JPH11505708A

JPH11505708A - レプトスピラ属膜蛋白質

Info

Publication number: JPH11505708A
Application number: JP8535099A
Authority: JP
Inventors: ハアケ，デビッド，エー．; シャング，エレン，エス．
Original assignee: ザレジェンツオブザユニバーシティオブカリフォルニア
Priority date: 1995-05-19
Filing date: 1996-05-17
Publication date: 1999-05-25
Also published as: ES2203704T3; EP0837694A4; CA2220674A1; US20020127240A1; EP0837694B1; WO1996036355A1; AU5863796A; US6699482B2; AU712882B2; ATE246002T1; EP0837694A1; US5837263A; DE69629304T2; DE69629304D1

Abstract

(57)【要約】本発明はレプトスピラの病原性菌株と関連する新規なレプトスピラ膜リポ蛋白質、ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２を提示する。ＬｉｐＬ１は約３５ｋＤａであり、ＬｉｐＬ２は約４１ｋＤａである。これらの蛋白質をレプトスピラから精製する方法、それらのヌクレオチドおよびアミノ酸配列、蛋白質およびそれらの組み換え蛋白質を暗号化する遺伝子のクローニング、これらの蛋白質に対する抗体を生成する方法、その結果生ずる抗体も開示されている。これらの蛋白質、それらの免疫学的断片、およびそれらに対する抗体は、病原性レプトスピラに対する免疫応答を誘発するために、そしてレプトスピラ病のための診断目標を提供するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】レプトスピラ属膜蛋白質本発明は復員軍人庁医療研究基金、微生物病原2-T32-AI07323-06における国立衛生研究所多専門分野養成助成金からの資金および助成金番号AI21352,AI29733, AI12601 による合衆国公共医療からの奨学金による政府の支援で行われた。発明の技術分野本発明は一般に抗原性製剤、特に動物に感染防御免疫応答を引き起こすために使用されるレプトスピラ属膜蛋白質に関するものである。このような蛋白質はこの微生物により引き起こされるレプトスピラ症のワクチンとして免疫学的に使用できる。あるいは、該蛋白質、該蛋白質に対する抗体、または該蛋白質を暗号化するポリヌクレオチドの存在を検出することによってレプトスピラ症の診断を行うことができる。発明の背景レプトスピラ症は世界的に重要なヒトおよび家畜の健康問題である。レプトスピラ症はほとんどの哺乳類の種に感染することのできるレプトスピラ属の病原性菌株により引き起こされる広く行き渡った動物原性感染症である。感染した動物と直接接触すること、または汚染された土壌または水と間接的に接触することのいずれかにより感染が発生する。家畜の場合、この病気は流産、死産、不妊、ミルク生成の減少、および死による経済的損失を引き起こす。悪性のレプトスピラ属は環境の中で長期間生き残るばかりでなく、持続性の感染および野生動物や家畜により伝播する能力を有するので、レプトスピラ症を抑制する努力が妨げられてきた。現在入手できるレプトスピラ属ワクチンは短期間の免疫性しか与えず、170 の血液型亜種の病原性レプトスピラ属の多くに対して交差感染防御をもたらすことはない(Thiermann，et al.，J．Am．Vet．Med．Ass oc.,184:722(1984))。これらのワクチンは、不活性化された完全な微生物、または無傷で完全な微生物の顕微鏡的な微細な凝集により測定されるように血清反応性を生ずる外層エンペロープ調製物から成る。これらのワクチン調製物の中の感染防御免疫源の性質は決定的に解明されてはいないが、リポ多糖類上の物質(LLS )が一定の感染防御性を付与するかもしれないことを示唆するいくつかの証拠がある。市販のワクチンは熱またはホルマルリンで殺菌されたレプトスピラ属から成り、不完全なまたはほんの短期間の免疫性しか与えず、年１回または半年に１回投与する必要がある。北アメリカにおける一般的なウシの病原菌であるL.inte rrogans 血液型亜種 hardjo の場合、この方法で調製されたワクチンは効果的ではない(Bolin，C.A．et al.，Am．J．Vet．Res.，50:161-165(1989)and Bolin， C.A.，et al.，Am．J．Vet．Res.，50:2004-2008(1989))。従って、改良されたレプトスピラ属ワクチンを開発する必要に迫られている。レプトスピラ症の病原は、梅毒（Treponema pallidumトレポネーマ・パリドムにより発病）およびライム・ボレリア症（Borrelia burgdorferiにより発病）などの他のスピロヘータによる病気の病原に非常に類似している。梅毒もライム・ボレリア症も病気の初期に、中枢神経系が侵されるなどの広範囲の播種性を特徴とする。レプトスピラ属は他の病原性スピロヘータと共にこの能力を発揮し、その結果として普通レプトスピラ症として発現するのが髄膜炎である。スピロヘータ感染の別の特徴は、第三期梅毒および慢性ライム関節炎の場合に明らかなように、宿主に慢性的に生き残る能力である。脂質が変性された一体化膜蛋白質が広い範囲の細菌の種に確認されている(林, S.,et al.，J．Bioenerg．Biomembr.，22:451-47１(1990))。グラム陰性菌では、これらのリポ蛋白質は３個の脂肪酸残基がN-末端システインに共有結合した後で(Hantke，et al.，Eur．J．Biochem.，34:384-296(1973))、シグナルペプチダーゼII(Pugsley、A．P.，Microbiol．Rev.，57:50-108(1993))により処理される。脂肪酸残基はリポ蛋白質を細胞質膜または外層の膜のいずれかに固定する。リポ蛋白質のポリペプチドの部分は一般に親水性であるが、脂質変性により両親媒性とされ、トリトンX-114 相分割の間に疎水性相に分配される(Chamberlain，N. R.，et al.，Infect. Immun.，57:2872-2877(1989))。リポ蛋白質は、Treponema pallidum(Chamberlain，N.R.，et al.，Infect．Im mun.，57:2872-2877（1989）and Chamberlain，N.R.，et al.，Infect．Immun. ，57:2878-2885(1989))、Treponema denticola(Miyamoto，M., et al.，Infect ．Immun.，59:1941-1947(1991))、Serpulina hyodysenteriae(Thomas，W.，et a l.，Infect. Immun.，61:1136-1140(1993))、Borrelia burgdorferi(Brandt，et al.，Infect．Immun.，58:983-991(1990))、および回帰熱のBorreliae(Burman ，N.，et al.，Mol．Microbiol.，4:1715-1726(1990))などを含む多数のスピロヘータの中に確認された。リポ蛋白質はスピロヘータによる病気の病原において重要な役割を演じているようである。例えば、T．pallidum のリポ蛋白質の多くは強力な体液および細胞の免疫応答を引き出す免疫優性抗原である(Akins，D.R. ，et al.，Infect．Immun., 61:1202-1210(1993))。さらに、Borrelia burgdorf eriの外層の表面蛋白質Ａ(OspA)はライム病の動物モデルにおいて免疫防御性である(Fikrig，E.，et al.，Science，250:553-556(1990))。トリトン X-114は、疎水性洗剤相に分割されたL．kirschneri（以前の、L．al stoniとL．interrogans）の有毒な菌株と減毒された菌株とから得られた材料を溶解し、微生物の外層膜成分から得られたリポ多糖類のような物質(LLS)を含有していた(Haake，D.A.，et al.，Infec tion & Immunity，59:1131-40（1991）)。この研究では、L．kirschneriの有毒な菌株は明白な分子質量30キロダルトン(kDa)を有する LLS成分の含有量を増加させた。もっと後の Haake，D.A.らの出版物には、病原性Leptospira spp のOmp L1(予想分子量31,113Da)の蛋白質を暗号化する遺伝子のクローン化および配列化が開示されている(Haake，D.A.，et al.，J．Bacteriol.，175:4225-4234(1993) )。これは構造的遺伝子がクローン化され配列化されたスピロヘータの最初のトランスメンブラン外層膜蛋白質であるかもしれない。 LeptospiraおよびT.pallidum OMPの同定に関する研究は不成功に終わったが、スピロヘータの外層膜の脆さと外層の膜の例えばドデシル硫酸ナトリウム(SDS) などのイオン性洗浄剤の選択性に欠けていることを考慮する重要性を明らかにした(Cunningham，et al.，J．Bacteriol.，170:5789(1988); Penn，et al.，J．G en．Microbiol.，131:2349(1985); Stamm，et al.，Infect．Immun., 55:2255(1 987))。外層膜蛋白質は、細菌の病原において重要な役割を果たしてるので、極めて重要である。レプトスピラ属（Leptospira）病原に含まれる外層膜蛋白質の同定は、レプトスピラ属外層膜蛋白質とそれらが病原に含まれることを理解するばかりでなく、他のスピロヘータの外層膜蛋白質およびそれらの病原における役割を理解するためにも重要である。発明の要約本発明は２つの新規なレプトスピラ属膜蛋白質：ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２を提供する。特に、これらの蛋白質はレプトスピラ（Leptospira）属の病原菌株と関連するリポ蛋白質である。ＬｉｐＬ１は約35kDa であり、ＬｉｐＬ２は約 4 1kDaである。また、これらの蛋白質をレプトスピラ属から精製成する方法、それらのヌクレオチドやアミノ酸配列、その蛋白質およびそれらの組み替え蛋白質を暗号化する遺伝子のクローンニング、これらの蛋白質に対する抗体の生成方法、およびその結果得られる抗体についても開示される。これらの蛋白質、それらの免疫原断片、およびそれらに結合できる抗体は、病原レプトスピラ属に対する免疫応答を引き起こすばかりでなくレプトスピラ症の診断用標的を提供するのに有用である。図面の簡単な説明図１はＬｉｐＬ１遺伝子を含有する2.3kbのEcoRI断片の部分的制限マップと、ヌクレオチド配列を決定するための戦略を示す。そのＬｉｐＬ１遺伝子は1092塩基対の長さを有する。マップの下の矢印は配列分析の方向と程度を示す。マップの上の文字は以下の制限酵素を示す：EcoRI(E)、PvuII(P)、Bam HI(B)、EcoRV(E v)、Hinc II(Hc)、Hind III(Hd)。図２はＬｉｐＬ１のヌクレオチド配列と導き出されたアミノ酸配列を示す。推定されている−35と−10のプロモータ領域、リボゾーム結合部位(RBS)が示されている。推定されているシグナルペプチダーゼII分裂部位は矢印（↑）で示されている。本来の蛋白質のブドウ球菌V8プロテアーゼ消化から得られたアミノ酸配列にはアンダーラインが引いてある。TAA 停止コドンの位置は星印で示されている。逆の繰り返しは水平な点線矢印で示されている。これはロー値非依存性転写ターミネーターとして機能するかもしれない。図３はＬｉｐＬ１のカイト・ドーリットル疎水性のグラフを示す。図４はＬｉｐＬ２遺伝子を含有する2.25kbのEcoRI 断片の部分的制限マップと、ヌクレオチド配列を決定するための戦略を示す。そのＬｉｐＬ２遺伝子は1065 塩基対の長さを有する。マップの下の矢印は配列分析の方向と程度を示す。マップの上の文字は以下の制限酵素を示す：EcoRI(E)、DraI(D)、HaeII(H)、ScaI(S) 、PuvII(P)、HindIII(Hd)、ClaI(C)、HincII(Hc)、RsaI(R)、SspI(Ssp)。