1]. O principal vetor da leptospirose em humanos, principalmente nas áreas urbanas, é o rato (Rattus norvegicus). Entretanto, os cães também são importantes reservatórios [3,11].

[004] A leptospirose humana é geralmente contraída pelo contato direto com animais infectados ou indireto através da água ou solo contaminados com a urina desses animais. As manifestações clínicas variam desde um estado febril auto limitante, até uma doença ictérica crônica, com falhas renais e hepáticas (Doença de Weil), ou ainda, pode progredir para a forma mais severa, a síndrome Hemorrágica Pulmonar da leptospirose (LPHS), com taxas de mortalidade superiores à 70% [1,7,12,13].

[005] O teste de diagnóstico referência para leptospirose é o Teste de Aglutinação Microscópica (Microscopic Agglutination Test(MAT)). O MAT consiste na verificação da presença sorológica de anticorpos aglutinantes contra Leptospira spp. Sua metodologia é simples, consistindo na mistura do soro suspeito com uma cultura de leptospiras (geralmente 1x108 células por ml) e a verificação da aglutinação em microscopia de campo escuro. O teste recomenda a utilização de amostras de soros pareadas, sendo a primeira coleta durante a fase aguda (≤10 dias) e a segunda durante a fase tardia (>10 dias depois a coleta da primeira amostra). Em casos onde já existem títulos de anticorpos na fase aguda, espera-se que seus títulos aumentem quatro vezes ou mais para um diagnóstico confirmatório. Após a soroconversão, os títulos decaem progressivamente e permanecem baixos durante meses ou até anos [1].

[006] O MAT apresenta um bom desempenho com soros pareados, porém, a sensibilidade do teste diminui para a detecção da doença na fase aguda, refletindo em pouco impacto no tratamento do paciente [6]. Além disso, o custo de manutenção das cepas é relativamente alto e a técnica requer laboratórios bem equipados, sendo então restrita a poucos locais, e esse problema é ainda acrescido pelo fato da doença ser negligenciada e de maior ocorrência em países em desenvolvimento [14].

[007] Outras técnicas para o diagnóstico de leptospirose como o diagnóstico molecular e testes sorológicos vêm sendo propostos. Dentre as técnicas moleculares, a mais utilizada é a reação em cadeia da polimerase (PCR). A PCR visa a detecção do DNA de leptospiras pela amplificação de segmentos específicos, a partir de material provindo de amostras clínicas como sangue, urina, líquor, humor aquoso ou tecidos [3,15]. Diversos genes já foram descritos na literatura como alvos para o diagnóstico da leptospirose baseado em PCR, dentre eles se destacam o secY, rrs, flaB, rrl e lipL32[16].

[008] A técnica pode confirmar o diagnóstico na fase inicial da doença, ou seja, enquanto a bactéria está presente e os títulos de anticorpos estão em níveis indetectáveis no soro. Além disso, juntamente com isolamento e sorologia, a técnica de PCR é amplamente utilizada para detectar leptospiras em diagnósticos post-mortem[17]. Contudo, as técnicas moleculares possuem custo relativamente elevado, necessitam de profissionais especializados, equipamentos específicos e as amostras constantemente apresentam inibidores da reação, o que pode aumentar o índice de resultados falso-negativos.

[009] Os ensaios sorológicos, como os Ensaios Imunoenzimáticos (ELISA), possuem um formato rápido e podem discernir pacientes recuperados e/ou vacinados dos que estão tendo o primeiro contato com a bactéria [18]. O teste pode ser realizado utilizando células inteiras de leptospiras[19,20] ou proteínas recombinantes, como, por exemplo, OmpL41 [21], rLipL32[22-24], rLipL41[24,25], rLigA[24,26] e rLigB [27,28].

[010] As proteínas rLipL21, rLipL32 e rOmpL1 foram testadas separadamente [21,23,29], e fusionadas em único antígeno recombinante[30]. O ELISA-IgM com os antígenos fusionados obteve a sensibilidade de 97,8%, com um total de 493 soros confirmados para leptospirose e em fase aguda, além de especificidade de 100%, com 112 amostras de soros de pacientes saudáveis e 56 de pacientes com outras doenças de caráter febril [30].

[011] A utilização de rLigB associada à técnica de ELISA demonstrou 96 % de sensibilidade e 91 de especificidade na avaliação de soros bovinos (554 positivos e 572 negativos) [28].No estudo de Sankar et al.(2010), o uso de rLigB emum ELISA cinético (k-ELISA-IgG) apresentou sensibilidade de 100% em uma amostra de 95 soros bovinos confirmados por MAT, além de especificidade de 97,1% em 105 das amostras de soros bovinos saudáveis[27].

[012] A limitação dos ensaios imunoenzimáticos decorre da grande variação em relação a sensibilidade e especificidade dos testes[24,31], por exemplo, a sensibilidade varia de 28-71% para detectar a doença na fase aguda, e alteram entre 75-94% na detecção na fase convalescente [31]. O kit Pan-Bio (IgM) apresentou resultados controversos [32,33][34,35], inicialmente sua sensibilidade geral foi de 100%, com especificidade de 92% em 49 amostras de soros pareadas[36]. Porém em uma avaliação do kit na Tailândia os mesmos resultados não puderam ser reproduzidos, deixando o teste com uma sensibilidade de 83,8% e 95,5%, somado a uma especificidade de 45,2% e 64,6%, ambos nas fases aguda e convalescente, respectivamente [35].

