ES2203704T3 - Proteinas de membrana de leptospira. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION ACTUAL PRESENTA UNAS NOVEDOSAS LIPOPROTEINAS DE LA MEMBRANA DE LEPTOSPIRA, LIPL1 Y LIPL2, ASOCIADAS A CEPAS PATOGENAS DE LEPTOSPIRA. LIPL1 ESTA ALREDEDOR DE LOS 35 KDA, Y LIPL2 ALREDEDOR DE LOS 41 KDA. TAMBIEN SE REVELA EL METODO PARA PURIFICAR ESTAS PROTEINAS DE LEPTOSPIRA, SUS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS Y AMINOACIDOS, LA CLONACION DE LOS GENES QUE CODIFICAN LAS PROTEINAS Y SUS PROTEINAS RECOMBINANTES, UNOS METODOS PARA PRODUCIR ANTICUERPOS FRENTE A ESTAS PROTEINAS, LOS ANTICUERPOS RESULTANTES. DICHAS PROTEINAS, SUS FRAGMENTOS INMUNOGENICOS Y LOS ANTICUERPOS CONTRA ELLOS, SON UTILES PARA INDUCIR UNA RESPUESTA INMUNITARIA FRENTE A ESPECIES PATOGENAS DE LEPTOSPIRA, Y PROPORCIONAN TAMBIEN UNA DIANA DIAGNOSTICA EN LA LEPTOSPIROSIS.

Description

Proteínas de membrana de Leptospira.

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere en general a una preparación antigénica y específicamente a proteínas de membrana de Leptospira que se utilizan para inducir una respuesta inmune protectora en animales. Tales proteínas pueden utilizarse inmunológicamente como vacunas contra la leptospirosis causada por este organismo. Alternativamente, puede efectuarse el diagnóstico de la leptospirosis detectando la presencia de las proteínas, anticuerpos frente a las proteínas o polinucleótidos que codifican para las proteínas.

Antecedentes de la invención

La leptospirosis es un importante problema global de salud humana y veterinaria. Es una extendida enfermedad zoonótica causada por cepas patógenas de Leptospira que son capaces de infectar a la mayoría de las especies mamíferas. La infección ocurre bien a través del contacto directo con un animal infectado o del contacto indirecto con suelo o agua contaminados. En ganado, la enfermedad ocasiona pérdidas económicas debidas a abortos, animales nacidos muertos, infertilidad, disminución en la producción de leche y muertes.

Los esfuerzos por controlar la leptospirosis se han visto dificultados porque las leptospiras virulentas tienen capacidad tanto de supervivencia a largo plazo en el entorno como de infección persistente y cobijo en fauna salvaje y ganado. Actualmente, las vacunas leptospirales disponibles producen inmunidad a corto plazo y no proporcionan protección cruzada frente a muchos de los 170 serovares de Leptospira patógenas {Thiermann y otros, J. Am. Vet. Med. Assoc., 184:722 (1984)}. Estas vacunas consisten en organismos enteros inactivados o preparaciones de cubierta externa que producen seroreactividad según se determina mediante la aglutinación microscópica de organismos intactos. La naturaleza de los inmunógenos protectores presentes en esas vacunas no se ha elucidado de forma conclusiva, aunque varias líneas de evidencia sugieren que la sustancia semejante a lipopolisacáridos (LLS) puede conferir algún grado de protección. Las vacunas disponibles comercialmente, que consisten en leptospiras muertas por calor o formalina, producen una inmunidad incompleta o sólo a corto plazo, requiriéndose su administración anual o semianual. En el caso del serovar hardjo de L. interrogans, el patógeno bovino común en Norteamérica, las vacunas preparadas de ese modo son inefectivas {Bolin, C. A. y otros, Am. J. Vet. Res., 50:161-165 (1989) y Bolin, C. A. y otros, Am. J. Vet. Res., 50:2004-2008 (1989)}. Así pues, hay una importante necesidad de desarrollar una vacuna leptospiral mejorada.

La patogénesis de la leptospirosis es muy similar a la de otras enfermedades espiroquetales, incluidas la sífilis (causada por Treponema pallidum) y la borreliosis de Lyme (causada por Borrelia burgdorferi). Tanto la sífilis como la borreliosis de Lyme se caracterizan por una amplia diseminación temprana en el curso de la enfermedad, que incluye la invasión del sistema nervioso central. La Leptospira comparte esa habilidad con otros espiroquetos patógenos, de modo que la meningitis es una manifestación habitual de la leptospirosis. Otra propiedad de las infecciones espiroquetales es la habilidad para persistir de forma crónica en el hospedador, como se manifiesta en casos de sífilis terciaria y artritis de Lyme crónica.

Se han identificado proteínas de membrana integrales con modificación lipídica en un amplio rango de especies bacterianas {Hayashi, S. y otros, J. Bioenerg. Biomembr., 22:451-471 (1990)}. En bacterias gram-negativas, esas lipoproteínas las procesa la peptidasa señal II {Pugsley, A. P., Microbiol. Rev., 57:50-108 (1993)} tras la unión covalente de tres residuos ácidos grasos a una cisteína N-terminal {Hantke y otros, Eur. J. Biochem., 34:384-296 (1973)}. Los residuos ácidos grasos anclan las lipoproteínas bien a la membrana citoplasmática o a la membrana externa. Aunque la porción polipeptídica de las lipoproteínas es generalmente hidrofílica, la modificación lipídica las convierte en anfifílicas y causa su reparto en la fase hidrofóbica durante el reparto de fases con Triton X-114 {Chamberlain, N. R. y otros, Infect. Immun., 57:2872-2877 (1989)}.

Se han identificado lipoproteínas en una serie de espiroquetos entre los que se incluyen Treponema pallidum {Chamberlain, N. R. y otros, Infect. Immun., 57:2872-2877 (1989) y Chamberlain, N. R. y otros, Infect. Immun. 57:2878-2885 (1989)}, Treponema denticola {Miyamoto, M. y otros, Infect. Immun., 59:1941-1947 (1991)}, Serpulina hyodysenteriae {Thomas, W. y otros, Infect. Immun., 61:1136-1140 (1993)}, Borrelia burgdorferi {Brandt y otros, Infect. Immun., 58:983-991 (1990)}, y las Borreliae de la fiebre recurrente {Burman, N. y otros, Mol. Microbiol., 4:1715-1726 (1990)}. Las lipoproteínas parecen jugar un papel importante en la patogénesis de enfermedades espiroquetales. Por ejemplo, muchas de las lipoproteínas de T. pallidum son antígenos inmunodominantes, que incitan una fuerte respuesta inmune humoral y celular {Akins, D. R. y otros, Infect. Immun., 61:1202-1210 (1993)}. Además, la proteína de superficie externa A (OspA) de Borrelia burgdorferi es inmunoprotectora en modelos animales de la enfermedad de Lyme {Fikrig, E. y otros, Science, 250:553-556 (1990)}.

Material solubilizado en Triton X-114 procedente de cepas tanto virulentas como atenuadas de L. kirschneri (anteriormente L. alstoni y L. interrogans) se repartió en la fase detergente hidrofóbica y contenía sustancia semejante a lipopolisacáridos (LLS) procedente de componentes de la membrana externa de los organismos {Haake, D. A. y otros, Infection & Immunity, 59:1131-40 (1991)}. En el estudio, la cepa virulenta de L. kirschneri contenía mayores cantidades de un componente LLS con una masa molecular aparente de 30 kilodalton (kDa). Una publicación posterior de Haake, D. A. y otros divulga la clonación y secuenciación de un gen que codifica para la proteína OmpL1 (con un peso molecular predicho de 31.113 Da) de Leptospira spp patógena {Haake, D. A. y otros, J. Bacteriol., 175:4225-4234 (1993)}. Esta podría ser la primera proteína de membrana externa transmembrana espiroquetal para la que se ha clonado y secuenciado el gen estructural.

La investigación sin éxito en la identificación de OMPs de Leptospira y T. pallidum ha mostrado la importancia de tomar en consideración la fragilidad de la membrana externa espiroquetal y la ausencia de selectividad de membrana externa de detergentes iónicos tales como el dodecil sulfato sódico (SDS) {Cunningham y otros, J. Bacteriol., 170:5789 (1988); Penn y otros, J. Gen. Microbiol., 131:2349 (1985); Stamm y otros, Infect. Immun., 55:2255 (1987)}. Las proteínas de membrana externa son de gran importancia porque juegan un papel clave en la patogénesis bacteriana. La identificación de proteínas de membrana externa implicadas en la patogénesis de Leptospira es significativa para la comprensión no sólo de las proteínas de membrana externa leptospirales y su implicación en la patogénesis sino también para la comprensión de otras proteínas de membrana externa espiroquetales y su papel en la patogénesis.

Sumario de la invención

La presente invención presenta dos proteínas de membrana leptospiral novedosas: LipL1, que tiene una secuencia aminoacídica como se expone en SEQ ID NO: 3, y LipL2, que tiene una secuencia aminoacídica como se expone en SEQ ID NO: 6. En particular, esas proteínas son lipoproteínas que están asociadas con cepas patógenas de Leptospira. LipL1 es de unos 35 kDa y LipL2 es de unos 41 kDa. También se divulgan el método para purificar esas proteínas a partir de Leptospira, sus secuencias nucleotídicas y aminoacídicas, la clonación de los genes que codifican para las proteínas y sus proteínas recombinantes, métodos para producir anticuerpos frente a esas proteínas, y los anticuerpos resultantes. Estas proteínas, sus fragmentos inmunogénicos, y anticuerpos capaces de fijarse a ellas, son útiles para inducir una respuesta inmune frente a Leptospira patógenas así como proporcionar un blanco diagnóstico para la leptospirosis.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 presenta el mapa de restricción parcial del fragmento EcoRI de 2,3 kb que contiene el gen lipL1 y la estrategia para determinar la secuencia nucleotídica. El gen lipL1 tiene una longitud de 1092 pares de bases. La flecha situada debajo del mapa indica la dirección y extensión del análisis de secuencia. Las letras individuales encima del mapa indican las siguientes enzimas de restricción: EcoRI (E), PvuII (P), BamHI (B), EcoRV (Ev), HincII (Hc) y HindIII (Hd).

La figura 2 presenta la secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica deducida de lipL1. Se muestran regiones promotoras -35 y -10 putativas y un sitio de fijación de ribosomas (RBS). El sitio putativo de escisión de la peptidasa señal II se indica mediante una flecha (\uparrow). La secuencia aminoacídica obtenida a partir de la digestión con la proteasa V8 estafilocócica de la proteína nativa aparece subrayada. La ubicación del codón de parada TAA se indica mediante un asterisco. Una repetición invertida se indica mediante las flechas discontinuas horizontales. Ésta puede funcionar como terminador de la transcripción independiente de rho.

La figura 3 presenta la representación gráfica de la hidrofobicidad Kyte-Doolittle de LipL1.

La figura 4 presenta un mapa de restricción parcial del fragmento EcoRI de 2,25 kb que contiene el gen lipL2 y la estrategia para determinar la secuencia nucleotídica. El gen lipL2 tiene una longitud de 1065 pares de bases. Las flechas situadas debajo del mapa indican la dirección y extensión del análisis de secuencia. Las letras individuales encima del mapa indican las siguientes enzimas de restricción: EcoRI (E), DraI (D), HaeIII (H), ScaI (S), PuvII (P), HindIII (Hd), ClaI (C), HincII (Hc), RsaI (R) y SspI (Ssp).

La figura 5 presenta la secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica deducida de lipL2. Se muestran regiones promotoras -35 y -10 putativas y un sitio de fijación de ribosomas (RBS). El sitio de escisión de la peptidasa señal II putativo se indica mediante una flecha (\uparrow). La secuencia aminoacídica obtenida a partir de la digestión con proteasa V8 estafilocócica de la proteína nativa aparece subrayada. La ubicación del codón de parada TAA se indica mediante un asterisco. Una repetición invertida se indica mediante las flechas discontinuas horizontales. Ésta puede funcionar como terminador de la transcripción independiente de rho.