図５はＬｉｐＬ２のヌクレオチド配列と導き出されたアミノ酸配列を示す。推定されている−35と−10のプロモータ領域、リボゾーム結合部位(RBS)が示されている。推定されているシグナルペプチダーゼII分裂部位は矢印（↑）で示されている。本来の蛋白質のブドウ球菌V8プロテアーゼ消化から得られたアミノ酸配列にはアンダーラインが引いてある。TAA 停止コドンの位置は星印で示されている。逆の繰り返しは水平な点線矢印で示されている。これはロー値非依存性転写ターミネーターとして機能するかもしれない。図６はＬｉｐＬ２のカイト・ドーリットル疎水性のグラフを示す。図７は抗ＬｉｐＬ１抗血清を有するＬｉｐＬ１の免疫沈降実験の結果を示す。ＬｉｐＬ１は、L.kirschneriでアシル化される。レーン１：[³H]パルミチン酸塩で本質的に標識された完全なL.kirschneri。レーン２：[³H]パルミチン酸塩で本質的に標識され、トリトンX-100 で抽出され、抗ＬｉｐＬ１抗血清で免疫沈降されたL.kirschneri。図８は抗ＬｉｐＬ１抗血清を有するＬｉｐＬ２の免疫沈降実験の結果を示す。ＬｉｐＬ２は、L.kirschneriでアシル化される。レーン１：[³H]パルミチン酸塩で本質的に標識された完全なL.kirschneri。レーン２：[³H]パルミチン酸塩で本質的に標識され、トリトンX-100 で抽出され、抗ＬｉｐＬ２抗血清で免疫沈降されたL.kirschneri。矢印はＬｉｐＬ２の位置を示す。図９はレプトスピラ種のパネルのクマシーブルー染色SDS-PAGEゲルを示す。L ．interrogans、L．noguchii、L． kirschneri、L．borgpetersenii、L．santar osai、L．weiliiは病原性レプトスピラ(Leptospira)種である。L． biflexa、L ．wolbachii、L．inadaiは、関連微生物のLeptonema illini のように、周知の３つの非病原性レプトスピラ種である。分子サイズ基準の位置は左側に示してある（キロダルトン）。図10は抗ＬｉｐＬ１抗血清を使用するレプトスピラ種のパネルの免疫ブロットを示す。L．interrogans、L．noguchii、L．kirschneri、L．borgpetersenii、L ．santarosai、L．weiliiは病原性レプトスピラ（Leptospira）種である。L．bi flexa、L．wolbachii、L．inadai は、関連微生物のLeptonema illiniのように、周知の３つの非病原性レプトスピラ種である。分子サイズ基準の位置は左側に示してある（キロダルトン）。図11は抗ＬｉｐＬ２抗血清を使用するレプトスピラ種のパネルの免疫ブロットを示す。L．interrogans、L．noguchii、L．kirschneri、L．borgpetersenii、L ．santarosai、L．weiliiは病原性レプトスピラ（Leptospira）種である。L．bi flexa、L．wolbachii、L．inadai は、関連微生物のLeptonema illiniのように、周知の３つの非病原性レプトスピラ種である。分子サイズ基準の位置は左側に示してある（キロダルトン）。図12は、ＬｉｐＬ１が選択的にトリトンX-114 洗剤相に分離する様子を示す。それは抗ＬｉｐＬ１抗血清で探査された培養減毒L.kirschneri微生物の免疫ブロットを示す。分析された分画は完全な微生物（Ｗ）とトリトンX-114 不溶解性ペレット（Ｐ）、水性相（Ａ）および洗剤相（Ｄ）材料である。分子サイズ標準の位置は左側に示してある（キロダルトン）。図13は、ＬｉｐＬ２が選択的にトリトンX-114 洗剤相に分離する様子を示す。それはＬｉｐＬ２抗血清で探査された培養減責L．kirsc hneri 微生物の免疫ブロットを示す。分析された分画は完全な微生物（Ｗ）とトリトンX-114 不溶解性ペレット（Ｐ）、水性相（Ａ）および洗剤相（Ｄ）材料である。分子サイズ標準の位置は左側に示してある（キロダルトン）。発明の詳細な説明本発明は２つの新規なレプトスピラ属膜蛋白質、ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２を提供する。特に、これらの蛋白質はレプトスピラ（Leptospira）属の病原菌株と関連するリポ蛋白質である。ＬｉｐＬ１は約35kDa であり、ＬｉｐＬ２は約41 kDa である。またこれらの蛋白質をレプトスピラ属から精製する方法、それらのヌクレオチドやアミノ酸配列、その蛋白質およびそれらの組み替え蛋白質を暗号化する遺伝子のクローン化、これらの蛋白質に対する抗体の生成方法、およびその結果得られる抗体についても開示される。これらの蛋白質、それらの免疫原断片、およびそれらに結合できる抗体は、病原レプトスピラ属に対する免疫応答を引き起こすばかりでなくレプトスピラ症の診断用標的を提供するのに有用である。ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２はそれらの論理的に推理されたアミノ酸配列の配列分析に基づいて、アミノ末端脂質が変性されたと思われる。両方とも、信号ペプチドの後にL-X-Y-CシグナルペプチダーゼII分裂部位がある。ＬｉｐＬ１は、L eputospira kirschneriトリトンX-114 抽出物中の洗剤相に認められた最も豊富な蛋白質である。ＬｉｐＬ１の回収は洗剤を溶解する間にプロテアーゼ阻害剤の存在を必要とする。ＬｉｐＬ２は表面免疫沈降研究において潜在的な膜蛋白質として同定され、また顕著なトリトンX-11 4 洗剤相蛋白質である。ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２は一体化膜蛋白質である。特定のウサギの抗血清を生成するために組み替えＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２融解蛋白質が大腸菌で産出された。いずれのリポ蛋白質も大部分の病原性レプトスピラ種により産出される。産出されたＬｉｐＬ１の量はレプトスピラ種間で様々であるが、ＬｉｐＬ２の発現は高度に維持される。ＬｉｐＬ１の分子量は約35-4 0kDaの範囲で変動した（例えば、図10参照）。ＬｉｐＬ２の分子量は変化せず、 41±１kDa であった（例えば、図11参照）。ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２は、下記の実施例のところで説明する、ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２に対して高められた抗体との免疫反応性によって、様々なレプトスピラ属中において同定できる。その蛋白質は様々なレプトスピラ属から精製でき、それらのＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２は、実施例のところで説明する方法により、実施例のＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２で免疫化された動物により高められた抗血清との免疫反応性によって同定される。これらの蛋白質は病原性レプトスピラ属に免疫応答を引き起こすための製薬組成物として有用であるばかりでなく、レプトスピラ症を診断するための標的を提供するものとしても有用である。ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図２と図５に示されており、下記の通り、配列同定番号（SEQ ID NO）として同定される。表１の配列は天然の配列と合成の配列の両方を含む。別途修正しない限り、ここで使用されている「蛋白質」という用語は天然と合成の両方のポリペプチドとペプチドを包含する。合成蛋白質には組み替え蛋白質と化学的に合成された蛋白質とが包含される。別途指示がない限り、「ＬｉｐＬ１」および「ＬｉｐＬ２」の蛋白質は天然および合成蛋白質の両方を包含する。表１および図２と図５に開示されたヌクレオチド配列はDNA の形である。しかし、開示された配列に基づき、当該技術に精通した者なら、それらの相補的 DNA およびRNA配列、および前記のものに対する相補的なRNAを決定することができるはずである。従って、「ヌクレオチド配列」という用語はDNAとRNAの両方の配列を包含する。さらに、この出願および特許請求の範囲で使用されているように、配列同定番号および開示されたヌクレオチド配列としては、（１）開示されたとおりのDNA配列、（２）開示された配列に対して相補的なヌクレオチド配列(RNA またはDNA かもしれない)、（３）開示されたDNA 配列中のチミジン("T")がウラシル("U")と置換されている場合のリストに挙げられたDNA配列に対応するRNA配列、（４）当該技術において周知の他のヌクレオチド、例えばヌクレオチド類似体が前記配列において代わりに使用されている配列、例えば、シトシンの代わりに５ーメチルーシトシンが使用されているヌクレオチド配列、および（５）それぞれの配列同定番号または開示されたヌクレオチド配列を10% 以内変更したヌクレオチド配列、が含まれる。ヌクレオチドコドンは重複しているので、等しいヌクレオチド配列も本発明の範囲内であり、ＬｉｐＬ１、ＬｉｐＬ２、それらの蛋白質変性物、機能的に同等のもの、または誘導体に暗号化するまたは翻訳できるヌクレオチド配列が含まれる。また、これらのヌクレオチド配列を本発明を実施する際に使用してもよい。上記の他に、ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２のヌクレオチド配列として、（１）最も厳しい交雑条件下でそれぞれのヌクレオチド配列の暗号化配列に交雑することのできるヌクレオチド配列、および（２）ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２それぞれの同じ生物学的特徴／活性を実質的に有する蛋白質を暗号化する配列同定番号１、２、４、５の断片も挙げられる。決定力のある生物学的特徴／活性が少なくとも１個の免疫エピトープを保持しているのが好ましい。レプトスピラ属に関する免疫検定法において使用される場合には、これらの蛋白質はレプトスピラ属に関する抗体で免疫反応性を示すが、生物試料に認められる非レプトスピラ属の特定の抗体で検出できるような免疫反応は示さないことが好ましい。ここに定義されるように、「生物試料」は生物体液または組織の試料である。生物体液試料の例としては、血液、血清、血漿、涙、乳、尿、脳脊髄液が挙げられる。生物組織試料の例としては、肝臓および腎臓由来の組織試料および内皮起始の細胞が挙げられる。生物試料には糞便および排泄物も含まれる。従って、例えば、これらの組織試料について免疫組織化学検定法を行うこともできる。これらの試料はヒト、野性および家畜の哺乳類のような哺乳類のものが好ましい。これらの蛋白質および免疫検定法が、さらに病原性レプトスピラ属と非病原性レプトスピラ属とを区別できることがより好ましい。あるいは、ヌクレオチド配列の断片が少なくとも10ヌクレオチドの長さのヌクレオチド・プローブであってもよい。これらのプローブがレプトスピラ属について交雑検定法で使用される場合、中位から最も厳しい交雑条件下では、生物試料中に認められる非レプトスピラ微生物のヌクレオチド配列に検出可能な程度に交雑されないことが好ましい。あるいは、ヌクレオチド配列は上記ヌクレオチド配列の暗号化配列において少なくとも10個の連続的ヌクレオチドに交雑する。ヌクレオチド配列には、少なくとも８個、さらに好ましくは５個から６個、最も好ましくは４個のアミノ酸を含有する蛋白質を暗号化するヌクレオチド配列が含まれる。この蛋白質はレプトスピラ属に特定のものであるか、あるいは１個以上のレプトスピラ属の生物機能を保持していることが好ましい。これらのヌクレオチド配列および交雑検定法により、さらに病原性レプトスピラ属と非病原性レプトスピラ属を区別できることが最も好ましい。「ＬｉｐＬ１」および「ＬｉｐＬ２」という用語は、それぞれ上記表１、図２、図５において定義されているように蛋白質に関連して使用されており、下記のものを有する、すなわち（１）それぞれ、そのシグナルペプチドを除いた、配列同定番号３と６の配列に適合するそれぞれのアミノ酸の少なくとも95% を有するアミノ酸配列を含有する蛋白質変異体；（２）それぞれの蛋白質およびその変異体と機能が同等のもの；および（３）ＬｉｐＬ１、ＬｉｐＬ２蛋白質およびその変異体の断片をそれぞれ含む誘導体。レプトスピラ属の免疫検定で使用される場合、これらの蛋白質は、レプトスピラ属に関する抗体と免疫反応を示すが、生物試料中に認められる非レプトスピラ属の特定の抗体とは検出できるほどの免疫反応を示さないことが好ましい。