[013] Contudo, o desempenho geral dos ensaios Imunoenzimáticos (ELISA) sugere a aplicabilidade como um teste rápido de diagnóstico de leptospirose, principalmente em hospitais com recursos limitados e laboratórios onde o MAT não é disponível [37]. No entanto, os testes de diagnóstico do tipo ELISA, precisam ser importados, tornando os ensaios onerosos e dificultando a implementação de novas metodologias.

[014] A vacinação é a medida profilática mais promissora para o controle da leptospirose. Entretanto, as vacinas atualmente disponíveis são bacterinas, compostas por um painel limitado de sorovares, as quais conferem uma proteção de curta duração e sorovar-específica, além de haver efeitos colaterais [38]. Seu uso em humanos é comum apenas em poucos países (China, Cuba, Japão, Vietnã e França) e somente em períodos de enchentes. O uso veterinário para cães, bovinos e suínos é relatado globalmente.

[015] O desenvolvimento de vacinas de subunidade é uma estratégia alternativa e apresenta várias vantagens: a utilização de proteínas definidas evita as reações adversas associadas ao LPS da Leptospira; determinantes proteicos podem induzir uma resposta de longa duração e não induzir a formação de anticorpos aglutinantes; e uma vacina poderia ser desenvolvida utilizando proteínas conservadas entre todos os sorovares patogênicos [6].

[016] Na última década, um número crescente de estudos investigou a proteção induzida por vacinas experimentais contra leptospirose utilizando como antígeno proteínas da membrana externa de Leptospira sp. Diversos antígenos leptospirais, jáforam testados através de diferentes estratégias vacinais e com diferentes adjuvantes – LipL32, LipL41, LigANI, LigB, Loa22 – porém nenhum trabalho obteve proteção heteróloga total, estatisticamente significativa, esterilizante e sem efeitos adversos[39].

[017] As proteínas da família Lig (Leptospiral immunoglobulinlike), dentre elas LigA e LigB, são proteínas altamente conservadas e envolvidas no mecanismo de patogenicidade de Leptospira spp. Localizam-se na membrana externa de leptospiras patogênicas e tem sua expressão aumentada durante o processo de invasão [40,41]. Além disso, o gene ligB é conservado em todas as espécies de leptospiras patogênicas e, tanto LigA quanto LigB, possuem repetições em tandem de aproximadamente 90 resíduos de aminoácidos. Ambas apresentam 100% de identidade nos domínios repetitivos de suas porções N-terminal (polipeptídio LigBNID) [42].

[018] Além da literatura acima discutida, citam-se ainda os documentos WO03/098214, publicado em 27/11/2003, de titularidade da Fundação Oswaldo Cruz e o documento WO2004/032599, publicado em 22/04/2004 de titularidade Cornell Research Foundation Inc. Ambos os pedidos de patente reivindicam as proteínas Lig para uso em diagnóstico e vacina, porém nenhum dos documentos apresenta evidência de proteção usando as proteínas Lig. Ressalta-se também que esses documentos não se referem especificamente ao fragmento de LigBNID, utilizado nesse estudo e também não apresentam a sequência do polipeptídeo para uso no diagnóstico, bem como em uma formulação de vacina contra leptospirose.

[019] Destaca-se ainda o documento PI 0505529-6(WO2007070996), publicado em 19/12/2005 de titularidade da Fundação Oswaldo Cruz, o qual também explora o potencial de fragmentos das proteínas Lig para uso em vacinas e diagnóstico. O documento relata a obtenção de fragmentos recombinantes das proteínas Lig e avaliação destes como antígeno em ensaios de proteção em hamsters. Os ensaios indicam que as vacinações com o fragmento LigAni podem induzir proteção contra leptospirose. Entretanto, a invenção não registra avaliações de proteção utilizando antígeno equivalente a LigBNID. Logo, as reivindicações do uso deste antígeno como imunobiológico, principalmente em composições vacinais não possuem fundamentação experimental. Devido a essa e outras limitações, o pedido da patente PI 0505529-6foi indeferido.

[020] O estudo de Koizumi; Watanabe (2004),intitulado “Leptospiral immunoglobulin-like proteins elicit protective immunity”, avaliou o uso das proteínas Lig como vacina contra leptospirose. Brevemente, camundongos foram inoculados subcutaneamente com 10 µg do antígeno recombinante emulsificado em Adjuvante de Freund completo na primeira dose e, posteriormente, duas doses reforço de 10 µg do antígeno, porém sem adjuvante. Uma semana após a última dose da vacina os animais foram desafiados com 1x106células de L. interrogans sorovar Manilae. Ao final do experimento, observou-se que ambos os antígenos induziram proteção frente ao desafio com leptospiras letais em camundongos[43].

[021] Os camundongos (Mus musculus) são hospedeiros reservatórios das leptospiras e geralmente são resistentes à doença. A vantagem do uso desse modelo é a vasta disponibilidade de insumos laboratoriais e as linhagens knockout, usadas paraestudar a resposta imune à leptospirose [44,45]. No entanto, os camundongos têm sido usados somente no estágio inicial do desenvolvimento da vacina, em ensaios de triagem de um grande número de candidatos vacinais [46] e não é reconhecido como modelo experimental para o desenvolvimento de vacinas [38,47]. O hamster sírio (Mesocricetus auratus) é o modelo padrão para estudos de leptospirose e é usado pelas agências reguladoras no teste de vacinas comerciais. O hamster possui alta susceptibilidade à leptospirose, a evolução da doença é semelhante em humanos e o modelo já é bem caracterizado[1,44,48,49].