La figura 6 presenta la representación gráfica de la hidrofobicidad Kyte-Doolittle de LipL2.

La figura 7 presenta el resultado de un experimento de inmunoprecipitación de LipL1 con antisuero anti-LipL1. LipL1 es acilada por L. kirschneri. Línea 1: L. kirschneri marcada intrínsecamente con [^{3}H] palmitato entera. Línea 2: L. kirschneri marcada intrínsecamente con [^{3}H] palmitato extraída con Triton X-100 e inmunoprecipitada con antisuero anti-LipL1.

La figura 8 presenta el resultado de un experimento de inmunoprecipitación de LipL2 con antisuero anti-LipL2. LipL2 es acilada por L. kirschneri. Línea 1: L. kirschneri marcada intrínsecamente con [^{3}H] palmitato entera. Línea 2: L. kirschneri marcada intrínsecamente con [^{3}H] palmitato extraída con Triton X-100 e inmunoprecipitada con antisuero anti-LipL2.

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La figura 9 presenta el gel SDS-PAGE teñido con azul Coomasssie de un panel de especies Leptospira. L. interrogans, L. noguchii, L. kirschneri, L. borgpetersenii, L. santarosai y L. weilii son especies Leptospira patógenas. L. biflexa, L. wolbachii y L. inadai son tres conocidas especies Leptospira no patógenas, como lo es el organismo relacionado Leptonema illini. La ubicación de los patrones de tamaño molecular se muestra (en kilodalton) a la izquierda.

La figura 10 presenta la inmunotransferencia de un panel de especies Leptospira usando antisuero anti-LipL1. L. interrogans, L. noguchii, L. kirschneri, L. borgpetersenii, L. santarosai y L. weilii son especies Leptospira patógenas. L. biflexa, L. wolbachii y L. inadai son tres conocidas especies Leptospira no patógenas, como lo es el organismo relacionado Leptonema illini. La ubicación de los patrones de tamaño molecular se muestra (en kilodalton) a la izquierda.

La figura 11 presenta la inmunotransferencia de un panel de especies Leptospira usando antisuero anti-LipL2. L. interrogans, L. noguchii, L. kirschneri, L. borgpetersenii, L. santarosai y L. weilii son especies Leptospira patógenas. L. biflexa, L. wolbachii y L. inadai son tres conocidas especies Leptospira no patógenas, como lo es el organismo relacionado Leptonema illini. La ubicación de los patrones de tamaño molecular se muestra (en kilodalton) a la izquierda.

La figura 12 muestra que LipL1 se reparte selectivamente en la fase detergente Triton X-114. Presenta una inmunotransferencia de organismos L. kirschneri atenuados por cultivo sondeados con antisuero anti-LipL1. Las fracciones analizadas fueron el organismo entero (W) y la pastilla insoluble en Triton X-114 (P), material de fase acuosa (A) y fase detergente (D). La ubicación de los patrones de tamaño molecular se muestra (en kilodalton) a la izquierda.

La figura 13 muestra que LipL2 se reparte selectivamente en la fase detergente Triton X-114. Presenta una inmunotransferencia de organismos L. kirschneri atenuados por cultivo sondeados con antisuero anti-LipL2. Las fracciones analizadas fueron el organismo entero (W) y la pastilla insoluble en Triton X-114 (P), material de fase acuosa (A) y fase detergente (D). La ubicación de los patrones de tamaño molecular se muestra (en kilodalton) a la izquierda.

Descripción detallada de la invención

La presente invención presenta dos proteínas de membrana leptospiral novedosas: LipL1 y LipL2. En particular, esas proteínas son lipoproteínas que están asociadas con cepas patógenas de Leptsopira. LipL1 es de unos 35 kDa y LipL2 es de unos 41 kDa. También se divulga el método para purificar esas proteínas a partir de Leptsopira, sus secuencias nucleotídica y aminoacídica, la clonación de los genes que codifican para las proteínas y sus proteínas recombinantes, métodos para producir anticuerpos frente a esas proteínas, y los anticuerpos resultantes. Esas proteínas, sus fragmentos inmunogénicos, y anticuerpos capaces de fijarse a ellas son útiles para inducir una respuesta inmune frente a Leptsopira patógena así como proporcionar un blanco diagnóstico para la leptospirosis.

Se presume que LipL1 y LipL2 tienen modificación lipídica aminoterminal sobre la base del análisis de secuencia de sus secuencias aminoacídicas deducidas. En ambos casos, el péptido señal va seguido por un sitio de escisión para peptidasa señal II L-X-Y-C. LipL1 es la proteína más abundante encontrada en la fase detergente de extractos en Triton X-114 de Leptsopira kirschneri. La recuperación de LipL1 requiere la presencia de inhibidores de la proteasa durante la solubilización en detergente. LipL2 fue identificada como proteína de membrana potencial en estudios de inmunoprecipitación superficial, y es también una proteína prominente en la fase detergente Triton X-114. LipL1 y LipL2 son proteínas de membrana integrales. Se produjeron proteínas de fusión LipL1 y LipL2 recombinantes en Escherichia coli con el fin de generar antisuero de conejo específico. Ambas lipoproteínas son producidas por una mayoría de especies Leptsopira patógenas. Si bien la cantidad de LipL1 producida es variable entre las especies de Leptsopira, la expresión de LipL2 se conserva en gran medida. Los pesos moleculares de LipL1 variaron entre unos 35 y 40 kDa (véase, por ejemplo, la figura 10). Los pesos moleculares de LipL2 fueron invariantes: 41 \pm 1 kDa (véase, por ejemplo, la figura 11). LipL1 y LipL2 pueden identificarse en diferentes Leptsopira por su inmunoreactividad con anticuerpos desarrollados frente a las LipL1 y LipL2 que se describen en la sección "Ejemplo" a continuación. Pueden purificarse las proteínas a partir de las diferentes Leptsopira, e identificarse sus LipL1 y LipL2 por su inmunoreactividad con antisueros desarrollados por animales inmunizados con las LipL1 y LipL2 del "Ejemplo", según el método descrito en la sección "Ejemplo". Estas proteínas son útiles como composiciones farmacéuticas para inducir una respuesta inmune frente a Leptsopira patógena así como proporcionar blancos diagnósticos para la leptospirosis.

Las secuencias nucleotídica y aminoacídica de LipL1 y LipL2 se muestran en las figuras 2 y 5, y se identifican como SEQ ID NOS. como viene a continuación.

TABLA 1

		SEQ ID NO.
LipL1	Secuencia de ADN genómico (incluido el marco de lectura abierto)	1
LipL1	Secuencia de ADN codificador	2
LipL1	Proteína (incluido el péptido señal)	3
LipL2	Secuencia de ADN genómico (incluido el marco de lectura abierto)	4
LipL2	Secuencia de ADN codificador	5
LipL2	Proteína (incluido el péptido señal)	6

Las secuencias de la tabla 1 incluyen secuencias tanto nativas como sintéticas. Salvo que se modifique de otro modo, el término "proteína" como aquí se usa abarca polipéptidos y péptidos tanto nativos como sintéticos. Entre las proteínas sintéticas se incluyen proteínas recombinantes y sintetizadas químicamente. Salvo que se indique de otro modo, las proteínas "LipL1" y "LipL2" incluyen sus versiones tanto nativas como sintéticas.

Las secuencias nucleotídicas divulgadas en la tabla 1 y las figuras 2 y 5 están en forma de ADN. No obstante, sobre la base de las secuencias divulgadas, alguien experto en la técnica podría determinar sus secuencias de ADN y ARN complementarias, y las secuencias de ARN complementarias de las anteriores. Así pues, el término "secuencia nucleotídica" incluye tanto las secuencias de ADN como las de ARN. Adicionalmente, como se usa en esta solicitud y reivindicaciones, los SEQ ID NOS. y las secuencias nucleotídicas divulgadas incluyen: (1) las secuencias de ADN como se divulgan, (2) las secuencias nucleotídicas (que pueden ser ARN o ADN) complementarias de las secuencias divulgadas, (3) las secuencias de ARN correspondientes a las secuencias de ADN listadas en las que la timidina ("T") de las secuencias de ADN divulgadas se reemplaza por uracilo ("U"), (4) secuencias nucleotídicas en las que otros nucleótidos conocidos en la técnica tales como análogos nucleótidos reemplazan a los de las secuencias anteriores, por ejemplo 5-metil-citosina que reemplaza citosina, y (5) secuencias nucleotídicas que están dentro de un 10% de varianza con respecto a los respectivos SEQ ID NOS. o secuencias nucleotídicas divulgadas.

Puesto que los codones nucleótidos son redundantes, también están dentro del alcance de esta invención secuencias nucleotídicas equivalentes entre las que se incluyen: secuencias nucleotídicas que codifican para o pueden traducirse en LipL1, LipL2, sus variantes proteicas, equivalentes funcionales, o derivados. Esas secuencias nucleotídicas pueden usarse también en la práctica de la invención.

Además de lo anterior, las secuencias nucleotídicas de LipL1 y LipL2 incluyen también: (1) secuencias nucleotídicas que son capaces de hibridar con las secuencias codificadoras de las respectivas secuencias nucleotídicas, en condiciones de hibridación astringentes, y (2) fragmentos de los SEQ ID NOS. 1, 2, 4 y 5 que codifican para proteínas que tienen sustancialmente las mismas actividades / características biológicas que LipL1 y LipL2 respectivamente. Preferiblemente, la actividad / característica biológica determinante es la retención de al menos un inmunoepítopo. Preferiblemente, cuando se usan en un inmunoensayo de Leptospira, esas proteínas son inmunoreactivas con anticuerpos dirigidos hacia Leptospira pero no son detectablemente inmunoreactivas con anticuerpos no específicos de Leptospira encontrados en una muestra biológica. Como aquí se define, una "muestra biológica" puede ser una muestra de tejido o fluido biológico. Entre los ejemplos de muestras de fluido biológico se incluyen: sangre, suero, plasma, lágrimas, leche, orina y líquido cefalorraquídeo. Entre los ejemplos de muestras de tejido biológico se incluyen muestras de tejido procedentes del hígado y el riñón y tejido de origen endotelial. Una muestra biológica puede incluir también heces y descarga. Así pues, por ejemplo, puede llevarse a cabo un ensayo inmunohistoquímico sobre esas muestras de tejido. Preferiblemente, esas muestras son de mamíferos, tales como humanos y mamíferos domésticos y salvajes. Más preferiblemente, esas proteínas y los inmunoensayos pueden distinguir adicionalmente entre Leptospira patógena y Leptospira no patógena. Alternativamente, los fragmentos de secuencias nucleotídicas pueden ser sondas nucleótidas de al menos 10 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, cuando se usan en un ensayo de hibridación de Leptospira, en condiciones de hibridación de moderadas a astringentes, esas sondas no hibridan de forma detectable con las secuencias nucleotídicas de organismos no Leptospira que se encuentran en una muestra biológica. Alternativamente, las secuencias nucleotídicas hibridan con al menos 10 nucleótidos consecutivos de las secuencias codificadoras de las secuencias nucleotídicas anteriormente listadas. Las secuencias nucleotídicas incluyen una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína que contiene al menos 8 aminoácidos; más preferiblemente de 5 a 6; y con máxima preferencia 4. Preferiblemente, la proteína es específica de Leptospira o retiene una o más funciones biológicas de Leptospira. Con máxima preferencia, esas secuencias nucleotídicas y los ensayos de hibridación pueden distinguir adicionalmente entre Leptospira patógena y Leptospira no patógena.