これらの蛋白色および免疫検査により、さらに病原性レプトスピラ属と非病原性レプトスピラ属を区別できることがより好ましい。これらの蛋白質はレプトスピラ属に特定のものであるか、あるいは１個以上のレプトスピラ属の生物機能を保持していることが好ましい。従って、この出願で請求される断片は好ましくはレプトスピラ属、さらに好ましくは病原性レプトスピラ属の少なくとも１個の免疫原エピトープを含有する。さらに好ましくは、この断片はレプトスピラ属に関する多クローン性抗体により結合されることができる。線状のエピトープを認識する抗体の場合は、一般に約３個から１０個のアミノ酸により限定されるエピトープに結合する。あるいは、またはさらに、これらの蛋白質は蛋白質のワクチン注射をされた動物において細胞および／または体液の反応を起こす能力を有するのが好ましい。さらに好ましくは、この細胞および／または体液の反応はレプトスピラ属、特に病原性レプトスピラ属に向けられる。これらの蛋白質のワクチンを注射された動物はレプトスピラ症に対して免疫を有するようになるか、このようなワクチン接種により感染した動物の病気が改善されることが最も好ましい。動物は哺乳類であるのが好ましい。この動物はヒトまたは家畜であるのがさらに好ましい。あるいは、これらの蛋白質またはそのアミノ酸配列はレプトスピラ属の膜蛋白質から誘導され、下記の実施例で開示されるＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２に対して高められた抗体と免疫反応を示すことが好ましい。その変異体は表１に示されるアミノ酸配列の例えば置換、挿入または削除から得ることができる。蛋白質の誘導体およびその変異体はこれらの蛋白質の断片およびそれらの免疫原エピトープを含有する。既に説明したように、各変異体は好ましくはレプトスピラ属およびさらに好ましくは病原性レプトスピラ属の少なくとも１個の免疫エピトープを保持する。免疫エピトープはレプトスピラ属に特定であることが好ましく、病原性レプトスピラ属に対して特定であることがさらに好ましい。２つのアミノ酸配列は、例えば蛋白質のワクチン注射をされた動物に細胞および／または体液の反応を起こす能力などの実質的に同じ生物活性を有するなら、機能は同等である。この蛋白質は他の蛋白質に融合され、例えば、シグナル配列融合はＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２蛋白質の分泌をさらに迅速に導くために使用される。さらに、ＬｉｐＬ１はＬｉｐＬ２に融合されてもよい。これらの融合蛋白質を暗号化するヌクレオチド配列もまた本発明に包含される。非対応シグナルは天然のＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２のシグナルにとって代わり、得られた融合が認識されると、すなわち宿主の細胞により処理され分裂されると、Ｌｉｐ１またはＬｉｐＬ２の蛋白質が分泌される。シグナルは目的の宿主細胞に基づいて選択され、細胞、酵母、昆虫およびウイルスの配列を含有していてもよい。ここに開示された蛋白質の代理の変異体は開示された配列の少なくとも１つの残基が取り除かれ、別の残基がその位置に挿入されたものである。アミノ酸の変化は保守的であるのが好ましい。従って、ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２の主要なアミノ酸配列の変更も保守的変更が好ましい。ここで使用する「保守的変更」という用語は、アミノ酸残基を生物学的に類似の別の残基と置き換えることを意味する。保守的な変更の例としては、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１個の疎水性残基を別の残基と置換すること、または１個の極性残基を別の極性残基と置換すること、例えばアルギニンをリシンと、グルタミン酸をアスパラギン酸と、グルタミンをアスパラギンと置換するなどの例が挙げられる。「保守的な変更」という用語はまた、置換されたポリペプチドに対して高められた抗体が置換されなかったポリペプチドとも免疫反応する場合に、置換されなかった親のアミノ酸の位置に置換されたアミノ酸を使用することも包む。さらに、全ての蛋白質がそうであるように、正確な化学的構造は多くの因子により左右される。イオン化可能なアミノ基およびカルボキシル基が分子中に存在するので、特別な蛋白質は酸性または塩基性塩としてまたは中性の形で得られるかもしれない。適当な環境条件におかれたときにその活性を保持するような調製物全てがこの定義に含まれる。さらに、主要なアミノ酸配列は、糖部分を使って誘導すること（糖化）により、または脂質、燐酸塩、アセチル基などの他の相補的分子により、またはさらに一般的には糖類との共役により増加させてもよい。主要なアミノ酸構造は集まって複合体、最も頻繁には２量体を形成するかもしれない。このような増加の態様は生成宿主の翻訳後の処理系により達成される。他のこのような変更はin vitro（試験管内）に導入されてもよい。ともかく、このような変更物は蛋白質の活性が破壊されない限り前記定義に包含される。このような変更物は様々な検定法において蛋白質の活性を増大または減少させることにより定量的または定性的にその活性に影響を与えると期待される。連鎖中の個々のアミノ酸残基も酸化、還元、または他の誘導化により変更されるかもしれないし、蛋白質は分割され、活性を保持する断片を得るかもしれない。活性を破壊しないこのような変更物は定義から蛋白質の配列を取り除かない。以下、実施例によりさらに詳細に変更物のいくつかを考察する。従って、糖化変異体はＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２の範囲内に含まれる。完全に糖化の欠けている（糖化されなかった）変異体、および、天然の形より少なくとも１個糖化位置が少ない変異体（脱糖化）ばかりでなく、糖化が変えられた変異体も含まれる。本発明には、組み替えDNA 法を使用してレプトスピラ属の膜リポ蛋白質を製造する方法も包含される。組み替えＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２融合蛋白質は大腸菌(E .coli)において生成された。これらの蛋白質は哺乳類を免疫化して抗血清を生成するために使用できる。L．kirschneri のＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２の蛋白質の遺伝子はプラスミドベクターにクローン化され、次に大腸菌を形質転換するために使用された。病原性レプトスピラ種の間に発現するＬｉｐＬ２の分子量と量はかなり一定している。それに対して、ＬｉｐＬ１は大部分のレプトスピラ属病原により生成されるが、得られたＬｉｐＬ１の分子量および量は一様ではない。ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２に対する抗血清について、レプトスピラ属の病原性と反応性との間には強い相関性があった。これは特にＬｉｐＬ２について言えることで、ＬｉｐＬ２はL.interrogans、L.noguchii、L.kirschneri、L.borgpetersenii、L .santarosai、L.weiliiなどの病原性レプトスピラ種の全ての菌株において検出されたが、非病原性のレプトスピラ種であるL.biflexa、L.wolbachii、L.inadai および関連の微生物のLeptonema illiniおいては検出されなかった。ＬｉｐＬ１は大部分の病原性レプトスピラ種において検出されたが、非病原性のレプトスピラ種であるL.biflexa、L.wolbachii、L.inadaiおよび関連の微生物のLe ptonema illiniでは検出されなかった。これは、ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２は、種とは関わりなく病原性レプトスピラ属の間に発現されるばかりでなく、抗原性が保存されており、従って、これらの蛋白質は優れたワクチンの候補であるばかりでなく、レプトスピラ症の診断のためのマーカー抗原となることを示している。非イオン性洗剤のトリトンX-114(TX-114)を使用してL.kirschneri の全細胞から蛋白質を抽出することにより、ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２の蛋白質の洗剤層蛋白質を含むかなりの数の蛋白質が溶解された。全てのL.kirschneriに対して高められた抗血清を使用する表面免疫沈降を用いて、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を弱める分画を生成した。次に、電気泳動にかけた分画は配列する膜に移され、35kDaと41kDaの蛋白質のN-末端配列がそれぞれ決定された。N-末端アミノ酸配列に基づいて、２つの変性オリゴヌクレオチド・プローブが各蛋白質について合成された。L.kirschneriのゲノムDNA ライブラリーがオリゴヌクレオチドで探査され、挿入物がＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２の暗号化配列をそれぞれ含有していると同定された。配列の分析により、ＬｉｐＬ１構造遺伝子は３６４アミノ酸の蛋白質を暗号化する1092塩基から成ることが明らかにされた。内側の膜を越えて運び出されるリポ蛋白質について期待されるように、推定されたアミノ酸配列は20残基信号ペプチドで始まる。ＬｉｐＬ１構造遺伝子は355 アミノ酸の蛋白質を暗号化する1065の塩基から成る。内側の膜を越えて運び出されるリポ蛋白質について期待されるように、推定されたアミノ酸配列は19残基信号ペプチドで始まる。免疫ブロット研究により、レプトスピラ病原性とＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２に対する抗血清との反応性との間には強い相関性があることが明らかにされた。ＬｉｐＬ２は試験された病原性レプトスピラ属の全ての菌株と反応したが、試験されたレプトスピラ属の全ての非病原性菌株とは反応しなかった。ＬｉｐＬ１は試験された病原性レプトスピラ属のほとんどの菌株と反応したが、試験されたレプトスピラ属の全ての非病原性菌株とは反応しなかった。L.inadaiにおいて少量の反応性があったが、L.biflexa、L.wolbachiiまたはL.illiniにおいては41kDa の抗原は全く検出されなかった（図11）。ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２の膜蛋白質のための細菌の遺伝子は病原性レプトスピラ属のどの菌株からも誘導できる。この蛋白質は Leptospira kirschneri、血液型亜種grippotyphosaから得られるのが好ましい。本発明は、レプトスピラ属のＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の蛋白質を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドには該蛋白質を暗号化するDN AとRNAの配列が含まれる。既に考察したように、ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２の全てまたは一部を暗号化する全てのポリヌクレオチドも、例えば抗体を誘導するまたは結合する能力などのＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２の機能を示す限り、ここに含まれることは言うまでもない。このようなポリヌクレオチドには、自然に発生するものと意図的に増幅されたもの例えば突然変異を起こさせたポリヌクレオチド、の両者が含まれる。本発明のDNA 配列はいくつかの方法により得られる。例えば、当該技術において周知の交雑方法を使ってDNA を単離してもよい。これらの方法には、（１）分配されたヌクレオチド配列を検出するためにゲノムライブラリーにプローブを交雑すること、および（２）分配された構造特徴を検出するために発現ライブラリーの抗体審査をすることが含まれるが、それに限定されるものではない。交雑方法は標識を付けられた混合合成オリゴヌクレオチドプローブを使って組み換えクローンの審査（スクリーニング）をするのに有用であり、その場合、各プローブは、もしかすると変性二重ストランドDNA の不均質混合物を含む交雑試料における特定のDNA 配列の完全な補体である。