[022] Para causar infecção letal em camundongos um alto inóculo (1 x 106) foi requerido, o que provocou óbito por choque séptico, ao invés de induzir leptospirose aguda nos animais. Destaca-se também a importância do adjuvante na formulação da vacina. Porém, o adjuvante completo de Freund, utilizado no estudo descrito, não é licenciado devido a sua alta toxicidade[50]. Além disso, o estudo de Silva, et al., (2007) indica que o antígeno vacinal em questão, quando adsorvido no adjuvante de Freund, é incapaz de estimular proteção contra leptospirose em hamsters [51].

[023] No estudo de Silva et al. (2007), denominado “The terminal portion of leptospiral immunoglobulin-like protein LigA confers protective immunity against lethal infection in the hamster model of leptospirosis”, a vacinação com ofragmento recombinante de LigB, similar ao fragmento da presente invenção (LigBNID), e adjuvante de Freund, não induziu imunidade protetora em hamsters[51].

[024] O trabalho de Yan et al. (2009), intitulado “Immunogenicity and protective efficacy of recombinant Leptospira immunoglobulin-like protein B (rLigB) in a hamster challenge model” avaliou o potencial de subunidades da proteína LigB (rLigCon, rVarB1 e 16 rVarB3)para uso em vacinas contra leptospirose. Nos ensaios de proteção hamsters foram vacinados com 50 µg do antígeno recombinante, adsorvido no adjuvante hidróxido de alumínio. Foram administradasduas doses com intervalo de 3 semanas entre elas, posteriormente os animais foram desafiados, via intraperitoneal, com 2,5 X DL50 de L. interrogans serovar Pomona. O estudo demonstrou em torno de 70% de sobrevivência nos animais vacinados, sem indução de imunidade esterilizante e com sobrevivência no grupo controle [52]. Além disso, a sequência do antígeno rLigcon compreende os aminoácidos 68–1191, diferindo da sequência do antígeno rLigBNID, que corresponde aos aminoácidos 131-645, ambos de LigB. Logo, os antígenos avaliados no estudo de Yan et al.(2009) não possuem identidade com LigBNID, antígeno avaliado na presente invenção.

[025] A principal diferença entre os estudos de Silva et al. (2007) e Yan et al. (2009)é o adjuvante utilizado. No primeiro a proteína foi emulsificada em adjuvante de Freund, enquanto nosegundo [52],bem como na presente invenção, o adjuvante hidróxido de alumínio compôs a vacina. O adjuvante hidróxido de alumíniopossui licença e aprovação para uso animal e humano[50].

[026] Os estudos que exploram o potencial vacinal de LigB, não demonstram proteção total, e na maioria dos casos não explora antígenos equivalentes a LigBNID (aa 131–645). Além disso, nenhum dos estudos obteve a indução de imunidade esterilizante [43,51,52]. Na presente invenção, a vacinação com rLigBNID proporcionou até 100% de proteção e imunidade esterilizante contra leptospirose letal em hamsters.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[026] Neste contexto, os eventos descritos a seguir, apresentam a invenção baseada no polipetídeo LigBNID, que tem como objetivo explorar seu potencial para uso em vacinas contra leptospirose, atuando no controle e prevenção da doença, bem como, para uso no diagnóstico da leptospirose humana e animal.

[027] A invenção se refere ao uso isolado ou combinado de LigBNID, dos anticorpos contra esses polipeptídeos e dos polinucleotídeos que os codificam, os quais poderão ser utilizados como veículo farmaceuticamente aceitável para a prevenção, tratamento ou diagnóstico da leptospirose.

Breve descrição das ilustrações

[027] Para um melhor entendimento da presente invenção, seguem em anexo as seguintes figuras:

[028] A Figura 1 representa a avaliação da expressão do polipeptídeo recombinante (rLigBNID). A análise da expressão foi realizada através de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDSPAGE 12%) corado com Comassie blue. Coluna 1. Marcador de massa molecular; Coluna 2. Fração do polipeptídeo expressa de formasolúvel; Coluna 3. Fração do polipeptídeo expresso de forma insolúvel.

[029] A figura 2 demonstra a confirmação da expressão de rLigBNID através de Western blot utilizando o anticorpo monoclonal anti-histidina.Coluna 1. Marcador de massa molecular; Coluna 2. Fração do polipeptídeo expressa de forma solúvel; Coluna 3. Fração do polipeptídeo expresso de forma insolúvel.

[030] A figura 3 demonstra a caracterização de rLigBNID, através de Western blot,utilizando um pool de soros humanos positivos para leptospirose.Coluna 1. Marcador de massa molecular; Coluna 2. Fração do polipeptídeo expressa de forma solúvel; Coluna 3. Fração do polipeptídeo expresso de forma insolúvel.

[031] Figura 4 demonstra a sobrevivência de hamsters vacinados com rLigBNID no experimento I. Grupos de 10 hamsters foram inoculados com rLigBNID (grupo vacinado) ou com PBS (grupo controle) e desafiados com L. interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130. A linha vermelha representa os animais vacinados e a linha cinza representa o grupo controle. Os dias após a infecção correspondem ao eixo X. O eixo Y representa a sobrevivênciaem porcentagem (%).