Los términos "LipL1" y "LipL2", como se usan en relación con las proteínas, son, respectivamente, como se definieron anteriormente en la tabla 1 y las figuras 2 y 5, junto con: (1) variantes proteicas que contienen secuencias aminoacídicas que tienen al menos un 95% de sus aminoácidos coincidentes con las secuencias de SEQ ID NOS. 3 y 6, excluyendo sus péptidos señal, respectivamente; (2) los equivalentes funcionales de esas proteínas y sus variantes, respectivamente; y (3) los derivados, incluyendo fragmentos, de proteínas LipL1, LipL2 y sus variantes, respectivamente. Preferiblemente, cuando se usan en un inmunoensayo de Leptospira, esas proteínas son inmunoreactivas con anticuerpos dirigidos hacia Leptospira pero no detectablemente inmunoreactivas con anticuerpos no específicos de Leptospira encontrados en una muestra biológica. Más preferiblemente, esas proteínas y los inmunoensayos pueden distinguir adicionalmente entre Leptospira patógena y Leptospira no patógena. Preferiblemente, las proteínas son específicas de Leptospira o retienen una o más funciones biológicas de Leptospira. Así pues, preferiblemente, el fragmento reivindicado en esta solicitud contiene al menos un epítopo inmunogénico de Leptospira y más preferiblemente de Leptospira patógena. Más preferiblemente, el fragmento es capaz de ser fijado por anticuerpos policlonales dirigidos hacia Leptospira. En el caso de anticuerpos que reconocen epítopos lineales, generalmente se fijan a epítopos definidos por de unos 3 a 10 aminoácidos.

Alternativamente o adicionalmente, esas proteínas poseen preferiblemente la habilidad de provocar una respuesta celular y/o humoral en un animal vacunado con las proteínas. Más preferiblemente, la respuesta celular y/o humoral se dirige contra Leptospira, especialmente Leptospira patógena. Con máxima preferencia, los animales vacunados con esas proteínas resultan inmunizados contra la leptospirosis o tal vacunación produce una mejoría de la enfermedad en los animales infectados. El animal es preferiblemente un mamífero. Más preferiblemente, el animal es un humano o un animal doméstico. Alternativamente, esas proteínas o sus secuencias aminoacídicas son preferiblemente derivables de proteínas de membrana de Leptospira y son inmunoreactivas con anticuerpos desarrollados frente a las LipL1 o LipL2 divulgadas en el "Ejemplo" a continuación.

Las variantes pueden ser resultado de, por ejemplo, sustitución, inserción o deleción de las secuencias aminoacídicas mostradas en la tabla 1. Los derivados de las proteínas y sus variantes incluyen fragmentos de esas proteínas y sus epítopos inmunogénicos. Como se describió anteriormente, preferiblemente, también, cada variante retiene al menos un inmunoepítopo de Leptospira y más preferiblemente de Leptospira patógena. Preferiblemente el inmunoepítopo es específico de Leptospira y más preferiblemente de Leptospira patógena.

Dos secuencias aminoacídicas son funcionalmente equivalentes si tienen sustancialmente las mismas actividades biológicas tales como la habilidad de provocar una respuesta celular y/o humoral en un animal vacunado con las proteínas. Las proteínas pueden estar fusionadas a otras proteínas, por ejemplo pueden emplearse fusiones de secuencia señal con el fin de dirigir de forma más expedita la secreción de la proteína LipL1 o LipL2. Adicionalmente, LipL1 puede estar fusionada con LipL2. Las secuencias nucleotídicas que codifican para esas proteínas de fusión están también incluidas en la presente invención. La señal heteróloga reemplaza a la señal LipL1 o LipL2 nativa y, cuando la fusión resultante es reconocida, es decir procesada y escindida por la célula hospedadora, se segrega la proteína LipL1 o LipL2. Las señales se seleccionan sobre la base de la célula hospedadora prevista y pueden incluir secuencias bacterianas, de levaduras, de insectos y víricas.

Las variantes sustitucionales de las proteínas aquí divulgadas son aquéllas en las que se ha eliminado al menos un residuo de las secuencias divulgadas y se ha insertado en su lugar un residuo diferente. Preferiblemente, el cambio aminoacídico es conservativo. Así pues, las modificaciones de las secuencias aminoacídicas primarias de LipL1 y LipL2 incluyen también variaciones conservativas. El término "variación conservativa" como se usa aquí denota el reemplazo de un residuo aminoácido por otro residuo biológicamente similar. Entre los ejemplos de variaciones conservativas se incluyen la sustitución por un residuo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina o metionina de otro, o la sustitución por un residuo polar de otro, tal como la sustitución por arginina de lisina, por ácido glutámico de ácido aspártico o por glutamina de asparagina, y similares. El término "variación conservativa" incluye también el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido progenitor no sustituido con tal de que los anticuerpos desarrollados frente al polipéptido sustituido inmunoreaccionen también con el polipéptido no sustituido.

Adicionalmente, como es el caso con todas las proteínas, la estructura química precisa depende de una serie de factores. Ya que hay presentes en la molécula grupos amino y carboxilo ionizables, una proteína particular puede obtenerse como sal ácida o básica o en forma neutra. Todas las preparaciones tales que retienen su actividad cuando se colocan en condiciones ambientales adecuadas están incluidas en la definición. Adicionalmente, la secuencia aminoacídica primaria puede aumentarse mediante derivación usando fracciones azúcar (glicosilación) o mediante otras moléculas suplementarias tales como lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares, más habitualmente por conjugación con sacáridos. La estructura aminoacídica primaria puede agregarse también para formar complejos, con máxima frecuencia dímeros. Ciertos aspectos de tal aumento se consiguen a través de sistemas de procesado postraduccional del hospedador productor; otras tales modificaciones pueden introducirse in vitro. En cualquier caso, tales modificaciones están incluidas en la definición con tal de que no se destruya la actividad de la proteína. Se espera que tales modificaciones puedan afectar cuantitativa o cualitativamente a la actividad, bien promoviendo o diminuyendo la actividad de la proteína en varios ensayos.

Los residuos aminoácidos individuales de la cadena pueden modificarse también mediante oxidación, reducción u otra derivación, y la proteína puede escindirse para obtener fragmentos que retengan la actividad. Tales alteraciones que no destruyen la actividad no excluyen a la secuencia proteica de la definición. A continuación se discuten algunas de las modificaciones en más detalle a modo de ejemplo.

Así pues, las variantes de glicosilación están incluidas dentro del alcance de LipL1 y LipL2. Incluyen variantes que carecen completamente de glicosilación (no glicosiladas) y variantes que tienen al menos un sitio glicosilado menos que la forma nativa (desglicosiladas) así como variantes en las que ha cambiado la glicosilación.

La invención incluye también un método para producir las lipoproteínas de membrana de Leptospira usando técnicas de ADN recombinante. Se produjeron proteínas de fusión LipL1 y LipL2 recombinantes en Escherichia coli (E. coli). Esas proteínas pueden usarse para inmunizar a un mamífero para generar antisuero. Los genes correspondientes a las proteínas LipL1 y LipL2 de L. kirschneri se clonaron en un vector plásmido que se usó entonces para transformar E. coli. El peso molecular y la cantidad de LipL2 expresada entre especies Leptospira patógenas se conservan en gran medida. Por otro lado, aunque una mayoría de patógenos leptospirales producen LipL1, el peso molecular y la cantidad de LipL1 producida son variables. Hubo una fuerte correlación entre la patogenicidad leptospiral y la reactividad con antisuero frente a LipL1 y LipL2. Eso es especialmente así con LipL2, que se detectó en todas las cepas de especies Leptospira patógenas de L. interrogans, L. noguchii, L. kirscheri, L. borgpetersenii, L. santarosai y L. weilli pero no en las especies Leptospira no patógenas L. biflexa, L. wolbachii y L. inadai, y el organismo relacionado Leptonema illini. LipL1 se detectó en la mayoría de las especies Leptospira patógenas pero no en las especies Leptospira no patógenas L. biflexa, L. wolbachii y L. inadai, y el organismo relacionado Leptonema illini. Eso indica que LipL1 y LipL2 son no sólo expresadas sino también antigénicamente conservadas entre Leptospira patógenas con independencia de la especie y, por tanto, esas proteínas son excelentes candidatos a vacuna así como antígenos marcadores para el diagnóstico de la leptospirosis.

La extracción de proteínas de células enteras de L. kirschneri usando el detergente no iónico Triton X-114 (TX-114) tuvo como resultado la solubilización de una serie de proteínas, incluidas proteínas en fase detergente de las proteínas LipL1 y LipL2. Se usó la inmunoprecipitación superficial usando antisuero desarrollado frente a L. kirschneri entera para generar una fracción que se sometió a SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida reductora. La fracción electroforizada se transfirió entonces a una membrana de secuenciación y se determinaron las secuencias N-terminales de las proteínas de 35 y 41 kDa respectivamente. Sobre la base de la secuencia aminoacídica N-terminal, se sintetizaron dos sondas oligonucleótidas degeneradas para cada una de las proteínas. Se sondeó con los oligonucleótidos una librería de ADN genómico de L. kirschneri y se identificaron los insertos como conteniendo la secuencia codificadora para LipL1 y LipL2 respectivamente.

El análisis de secuencia mostró que el gen estructural de LipL1 consiste en 1092 bases que codifican para una proteína de 364 aminoácidos. Como se espera de una lipoproteína que se va a exportar más allá de la membrana interna, la secuencia aminoacídica deducida comienza con un péptido señal de 20 residuos. El gen estructural de LipL2 consiste en 1065 bases que codifican para una proteína de 355 aminoácidos. Como se espera de una lipoproteína que se va a exportar más allá de la membrana interna, la secuencia aminoacídica deducida comienza con un péptido señal de 19 residuos. Los estudios de inmunotransferencia mostraron que hay una fuerte correlación entre la patogenicidad de Leptospira y la reactividad con antisueros frente a LipL1 y LipL2. LipL2 reaccionó con todas las cepas de Leptospira patógenas probadas pero no con todas las cepas de Leptospira no patógenas probadas. LipL1 reaccionó con la mayoría de las cepas de Leptospira patógenas probadas pero no con todas las cepas de Leptospira no patógenas probadas; aunque hubo una pequeña cantidad de reactividad en L. inadai, no se detectaron antígenos de 41 kDa en L. biflexa, L. wolbachii o L. illini (figura 11).

Los genes bacterianos para las proteínas de membrana LipL1 y LipL2 pueden derivarse a partir de cualquier cepa de Leptospira patógena. Preferiblemente, las proteínas son procedentes del serovar grippotyphosa de Leptospira kirschneri.

La invención proporciona polinucleótidos que codifican para las proteínas LipL1 y LipL2 de Leptospira. Esos polinucleótidos incluyen secuencias de ADN y ARN que codifican para la proteína. Como se discutió previamente, se entiende que todos los polinucleótidos que codifican para la totalidad o una porción de LipL1 y LipL2 están también incluidos aquí, con tal de que exhiban una función de LipL1 y LipL2 tal como la habilidad para inducir o fijar anticuerpos. Tales polinucleótidos incluyen tanto los de ocurrencia natural como los manipulados intencionalmente, por ejemplo polinucleótidos mutagenizados.

Las secuencias de ADN de la invención pueden obtenerse mediante varios métodos. Por ejemplo, puede aislarse el ADN usando procedimientos de hibridación que son bien conocidos en la técnica. Estos incluyen, pero no están limitados a: 1) hibridación de sondas con librerías genómicas para detectar secuencias nucleotídicas compartidas y 2) cribado con anticuerpos de librerías de expresión para detectar propiedades estructurales compartidas.

Los procedimientos de hibridación son útiles en el cribado de clones recombinantes usando sondas oligonucleótidas sintéticas mezcladas marcadas, donde cada sonda es potencialmente el complementario completo de una secuencia de ADN específica de la muestra de hibridación que incluye una mezcla heterogénea de ADN de doble hebra desnaturalizado. Para tal cribado, la hibridación se efectúa preferiblemente bien sobre ADN de hebra única o bien sobre ADN de doble hebra desnaturalizado. Utilizando condiciones de hibridación astringentes dirigidas a impedir la fijación no específica, es posible, por ejemplo, permitir la visualización autoradiográfica de un clon de ADN específico mediante la hibridación del ADN blanco a esa sonda individual de la mezcla que es su complementario completo {Wallace y otros, Nucleic Acid Research, 9:879 (1981)}.