このような審査には、交雑は好ましくは単一ストランドのDNAまたは変性二重ストランドのDNAのいずれかにおいて実施される。非特定の結合を避けるように方向付けられた厳しい交雑条件を使うことによって、例えば、その完全な補体である混合物中の単一のプローブに標的DNAを交雑することにより、特定のDNAクローンのオートラジオグラフィー視覚化が可能である(Wa llace，et al.，Nucleic Acid Research，9:879(1981))。あるいは、ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２に対する抗体を使って、少なくとも１つのエピトープを有するＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２ペプチドについて、間接的に発現ライブラリーの審査を行うことができる。このような抗体は多クローンまたは単クローンのいずれかとして誘導でき、ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２のDNA の存在を示す発現産出物を検出するために使用できる。一般に、ラムダgtllライブラリーはフインらの方法に従って免疫学的に構成され、審査される(Huynh，et al，in DNA Cloning：A Practical Approach，D.M．Glover，ed.，1:49(1985))。ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２を暗号化する特定のDNA 配列の開発も、（１）ゲノム DNAから二重ストランドDNA配列の単離、および（２）問題のポリペプチドに必要なコドンを提供するためのDNA 配列の化学的製造により得られる。ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２を暗号化するDNA 配列は適当な宿主細胞にDNA転写することによりin vitro で発現できる。「組み替え宿主細胞」または「宿主細胞」とは、ベクターが増殖され、そのDNA が発現される細胞のことである。その用語は対象の宿主細胞の子孫も含む。複製で発生する突然変異体があるかもしれないので、全ての子孫が親細胞に等しいとは限らないことは言うまでもない。しかし、このような子孫は前記用語が使用される場合に包含される。本発明で使用される「宿主細胞」という用語は原核生物ばかりでなく、酵母、糸状菌などの真核生物や植物、動物の細胞も含むものである。「原核生物」という用語は、レプトスピラ属のＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２の外層膜蛋白質の発現用の遺伝子で形質転換できる全ての細菌を含むものである。原核生物の宿主にはグラム陰性菌ばかりでなくグラム陽性菌の例えば大腸菌、連鎖球菌（s.typhimurium ）、枯草菌なども含まれる。ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２蛋白質のための遺伝子を指定する組み替え DNA分子を用いて、当該技術において普通の技術を有するものに一般的に知られている任意の方法で宿主の形質転換をすることができる。特に好ましいのは、原核生物の形質転換を行う目的のためにＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２の遺伝子の暗号化配列を含有するプラスミドの使用である。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、DNA を取り込むことのできる補体細胞は指数関数的成長相の後で収穫され、その後で当該技術分野で周知のCaCl₂方法により処理された細胞から調製できる。代わりの方法として、MgCl₂またはRbClが使用できる。宿主細胞の原形質体を形成した後で、形質転換も行うことができる。本発明において、ＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２の配列は組み替え発現ベクターに挿入されてもよい。「組み替え発現ベクター」という用語は当該技術において公知のプラスミド、ウイルスまたは他の担体を指し、これはＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２の遺伝子配列の挿入または混入により操作される。このような発現ベクターは宿主に挿入された遺伝子配列の効果的な転写を容易にするプロモーター配列を含んでいる。一般に、発現ベクターは複製の源、プロモーター、ならびに形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特定の遺伝子を含んでいる。形質転換された原核生物宿主は当該技術で周知の手段により培養されて、最適な細胞の成長を達成できる。酵母に異物の遺伝子を発現させるための様々なシャトル担体が報告されている(Heinemann，et al.，Nature，340:20 5(1989);Rose，et al.，Gene，60:237(1987))。宿主に発現と複製を可能にする生物学的機能性を有するDNAベクターは当該技術において周知である。このようなベクターが本発明のDNA配列を組み込むために使用される。融合され、操作可能に結合された遺伝子を調製しそれらを細菌に発現させる方法は周知であり、例えば、参考文献としてここに取り入れてある米国特許第4,36 6,246号に示されている。そこで説明されている遺伝子の構造および方法を用いて、原核生物の宿主にレプトスピラ属のＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２を発現させることができる。本発明で使用できるプロモーターの例としては、recA、trp、lac、tac、バクテリオファージのラムダP_RまたはP_Lが挙げられる。本発明で使用できるプラスミドの例はサンブルックらの文献中に挙げている(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor L aboratories，1982))。本発明において提供される抗体はＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２の蛋白質と免疫反応性を有する。これらの抗体は多クローン性抗体または単クローン性抗体である。多クローン性抗体は当該技術で周知の方法、例えば、動物にＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２の蛋白質のワクチンを接種し、ＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２に対して向けられたその動物の抗血清を収集し精製する方法などにより生成できる。単一特異性多クローン性抗体も当該技術に周知の方法を使って生成できる。異なるエピトープ特異性を有する単クローン性抗体を集めたものから本来構成される抗体ばかりでなく、個々の単クローン性抗体の調製物も提供される。単クローン性抗体は、当該技術に周知の方法により、蛋白質の断片を含有する抗原から作られる(Kohler，et al.，Nature，256:495(1975); Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，et al.，ed.，(1989))。例えば、単クローン性抗体はコーラー(Kohler)およびミルスタイン(Milstein)（Nature，256:495-497(1975)）の方法により、免疫原またはその断片を接種された動物から得た脾臓細胞を、通常は接種を施された動物と同じまたは異なる種の不滅の細胞系（好ましくは、骨髄腫細胞系）と融合させた後で適当なクローン化および審査の工程により不滅化することにより得られる。抗体はまた、リーディングによる米国特許番号4,474,893 またはカビリーらによる米国特許番号4,816,567 に開示された方法により製造された組み替え単クローン性抗体でもよい。抗体はまた、シーゲルらの米国特許番号4,676,980 に開示された方法により化学的に構成されてもよい。本発明で使用されるように、抗体または免疫グロブリンという用語には、ＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２に対してエピトープ決定子を結合できる、例えばFab，F (ab')₂、 Fvおよび単一鎖抗体(SCA)などの無傷で完全な分子ばかりでなくその断片も含まれる。単一鎖抗体は遺伝子工学により融合された単一の鎖分子であり、軽い鎖の可変性の領域と適当なポリペプチド結合子により結合された重い鎖の可変性領域を含む。これらの断片を生成する方法は当該技術において周知である。例えば、Harlow and Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Ha rbor Labortory，New York(1988)を参照のこと。既に考察したように、ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の主要なアミノ酸配列の少数の変更修正により、説明されたＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２蛋白質と実質的に等しい機能を有する蛋白質が得られる。このような変更は特定部位の突然変異誘発によるなど計画的でもよいし、または自然発生的でもよい。これらの変更修正により得られた全ての蛋白質は、ＬｉｐＬ１とＬｉｐＬ２の機能が存在する限り、本発明に含まれる。微生物により発現された蛋白質またはその断片の単離と精製が本発明により提供されるが、予備的クロマトグラフィおよび単クローン性または多クローン性抗体を伴う免疫学的分離を含む従来の手段により実施されてもよい。本発明は、既に説明した方法により、または当該技術分野で普通の技術を有する者なら一般的に知られている、例えば、溶原ファージを使用する遺伝子材料の転写などの他の方法により変性された、宿主の変性蛋白質も包含するものであり、これによってＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２蛋白質のためにレプトスピラ属遺伝子を発現する原核生物が得られる。ＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２蛋白質を暗号化するレプトスピラ属遺伝子で形質転換された原核生物は動物の免疫化のために使用できる蛋白質の製造に特に有用である。１つの実施態様において、本発明は、製薬用に認められる担体にＬｉｐＬ１および／またはＬｉｐＬ２蛋白質の免疫学的に有効な量を含有する、動物中の病原性レプトスピラ属に免疫応答を引き起こすのに有用な製薬組成物を提供する。本発明を説明する場合に使用される、「免疫学的に有効な量」という用語は、動物にレプトスピラ属に対する免疫応答を発生させるのに必要なレプトスピラ属抗原の量を意味するものとする。ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２は、結果的に、レプトスピラ属感染の影響を改善する免疫応答が得られるように動物の免疫系を敏感にさせるのに特に有用である。ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の蛋白質、すなわちその変異体、機能が同等のもの、および誘導体はレプトスピラ症に対する有効なワクチンであり、ボリンらおよびベイらの方法（Bolin，C.A.，et al.，Am．J．Vet．Res., 52:1639-1643(19 91)およびBey，R.F.，et al.，Infect. Immun.，10:1051-1056(1974)を使用するために審査することができる。これらの参考文献に開示されたワクチン方法も、ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の蛋白質を動物にワクチン接種するのに使用することができる。ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の蛋白質は単独でまたは組み合わせて、例えば非経口的に注射、急速点滴、鼻咽喉吸収、皮膚吸収および例えば経口的に腸溶性に投与できる。非経口的投与のための製薬として認められる担体調製物としては、無菌のまたは水性のまたは非水性の溶液、懸濁液および乳濁液が挙げられる。