[032] A Figura 5 demonstra a sobrevivência de hamsters vacinados com rLigBNID no experimento II. Grupos de 10 hamsters foram inoculados com rLigBNID (grupo vacinado) ou com PBS (grupo controle) e desafiados com L. interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130. A linha vermelha representa os animais vacinados e a linha cinza representa o grupo controle. Os dias após a infecção correspondem ao eixo X. O eixo Y representa a sobrevivência em porcentagem (%).

[033] A Figura 6 demonstra a sobrevivência de hamsters vacinados com rLigBNID no experimento III. Grupos de 10 hamsters foram inoculados com rLigBNID (grupo vacinado) ou com PBS (grupo controle) e desafiados com L. interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130. A linha vermelha representa os animais vacinados e a linha cinza representa o grupo controle. A linha vermelha representa os animais vacinados e a linha cinza representa o grupo controle. Os dias após a infecção correspondem ao eixo X. O eixo Y representa a sobrevivência em porcentagem (%).

[034] A Figura 7 demonstra a resposta imune humoral IgM em hamsters vacinados com rLigBNID no experimento I. Foram avaliados os soros pré-imune (representado em branco), imune (representado em vermelho) e pós-desafio (representado em cinza). As barras representam a média das absorbâncias dos soros individuais através de ELISA indireto, utilizando como antígeno 50 ng de rLigBNID.

[035] A Figura 8 demonstra a resposta imune humoral IgM em hamsters vacinados com rLigBNID no experimento II. Foram avaliados os soros pré-imune (representados em branco), soros imune (representados em vermelho) e soros pós-desafio (representados em cinza). As barras representam a média das absorbâncias dos soros individuais através de ELISA indireto, utilizando como antígeno 50 ng de rLigBNID.

[036] A Figura 9 demonstra a resposta imune humoral IgM em hamsters vacinados com rLigBNID no experimento III. Foram avaliados os soros pré-imune (representado em branco), imune (representao em vermelho) e pós-desafio (representado em cinza). As barras representam a média das absorbâncias dos soros individuais através de ELISA indireto, utilizando como antígeno 50 ng de rLigBNID.

[037] A Figura 10 demonstra a resposta imune humoral IgG total em hamsters vacinados com rLigBNID no experimento I. Foram avaliados os soros pré-imune (representado em branco), imune (representado em vermelho) e pós-desafio (representado em cinza). As barras representam a média das absorbâncias dos soros individuais através de ELISA indireto, utilizando como antígeno 50 ng de rLigBNID.

[038] A Figura 11 demonstra a resposta imune humoral IgG total em hamsters vacinados com rLigBNID no experimento II. Foram avaliados os soros pré-imune (representado em branco), imune (representado em vermelho) e pós-desafio (representado em cinza). As barras representam a média das absorbâncias dos soros individuais através de ELISA indireto, utilizando como antígeno 50 ng de rLigBNID.

[039] A Figura 12 demonstra a resposta imune humoral IgG total em hamsters vacinados com rLigBNID no experimento III. Foram avaliados os soros pré-imune (representado em branco), imune (representado em vermelho) e pós-desafio (representado em cinza). As barras representam a média das absorbâncias dos soros individuais através de ELISA indireto, utilizando como antígeno 50 ng de rLigBNID.

[040] A Figura 13 representa a isotipagem (IgG1)dos anticorpos obtidos a partir da vacinação com rLigBNID. Foram avaliados os soros pré-imune (representado em branco), imune (representado em vermelho) e pós-desafio (representado em cinza). Os anticorpos dos três experimentos foram avaliados em pool através de ELISA indireto utilizando rLigBNID como antígeno (50 ng/cavidade). As colunas representam a média das duplicatas.

[041] A Figura 14 representa a isotipagem (IgG2)dos anticorpos obtidos a partir da vacinação com rLigBNID. Foram avaliados os soros pré-imune (representado em branco), imune (representado em vermelho) e pós-desafio (representado em cinza). Os anticorpos dos três experimentos foram avaliados em pool através de ELISA indireto utilizando rLigBNID como antígeno (50 ng/cavidade). As colunas representam a média das duplicatas.

[042] A Figura 15 representa a isotipagem (IgG3)dos anticorpos obtidos a partir da vacinação com rLigBNID. Foram avaliados os soros pré-imune (representado em branco), imune (representado em vermelho) e pós-desafio (representado em cinza). Os anticorpos dos três experimentos foram avaliados em pool através de ELISA indireto utilizando rLigBNID como antígeno (50 ng/cavidade). As colunas representam a média das duplicatas.

[043] A figura 16 apresenta a avaliação do uso de rLigBNID como antígeno em testes de ELISA indireto para o diagnóstico de leptospirose. No ELISA IgM foram avaliados 22 soros humanos suspeitos de leptospirose, os quais foram previamente caracterizados por MAT. Os círculos representam os soros positivos e os triângulos representam os soros negativos. O valor do Cut-off, representado pela linha pontilhada vermelha na figura, foi determinado como a média dos soros negativos somado de duas vezes o seu desvio padrão.

[044] A Figura 17 apresenta a avaliação do uso de rLigBNID como antígeno em testes de ELISA indireto para o diagnóstico de leptospirose. No ELISA IgG foram avaliados 124 soros humanos suspeitos de leptospirose, os quais foram previamente submetidos ao MAT. Os círculos representam os soros positivos e os triângulos representam os soros negativos.O valor do Cut-off, representado pela linha pontilhada vermelha na figura, foi determinado como a média dos soros negativos somado de duas vezes o seu desvio padrão.