Alternativamente, puede cribarse una librería de expresión indirectamente en busca de péptidos LipL1 y LipL2 que tengan al menos un epítopo usando anticuerpos frente a LipL1 y LipL2. Tales anticuerpos pueden derivarse de forma bien policlonal o monoclonal y usarse para detectar un producto de expresión indicativo de la presencia de ADN de LipL1 y LipL2. Generalmente, se construye una librería gt11 lambda que se criba inmunológicamente según el método de Huynh y otros {en DNA Cloning: A Practical Approach, D. M. Glover, ed., 1:49 (1985)}.

El desarrollo de secuencias de ADN específicas que codifican para LipL1 y LipL2 puede obtenerse también mediante: (1) aislamiento de una secuencia de ADN de doble hebra a partir del ADN genómico, y (2) fabricación química de una secuencia de ADN para proporcionar los codones necesarios para el polipéptido de interés.

Las secuencias de ADN que codifican para LipL1 y LipL2 pueden expresarse in vitro mediante transferencia de ADN a una célula hospedadora adecuada. Las "células hospedadoras recombinantes" o "células hospedadoras" son células en las que se puede propagar un vector y expresar su ADN. El término incluye también cualquier progenie de la célula hospedadora sujeto. Se entiende que no toda la progenie es idéntica a la célula progenitora, ya que puede haber mutaciones que ocurran durante la replicación. No obstante, tal progenie está incluida cuando se usan los términos anteriores.

El término "célula hospedadora" como se usa en la presente invención pretende incluir no sólo procariotas sino también eucariotas tales como levaduras y hongos filamentosos así como células de plantas y animales. El término "procariota" pretende incluir todas las bacterias que se pueden transformar con el gen para la expresión de las proteínas de membrana externa LipL1 y LipL2 de Leptospira. Entre los hospedadores de naturaleza procariota se pueden incluir bacterias Gram negativas así como Gram positivas, tales como E. coli, S. typhimurium y Bacillus subtilis.

Una molécula de ADN recombinante que codifica para la proteína LipL1 o LipL2 puede usarse para transformar un hospedador usando cualquiera de las técnicas habitualmente conocidas por quienes tengan una destreza ordinaria en la técnica. Es especialmente preferido el uso de un plásmido que contenga la secuencia codificadora para LipL1 o LipL2 con propósitos de transformación procariótica. Cuando el hospedador es de naturaleza procariota, tal como E. coli, las células competentes que son capaces de captar ADN pueden prepararse a partir de células cosechadas tras la fase de crecimiento exponencial y subsiguientemente tratadas por el método de CaCl_{2} mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, puede usarse MgCl_{2} o RbCl. La transformación puede efectuarse también tras la formación de un protoplasto de la célula hospedadora.

En la presente invención, la secuencia de LipL1 o LipL2 puede insertarse en un vector de expresión recombinante. El término "vector de expresión recombinante" se refiere a un plásmido, virus u otro vehículo conocido en la técnica que se ha manipulado por inserción o incorporación de secuencia genética de LipL1 o LipL2. Tales vectores de expresión contienen una secuencia promotora que facilita la efectiva transcripción de la secuencia genética insertada en el hospedador. El vector de expresión contiene típicamente un origen de replicación y un promotor además de genes específicos que permiten la selección fenotípica de las células transformadas. Los hospedadores de naturaleza procariota transformados pueden cultivarse según medios conocidos en la técnica para alcanzar un crecimiento celular óptimo. Se han informado varios vectores lanzadera para la expresión de genes extraños en levadura {Heinemann y otros, Nature, 340:205 (1989); Rose y otros, Gene, 60:237 (1987)}. Los vectores de ADN biológicamente funcionales capaces de expresión y replicación en un hospedador son conocidos en la técnica. Tales vectores se usan para incorporar secuencias de ADN de la invención.

Los métodos para preparar genes fusionados, operativamente enlazados, y expresarlos en bacterias con conocidos y se muestran, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 4.366.246 que se incorpora aquí como referencia. Los métodos y constructos genéticos en ella descritos pueden utilizarse para la expresión de LipL1 y LipL2 de Leptospira en hospedadores de naturaleza procariota.

Entre los ejemplos de promotores que se pueden usar en la invención están: rec A, trp, lac, tac, y bacteriófagos lambda p_{R} o p_{L}. Ejemplos de plásmidos que pueden usarse en la invención se enumeran en Sambrook y otros {Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982}.

Los anticuerpos proporcionados en la presente invención son inmunoreactivos con proteína LipL1 o LipL2. Esos anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos policlonales pueden producirse según métodos conocidos en la técnica, tales como vacunar un animal con proteínas LipL1 o LipL2, recoger y purificar el antisuero del animal dirigido contra LipL1 o LipL2. Pueden producirse también anticuerpos policlonales monoespecíficos usando métodos conocidos en la técnica. Se proporcionan también anticuerpo que consiste esencialmente en mezclas de anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades epitópicas, así como preparaciones de anticuerpo monoclonal distintivo. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de antígeno que contiene fragmentos de la proteína mediante métodos bien conocidos en la técnica {Kohler y otros, Nature, 256:495 (1975); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y otros, ed., (1989)}. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante el método de Kohler y Milstein {Nature, 256:495-497 (1975)} inmortalizando células del bazo de un animal inoculado con el inmunógeno o un fragmento de éste, habitualmente mediante fusión con una línea celular inmortal (preferiblemente una línea celular de mieloma), de una especie igual o diferente a la del animal inoculado, seguido de los pasos de clonación y cribado apropiados. Los anticuerpos pueden ser también anticuerpos monoclonales recombinantes producidos según los métodos divulgados en Reading, patente de EE.UU. nº 4.474.893 o Cabilly y otros, patente de EE.UU. nº 4.816.567. Los anticuerpos pueden ser también construidos químicamente según el método divulgado en Segel y otros, patente de EE.UU. nº 4.676.980.

El término anticuerpo, o inmunoglobulina, como se usa en esta invención incluye moléculas intactas así como fragmentos de éstas, tales como Fab, F(ab')_{2}, Fv, y anticuerpo de cadena sencilla (SCA) que son capaces de fijar un determinante epitópico sobre LipL1 o LipL2. SCA es una molécula de cadena sencilla fusionada fabricada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada enlazadas mediante un enlazador polipeptídico adecuado. Los métodos para preparar esos fragmentos son conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988).

Como se discutió previamente, modificaciones menores de las secuencias aminoacídicas primarias de LipL1 y LipL2 pueden dar como resultado proteínas con una función sustancialmente equivalente en comparación con las proteínas LipL1 y LipL2 aquí descritas. Tales modificaciones pueden ser deliberadas, como mutagénesis sitio-dirigida, o pueden ser espontáneas. Todas las proteínas producidas mediante esas modificaciones se incluyen aquí con tal de que existan funciones de LipL1 y LipL2.

El aislamiento y la purificación de proteínas expresadas de forma microbiana, o fragmentos de éstas, proporcionados por la invención, pueden llevarse a cabo mediante medios convencionales incluyendo cromatografía preparativa y separaciones inmunológicas que implican anticuerpos monoclonales o policlonales.

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La invención se extiende a cualquier proteína modificada mediante hospedador según los métodos descritos, o modificada mediante cualquier otro medio habitualmente conocido por quienes tienen una destreza ordinaria en la técnica, tal como, por ejemplo, mediante transferencia de material genético usando un fago lisogénico, y que dan como resultado una procariota que expresa el gen de Leptospira para la proteína LipL1 o LipL2. Las procariotas transformadas con el gen de Leptospira que codifica para la proteína LipL1 o LipL1 son particularmente útiles para la producción de proteínas que pueden usarse para la inmunización de un animal.

En una realización, la invención proporciona una composición farmacéutica útil para inducir una respuesta inmune frente a Leptospira patógena en un animal que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de LipL1 y/o LipL2 en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "cantidad inmunogénicamente efectiva", como se usa en la descripción de la invención, pretende denotar la cantidad de antígeno de Leptospira que es necesario para inducir en un animal la producción de una respuesta inmune frente a Leptospira. LipL1 y LipL2 son particularmente útiles en la sensibilización del sistema inmunitario de un animal tal que, como un resultado, se produce una repuesta inmune que mejora el efecto de la infección por Leptospira.

Las proteínas LipL1 y LipL2, esto es, sus variantes, equivalentes funcionales y derivados, que son vacunas efectivas contra la leptospirosis pueden cribarse usando los métodos descritos en Bolin, C. A. y otros, Am. J. Vet. Res., 52:1639-1643 (1991) y Bey, R. F. y otros, Infect. Immun., 10:1051-1056 (1974). Los métodos de vacunación divulgados en esas referencias pueden usarse también para vacunar animales con proteínas LipL1 y LipL2.

Las proteínas LipL1 y LipL2 pueden administrarse, solas o en combinación, por ejemplo, parenteralmente mediante inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea, absorción dérmica, y enteralmente, por ejemplo, oralmente. Entre las preparaciones de vehículo farmacéuticamente aceptables para administración parenteral se incluyen emulsiones, suspensiones y disoluciones acuosas o no acuosas estériles. Entre los ejemplos de disolventes no acuosos están propilen glicol, polietilen glicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como etil oleato. Pueden usarse vehículos para apósitos oclusivos para aumentar la permeabilidad cutánea y mejorar la absorción antigénica. Las formas de dosificación líquida para administración oral pueden comprender generalmente una disolución liposómica que contiene la forma de dosificación líquida. Entre las formas adecuadas para suspender los liposomas se incluyen emulsiones, suspensiones, disoluciones, siropes y elixires que contienen diluyentes inertes habitualmente usados en la técnica, tales como agua purificada.

Aparte de los diluyentes inertes, tales composiciones pueden incluir también adyuvantes, agentes de mojado, agentes de emulsión y suspensión, y agentes endulzantes, aromatizantes y perfumantes.

Por ejemplo, pueden usarse como vacunas en las composiciones anteriores virus y bacterias recombinantes que expresan LipL1 y/o LipL2 y administrarse, por ejemplo, oralmente. Las vacunas pueden añadirse también a cebos contra portadores potenciales de Leptospira tales como roedores de modo que no resulten infectados con Leptospira y sean portadores en la expansión de Leptospira y la enfermedad a humanos y otros animales, tales como animales domésticos.

También es posible que las preparaciones antigénicas que contienen las proteínas LipL1 y/o LipL2 de la invención incluyan un adyuvante. Los adyuvantes son sustancias que pueden usarse para aumentar de forma no específica una respuesta inmune específica. Normalmente, el adyuvante y el antígeno se mezclan previamente a la presentación al sistema inmunitario, o se presentan por separado pero en el mismo sitio del animal que está siendo inmunizado. Los adyuvantes pueden dividirse a grandes rasgos en varios grupos sobre la base de su composición. Estos grupos incluyen adyuvantes oleosos (por ejemplo, los adyuvantes completo e incompleto de Freund), sales minerales {por ejemplo, AIK(SO_{4})_{2}, AINa(SO_{4})_{2}, AINH_{4}(SO_{4}), sílice, alumbre, AI(OH)_{3}, Ca_{3}(PO_{4})_{2}, caolín y carbón}, polinucleótidos (por ejemplo, ácidos poli AU y poli IC), y ciertas sustancias naturales (por ejemplo, cera D procedente de Mycobacterium tuberculosis, así como sustancias que se encuentran en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, y miembros del género Brucella).