非水性の溶剤の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。閉塞作用の包帯用の担体は皮膚の透過性を増加し、抗原吸収を増大するために使用できる。経口投与のための液体投薬の形は一般に液体投薬の形を有するリポゾーム溶液から構成されてもよい。リポゾームを懸濁するための適当な形としては、乳濁液、懸濁液、溶液、シロップ、および当該技術において一般に使用される例えば精製水などの不活性希釈液を含有するエリキシルが挙げられる。不活性希釈液の他に、このような組成物にはまた補助剤（アジュバント）、湿潤剤、乳化懸濁剤、甘味剤、調味料および香料なども添加できる。例えば、組み替え細菌およびウイルスが発現するＬｉｐＬ１および／またはＬｉｐＬ２は、上記組成物中においてワクチンとして使用でき、例えば経口的に投与できる。このワクチンはまたげっ歯類などのレプトスピラ属の潜在的保菌者に対する餌に加えて、その動物がレプトスピラ属に感染せず、レプトスピラ属やその病気をヒトや他の動物、例えば家畜など、に蔓延させる保菌者とならないようにすることができる。本発明のＬｉｐＬ１および／またはＬｉｐＬ２蛋白質を含有する抗原調製物がアジュバントを含むことも可能である。アジュバントは特定の免疫応答を非特異的に増加させるために使用できる物質である。通常は、アジュバントおよび抗原を免疫系の発現前に混合するか、または別個であるが、免疫感作させようとする動物の同じ部位の中で発現させる。アジュバントは組成により、大まかに数群に分類することができる。これらの群には、油アジュバント（例えば、フロイント完全および不完全アジュバント）、鉱物塩類（例えば、ＡｌＫ(ＳＯ₄)₂、ＡｌＮａ(ＳＯ₄)₂、ＡｌＮＨ₄(ＳＯ₄)、シリカ、明礬、Ａｌ(ＯＨ)₃、Ｃａ₃(ＰＯ₄)₂、カオリン、および炭素）、ポリヌクレオチド類（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸類）並びにある種の天然物質（例えば、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)からのワックスＤ、並びにジフテリア菌(Corynebacterium parvum)、百日咳菌(Bordetella pertussis)の中で見られる物質、およびブルセラ(Brucella)属の員）が包含される。別の態様では、動物において病原性レプトスピラに対する免疫応答を誘発する方法が提供される。複数の免疫化法が使用される時には免疫感作の時機に関する多くの技術が存在する。免疫感作された動物の免疫応答の発現の水準および多様性を増加させるために本発明の抗原調製物を１回より多く使用することが可能である。典型的には、複数の免疫感作を行う場合には、２〜４週間の間隔を置いて行う。レプトスピラに対する免疫応答が望まれる対象にはレプトスピラ感染症に敏感なすべての動物が含まれる。動物は好適には哺乳動物である。哺乳動物の例としては、ヒト、飼育および野生哺乳動物があげられる。飼育哺乳動物には、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、バッファロー、などの家畜およびイヌなどのペットが包含まれる。一般的には、動物に投与されるＬｉｐＬ１および／またはＬｉｐＬ２蛋白質の投与量は年令、状態、性、およびあるとしたら疾病の程度の如き要素、並びに当技術の専門家により調節可能な他の変数に依存して変わる。本発明の抗原調製物は単一の投与または複数の投与で用いることができ、例えばレプトスピラＬｉｐＬ１および／またはＬｉｐＬ２抗原に関しては１回の投与当たり約１０μｇ〜約１，０００μｇ、より好適には１回の投与当たり約５０μｇ〜約７００μｇのＬｉｐＬ１および／またはＬｉｐＬ２抗原、最も好適には１回の投与当たり約５０μｇ〜約３００μｇのＬｉｐＬ１および／またはＬｉｐＬ２抗原、で変動することができる。免疫療法用に使用される時には、本発明の抗体、好適にはモノクローン性の抗体すなわちＳＣＡ、は標識が付けられていなくてもよいし、治療剤で標識が付けられていてもよい。これらの剤は本発明の抗体と直接的にまたは間接的に結合できる。直接的結合の一例はスペーサー部分の使用によるものである。これらのスペーサー部分は不溶性であってもまたは可溶性であってもよく｛Diener，et al. ，Science，231:148(1986)｝、また薬品が目標部位で抗体分子から放出できるように選択できる。免疫療法用に抗体と結合できる治療剤の例は薬品、放射性同位体、レクチン類、およびトキシン類である。標識が付けられたかまたは標識が付けられていない抗体を上記のような治療剤と組み合わせて使用することもできる。抗体および免疫調節剤並びに他の生物学的応答条件剤を含む治療用組成物が特に好適である。ここに記載されているような種々の治療剤と抗体を組み合わせて使用する時には、抗体および治療剤の投与は実質的に同時に行うのが普通である。「実質的に同時に」という用語は抗体および治療剤が時期に関してかなり近接して投与されることを意味する。一般的には、治療剤を抗体の前に投与することが好ましい。例えば、治療剤を抗体の１〜６日前に投与してもよい。治療剤の投与は、例えば障害の性質、患者の状態および治療剤の半減期の如き要素により、毎日であってもよいし、別の間隔であってもよい。抗体を投与する投与量範囲は、レプトスピラ病の開始兆候が改善されるという望ましい効果を生ずるのに十分な大きさのものである。投与量は望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの如き有害な副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般的には、投与量は患者の年令、状態、性および疾病の程度に応じて変動するであろうし、当技術の専門家が決めることができる。投与量は１日当たり１回もしくはそれ以上の投与回数で、１日または数日にわたり、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０００ｍｇ／ｋｇ、好適には約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇで変動できる。一般的には、抗体が治療剤と一緒に結合されて投与される時には、インビボ診断イメージング用に使用されるものと比べて低い投与量を使用することができる。抗体は注射により、または時間をかけて徐々に注入することにより非経口的に投与することができる。抗体は静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、体腔内に、または経皮的に、単独でまたはエフェクター細胞と組み合わせて、投与することができる。非経口的投与用調製物には、殺菌性の水性または非水性溶液、懸濁液、および乳濁液が包含される。非水性溶媒の例としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、および例えばオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステル類がある。水性担体には、水、食塩水および緩衝媒体を含むアルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液がある。非経口的賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムが、乳酸処理されたリンゲル静脈内賦形剤には流体および養分補充剤、電解質補充剤（例えばリンゲルデキストロースを基にしたもの）などが包含される。防腐剤および他の添加剤、例えば好適には単離されているかまたは実質的に純粋な、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性気体、などが存在していてもよい。ここに開示されている、好適には単離されているか実質的に純粋である組成物、核酸配列、それらの突然変異配列またはそれらの断片を使用して動物を予防接種することもでき、それらは直接注射してもよいし、プラスミド中に加え動物に注射してもよい。注射前に核酸配列を製薬用に認められる担体と混合してもよい。注射は、Yang，N.-S．et al.，Gene Therapy via Particle Bombardment: App lications of the Accell Gene Gun, in Gene Therapeutics: Methods and Appl ications of Direct Gene Transfer，Wolff，J．A.，ed.，Birkhauser，USA（1994）に記載されているような遺伝子銃を用いて行ってもよい。別の態様では、本発明は細胞成分をこの細胞成分と結合する試薬と接触させることを含む、病原性レプトスピラ−関連疾病を対象中に検出する方法を提供する。細胞成分はＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸であってもよいし、蛋白質であってもよい。成分が核酸である時には、試薬は核酸プローブまたはＰＣＲプライマーである。細胞成分が蛋白質である時には、試薬は抗体プローブである。これらのプローブは検出できるように、例えば放射性同位体である蛍光化合物、生蛍光化合物、化学蛍光化合物、金属キレーターまたは酵素で標識が付られている。当技術の一般的知識を有する者であれば抗体との結合用の他の適当な標識を知っているであろうし、または一般的な実験によりそれを確認することができよう。本発明の目的のためには、ＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２に特異的な抗体または核酸プローブを使用して各々のＬｉｐＬ１もしくはＬｉｐＬ２蛋白質（抗体を使用）またはポリヌクレオチド（核酸プローブを使用）の存在を検出することができる。検出可能量のＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２抗原またはポリヌクレオチドを含有する任意の試料を使用することができる。本発明の好適な試料は生物学的流体または組織サンプルである。生物学的流体サンプルの好適な例には、血液、血清、血漿、涙、乳、尿、および脳−脊髄流体がある。生物学的組織サンプルの好適な例には、肝臓および腎臓からの組織サンプル並びに内皮起源の組織がある。細胞成分が核酸である時には、レプトスピラ特異的プローブと結合する前に核酸を増殖させる必要があるかもしれない。好適にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用されるが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結された活性化転写（ＬＡＴ）および核酸配列を基にした増殖（ＮＡＳＢＡ）の如き他の核酸増殖方法を使用してもよい。より大きい感度を生ずるかもしれない他の技術は、抗体を低分子量ヘプテン類と結合することからなっている。そうすればこれらのヘプテン類を第二の反応により特異的に検出することができる。例えば、アビチンと反応するビオチン、ジニトロフェニル、ピリドキサル、および特異的な抗ヘプテン抗体と反応できるフルオレセインの如きヘプテン類を使用するのが一般的である。或いは、ＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２蛋白質を使用して試料中のＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２蛋白質に対するそれぞれの抗体を検出することもできる。本発明のＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２は免疫検定中の使用に特に適しており、そこではそれらを液相で使用するか、固相担体と結合させることができる。さらに、これらの検定で使用されるＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２は種々の方法で検出可能に標識を付けることができる。本発明のＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２を利用できる免疫検定法の例は、直接または間接方式のいずれかの競合的および非競合的免疫検定法である。そのような免疫検定法の例は放射免疫検定法（ＲＩＡ）、サンドイッチ法（免疫計検定法）およびウェスターンブロット検定法である。