[045] A Figura 18 demonstra o resultado do teste de diagnóstico para leptospirose canina baseado no polipeptídeo recombinante LigBNID (rLigBNID) avaliado em ELISA IgG. O teste utilizou rLigBNID como antígeno (50 ng/cavidade). Foram avaliados 24 soros caninos suspeitos de leptospirose, os quais foram previamente caracterizados por MAT. Os círculos representam os soros positivos e os triângulos representam os soros negativos.O valor do Cut-off, representado pela linha pontilhada vermelha na figura, foi determinado como a média dos soros negativos somado de duas vezes o seu desvio padrão.

Descrição da invenção

[046] Por conveniência o significado de alguns termos empregados nas especificações estão descritos abaixo.

[047] Lig – Proteínas que pertencem a Família das Proteínas semelhantes a imunoglobulinas (Bacterial Imunoglobulin-like). Localizam-se na membrana externa de leptospira spp. e são fortemente reconhecidas pelo soro de pacientes com leptospirose.

[048] ligBNID – porção altamente conservada nos genes ligA e ligB de Leptospira spp. A região corresponde aos nucleotídeos 391-1948 do DNA genômico das Leptospiras.

[049] rLigBNID – polipeptídeo recombinante que correspondente aos aminoácidos 131 – 645 de LigB. O polipeptídeo recombinante é derivado do DNA genômico de L. interrogansIcterohaemorrhagiae sorovar Copenhageni cepa FIOCRUZ L1-130.

[050] O gene ligBNID (LIC10464) possui uma sequência de mil e quinhentos e cinquenta e oito (1558) nucleotídeos (SEQ 1), região correspondente aos nucleotídeos 391-1948 do DNA genômico das Leptospiras, que codificam para quinhentos e quinze (515) aminoácidos (SEQ 2), os quais originam um polipeptídeo com massa molecular de cerca de 54 kDa, denominada LigBNID. O antígeno rLigBNID, adsorvido no adjuvante hidróxido de alumínio (Alhydrogel), induziu até 100% de proteção contra leptospirose letal em hamsters e imunidade esterilizante. Nesse sentido, a invenção proporcionará composições farmacêuticas capazes de induzir proteção contra leptospirose, além de proporcionar um composto passível de uso no tratamento dessa doença.

[051] Nos ensaios de proteção, hamsters vacinados com rLigBNID desenvolveram anticorpos que reconhecem rLigBNID. A resposta imune humoral apresenta anticorpos IgM e IgG, a qual é caracterizada pela presença de anticorpos mistos, dos isotipos IgG1 e IgG2. O desenvolvimento de resposta humoral específica demonstra que o antígeno recombinante é imunogênico.

[052] Testes de diagnóstico sorológico baseados na técnica de ELISA indireto, utilizando rLigBNID como antígeno apresentaram de 90 –100% de sensibilidade na identificação de leptospirose humana e canina. Nesse contexto, em uma das modalidades, a invenção disponibilizará um antígeno imunogênico caracterizado por ser reconhecido por anticorpos presentes no soro de pacientes com leptospirose. O antígeno poderá ser utilizado de forma isolada ou em combinação com outros antígenos em testes de diagnóstico sorológico contra leptospirose.

[053] Ainda, a invenção proporcionará anticorpos específicos contra o antígeno rLigBNID que poderão ser utilizados de forma isolada ou em combinação com outros anticorpos ou antígenos em ensaios de diagnóstico da infecção, bem como em compostos farmaceuticamente aceitáveis para a prevenção e terapia de leptospirose.

[054] Com base na sequência de nucleotídeos do gene ligBNID seguiram os processos de clonagem, expressão, purificação doantígeno recombinante e avaliação do potencialimunobiológico de rLigBNID, segundo os procedimentos a seguir:

[056] Passo 1. A partir do DNA genômico de L. interrogansIcterohaemorrhagiae sorovar Copenhageni cepa FIOCRUZ L1-130, o gene LigBNID (SEQ 1), foi amplificado através deprimersespecíficos: Primer Forward5’- ATGGGACTCGAGATTACCGTTACACCAGCCATT-3’ e Primer Reverse 5’- ATTCCATGGTTATCCTGGAGTGAGTGTATTTGT-3’. A amplificação foi realizada através de reação em cadeia da polimerase (PCR). A PCR foi realizada em um volume final de 25 μL, contendo aproximadamente 20 ng de DNA molde, primers forward e reverse [0,4μM cada], MgCl2 [1,5mM], dNTPs [200μM], tampão PCR [1x] e 1 unidade da enzima Platinum®Taq DNA Polymerase (Invitrogen). A reação foi realizada em termociclador Eppendorf (modelo Mastercycle Gradient) e padronizada nas seguintes condições: desnaturação inicial (94°C, 3 min) seguida de 35 ciclos de desnaturação (94°C, 15 seg), anelamento (55°C, 30 seg) e extensão (68°C, 90 seg). Ao término destes 30 ciclos, a reação foi submetida a um ciclo de extensão final (68°C, 5 min). Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% contendo brometo de etídio, e purificados com kit GFX TM PCR DNA and gel Band Purification (GE Healthcare), de acordo com as orientações do fabricante.