En otra realización, se proporciona una composición para la fabricación de un medicamento para inmunizar a un animal mediante inducción de una respuesta inmune frente a Leptospira patógena en el animal. Existen muchas técnicas diferentes para la temporización de las inmunizaciones cuando se utiliza un régimen de inmunización múltiple. Es posible usar la preparación antigénica de la invención más de una vez para aumentar los niveles y la diversidad de la expresión de la respuesta inmune del animal inmunizado. Típicamente, si se dan múltiples inmunizaciones, se espaciarán entre dos y cuatro semanas entre sí. Entre los sujetos en los que es deseable una respuesta inmune frente a Leptospira se incluye cualquier animal susceptible de infección por Leptospira. Los animales son preferiblemente mamíferos. Son ejemplos de los mamíferos: mamíferos humanos, domésticos y salvajes. Los mamíferos domésticos incluyen: ganado tal como bovino, cerdos, cabras, caballos, búfalos; y mascotas tales como perros.

En general, la dosificación de las proteínas LipL1 y/o LipL2 administrada a un animal variará dependiendo de factores tales como edad, estado, sexo y grado de enfermedad, en su caso, así como otras variables que pueden ser ajustadas por alguien con la destreza ordinaria en la técnica.

Las preparaciones antigénicas de la invención pueden administrarse mediante dosis bien sencillas o múltiples y pueden variar, por ejemplo, entre aproximadamente 10 ug y aproximadamente 1.000 ug del antígeno LipL1 y/o LipL2 de Leptospira por dosis, más preferiblemente entre aproximadamente 50 ug y aproximadamente 700 ug de antígeno LipL1 y/o LipL2 por dosis, con máxima preferencia entre aproximadamente 50 ug y aproximadamente 300 ug de antígeno LipL1 y/o LipL2 por dosis.

Cuando se usan para inmunoterapia, los anticuerpos, preferiblemente anticuerpos monoclonales o SCA, de la invención pueden no estar marcados o estar marcados con un agente terapéutico. Esos agentes pueden estar acoplados bien directamente o indirectamente a los anticuerpos de la invención. Un ejemplo de acoplamiento indirecto es mediante el uso de una fracción espaciadora. Esas fracciones espaciadoras, a su vez, pueden ser bien insolubles o solubles {Diener y otros, Science, 231:148 (1986)} y pueden seleccionarse para permitir la liberación de fármaco a partir de la molécula de anticuerpo en el sitio blanco. Son ejemplos de agentes terapéuticos que pueden acoplarse con los anticuerpos para inmunoterapia fármacos, radioisótopos, lectinas y toxinas.

Los anticuerpos marcados o no marcados pueden usarse también en combinación con agentes terapéuticos tales como los descritos anteriormente. Son especialmente preferidas las combinaciones terapéuticas que comprenden el anticuerpo e inmunomoduladores y otros modificadores de la respuesta biológica.

Cuando el anticuerpo se usa en combinación con varios agentes terapéuticos, tales como los aquí descritos, la administración del anticuerpo y el agente terapéutico ocurre habitualmente de forma sustancialmente simultánea. El término "de forma sustancialmente simultánea" significa que el anticuerpo y el agente terapéutico se administran razonablemente cerca el uno del otro con respecto al tiempo. Habitualmente, se prefiere administrar el agente terapéutico antes que el anticuerpo. Por ejemplo, el agente terapéutico puede administrarse de 1 a 6 días antes que el anticuerpo. La administración del agente terapéutico puede ser diaria o con cualquier otro intervalo, dependiendo de factores tales, por ejemplo, como la naturaleza del trastorno, el estado del paciente y la vida media del agente.

Los intervalos de dosificación para la administración de anticuerpos son aquéllos suficientemente altos para producir el efecto deseado en el que mejoran los síntomas iniciales de la enfermedad leptospiral. La dosificación no debe ser tan alta como para causar efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas y similares. En general, la dosificación variará con la edad, el estado, el sexo y el grado de enfermedad del sujeto y puede determinarla alguien experto en la técnica. La dosificación puede ajustarla el médico individual en caso de producirse cualquier complicación. La dosificación puede variar, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 2.000 mg/kg, preferiblemente entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 500 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diarias, durante uno o varios días. Generalmente, cuando los anticuerpos se administran conjugados con agentes terapéuticos, pueden usarse dosis inferiores, comparables a las utilizadas para obtener imágenes de diagnóstico in vivo.

Los anticuerpos pueden administrarse parenteralmente mediante inyección o mediante perfusión gradual en el tiempo. Los anticuerpos pueden administrarse de forma intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavidad o transdérmica, solos o en combinación con células efectoras.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen emulsiones, suspensiones y disoluciones acuosas o no acuosas estériles. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilen glicol, polietilen glicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como etil oleato. Entre los portadores acuosos se incluyen agua, disoluciones alcohólicas / acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sólido, los vehículos intravenosos de Ringer lactatos incluyen reponedores de fluido y nutriente, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. Pueden estar también presentes preservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes o quelantes y gases inertes, preferiblemente aislados o sustancialmente puros, y similares.

Un animal puede ser vacunado también usando, preferiblemente aisladas o en composición sustancialmente pura, las secuencias de ácidos nucleicos divulgadas, sus secuencias mutagenizadas o fragmentos de éstas, que pueden inyectarse directamente o incorporarse en un plásmido e inyectarse en el animal. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden mezclarse con un vehículo farmacéuticamente aceptable previamente a la inyección. Las inyecciones pueden ser por medio de una pistola génica, tal como la que se describe en Yang, N. -S. y otros, Gene Therapy via Particle Bombardment: Applications of the Accell Gene Gun, en Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer, Wolff, J. A., ed., Birkhauser, EE.UU. (1994).

En una realización adicional, la invención proporciona un método para detectar un trastorno asociado con Leptospira patógena en un sujeto que comprende poner en contacto un componente celular con un reactivo que se fija al componente celular. El componente celular puede ser un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, o puede ser una proteína. Cuando el componente es un ácido nucleico, el reactivo es una sonda de ácidos nucleicos o un cebador para PCR. Cuando el componente celular es una proteína, el reactivo es una sonda de anticuerpos. Las sondas están marcadas de forma detectable, por ejemplo, con un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima. Quienes tengan una destreza ordinaria en la técnica conocerán otros marcadores adecuados para fijación al anticuerpo o serán capaces de determinar tales, usando experimentación de rutina.

Para los propósitos de la invención, puede usarse una sonda de anticuerpos o ácidos nucleicos específica de LipL1 o LipL2 para detectar la presencia de la respectiva proteína (usando anticuerpos) o polinucleótido (usando sondas de ácidos nucleicos) de LipL1 o LipL2 en muestras biológicas. Puede usarse cualquier espécimen que contenga una cantidad detectable de antígeno o polinucleótido de LipL1 o LipL2. Son especímenes preferidos de esta invención una muestra de tejido o fluido biológico. Entre los ejemplos preferidos de una muestra de fluido biológico se incluyen: sangre, suero, plasma, lágrimas, leche, orina y líquido cefalorraquídeo. Entre los ejemplos preferidos de una muestra de tejido biológico se incluyen muestras tisulares procedentes del hígado y el riñón y tejido de origen endotelial.

Cuando el componente celular es un ácido nucleico, puede ser necesario amplificar el ácido nucleico previamente a la fijación a una sonda específica de Leptospira. Preferiblemente, se usa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR); no obstante, pueden usarse otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la transcripción activada ligada (LAT) y la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA).

Otra técnica que puede dar también como resultado una mayor sensibilidad consiste en el acoplamiento de anticuerpos a haptenos de bajo peso molecular. Esos haptenos pueden detectarse entonces específicamente por medio de una segunda reacción. Por ejemplo, es habitual usar haptenos tales como biotina, que reacciona con avidina, o dinitrofenilo, piridoxal y fluoresceína, que pueden reaccionar con anticuerpos antihapteno específicos.

Alternativamente, puede usarse la proteína LipL1 o LipL2 para detectar anticuerpos frente a la respectiva proteína LipL1 o LipL2 en un espécimen. Las LipL1 y LipL2 de la invención son particularmente adecuadas para uso en inmunoensayos en los que se pueden utilizar en fase líquida o fijados a un portador de fase sólida. Además, las LipL2 y LipL2 usadas en esos ensayos pueden marcarse de forma detectable de varios modos.

Ejemplos de inmunoensayos que pueden utilizar las LipL1 y LipL2 de la invención son los inmunoensayos competitivos y no competitivos en formato bien directo o bien indirecto. Son ejemplos de tales inmunoensayos el radioinmunoensayo (RIA), el ensayo intercalado (ensayo inmunométrico) y el ensayo de transferencia Western. La detección de anticuerpos que se fijan a las LipL1 o LipL2 de la invención puede realizarse utilizando inmunoensayos que proceden en los modos bien directo, inverso o simultáneo, incluyendo ensayos inmunohistoquímicos en muestras biológicas. La concentración de LipL1 y LipL2 que se usa variará dependiendo del tipo de inmunoensayo y la naturaleza del marcador detectable que se usa. No obstante, con independencia del tipo de inmunoensayo que se use, las concentraciones de LipL1 y LipL2 utilizadas puede determinarlas fácilmente alguien con la destreza ordinaria en la técnica usando experimentación de rutina.

Las LipL1 y LipL2 de la invención pueden fijarse a muchos portadores diferentes y usarse para detectar la presencia de anticuerpo específicamente reactivo con el polipéptido. Entre los ejemplos de portadores bien conocidos se incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nilón, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas, y magnetita. La naturaleza del portador puede ser bien soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Los expertos en la técnica sabrán de otros portadores adecuados para la fijación de LipL1 y LipL2 o serán capaces de determinar tales, usando experimentación de rutina.

Hay muchos marcadores y métodos de marcación diferentes conocidos para quienes tengan una destreza ordinaria en la técnica. Entre los ejemplos de los tipos de marcadores que se pueden usar en la presente invención se incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes.

Para los propósitos de la invención, el anticuerpo que se fija a las LipL1 o LipL2 de la invención puede estar presente en varias muestras biológicas. Puede usarse cualquier muestra que contenga una cantidad detectable de anticuerpos frente a LipL1 o LipL2. Son especímenes preferidos de esta invención: una muestra de tejido o fluido biológico. Entre los ejemplos preferidos de una muestra de fluido biológico se incluyen: sangre, suero, plasma, lágrimas, leche, orina y líquido cefalorraquídeo. Entre los ejemplos preferidos de una muestra de tejido biológico se incluyen muestras tisulares procedentes del hígado y el riñón y tejido de origen endotelial.

Los anticuerpos de la invención, preferiblemente anticuerpos monoclonales y SCA, dirigidos hacia LipL1 o LipL2, son también útiles para la detección in vivo de antígeno. El anticuerpo marcado de forma detectable se da en una dosis que es diagnósticamente efectiva. El término "diagnósticamente efectiva" significa que la cantidad de anticuerpo monoclonal marcado de forma detectable se administra en cantidad suficiente para permitir la detección de antígeno LipL1 o LipL2 de Leptospira para el que son específicos los anticuerpos.

La concentración de anticuerpo marcado de forma detectable que se administra debe ser suficiente para que la fijación a esas células, fluido corporal o tejido que tiene LipL1 y/o LipL2 sea detectable en comparación con el fondo. Adicionalmente, es deseable que el anticuerpo marcado de forma detectable se elimine rápidamente del sistema circulatorio con el fin de dar la mejor relación de señal blanco-fondo.

Por norma, la dosis de anticuerpo marcado de forma detectable para diagnóstico in vivo variará dependiendo de factores tales como la edad, el sexo y el grado de enfermedad del sujeto. La dosis de anticuerpo puede variar, por ejemplo, entre aproximadamente 0,001 mg/m^{2} y aproximadamente 500 mg/m^{2}, preferiblemente entre 0,1 mg/m^{2} y aproximadamente 200 mg/m^{2}, con máxima preferencia entre aproximadamente 0,1 mg/m^{2} y aproximadamente 10 mg/m^{2}. Tales dosis pueden variar, por ejemplo, dependiendo de si se dan múltiples inyecciones y otros factores conocidos para los expertos en la técnica.