本発明のＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２と結合する抗体の検出は、生物学的サンプルに対する免疫歴化学検定を含む前進、逆転、または同時方式で操作される免疫検定法を使用して行うことができる。ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の使用濃度は免疫検定法のタイプおよび使用する検出可能な標識の性質に依存して変動するであろう。しかしながら、使用する免疫検定法のタイプとは無関係に、ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の使用濃度は当技術の専門家により一般的な実験を用いて容易に決めることができる。本発明のＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２は多種の担体と結合でき、またポリペプチドと特異的に反応性の抗体の存在を検出するために使用できる。公知の担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース類、天然および改質セルロース類、ポリアクリルアミド類、アガロース類、および磁鉄鉱がある。本発明の目的のためには、担体は溶性でも不溶性でもよい。当技術の専門家であればＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２を結合するための他の適当な担体を知っているであろうし、または一般的な実験を用いてそれを突きとめることができよう。当技術の専門家に既知である多種の標識および標識付け方法がある。本発明で使用できる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位体、コロイド状金属、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物がある。本発明の目的のためには、本発明のＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２と結合する抗体が種々の生物学的サンプル中に存在していてもよい。ＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２に対する検出可能な量の抗体を含んでいればどのようなサンプルでも使用できる。本発明の好適な試料は生物学的流体または組織サンプルである。生物学的流体サンプルの好適な例には、血液、血清、血漿、涙、乳、尿、および脳−脊髄流体がある。生物学的組織サンプルの好適な例には肝臓および腎臓からの組織サンプル並びに内皮起源の組織がある。ＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２に対して向けられている、本発明の抗体、好適にはモノクローン性抗体およびＳＣＡ、は抗原のインビボ検出に使用する際にも有用である。検出可能に標識が付けられた抗体は診断的に有効な投与量で与えられる。「診断的に有効な」という用語は、検出可能に標識が付けられているモノクローン性抗体の量が、抗体が特異的であるレプトスピラＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２の検出を可能にするのに十分な量で投与されることを意味する。検出可能な標識のついた抗体の投与濃度は、ＬｉｐＬ１および／またはＬｉｐＬ２を有する細胞、体液、または組織との結合が背景と比較して検出可能となるのに十分なものでなければならない。さらに、最良の目標対背景の信号比を与えるためには、検出可能に標識が付けられている抗体が循環系から素早く排除されることが望ましい。原則として、インビボ診断用の検出可能に標識が付けられた抗体の投与量は、対象の年令、性、および病気の程度の如き要素に依存して変動するであろう。抗体の投与量は、例えば約０．００１ｍｇ／ｍ²〜約５００ｍｇ／ｍ²、好適には約０．１ｍｇ／ｍ²〜約２００ｍｇ／ｍ²で、最も好適には約０．１ｍｇ／ｍ²〜約１０ｍｇ／ｍ²で変動できる。そのような投与量は、例えば、複数回の注射がなされるかどうかにより、または当技術の専門家に既知である他の要素により、変動する。インビボ診断イメージングにとって、使用できる検出装置のタイプが特定の放射性同位体を選択する上で主要な要素である。選択される放射性同位体は所定のタイプの装置にとって検出可能な自然崩壊タイプを有していなければならない。また、インビボ診断用の放射性同位体を選択する上で重要な別の要素は、放射性同位体の半減期が目標により吸収される最大時間でも依然として検出可能であるほど長いが、宿主に与える有害な放射性が最少であるほど短いことである。理想的には、インビボイメージングで使用される放射性同位体は粒子放出を含まないが従来のガンマカメラで容易に検出できる１４０−２５０キー範囲内の多数のプロトンを製造するものである。インビボ診断用には、放射性同位体は免疫グロブリンと中間官能基を使用することにより直接的にまたは間接的に結合されていてもよい。免疫グロブリンに対して金属イオンとして存在する放射性同位体を結合させるためにしばしば使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）並びに同様な分子の如き二官能性キレート剤である。本発明のモノクローン抗体と結合できる金属イオンの代表的な例としては¹¹¹Ｉｎ、⁹⁷Ｒｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒ、および²⁰¹Ｔｌがある。本発明の抗体はインビボ診断用に、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）または電子回転共鳴（ＥＳＲ）の場合と同様に、常磁性同位体で標識を付けることもできる。一般的には、診断画像を可視化するため従来のどの方法を用いてもよい。通常、ガンマおよびポジトロン放出放射性同位体をカメラ画像用に、常磁性同位体をＭＲＩ用に使用する。そのような技術において特に有用な元素としては¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｃｒ、および⁵⁶Ｆｅが包含ある。好適にはモノクローン性抗体およびＳＣＡである本発明の抗体を使用してレプトスピラ関連疾病の改善過程を監視することもできる。それ故、種々の体液または組織中に存在するレプトスピラＬｉｐＬ１および／もしくはＬｉｐＬ２蛋白質またはＬｉｐＬ１および／もしくはＬｉｐＬ２蛋白質に対する抗体の増加または減少を測定することにより、疾患を改善するために特定の治療管理が有効であるかどうかを判定することが可能となろう。本発明の方法で用いる材料はキットの製造に理想的に適合する。そのようなキットは瓶、管などの１つもしくはそれ以上の容器手段を近くに制限して受けるために区画化された担持手段を含んでいてもよく、容器手段の各々はこの方法で使用される個々の要素の１つを含んでいる。例えば、容器手段の１つはＬｉｐＬ１および／またはＬｉｐＬ２結合試薬、例えば抗体、を含んでいてもよい。第二の容器はさらに、ＬｉｐＬ１および／またはＬｉｐＬ２蛋白質を含んでいてもよい。成分は希望により液体形態または凍結乾燥形態で存在していてもよい。上記の説明では、診断試験、例えば核酸ハイブリッド検定法または免疫検定法、はＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２のいずれかまたは両者を試験することができる。或いは、それらはＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２蛋白質または核酸配列をレプトスピラに特異的な他の蛋白質または核酸配列、特に病原性レプトスピラ、ＯｍｐＬ１｛Haake，D．A.，et al.，J．Bacteriol.，175:4225-4234(1993);１９９３年３月３１日に出願された Haake，D．A.，et al．の米国特許出願番号０８／０４０,７４７、"Cloned Leptospira Outer Membrane Protein"｝およびＯｍｐＬ２｛１９９４年５月２５日に出願された Haake，D．A., et al．の米国特許出願番号０８／２４９,０１３、"Cloned Leptospira Outer Membrane Protein"｝と組み合わせたＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２蛋白質の両者または核酸配列を試験するパネル試験からなっていてもよい。同様に、例えば免疫検定法または予防接種用の組成物は単独のＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２からなっていてもよい。或いは、それらはＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の両者、またはレプトスピラ、特にＯｍｐＬ１およびＯｍｐＬ２のような病原性レプトスピラ、に特異的な他の蛋白質と組み合わせたこれらの蛋白質を含有するカクテルからなっていてもよい。抗体組成物はＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２に特異的な抗体からなっていてもよい。或いは、それらはＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２またはこれらの蛋白質および、レプトスピラ、特にＯｍｐＬ１およびＯｍｐＬ２などの病原性レプトスピラ、に特異的な他の蛋白質、に対する抗体を含有するカクテルからなっていてもよい。ハイブリッド形成検定法は好適には穏やかな条件下から厳密な条件下で実施される。免疫検定法は好適には減じられた非特異的結合の条件下で実施される。このように、これらの組成物を使用する試験キットおよび方法はそれに応じて変化する。下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、限定するものではない。それらは使用されるであろうものの代表的なものであるが、当技術の専門家に既知である他の工程を代わりに使用してもよい。実施例下記の実施例はＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の同定、クローニング、配列、および特徴についてを記載する。レプトスピラ病原性と、ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２に対する抗血清との反応性との間に強い関係があった。材料および方法レプトスピラ菌株。有毒でかつ培養−減衰された Leptospira kirschneri、菌株ＲＭ５２（以前のL．alstoni）はＣ.Ａ.Ｂｏｌｉｎ氏（アイオワ州、アメス、米国農業局、農業研究サービス、国立動物疾病センター）から入手した。この菌株は最初は１９８３年に豚の流産発生時にアイオワ州立大学で獣医診断研究所に寄託された材料から単離された｛Thiermann，A．B.，et al.，Ann．Proc．Amer ．Assn．Veterinary Laboratory Diagnosticians，27:233-244(1984)｝。単離物のサンプルは液体窒素中に貯蔵されるか｛Alexander，A．D.，et al.，Internat ional J．System．Bacteriol.，22:165-169(1972)｝または毎週もしくは２週間毎に液体ＥＭＪＨ媒体の中を通過させた｛Johnson，R．C.，et al.，J．Bacteri ol., 94:27-31(1967)｝。有毒菌株の通過は４回以下（５回未満）であった。減衰菌株は１９８３年以降２００回以上通過されている。他のレプトスピラ種はＣ .Ａ.Ｂｏｌｉｎ氏の好意で同氏から提供された。大腸菌。大腸菌ＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４、△ｌａｃＵ１６９、［φ８０、ｌａｃＺ、△Ｍ１５］、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡ１）を組み換えＤＮＡの形質転換用の宿主菌株として使用した。大腸菌菌株ＰＬＫ−Ｆ’（ｒｅｃＡ、ｌａｃ、ｍｃｒＡ、，ｍｃｒＢ、ｈｓｄＲ、ｇａｌ、ｓｕｐＥ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩｑＺ△Ｍ１５、Ｔｎ１０（ｔｅｔ^R）］）を、λｚａｐIIベクター（カリフォルニア州、サンディエゴ、ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で感体するための宿主菌株として使用した。