[057] Passo 2. Posteriormente, o gene ligBNID amplificado foi inseridoem vetor de clonagem, neste caso utilizou-se o vetor topo. Para a expressão do polipeptídeo rLigBNID, o vetor recombinante, denominado topo/ligBNID, foi utilizado para transformar E. coli BL21 Star (DE3) por choque térmico, utilizando 100 μl de CaCl2, uma colônia isolada deE. coli BL21 Star DE3 e 2 μL do plasmídeo topo/ligBNID (incubação por 2 min a 0 °C, seguido de 1 min a 42 °C e 2 min a 0 °C). Posteriormente, um clone recombinante foi utilizado para inocular 10 ml de LB contendo 100 μg.ml-1 de ampicilina ecultivado sob agitação de 200 rpm, por 12 – 20 h a 37 °C. Esta cultura foi utilizada para inocular 500 ml de LB com 100 μg.ml-1de ampicilina, que foi incubado à 37 °C e agitação de 200 rpm até a fase exponencial de crescimento (DO600 entre 0,6 e 0,8), quando então a expressão dopolipeptídeo rLigBNID foi induzida com 1 mM de IPTG (isopropiltio-β-D-galactosideo), durante 3 h. Após este período, a cultura foi fracionada em tubos de 250 ml, centrifugada a 6.000 × g por 15 min a 4ºC. O pellet foi suspendido em um tampão de solubilização (8 M de uréia, 0,1 M de Tris-base, 0,3 M de rLigBNID foi purificado através de cromatografia de afinidade utilizando colunas Ni2 Sepharose NaCl e 5 mM de imidazole, pH 8,0) e incubado em agitador orbital a 60 rpm por 18 h, em temperatura ambiente. As células foram então sonicadas (3 ciclos de 30 s, 20 kHz), e centrifugadas (10.000 x g por 30 min a 4 °C). Opolipeptídeo HisTrap, sendo as proteínas eluídas da coluna com 200 mM de imidazole. A fração contendo a proteína eluída foi identificada através de SDS-PAGE 12%. As alíquotas eluídas contendo a proteína recombinante foi dialisada contra tampão fosfato-salino (PBS) (pH 7,2) overnight a 4 °C e armazenada a – 20 °C. A concentração da proteína purificada foi determinada usando BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA), com uma curva padrão de albumina sérica bovina (BSA).

[058] Passo 3. A confirmação da expressão e caracterização daproteína foi realizada através de Western blot. Após eletroforese em SDS-PAGE, a proteína recombinante foi transferida para uma membrana de nitrocelulose, HybondECL(GE Healthcare), a qual em seguida foi bloqueada com 5% de leite em pó desnatado diluído em PBS, pH 7,2 acrescido de 0,5% de Tween 20 (PBS-T) e incubado overnight a 4°C. Após, a membrana foi lavada três vezes com PBS-T por 5 min cada lavagem e posteriormente, a membrana contendo rLigBNID foi incubada com anticorpo monoclonal anti-histidina conjugado com peroxidase (Anti-His, Sigma). O anticorpo foi previamente diluído 1:10000 e incubado por 1h à temperatura ambiente. Finalmente, a reação na membrana foi revelada usando a solução cromógena de tetrahidrocloreto de diaminobenzedina (DAB, 0,6 mg de 3.3 diaminobenzidina-tetrahidrocloreto; 10 µL de H2O2 30%; 9 ml de Tris-HCl 50mM pH 7,6; 1 ml de Sulfato de Níquel 0,3%).

[059] A avaliação através de SDS PAGE demonstrou que o polipeptídeo recombinante foi expresso principalmente na forma insolúvel (Figura 1). O ensaio de Western blot, utilizando o anticorpo monoclonal anti-histidina, confirmou a expressão revelando bandas de aproximadamente 54 kDa, massa correspondente ao antígeno rLigBNID (Figura 2). Ainda através de Western blot, verificou-se que rLigBNID é reconhecido por anticorpos presentes no soro de pacientes com leptospirose (Figura 3).

[059] A avaliação através de SDS PAGE demonstrou que o polipeptídeo recombinante foi expresso principalmente na forma insolúvel (Figura 1). O ensaio de Western blot, utilizando o anticorpo monoclonal anti-histidina, confirmou a expressão revelando bandas de aproximadamente 54 kDa, massa correspondente ao antígeno rLigBNID (Figura 2). Ainda através de Western blot, verificou-se que rLigBNID é reconhecido por anticorpos presentes no soro de pacientes com leptospirose (Figura 3).

[061] Passo 5. A capacidade do polipeptídeo rLigBNID de induzir proteção foi investigada em ensaios utilizando hamsters, modelo experimental ideal para leptospirose. Os animais foram inoculados (dias 0 e 14) via intramuscular com o polipeptídeo rLigBNID ou com PBS (grupo controle). A concentração do polipeptídeo utilizada na vacinação foi de 100 µg em ambas as doses, ou de 40 e 20 µg, na primeira e segunda dose, respectivamente. Amostras de sangue para avaliação da resposta imune humoral foram coletadas no dia -2, (soro pré-imune) e no dia 26 (soro imune). Os animais foram desafiados, no dia 28, via intraperitoneal com 1x102 leptospiras, equivalente a 5 vezes Dose Letal 50%(DL50).