Para la obtención de imágenes para diagnóstico in vivo, el tipo de instrumento de detección disponible es un factor principal en la selección de un radioisótopo dado. El radioisótopo elegido debe tener un decaimiento que sea detectable por un tipo de instrumento dado. Otro factor más de importancia en la selección de un radioisótopo para diagnóstico in vivo es que la vida media del radioisótopo sea suficientemente larga para que éste sea aún detectable en el momento de máxima captación por el blanco, pero suficientemente corta para que se minimice la radiación perjudicial con respecto al hospedador. Idealmente, un radioisótopo usado para obtención de imágenes in vivo carecerá de emisión de partículas pero producirá un alto número de fotones en el intervalo de 140-250 k que puedan ser fácilmente detectados por cámaras gamma convencionales.

Para diagnóstico in vivo, los radioisótopos pueden fijarse a la inmunoglobulina bien directamente o indirectamente usando un grupo funcional intermedio. Son grupos funcionales intermedios que se usan con frecuencia para fijar radioisótopos que existen en forma de ion metálico a inmunoglobulinas los agentes quelantes bifuncionales tales como ácido dietilentriaminopentacético (DTPA) y ácido etilendiaminotetracético (EDTA) y moléculas similares. Ejemplos típicos de iones metálicos que se pueden fijar a los anticuerpos monoclonales de la invención son ^{111}In, ^{97}Ru, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{72}As, ^{89}Zr y ^{201}Tl.

Los anticuerpos de la invención pueden marcarse también con un isótopo paramagnético para propósitos de diagnóstico in vivo, como en la obtención de imágenes de resonancia magnética (MRI) o la resonancia de espín electrónico (ESR). En general, puede utilizarse cualquier método convencional para la visualización de imágenes diagnósticas. Habitualmente, se usan radioisótopos con emisión gamma y de positrones para la obtención de imágenes mediante cámara e isótopos paramagnéticos para MRI. Entre los elementos particularmente útiles en tales técnicas se incluyen ^{157}Gd, ^{55}Mn, ^{162}Dy, ^{52}Cr y ^{56}Fe.

Los anticuerpos, preferiblemente anticuerpos monoclonales y SCA, de la invención pueden usarse también para monitorizar el curso de mejora de trastornos asociados con Leptospira. Así pues, midiendo el aumento o la disminución de proteínas LipL1 y/o LipL2 de Leptospira o anticuerpos frente a las proteínas LipL1 y/o LipL2 presentes en varios tejidos o fluidos corporales, sería posible determinar si un régimen terapéutico particular destinado a mejorar el trastorno es efectivo.

Los materiales para uso en el método de la invención son idealmente adecuados para la preparación de un kit. Tal kit puede comprender un medio portador que se compartimenta para recibir en confinamiento cerrado uno o más medios contenedores tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada uno de los medios contenedores uno de los elementos separados que se van a usar en el método. Por ejemplo, uno de los medios contenedores puede comprender un reactivo de fijación de LipL1 y/o LipL2, tal como un anticuerpo. Un segundo contenedor puede comprender adicionalmente proteínas LipL1 y/o LipL2. Los constituyentes pueden estar presentes en forma líquida o liofilizada, como se desee.

En la discusión anterior, las pruebas diagnósticas, por ejemplo inmunoensayos o ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, pueden ser pruebas de la presencia de bien LipL1 o LipL2 o ambas. Alternativamente, pueden consistir en pruebas de panel que prueban la presencia de secuencias de ácidos nucleicos o proteínas tanto de LipL1 como de LipL2, en combinación con otras secuencias de proteínas o ácidos nucleicos específicas de Leptospira, en particular Leptospira patógena, tales como OmpL1 {Haake, D. A. y otros, J. Bacteriol., 175:4225-4234 (1993); solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 08/040.747, "Cloned Leptospira Outer Membrane Protein" de Haake, D. A. y otros, presentada el 31 de marzo de 1993} y OmpL2 {solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 08/249.013, "Cloned

\hbox{ Leptospira }

Outer Membrane Protein" de Haake, D. A. y otros, presentada el 25 de mayo de 1994}. Similarmente, las composiciones, por ejemplo, para inmunoensayos o vacunaciones, pueden consistir en LipL1 o LipL2 por separado. Alternativamente, pueden consistir en un cóctel que contenga tanto LipL1 como LipL2 o esas proteínas en combinación con otras proteínas específicas de Leptospira, en particular Leptospira patógena, tales como OmpL1 y OmpL2. Las composiciones de anticuerpos pueden consistir en anticuerpos específicos frente a LipL1 y LipL2. Alternativamente, pueden consistir en un cóctel que contenga anticuerpos frente a LipL1 y LipL2, o frente a esas proteínas y otras proteínas específicas de Leptospira, en particular Leptospira patógena, tales como OmpL1 y OmpL2. Los ensayos de hibridación se ejecutan preferiblemente en condiciones de moderadas a astringentes. Los inmunoensayos se llevan a cabo preferiblemente en condiciones de fijación no específica reducida. Así pues, los kits de prueba y métodos que usan esas composiciones varían como corresponda.

Los ejemplos siguientes están destinados a ilustrar pero no limitar la invención. Si bien son típicos de los que podrían usarse, pueden usarse alternativamente otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Ejemplo

El ejemplo siguiente describe la identificación, clonación, secuenciación y caracterización de LipL1 y LipL2. Hubo una fuerte correlación entre la patogenicidad leptospiral y la reactividad con antisueros frente a LipL1 y LipL2.

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Materiales y métodos Cepas leptospirales

Se recibieron Leptospira kirschneri, cepa RM52, (antes L. alstoni) virulentas y atenuadas en cultivo, de C. A. Bolin (National Animal Disease Center [Centro Nacional para Investigación de Enfermedades Animales], Agricultural Research Service [Servicio de Investigación Agrícola], Departamento de Agricultura de los EE.UU., Ames, Iowa). Esta cepa se aisló originalmente a partir de material enviado al Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad Estatal de Iowa durante un brote de aborto porcino en 1983 {Thiermann, A. B. y otros, Ann. Proc. Amer. Assn. Veterinary Laboratory Diagnosticians, 27:233-244 (1984)}. Las muestras del aislado bien se almacenaron en nitrógeno líquido {Alexander, A. D. y otros, International J. System. Bacteriol., 22:165-169 (1972)} o bien se pasaron semanalmente o quincenalmente en medio líquido EMJH {Johnson, R. C. y otros, J. Bacteriol., 94:27-31 (1967)}. La cepa virulenta se había pasado menos de cinco veces. La cepa atenuada se había pasado más de 200 veces desde 1983. Otras especies Leptospira fueron amablemente suministradas por C. A. Bolin.

Escherichia coli

Se usó E. coli DH5\alpha (supE44, \DeltalacU169, [\phi80, lacZ, \DeltaM15], hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1) como cepa hospedadora para las transformaciones de ADN recombinante. Se usó la cepa de E. coli PLK-F' (recA, lac, mcrA, mcrB, hsdR, gal, supE [F' proAB, lacIqZ\DeltaM15, Tn10 (tet^{R})]) como cepa hospedadora para la infección con el vector \lambdazap II (Stratagene, San Diego, California). Se usó la cepa de E. coli JM109 (recA1, supE44, endA1, hsdR17, gyrA96, relA1, thi\Delta[lacproAB], F'[traD36, proAB^{+}, IacI^{q}, lacZ\DeltaM15]) como cepa hospedadora para el vector de expresión pRSET (Invitrogen Corp., San Diego, California).

SDS-PAGE e inmunotransferencia

Se solubilizaron muestras para electroforesis en dodecil sulfato sódico y gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) en tampón de muestra final (FSB) compuesto por Tris hidrocloruro 62,5 mM (pH 6,8), 10% de glicerol, 5% de 2-mercaptoetanol, 2% de SDS y urea 8 M, salvo que se haga notar de otro modo. Se separaron las proteínas en un gel al 10% con un sistema tampón discontinuo {Laemmli, Reino Unido, Nature (Londres), 227:680-685 (1979)} y se transfirieron a nitrocelulosa (Schleicher & Schuell Inc, Keene, New Hampshire) para inmunotransferencia. Para la detección antigénica en la inmunotransferencia, se bloqueó la nitrocelulosa con un 5% de leche desnatada seca en medio salino tamponado con fosfato con Tween-20 al 0,1% (PBS-T), se incubó durante una hora con antisuero diluido 1:5000 (salvo que se haga notar de otro modo) en PBS-T, y se sondeó con antisuero anti-conejo de burro conjugado con peroxidasa de rábano picante (Amersham Corporation, Arlington Heights, Illinois). La fijación antígeno-anticuerpo se detectó usando el sistema de quimioluminiscencia mejorada (ECL, Amersham). Las transferencias se incubaron en reactivos ECL durante un minuto y luego se expusieron a película XAR-5 (Fuji Medical Systems, Stamford, Connecticut).

Extracción de Leptospira en Triton X-114

Se extrajo L. Kirschneri atenuada en cultivo con Triton X-114 al 1% mediante una modificación del método descrito previamente {Haake, D. A. y otros, Infection & Immunity, 59:1131-40 (1991)}. En resumen, se lavaron L. Kirschneri atenuadas en cultivo dos veces en medio salino tamponado con fosfato y con MgCl_{2} 5 mM y se extrajeron en presencia de Triton X-114 de calidad para proteínas al 1% (Calbiochem, La Jolla, California), Tris 10 mM pH 8, PMSF 1 mM, yodoacetamida 1 mM y EDTA 10 mM a 4ºC. El material insoluble se retiró mediante centrifugación a 17.000 x g durante 10 minutos. Se aumentó la concentración de Triton X-114 del sobrenadante al 2%. Se efectuó una separación de fases calentando el sobrenadante a 37ºC y sometiéndolo a centrifugación durante 10 minutos a 2.000 x g. Las proteínas del detergente y la fase acuosa se hicieron precipitar con acetona.

Secuenciación aminoacídica n-terminal

Se aislaron las lipoproteínas mediante SDS-PAGE y se digirieron con proteasa V8 estafilocócica. Los fragmentos polipeptídicos se sometieron a SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de secuenciación de proteínas de PVDF Trans-Blot (Bio-Rad, Richmond, California), y se enviaron al servicio de microsecuenciación de proteínas de la Universidad de California, Los Angeles (UCLA). El análisis de secuencias aminoacídicas n-terminales se efectuó en un secuenciador en fase gas Porton 1090-E con detección en línea de los aminoácidos de PTH.

Análisis de transferencia Southern

Se preparó ADN genómico de L. Kirschneri mediante el método de {Yelton, D. B. y otros, Gene, 28:147-152 (1984)}. El ADN leptospiral se digirió con EcoRI y se electroforizó en un gel de agarosa al 1,0%. Tras despurinación, desnaturalización y neutralización, se transfirió el ADN a un filtro de nilón (Zeta-Probe, Bio-Rad) mediante el método de Southern {Sambrook, J. y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)}. Los filtros se cocieron durante 2 horas a 80ºC bajo vacío y se prehibridaron durante 3 horas a 37ºC en tampón que contenía SSC 6X, disolución de Denhardt 1X, pirofosfato sódico al 0,05%, SDS al 0,5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridaron entonces de noche a 37ºC con oligonucleótidos radiomarcados.

Se sintetizaron dos sondas oligonucleótidas degeneradas, cada una de veinte pares de bases de longitud, sobre la base de las secuencias aminoacídicas n-terminales de los fragmentos lipoproteicos. Se prepararon oligonucleótidos sintéticos usando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado (380B, Applied Biosystems, Inc., Foster City, California). Para sondas oligonucleótidas degeneradas, los filtros se lavaron a 47ºC en cloruro de tetrametilamonio 3,0 M (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin), Tris 50 mM pH 8,0, EDTA 2,0 mM y SDS al 1,0% como se describió previamente {Wood, W. I. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1585-1588 (1985)}. Las sondas oligonucleótidas degeneradas se marcaron en sus extremos con ^{32}P-dATP mediante polinucleótido quinasa de T4 (Promega Corp., Madison, Wisconsin).