大腸菌菌株ＪＭ１０９（ｒｅｃＡ１、ｓｕｐＥ４４、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、ｔｈｉ△［ｌａｃｐｒｏＡＢ］、Ｆ’ ［ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ⁺、ｌａｃＩ^q、ｌａｃＺ△Ｍ１５］）を、ｐＲＳＥＴ発現ベクター（カリフォルニア州、サンディエゴ、インヴィトロゲン・コーポレーション）のための宿主菌株として使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用のサンプルを、断らない限り、６２．５ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ６．８）、１０％のグリセロール、５％の２ −メルカプトエタノール、２％のＳＤＳ、および８Ｍウレアからなる最終的なサンプル緩衝液の中に溶解させた。蛋白質を１０％ゲル上で不連続的緩衝液系を用いて分離し｛Laemmli，U.K.，Nature(London)，227:680-685(1970)｝、そして免疫ブロッティング用にニトロセルロースに移した（Schleicher & Schuell Inc. Keene，New Hampshire ）。免疫ブロット上での抗原検出用には、ニトロセルロースを燐酸塩緩衝食塩水 −０．１％ツイーン−２０（ＰＢＳ−Ｔ）中で５％無脂肪ドライミルクでブロックし、ＰＢＳ−Ｔの中に１：５０００（断らない限り）で希釈した抗血清を用いて１時間培養し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（イリノイ州、アーリントン．ハイツ、アメルシャム・コーポレーション）と結合されたドンキ−抗−兎抗血清を用いてプローブした。促進性化学発光系（ＥＣＬ、アメルシャム）を使用して抗原−抗体結合を検出した。ブロットをＥＣＬ試薬中で１分間培養し、次にＸＡＲ−５フィルム（コネチカット州、スタンフォード、フジ・メディカル・システムズ）にさらした。レプトスピラのトリトンＸ−１１４抽出。培養−減衰Ｌ．kirschneriを１％トリトンＸ−１１４を用いてこれまでに記載されている方法｛Haake，D．A.，et a l.，Infection & Immunity，59:1131-40(1991)｝の変法により抽出した。簡単に述べると、培養−減衰Ｌ．kirschneriを燐酸塩緩衝食塩水、５ｍＭＭｇＣｌ₂の中で２回洗浄し、そして１％蛋白質等級トリトンＸ−１１４（カリォルニア州、ラジョラ、カルバイオケム）、１０ｍＭトリスｐＨ８、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭヨードアセトアミド、および１０ｍＭＥＤＴＡの存在下で４℃で抽出した。不溶性物質を１７，０００ｘｇで１０分間遠心分離し除去した。上澄み液のトリトンＸ−１１４濃度を２％に高めた。上澄み液を３７℃に暖めそしてそれを１０分間にわたり２，０００ｘｇで遠心することにより相分離を行った。洗剤および水相蛋白質をアセトンを用いて沈澱させた。Ｎ−末端アミノ酸配列。リポ蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単離し、ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼで消化させた。ポリペプチド断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、トランス−ブロットＰＶＤＦ蛋白質配列膜（カリフォルニア州、リッチモンド、バイオ−ラド）に移し、そしてカリフォルニア大学ロスアンジェルス（ＵＣＬＡ）蛋白質微細配列施設に寄託した。Ｎ−末端アミノ酸配列分析はポートン１０９０−Ｅ気相配列器上でＰＴＨアミノ酸のオンライン検出で行われた。サザーン・ブロット分析。Ｌ．kirschneriゲノムＤＮＡを｛Yelton，D．B.，e t al.，Gene，28:147-152(1984)｝の方法により製造した。レプトスピラＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して１.０％アガロースゲル中で電気泳動させた。脱プリン、変性、および中和後に、ＤＮＡをサザーン法｛Sambrook，J.，et al.，Molecu lar Cloning: A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory ，Cold Spring Harbor，NY(1989)｝によりナイロンフィルター（ゼタ−プローブ、バイオ−ラド）に移した。フィルターを２時間にわたり８０℃で真空下で燃焼し、６ＸＳＳＣ、１Ｘデンハーツ溶液、０．０５％ピロ燐酸ナトリウム、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの変性鮭精子ＤＮＡを含有する緩衝液の中で３７℃で３時間にわたり予備ハイブリッド形成した。次にフィルターを一晩、３７℃で放射標識のついたオリゴヌクレオチド類を用いてハイブリッド形成した。各々が２０個の塩基対長である２種の変性オリゴヌクレオチドプローブを、リポ蛋白質断片のＮ−末端アミノ酸配列を基にして合成した。自動オリゴヌクレオチド合成器（カリフォルニア州、フォスターシティ、アプライド・バイオシステムズ・インコーポレーテッド、３８０Ｂ）を使用して合成オリゴヌクレオチドを製造した。変性オリゴヌクレオチドプローブ用に、フィルターを４７℃で３．０Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム（ウィスコンシン州、ミルウォーキー、アルドリッヒ・ケミカル・カンパニー）、５０ｍＭトリスｐＨ８.０、２.０ｍＭＥＤＴＡ、１.０％の前記のＳＤＳ｛Wood，W．I.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA，82:1585-1588(1985)｝の中で洗浄した。変性オリゴヌクレオチドプローブにはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ウィスコンシン州、マディソン、プロメガ・コーポレーション）により³²Ｐ−ｄＡＴＰで末端−標識を付けた。ｌｉｐＬ１およびｌｉｐＬ２遺伝子のクローニングおよび配列。標準的組み換えＤＮＡ工程を記載されている通りに実施した｛Sambrook，J.， et al.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)｝。制限エンドヌクレオチド消化は供給業者（マサチュセッツ州、ビバリー、ニューイングランド・バイオラブス・インコーポレーテッドおよびプロメガ）の推奨通りに行われた。Ｌ．kirschneriゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片をラムダＺａｐIIベクター（ストラタジーン）中に連結させた。連結されたＤＮＡをギガパックIIゴールドパッケージングエキス（ストラタジーン）と共に包装し、０．３％クロロホルム中で4℃において貯蔵した。大腸菌ＰＬＫＦ’ （ストラタジーン）を感染させることによりプラーク滴定量を測定した。プラークを板培養し、二重のフィルターに移し、そして前記の通りにして処理した｛Sa mbrook，J.，et al.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd ed.，Col d Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY（1989）｝。サザーン・ハイブリッド形成に関して上述したと同じオリゴヌクレオチドプローブハイブリッド形成および洗浄条件を使用した。組み換えｐブルースクリプトＳＫ（−）クローンを、製造業者に従うインビボ切り出しにより、ファージ生成性陽性プラークから回収した。制限地図作成後に、適当なＤＮＡ断片をｐブルースクリプトＫＳにサブクローンニングして、ＵＣＬＡコアＤＮＡ配列施設でフルオレセイン− 標識の付いたジデオキシヌクレオチド類（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレーテッド）を用いたジデオキシ連鎖終結方法により配列を決定した。ＤＮＡ配列分析。ＤＮＡ配列情報をＤＮＡストライダープログラムにより分析した｛Marck，C.，Nucleic Acids Res.，16:1829-1836(1988)｝。相同探索をＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびプロファイルサーチプログラム、ウィスコンシン大学ジェネティックス・コンピューター・グループ（ＧＣＧ）インコーポレーテッド（ウィスコンシン州、マディソン、ジェネティックス・コンピューター・グループ・インコーポレーテッド）パッケージ、ｖｅｒ.７.０｛Devereux，J．et al.，Nucl．Acids Res., 12:387-395(1984)｝を用いて行った。第二の構造予測は、同じくＧＣＧパッケージ中にあるプログラム、ＰＥＰＰＬＯＴおよびＰＬＯＴＳＴＲＵＣＴＵＲＥを使用した分析に基づいていた。Ｈｉｓ６−ＬｉｐＬ１融合蛋白質を用いる免疫感作。成熟ＬｉｐＬ１蛋白質のアミノ−末端近くの一般的な制限エンドヌクレアーゼ部位の欠如で、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してアミノ末端システインより後にある第一の基のところで始まる成熟蛋白質を暗号化するｌｉｐＬ１遺伝子の一部を増殖させた。５’オリゴヌクレオチドはＢｇ／II制限エンドヌクレアーゼ部位（下線）を含む成熟ＬｉｐＬ１のアミノ末端システインの後にある６個のアミノ酸を暗号化するヌクレオチド配列を含有していた：５’−ＴＴＡＡＣＧＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＧＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴ−３’。３’オリゴヌクレオチドはｌｉｐＬ１停止コドンの下流の１３３個の塩基対で始まる２４塩基対ヌクレオチド配列からなっていた：５’−ＣＡＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＡＡＧＡＡＴ−３’。ｌｉｐＬ１停止コドンと３’オリゴヌクレオチド配列との間のヌクレオチド配列は独特なＨｉｎｄIII 制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。前記の通りにして製造したＬ．kirschneriゲノムＤＮＡ｛Yelton，et al.，Gene，28:147 -152(1984)｝を鋳型として使用した。増殖したｌｉｐＬ１遺伝子の１１４４個の塩基対Ｂｇ／II−ＨｉｎｄIII断片をＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIで消化させたｐＲＳＥＴｂ（インヴィトロゲン）の中に連結させた。生じた構造ｐＲＳＥＴｂ− ＪＲ２を大腸菌ＪＭ１０９（インヴィトロゲン）の中で形質転換させた。Ｈｉｓ６−ＬｉｐＬ１融合蛋白質の発現はイソプロピルチオ−ｂ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ、ミズーリ州、セントルイス、シグマ・ケミカル・カンパニー）の誘発、およびその後の、大腸菌ｌａｃプロモーターにより作用されるＴ７ポリメラーゼ遺伝子を含有するＭ１３／Ｔ７ファージの感染により得られた。Ｈｉｓ６ＬｉｐＬ１融合蛋白質を６Ｍグアニジンの中に溶解させ、Ｎｉ²⁺−ＮＴＡ−アガロース（クイアゲン）を使用する親和クロマトグラフィーにより精製し、そして２０ｍＭトリス、ｐＨ８、５０ｍＭＮａＣｌ、および１０％グリセロールの中で透析した。約３０マイクログラムのＨｉｓ６−ＬｉｐＬ１をフロイント完全アジュバントと混合し、ニュージーランド・ホワイト雄兎に皮下および筋肉内接種した。第二の免疫感作にはフロイント不完全アジュバント中の約３０マイクログラムの精製Ｈｉｓ６−ＬｉｐＬ１融合蛋白質を使用した。第二免疫感作から２週間後に兎の採血をした。Ｈｉｓ６−ＬｉｐＬ２融合蛋白質を用いる免疫感作。蛋白質のアミノ−末端の４分の３を暗号化するｌｉｐＬ２遺伝子の８４２塩基対のＨａｅIII−ＣｌａＩ断片をＰｖｕIIおよびＣｌａＩで消化させたｐＲＳＥＴａ（インヴィトロゲン）の中に結さつ（ligate）した。