[062] A dose de L. interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 a ser utilizada no desafio foi determinada anteriormente em ensaios de Dose Letal 50% (DL50). Nos ensaios de DL50, hamsters com 9 semanas de idade foram divididos em 6 grupos com 3 animais em cada. Os animais foram desafiados intraperitonealmente com 100 - 105 leptospiras diluídas em PBS. O valor da DL50 foi calculado pelo método de Reed-Muench (1938)[53].

[063] Todos os animais foram observados e pesados diariamente após o desafio. A eutanásia foi realizada em seguida do surgimento dos primeiros sinais clínicos da doença. Os animais que se mantiveram saudáveis foram submetidos à eutanásia 28 dias após a infecção. Os tecidos foram armazenados em formalina para avaliação histopatológica e a -70 °C para a quantificação da carga leptospiral (q-RT-PCR). No momento da necropsia também foi coletada uma amostra de sangue, soro pós-desafio.

[064] A fim de garantir a confiabilidade do teste, foram realizados três ensaios de proteção independentes, seguindo a metodologia descrita acima. No experimento I, 80% dos animais vacinados sobreviveram ao desafio letal, seguido de 90% e 100% de sobrevivência nos ensaios subsequentes. Nos grupos controle, a maioria dos animais não sobreviveu ao desafio, atingindo 100, 70 e 80% de óbito nos experimentos I,II e III, respectivamente (Figuras 4, 5 e 6 e Tabela 1).

[065] Tabela 1. Avaliação dos ensaios de proteção em hamsters: doses de antígeno vacinal, taxas de sobrevivência e mortalidade, e análise estatística.

[066] Passo 6. A resposta imune humoral foi avaliada através de ELISA indireto utilizando o polipeptídio rLigBNID como antígeno. Os soros pré-imune (dia 0), imune (dia 26) e pós-desafio (dia 56) foram avaliados quanto aos níveis de anticorpos IgM, IgG total e isotipos (IgG1, IgG2 e IgG3).

[067] Os testes de ELISA foram realizados em placas de poliestireno de 96 cavidades (NUNC®). As placas foram sensibilizadas com 50 ng/cavidade de rLigBNID em tampão carbonato-bicarbonato (0,05M pH 9,6) por 18 h à 4ºC.Os soros foram diluídos (1:25) em PBS-T (Tampão Fosfato salino contendo 0,05% de Tween 20) e adicionados 50 µl/cavidade, em duplicata. Posteriormente, os anticorpos conjugados a peroxidase anti-IgM (1:3000), anti-IgG (1:6000) e os anti-isotipos (1:500), diluído em PBS-T, foram adicionados as placas. Após cada etapa as placas foram incubadas por 1 h a 37°C e lavadas 4 vezes com 200 µl de PBS-T. A revelação da reação antígeno-anticorpo foi realizada com a adição de Ortofenilenodiamina (OPD) acrescida de peróxido de hidrogênio. Após o período de incubação de 15 minutos, no escuro, a temperatura ambiente, a leitura foi realizada em espectrofotômetro a 450 nm. Através dessas análises verificou-se que a vacina induziu níveis significantes de anticorpos IgM (Figuras 7, 8 e 9) e IgG (Figuras 10, 11 e 12), os quais mantiveram-se até o final do experimento (dia 56). A resposta humoral é caracterizada pela presença de anticorpos IgG de isotipos mistos IgG1 e IgG2 (Figura 13, 14 e 15).

[068] Passo 7. A presença de leptospiras nos tecidos foi avaliadaatravés de imunofluorescência indireta e também isolamento através de macerado renal. A imunofluorescência foi realizada através da impressão, imediatamente após aeutanásia dos animais, através do contato dos órgãos (rim, fígado e pulmão) com lâminas de vidro, previamente preparadas com poli-Llisina. Em seguida, as lâminas foram fixadas com acetona por 3 minutos. As áreas das impressões foram delimitadas com caneta hidrofóbica antes de iniciar o procedimento de imunofluorescência. Anticorpos anti-Leptospira produzidos em coelho foram adicionados às lâminas para reação antígenoanticorpo. Para marcação foi utilizado um anticorpo secundário (anti-coelho) conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC). A visualização foi realizada em microscopia de fluorescência. A imunofluorescência demonstrou a presença de leptospiras nos tecidos dos animais do grupo controle, os quais foram inoculados somente com PBS. Esse grupo de animais apresentou leptospiras em no mínimo um dos órgãos avaliados (rim, fígado e pulmão). Em contraponto, o grupo vacinado com o polipeptídeo rLigBNID não apresentou leptospiras em nenhum dos órgãos (Tabela 2).

[069] A presença de leptospiras nos rins também foi verificada através de reisolamento de leptospiras em meioEllinghausenMcCullough-Johnson-Harris (EMJH) suplementado com Leptospira Enrichment EMJH (Difco, USA). Brevemente, o rim foi removido assepticamente durante a necropsia e macerado em 4,5 ml de meio EMJH. Após 1 hora de incubação para liberação das bactérias no meio, 0,5 ml deste cultivo foi transferido para outros 4,5 ml de meio EMJH líquido. Os cultivos foram mantidos a 28°C por 12 semanas e observados semanalmente, em microscopia de campo escuro, para verificar a presença de leptospiras.