Clonación y secuenciación de los genes lipL1 y lipL2

Se efectuaron procedimientos de ADN recombinante estándar como se describió {Sambrook, J. y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)}. Se llevaron a cabo digestiones con endonucleasa de restricción como recomiendan los proveedores (New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachussets y Promega). Se ligaron fragmentos EcoRI de ADN genómico de L. Kirschneri en el vector Lambda Zap II (Stratagene). El ADN ligado se empaquetó con extracto de empaquetamiento Gigapack II Gold (Stratagene) y se almacenó en cloroformo al 0,3% a 4ºC. Se determinó el título de placa mediante infección de PLK F' de E. coli (Stratagene). Las placas se emplacaron, se transfirieron a filtros por duplicado y se procesaron como se describió previamente {Sambrook, J. y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)}. Se usaron las mismas condiciones de hibridación y lavado de sondas oligonucleótidas anteriormente descritas para la hibridación Southern. Se recuperaron clones recombinantes en pBluescript SK(-) a partir de las placas positivas productoras de fagos mediante escisión in vivo según instrucciones del fabricante. Tras el mapeado de restricción, los fragmentos de ADN apropiados se subclonaron en pBluescript KS y se secuenciaron en el servicio de secuenciación de ADN de núcleo de UCLA mediante el método de terminación de cadena didesoxi con nucleótidos didesoxi marcados con fluoresceína (Applied Biosystems Inc.).

Análisis de secuencia de ADN

La información de secuencia de ADN se analizó por medio del programa DNA Strider {Marck, C., Nucleic Acids Res., 16:1829-1836 (1988)}. Se efectuaron búsquedas de homología con los programas BLAST, FASTA y Profile
Search que se encuentran en el paquete de Genetics Computer Group (GCG), Inc. de la Universidad de Wisconsin (Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin) versión 7.0 {Devereux, J. y otros, Nucl. Acids Res., 12:387-395 (1984)}. La predicción de estructuras secundarias se basó en el análisis usando los programas PEPPLOT y PLOTSTRUCTURE que se encuentran también en el paquete GCG.

Inmunización con la proteína de fusión His6-LipL1

A falta de un sitio para endonucleasa de restricción conveniente cerca del termino amínico de la proteína LipL1 madura, se usó la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar la porción del gen lipL1 que codifica para la proteína madura comenzando con el primer residuo después de la cisteína aminoterminal. El oligonucleótido 5' contenía la secuencia nucleotídica que codifica para los seis aminoácidos que siguen a la cisteína aminoterminal de la LipL1 madura, incluyendo un sitio para endonucleasa de restricción Bg/II (subrayado): 5'-TTA ACG AGA TCT AAA AGT GAC GAC GAT GAT-3'. El oligonucleótido 3' consistía en una secuencia nucleotídica de 24 pares de bases comenzando 133 pares de bases en dirección 3' del codón de parada de lipL1: 5'-CAT GAT AAA AAT TGA AAA TGA TTC AAG AAT-3'. La secuencia nucleotídica entre el codón de parada de lipL1 y la secuencia oligonucleótida 3' incluye un sitio para endonucleasa de restricción HindIII exclusivo. Se usó como plantilla ADN genómico de L. Kirschneri, preparado como se describió previamente {Yelton y otros, Gene, 28:147-152 (1984)}. El fragmento Bg/II - HindIII de 1144 pares de bases del gen lipL1 amplificado se ligó en pRSETb (Invitrogen) digerido con Bg1II y HindIII. El constructo pRSETb-JR2 resultante se transformó en E. coli. JM109 (Invitrogen). La expresión de la proteína de fusión His6-LipL1 se consiguió mediante inducción con isopropiltio-b-D-galactósido (IPTG, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) seguida de infección con el fago M13/T7 que contiene el gen de la polimerasa de T7 impulsada por el promotor lac de E. coli. La proteína de fusión His6LipL1 se solubilizó en guanidina 6M y se purificó mediante cromatografía de afinidad usando agarosa Ni^{2+}-NTA (Qiagen) y se dializó en Tris 20 mM pH 8, NaCl 50 mM y glicerol al 10%. Se mezclaron groseramente 30 microgramos de His6-LipL1 con adyuvante completo de Freund y se inocularon de forma subcutánea e intramuscular en conejo macho blanco de Nueva Zelanda. La inmunización secundaria usó groseramente 30 microgramos de la proteína de fusión His6-LipL1 purificada en adyuvante completo de Freund. Dos semanas después de la inmunización secundaria se realizó la sangría del conejo.

Inmunización con la proteína de fusión His6-LipL2

Se ligó un fragmento HaeIII - ClaI de 842 pares de bases del gen lipL2, que codifica para los tres cuartos aminoterminales de la proteína, en pRSETa (Invitrogen) digerido con PvuII y ClaI. El constructo pRSETa-800HC resultante se transformó en E. coli JM109 (Invitrogen). La expresión de la proteína de fusión His6-LipL2 se consiguió mediante inducción con isopropiltio-b-D-galactósido (IPTG, Sigma) seguida de infección con el fago M13/T7 que contiene el gen de la polimerasa de T7 impulsada por el promotor lac de E. coli. La proteína de fusión His6-LipL2 se solubilizó en guanidina 6M y se purificó mediante cromatografía de afinidad usando agarosa Ni^{2+}-NTA (Qiagen) y se dializó en Tris 20 mM pH 8, NaCl 50 mM y glicerol al 10%. Se mezclaron groseramente 400 microgramos de His6-LipL2 con adyuvante completo de Freund y se inocularon de forma subcutánea e intramuscular en conejo macho blanco de Nueva Zelanda. La inmunización secundaria usó groseramente 450 microgramos de la proteína de fusión His6-LipL2 purificada en adyuvante completo de Freund. Dos semanas después de la inmunización secundaria se realizó la sangría del conejo.

Resultados Diseño de sondas oligonucleótidas y clonación del gen lipL1

La digestión con proteasa V8 estafilocócica de LipL1 dio como resultado fragmentos de masas moleculares de 21, 9 y 5 kDa de tamaño. El análisis de secuencia aminoacídica N-terminal del fragmento de 21 kDa reveló la secuencia YFGKTVLVRPSEQAKQKQIVLL. Se diseñó una sonda oligonucleótida de 23 pares de bases con degeneración de 256 veces, GA(AG)CA(AG)GC(AGCT)AA(AG)CA(AG)AA(AG)CA(AG)AT, sobre la base de la porción de secuencia EQAKQKQI. La sonda oligonucleótida identificó independientemente un fragmento EcoRI de 2,3 kb mediante hibridación Southern del genoma de L. Kirschneri. El fragmento EcoRI de 2,3 kb se clonó a partir de una librería lambda ZAP II parcial (Stratagene) de ADN genómico de L. Kirschneri como se describió previamente {Haake, D. A. y otros, J. Bacteriol., 175:4225-4234 (1993)}.

Diseño de sondas oligonucleótidas y clonación del gen lipL2

La digestión con proteasa V8 estafilocócica de LipL2 dio como resultado fragmentos de masas moleculares de 21 y 17 kDa de tamaño. El análisis de secuencia aminoacídica N-terminal del fragmento de 17 kDa reveló la secuencia ASLSLTGITKNRAKIGNL. Se diseñó una sonda oligonucleótida de 20 pares de bases con degeneración de 864 veces, AC(TAG)GG(TAG)AT(CAT)AC(TCAG)AA(AG)AA(TC)(AC)G, sobre la base de la porción de secuencia TGITKNR. Se usó preferencia codónica para el primer residuo treonina y el residuo glicina sobre la base del bajo contenido en GC de Leptospira spp. {Johnson y otros, Family II. Lectospiraceae, en N. R. Krieg y J. G. Holt (ed.) Bergey's manual of systematic bacteriology, Vol. 1, págs. 62-67, The Williams & Wilkins Co., Baltimore (1984)}. La sonda oligonucleótida identificó independientemente un fragmento EcoRI de 2,3 kb mediante hibridación Southern del genoma de L. Kirschneri. El fragmento EcoRI de 2,3 kb se clonó a partir de una librería lambda ZAP II parcial (Stratagene) de ADN genómico de L. Kirschneri como se describió previamente {Haake, D. A. y otros, J. Bacteriol., 175:4225-4234 (1993)}.

Análisis de secuencia del gen lipL1

El mapeado de restricción, el análisis de transferencia Southern y la secuenciación de ADN revelaron que el gen lipL1 entero es codificado por el fragmento EcoRI de 2,3 kb (figura 1). Se identificó un marco de lectura abierto intacto a 430 pares de bases aguas abajo del sitio EcoRI. El gen estructural lipL1 consiste en 1092 bases que codifican para una proteína de 364 aminoácidos. Regiones promotoras semejantes a E. coli -35 (TTGACC) y -10 (TATTAT) y un sitio de fijación de ribosoma consenso (AAGAGG) están presentes aguas arriba del codón de iniciación (figura 2). Como se espera de una lipoproteína, la secuencia aminoacídica deducida comienza con un péptido señal de 20 residuos, representado por el pico N-terminal de la representación gráfica de la hidrofobicidad (figura 3). La secuencia de LipL1 es conforme con las reglas establecidas para péptidos señal de lipoproteínas procariotas {Pugsley, A. P., Microbiol. Rev., 57:50-108 (1993); Hayashi, S. y otros, J. Bioenerg. Biomembr., 22:451-471 (1990)}. El péptido señal de LipL1 tiene una región aminoterminal básica (que incluye argininas en las posiciones 2 y 3), un núcleo hidrofóbico (aminoácidos 8 a 20) y un sitio de escisión de peptidasa señal II carboxiterminal Leu-X-Y-Cys. Se sabe que la proteasa V8 estafilocócica escinde péptidos a continuación de aminoácidos ácidos. Inmediatamente después del residuo ácido glutámico 174 hay una secuencia que es idéntica en 20 de 22 aminoácidos a la secuencia obtenida mediante el análisis de secuencia aminoacídica N-terminal de la proteína nativa (figura 2). Tras la escisión del péptido señal de 20 aminoácidos por acción de la peptidasa señal II leptospiral, el polipéptido maduro tendría una masa molecular predicha de 35,3 kDa. A treinta pares de bases aguas abajo del codón de terminación hay una repetición invertida que puede funcionar como terminador de transcripción independiente de rho (figura 2). La búsqueda en base de datos usando los programas FASTA, BLAST y Profile Search no reveló homologías aminoácidas significativas. Hay dos características inusuales en la secuencia aminoacídica deducida de LipL1. La primera es una serie de seis residuos ácido aspártico consecutivos comenzando tres residuos después de la cisteína N-terminal de la proteína madura. La segunda característica inusual es una abundancia de residuos alanina. En la proteína LipL1 madura, 53 de 344 residuos son alaninas, 25 de las cuales están organizadas en pares o tripletes.