[070] Os animais vacinados, nos três experimentos independentes, apresentaram cultivos negativos. Esse resultado indica a ausência da bactéria viável nos rins dos animais vacinados e dessa forma, demonstra a capacidade da vacina de induzir imunidade esterilizante. Nos cultivos do grupo controle observou-se a presença de leptospiras viáveis nos rins de todos os animais (Tabela 2).

[071] A presença de leptospiras nos tecidos foi avaliada através de duas técnicas distintas: imunofluorescência indireta e reisolamento em cultivo. Os animais vacinados, não apresentaram leptospiras em nenhum dos tecidos avaliados, nos três experimentos. Esse resultado demonstra que a vacina induz imunidade protetora e esterilizante em hamsters.

[072] Tabela 2. Avaliação da presença de leptospiras nos tecidos dos hamsters vacinados com rLigBNID e grupo controle (PBS) através das técnicas de imunofluorescência indireta, baseada na impressão do órgão em lâminas, e reisolamento de leptospiras através de cultivo de macerado renal.

[073] Passo 8: O antígeno rLigBNID também foi avaliado quanto ao seu potencial para uso como antígeno em testes sorológicos, neste caso no teste de ELISA indireto.

[074] Placas de poliestireno de 96 cavidades (NUNC®) foram sensibilizadas com 50 ng/cavidade de rLigBNID em tampão carbonato-bicarbonato (0,05M pH 9,6) por 18 h à 4ºC.Os soros foram diluídos (1:100) em PBS-T (Tampão Fosfatosalino contendo 0,05% de Tween 20) e adicionados 50 µl/cavidade, em duplicata. Posteriormente, os anticorpos conjugados a peroxidase anti-IgM e anti-IgG humanos foram diluídos em PBS-T (1:1000) e adicionados as placas. Após cada etapa as placas foram incubadas por 1 h 37°C e lavadas 4 vezes com 200 µl de PBS-T. A revelação da reação antígeno-anticorpo foi realizada com a adição de Ortofenilenodiamina (OPD) acrescida de peróxido de hidrogênio. Após o período de incubação de 15 minutos, no escuro, a temperatura ambiente, a leitura foi realizada em espectrofotômetro a 450 nm. O valor do Cut-off, representado pela linha pontilhada vermelha nas figuras, foi determinado como a média dos soros negativos somado de duas vezes o seu desvio padrão.

[075] No teste de ELISA, visando diagnosticar uma infecção recente, na avaliação de anticorpos IgM foram testados 22 soros de pacientes com suspeita de leptospirose. Inicialmente os soros foram caracterizados através de MAT, o qual determinou 8 soros como positivos e 14 negativos. O teste de ELISA verificou 8 soros positivos verdadeiros, 6 soros falso-positivos e 8 soros negativos verdadeiros. Dessa forma, o teste de ELISA IgM, com soros humanos,apresentou 100% de sensibilidade e 72% de especificidade (Figura 16).

[076] Na avaliação de anticorpos IgG, foram analisados 124 soros humanos. Conforme o teste padrão MAT, 41 soros são positivos para leptospirose e 83 são negativos. No teste de ELISA IgG, 38 soros foram positivos verdadeiros, 3 falsos-negativos, 59 negativos verdadeiros e 24 falsos-positivos. A partir destes dados verificou se a sensibilidade do teste de 90% e especificidade de 71% (Figura 17).

[077] Além da avaliação de soros humanos através de ELISA indireto, também foram avaliados soros caninos, seguindo a mesma metodologia descrita anteriormente, com modificação do anticorpo secundário, anti-IgG canino conjugado com peroxidase (1:2000). As concentrações do antígeno e diluições dos soros mantiveramseas mesmas, já descritas. Foram avaliados 303 soros caninos, sendo 126 positivos e 177 negativos, conforme o MAT. O teste de ELISA verificou 125 soros positivos verdadeiros, 1 falsos negativos e 168 negativos verdadeiros. Dessa forma, o ELISA IgG canino, apresentou 99% de sensibilidade e 95% de especificidade (Figura 18).

[078] Os ensaios de diagnóstico de leptospirose humana e canina através de ELISA indireto, evidenciam o potencial do uso do polipeptídeo LigBNID em ensaios de diagnóstico para leptospirose.Logo, além de proporcionar uma vacina protetora e esterilizante, a invenção também disponibilizará um antígeno imunogênico que contribuirá para o diagnóstico da doença.

Claims (4)

1. Polipeptídeo LigBNID de Leptospira spp. para uso como imunobiológico caracterizado por composição farmacêutica utilizada para induzir resposta imune protetora contra Leptospira spp., que corresponde ao polipeptídeo recombinante LigBNID purificado contendo adjuvantes à base de alumínio (Al(OH)3).
2. .Polipeptídeo LigBNID de Leptospira spp. para uso como imunobiológico caracterizado por composição farmacêutica utilizada para induzir resposta imune contra leptospirose, que corresponde a anticorpos específicos que se ligam ao polipeptídeo recombinante e nativo.
3. Polipeptídeo LigBNID de Leptospira spp. para uso como imunobiológico caracterizado por composição para diagnóstico e para detecção da infecção por Leptospira spp., constituída por oligonucleotídeos para a identificação do gene ligBNID ou anticorpos contra a proteína LigBNID.
4. Polipeptídeo LigBNID de Leptospira spp. para uso como imunobiológico caracterizado por ser detectado por anticorpos que se ligam a ele, constituindo um kit para diagnóstico de infecção por Leptospira spp através da detecção de anticorpos anti-LigBNID.

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