Análisis de secuencia del gen lipL2

El mapeado de restricción, el análisis de transferencia Southern y la secuenciación de ADN revelaron que el gen lipL2 entero es codificado por el fragmento EcoRI de 2,25 kb (figura 4). Se identificó un marco de lectura abierto intacto a 170 pares de bases aguas abajo del sitio EcoRI. El gen estructural lipL2 consiste en 1065 bases que codifican para una proteína de 355 aminoácidos. Regiones promotoras semejantes a E. coli -35 (TTGACA) y -10 (TTAAAT) y un sitio de fijación de ribosoma consenso (AGGA) están presentes aguas arriba del codón de iniciación (figura 5). Como se espera de una lipoproteína, la secuencia aminoacídica deducida comienza con un péptido señal de 19 residuos, representado por el pico N-terminal de la representación gráfica de la hidrofobicidad (figura 6). La secuencia de LipL2 es conforme con las reglas establecidas para péptidos señal de lipoproteínas procariotas {Pugsley, A. P., Microbiol. Rev., 57:50-108 (1993); Hayashi, S. y otros, J. Bioenerg. Biomembr., 22:451-471 (1990)}. El péptido señal de LipL2 tiene una región aminoterminal básica (que incluye una arginina en posición 2 y una lisina en posición 3), un núcleo hidrofóbico (aminoácidos 4 a 17) y un sitio de escisión de peptidasa señal II carboxiterminal Leu-X-Y-Cys. Se sabe que la proteasa V8 estafilocócica escinde péptidos a continuación de aminoácidos ácidos. Inmediatamente después del residuo ácido glutámico 104 hay una secuencia de 18 aminoácidos que es idéntica al 100% a la secuencia obtenida mediante el análisis de secuencia aminoacídica N-terminal de la proteína nativa (figura 5). Tras la escisión del péptido señal de 19 aminoácidos por acción de la peptidasa señal II leptospiral, el polipéptido maduro tendría una masa molecular predicha de 36,8 kDa. A veintisiete pares de bases aguas abajo del codón de terminación hay una repetición invertida que puede funcionar como terminador de transcripción independiente de rho (figura 5). La búsqueda en base de datos usando los programas FASTA, BLAST y Profile Search no reveló homologías aminoácidas significativas. No obstante, la alineación de la secuencia aminoacídica de LipL2 con la secuencia OspA de B. burgdorferi usando el programa GAP reveló una región con un 53% de identidad en los 15 residuos carboxiterminales.

LipL1 y LipL2 aciladas de L. kirschneri

La marcación intrínseca de L. kirschneri atenuadas en cultivo con [^{3}H] palmitato tuvo como resultado la incorporación del marcador en glicolípido leptospiral (sustancia semejante a lipopolisacáridos), que aparece difusamente en la base de la línea del organismo entero así como en al menos diez proteínas que forman bandas discretas en la línea del organismo entero (figuras 7 y 8). Los experimentos de inmunoprecipitación con antisuero frente a LipL1 (figura 7) y antisuero frente a LipL2 (figura 8) confirman que esas dos proteínas son las segunda y tercera lipoproteínas más pequeñas, respectivamente, identificadas en estas autoradiografías.

Expresión de LipL1 y LipL2 en especies Leptospira

Para atender al nivel y la distribución de la expresión de LipL1 y LipL2, se efectuó un análisis de inmunotransferencia sobre un panel de especies Leptospira usando antisuero específico. La figura 10 muestra que mientras LipL1 la producen una mayoría de los patógenos leptospirales, el peso molecular y la cantidad de LipL1 producida son extremadamente variables. Se encontró que la cepa RM52 de L. kirschneri produce la mayor cantidad de LipL1 de todas las especies Leptospira probadas. La comparación de la inmunotransferencia de LipL1 con el gel teñido de azul Coomassie (figura 9) muestra que las diferencias observadas no pueden explicarse enteramente sobre la base de la reactividad preferencial del antisuero frente a LipL1 con la cepa fuente. En contraste, la figura 11 muestra que el peso molecular y la cantidad de LipL2 expresada entre las especies Leptospira patógenas se conservan en gran medida. LipL2 la expresan relativamente en la misma cantidad todas las especies leptospirales probadas.

Hubo una fuerte correlación entre la patogenicidad leptospiral y la reactividad con antisuero frente a LipL1 y LipL2. No se detectó LipL1 en L. biflexa, L. inadai o L. wolbachii, tres especies de Leptospira no patógenas, ni en el no patógeno relacionado Leptonema illini (figura 10). Si bien hubo una pequeña cantidad de reactividad en L. inadai, no se detectaron antígenos de 41 kDa en L. biflexa, L. wolbachii o L. illini (figura 11).

Comportamiento de LipL1 y LipL2 durante la extracción en Triton X-114 y el reparto de fases

Tanto LipL1 como LipL2 se repartieron selectivamente en la fase detergente Triton X-114 (figuras 12 y 13), una característica conocida de las lipoproteínas. LipL1 se extrajo completamente en Triton X-114 al 1%, como demuestra la completa eliminación de la pastilla insoluble en detergente (figura 12). En contraste, se encontró una reactividad LipL2 residual en la pastilla insoluble (figura 13), un patrón que se ha observado previamente para OmpL1 {Haake, D. A. y otros, J. Bacteriol., 175:4225-4234 (1993)}.

Evidencia que sugiere que LipL1 y LipL2 son dos lipoproteínas leptospirales

Hay varias líneas de evidenciaque soportan la conclusión de que estas proteínas son lipoproteínas. Lo primero de todo, se encontró que ambas proteínas estaban bloqueadas para la secuenciación aminoacídica N-terminal hasta que se sometían a la digestión con proteasa V8 estafilocócica. En segundo lugar, el análisis de sus secuencias aminoacídicas deducidas revela un péptido señal seguido de un sitio de escisión para peptidasa señal II L-X-Y-C. En tercer lugar, LipL1 y LipL2 resultan marcadas por la marcación intrínseca con [^{3}H] palmitato de L. kirschneri. Por último, tanto LipL1 como LipL2 se reparten selectivamente en la fase detergente Triton X-114.

Aunque LipL1 y LipL2 se reparten ambas en la fase detergente Triton X-114, parecen ser distintas de la proteína de 31 kDa identificada por Zuerner y otros {Zuerner y otros, Microbial. Pathogenesis, 10:311-322 (1991)} en el serovar Pomona de L. interrogans. El antisuero frente a LipL1 y LipL2 reaccionó con antígenos del serovar Pomona de L. interrogans que eran claramente mayores de 1 kDa (figuras 10 y 11).

Lo anterior pretende ilustrar pero no limitar el alcance de la invención. De hecho, quienes tengan una destreza ordinaria en la técnica podrán concebir y producir fácilmente realizaciones adicionales, basadas en las enseñanzas aquí incluidas, sin experimentación indebida.

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<110> Haake, David A.

\hskip1cm

Shang, Ellen S.

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<120> Proteínas de membrana de Leptospira

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<160> 6

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<170> Disquete compatible IBM PC-DOS/MS-DOS

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<210> 1

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<211> 1550

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<212> ADN (genómico), monohebra, lineal

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<400> 1

1

2

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<210> 2

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<211> 1092

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<212> ADN (genómico), monohebra, lineal

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<400> 2

3

4

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<210> 3

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<211> 364

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<212> Proteína, lineal

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<400> 3

5

6

7

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<210> 4

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<211> 1558

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<212> ADN (genómico), monohebra, lineal

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<400> 4

8

9

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<210> 5

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<211> 1065

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<212> ADN (genómico), monohebra, lineal

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<400> 5

10

11

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<210> 6

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<211> 355

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<212> Proteína, lineal

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<400> 6

12

13

Claims (32)

1. Una proteína aislada que comprende la secuencia aminoacídica de una proteína seleccionada de entre el grupo consistente en: LipL1, que tiene una secuencia aminoacídica expuesta como residuos aminoácidos 1 a 364 en SEQ ID NO: 3 o como residuos aminoácidos 21 a 364 en SEQ ID NO: 3, y LipL2, que tiene una secuencia aminoacídica expuesta como residuos aminoácidos 1 a 355 en SEQ ID NO: 6 o como residuos aminoácidos 20 a 355 en SEQ ID NO: 6.

2. Una proteína sustancialmente pura seleccionada de entre el grupo consistente en LipL1, que tiene una secuencia aminoacídica como la expuesta en SEQ ID NO: 3, y LipL2, que tiene una secuencia aminoacídica como la expuesta en SEQ ID NO: 6.

3. Una proteína sustancialmente pura que tiene una secuencia aminoacídica seleccionada de entre el grupo consistente en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 6, sin sus respectivas secuencias de péptido señal.

4. Un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo consistente en SEQ ID NOS: 1, 2, 4 y 5, sin una región codificadora para una secuencia de péptido señal.

5. Un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína aislada de la reivindicación 1.

6. Un vector recombinante que contiene la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. Una célula transformada por el vector de la reivindicación 6.

8. La célula de la reivindicación 7, en la que la célula es una procariota.

9. La procariota de la reivindicación 8, en la que la procariota es E. coli.

10. Un método para producir una proteína que comprende una secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 6, que comprende los pasos de:

- transformar un hospedador con la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 5; y

- expresar la secuencia de ácido nucleico en el hospedador.

11. El método de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente los pasos de aislar la proteína.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el hospedador es una procariota.

13. Una composición farmacéutica útil para inducir una respuesta inmune frente a Leptospira patógena en un animal, que comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de la proteína que tiene la secuencia aminoacídica expuesta como residuos aminoácidos 1 a 364 de SEQ ID NO: 3 o como residuos aminoácidos 21 a 364 de SEQ ID NO: 3, o la proteína que tiene la secuencia aminoacídica expuesta como residuos aminoácidos 1 a 355 de SEQ ID NO: 6 o como residuos aminoácidos 20 a 355 de SEQ ID NO: 6, sola o en combinación, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable contiene un adyuvante.

15. La composición de la reivindicación 13 para la fabricación de un medicamento para inmunizar a un animal induciendo una respuesta inmune frente a Leptospira patógena en el animal.

16. Una composición farmacéutica útil para inducir una respuesta inmune frente a Leptospira patógena en un animal, que comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de anticuerpos que fijan la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 3 o la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 6 o ambas en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Un anticuerpo capaz de fijar una proteína seleccionada de entre el grupo consistente en: la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 3 y la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 6.

18. El anticuerpo de la reivindicación 17, en el que el anticuerpo es policlonal.

19. El anticuerpo de la reivindicación 18, en el que el anticuerpo es monoclonal.

20. Un método para detectar Leptospira en una muestra, que comprende los pasos de:

- poner en contacto la muestra con una sonda de secuencia de ácido nucleico capaz de fijarse a una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 3 o la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 6; y

- detectar tal fijación.

21. Un método para detectar Leptospira en una muestra, que comprende los pasos de:

- poner en contacto la muestra con un anticuerpo capaz de fijarse a la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 3 o la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 6; y

- detectar tal fijación.

22. El método de la reivindicación 21, en el que la muestra es una muestra biológica.

23. El método de la reivindicación 22, en el que la muestra procede de un mamífero.

24. Un método para detectar en una muestra un anticuerpo capaz de fijar un antígeno, cuyo método comprende:

- poner en contacto la muestra con el antígeno en condiciones que permitan que el anticuerpo se fije al antígeno; y

- detectar la fijación del anticuerpo al antígeno;

en el que el antígeno se selecciona de entre el grupo consistente en la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 3 y la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 6.

25. El método de la reivindicación 24, en el que el antígeno está marcado de forma detectable.

26. Un kit útil para detectar un antígeno seleccionado de entre el grupo consistente en la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 3 y la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 6, comprendiendo el kit uno o más contenedores que contienen un reactivo capaz de fijar el antígeno.

27. El kit de la reivindicación 26, en el que el reactivo se selecciona de entre el grupo consistente en: un anticuerpo y una secuencia de ácido nucleico específica del antígeno.

28. Un kit útil para la detección de anticuerpos para antígenos, comprendiendo el kit uno o más contenedores que contienen el antígeno, en el que el antígeno se selecciona de entre el grupo consistente en la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 3 y la proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 6.

29. El método de la reivindicación 20, en el que la Leptospira es patógena.

30. El método de la reivindicación 21, en el que la Leptospira es patógena.

31. Una composición polinucleótida sustancialmente pura que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo consistente en SEQ ID NOS: 1, 2, 4 y 5 sin una región que codifica para una secuencia de péptido señal.

32. La composición polinucleótida sustancialmente pura de la reivindicación 31, que comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.