生じた構造ｐＲＳＥＴａ−８００ＨＣを大腸菌ＪＭ１０９（インヴィトロゲン）の中で形質転換させた。Ｈｉｓ６−ＬｉｐＬ２融合蛋白質の発現はイソプロピルチオ−ｂ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ、シグマ）の誘発、およびその後の、大腸菌ｌａｃプロモーターにより作用されるＴ７ポリメラーゼ遺伝子を含有するＭ１３／Ｔ７ファージの感染により得られた。Ｈｉｓ６ＬｉｐＬ２融合蛋白質を６Ｍグアニジンの中に溶解させ、Ｎｉ²⁺−ＮＴＡ− アガロース（クイアゲン）を使用する親和クロマトグラフィーにより精製し、そして２０ｍＭトリス、ｐＨ８、５０ｍＭＮａＣｌ、および１０％グリセロールの中で透析した。約４００マイクログラムのＨｉｓ６−ＬｉｐＬ２をフロイント（Freund's）完全アジュバントと混合し、ニュージーランド・ホワイト雄兎に皮下および筋肉内接種した。第二の免疫感作にはフロイント不完全アジュバント中の約４５０マイクログラムの精製Ｈｉｓ６−ＬｉｐＬ２融合蛋白質を使用した。第二免疫感作から２週間後に兎の採血をした。結果オリゴヌクレオチドプローブの設計およびｌｉｐＬ１遺伝子のクローニング。ＬｉｐＬ１のブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼ消化で、寸法が２１−、９−、および５−ｋＤａの分子量を有する断片を生じた。２１−ｋＤａ断片のＮ−末端アミノ酸配列分析は配列ＹＦＧＫＴＶＬＶＲＰＳＥＱＡＫＱＫＱＩＶＬＬを示した。配列ＥＱＡＫＱＫＱＩの部分を基に２５６倍の縮重(256-fold degeneracy)を有する２３個の塩基対オリゴヌクレオチドプローブ、ＧＡ（ＡＧ）ＣＡ（ＡＧ）ＧＣ（ＡＧＣＴ）ＡＡ（ＡＧ）ＣＡ（ＡＧ）ＡＡ（ＡＧ）ＣＡ（ＡＧ）ＡＴを設計した。オリゴヌクレオチドプローブは独立して、Ｌ．kirschneriゲノムのサザーン・ハイブリッド形成により２.３ｋｂＥｃｏＲＩ断片を同定した。２．３ｋｂＥｃｏＲＩ断片を前記の通りにして｛Haake，D．A.，et al.，J．Bacteriol．1 75:4225-4234(1993)｝Ｌ．kirschneriゲノムＤＮＡの部分的なラムダＺＡＰ II （ストラタジーン）ライブラリーからクローニングした。オリゴヌクレオチドプローブの設計およびｌｉｐＬ２遺伝子のクローニング。ＬｉｐＬ２のブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼ消化で、寸法が２１−、および１７−ｋＤａの分子量を有する断片を生じた。１７−ｋＤａ断片のＮ−末端アミノ酸配列分析は配列ＡＳＬＳＬＴＧＩＴＫＮＲＡＫＩＧＮＬを示した。配列ＴＧＩＴＫＮＲの部分を基に、８６４倍の縮重(864-fold degeneracy)を有する２０個の塩基対オリゴヌクレオチドプローブ、ＡＣ（ＴＡＧ）ＧＧ（ＴＡＧ）ＡＴ（ＣＡＴ）ＡＣ（ＴＣＡＧ）ＡＡ（ＡＧ）ＡＡ（ＴＣ）（ＡＣ）Ｇを設計した。コドンバイアスを、レプトスピラ種の低いＧＣ含有量を基にした第一のスレオニン基およびグリシン基用に使用した｛Jo hnson，et al.，Family II．Leptospiraceae，In N．R．Krieg and J．G．Holt （ed.）Bergey's manual of systematic bacteriology，Vol．1，pp．62-67，Th e Williams & Wilkins Co.，Baltimore，(1984)｝。オリゴヌクレオチドプローブは独立して、Ｌ．kirschneriゲノムのサザーン・ハイブリッド形成により２. ３ｋｂＥｃｏＲＩ断片を同定した。２．３ｋｂＥｃｏＲＩ断片を前記の通りにして｛Haake，D．A.，et al.，J．Bacteriol．175:4225-4234(1993)｝Ｌ．k irschneriゲノムＤＮＡの部分的なラムダＺＡＰ II（ストラタジーン）ライブラリーからクローニングした。ｌｉｐＬ１遺伝子の配列分析。制限地図作成、サザーン・ブロット分析、およびＤＮＡ配列決定により、全てのｌｉｐＬ１遺伝子が２．３ｋｂＥｃｏＲＩ断片によりコード付けされていることがわかった（図１）。無傷の解放読み取り枠がＥｃｏＲＩ部位から下流の４３０個の塩基対であると同定された。ｌｉｐＬ１構造遺伝子は３６４個のアミノ酸の蛋白質を暗号化する１０９２個の塩基からなっている。大腸菌−様−３５（ＴＴＧＡＣＣ）および−１０（ＴＡＴＴＡＴ）プロモーター領域、並びに共通リボソーム−結合部位（ＡＡＧＡＧＧ）が開始コドンから上流に存在している（図２）。リポ蛋白質に関して予期されるように、推定アミノ酸配列は疎水性プロット上のＮ−末端ピークにより表される２０基信号ペプチドで始まる（図３）。ＬｉｐＬ１配列は原核生物リポ蛋白質信号ペプチドに関して確立されている原則を確認している｛Pugsley，A． P.，Microbiol．Rev.，57:50-108(1993); Hayashi，S.，et al.，J．Bioenerg． Biomembr.，22:451-471（1990）｝。ＬｉｐＬ１信号ペプチドは塩基性アミノ− 末端領域（位置２および３におけるアルギニンを含む）、疎水性コア（アミノ酸８〜２０）、およびカルボキシ末端Ｌｅｕ−Ｘ−Ｙ−Ｃｙｓ信号ペプチターゼII 分解部位を有する。ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼは酸性アミノ酸の後のペプチドを分解することが知られている。グルタミン酸基１７４のすぐ後の２２個のアミノ酸の中の２０個が天然蛋白質のＮ−末端アミノ酸配列分析により得られた配列と同一である（図２）。レプトスピラ信号ペプチダーゼIIによる２０−アミノ酸信号ペプチドの分解後に、成熟ポリペプチドは３５．３ｋＤａの予想分子量を有するであろう。末端コドンから下流にある３０個の塩基対は、ｒｈｏ−非依存性転写ターミネーターとして機能するかもしれない逆転反復である（図２）。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、およびプロフィル・サーチプログラムを使用するデータベース調査は有意のアミノ酸相同を示すことに失敗した。ＬｉｐＬ１の推定アミノ酸配列には２つの顕著な特徴がある。第一は成熟蛋白質のＮ−末端システインの後の３つの基を開始する６個の連続的なアスパラギン酸基である。第二の顕著な特徴はアラニン残基が豊富であることである。成熟ＬｉｐＬ１蛋白質では、５５／３４４個の基がアラニンであり、その中の２５個は対にまたは三重対に配置されている。ｌｉｐＬ２遺伝子の配列分析。制限地図作成、サザーン・ブロット分析、およびＤＮＡ配列決定により、全てのｌｉｐＬ２遺伝子が２．２５ｋｂＥｃｏＲＩ断片によりコード付けされていることがわかった（図４）。無傷の解放読み取り枠がＥｃｏＲＩ部位から下流の１７０個の塩基対であると同定された。ｌｉｐＬ２構造遺伝子は３５５個のアミノ酸の蛋白質を暗号化する１０６５個の塩基からなっている。大腸菌−様−３５（ＴＴＧＡＣＡ）および−１０（ＴＴＡＡＡＴ）プロモーター領域、並びに共通リボソーム−結合部位（ＡＧＧＡ）が開始コドンから上流に存在している（図５）。リポ蛋白質に関して予期されるように、推定アミノ酸配列は疎水性プロット上のＮ−末端ピークにより表される１９基信号ペプチドで始まる（図６）。ＬｉｐＬ２配列は原核生物リポ蛋白質信号ペプチドに関して確立されている原則を確認している｛Pugsley，A．P.，Microbiol．Rev.，5 7:50-108(1993); Hayashi，S.，et al.，J．Bioenerg．Biomembr.，22:451-471 （1990）｝。ＬｉｐＬ２信号ペプチドは塩基性アミノ−末端領域（位置２におけるアルギニン、および位置３におけるリシンを含む）、疎水性コア（アミノ酸４〜１７）、およびカルボキシ末端Ｌｅｕ−Ｘ−Ｙ−Ｃｙｓ信号ペプチターゼII 分解部位を有する。ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼは酸性アミノ酸後のペプチドを分解することが知られている。グルタミン酸基１０４のすぐ後は、天然蛋白質のＮ−末端アミノ酸配列分析により得られる配列と１００％同一である１８個のアミノ酸の配列である（図５）。レプトスピラ信号ペプチダーゼIIによる１９− アミノ酸信号ペプチドの分解後に、成熟ポリペプチドは３６．８ｋＤａの予想分子量を有するであろう。末端コドンから下流の２７個の塩基対はｒｈｏ−非依存性転写ターミネーターとして機能するかもしれない逆転反復である（図５）。ＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、およびプロフィル・サーチプログラムを使用するデータベース調査は有意なアミノ酸相同を示すことに失敗した。しかしながら、ＧＡＰプログラムを使用するＬｉｐＬ２のアミノ酸配列とＢ．burgdorferi のＯｓｐＡ配列との整列は、カルボキシ末端１５基の中の５３％の同一性領域を示した。Ｌ．kirschneriアシレート類であるＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２。[³Ｈ]パルミテートを用いる培養−減衰Ｌ．kirschneri の固有標識付けは、全有機体レーンの底に拡散方式で出現するレプトスピラ糖脂質（リポ多糖−様物質）中への標識の導入、並びに全有機体レーン中で分離帯を生成する少なくとも１０個の蛋白質を生ずる（図７および８）。抗−ＬｉｐＬ１抗血清（図７）および抗−ＬｉｐＬ２抗血清（図８）を用いた免疫沈降実験により、これらの２種の蛋白質がそれぞれ、これらの自動ラジオグラフ中で同定された第二および第三の最も小さいリポ蛋白質であることを確認している。レプトスピラ種の中でのＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の発現。ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の発現の水準および分布を決めるために、特異的抗血清を使用してレプトスピラ種のパネル上で免疫ブロット分析を行った。図１０は、ＬｉｐＬ１は大多数のレプトスピラ病原体により製造されるが、製造されるＬｉｐＬ１の分子量および量は非常に可変的であることを示している。試験したレプトスピラ種の中では、Ｌ．kirschneriＲＭ５２菌株が最も多いＬｉｐＬ１を製造することがわかった。ＬｉｐＬ１免疫ブロットとクーマッシーブルー染色ゲルとの比較（図９）は、観察された差が全面的にＬｉｐＬ１抗血清と菌株源との好ましい反応性によるとは考えられないことを示している。それとは対照的に、図１１は病原体レプトスピラ種間で発現されるＬｉｐＬ２の分子量および量がかなり一定していることを示している。ＬｉｐＬ２は試験した全てのレプトスピラ病原体により、相対的に同じ量で発現される。レプトスピラの病原性とＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２に対する抗血清との反応性の間に強い相関関係があった。ＬｉｐＬ１はＬ．biflexa、Ｌ．inadai、もしくはＬ．wolbachii、レプトスピラの３種の非病原性種、または関連する非病原体であるLeptonema illiniの中では検出されなかった（図１０）。Ｌ．inadai中では少量の反応性があったが、４１−ｋＤａ抗原はＬ．biflexa、Ｌ．wolbachii 、またはＬ．illiniの中では検出されなかった（図１１）。トリトンＸ−１１４抽出および相分布の最中のＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の挙動。ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２の両者はリポ蛋白質の既知の特性であるトリトンｘ−１１４洗剤相（図１２および１３）の中に選択的に分布した。洗剤不溶性ペレットからの完全な除去により示されるように、ＬｉｐＬ１は１％トリトンＸ−１１４の中に完全に抽出された（図１２）。対照的に、残存ＬｉｐＬ２の反応性、すなわちＯｍｐＬ１に関してこれまでに観察されているパターン｛Haake ，D．A.，et al.，J. Bacteriol.，175:4225−4234(1993)｝、が不溶性ペレットの中で見られた（図１３）。ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２が２種のレプトスピラリポ蛋白質であることを示唆する証拠。数系統の証拠が、これらの蛋白質がリポ蛋白質であるという結論を支持している。第一に、いずれの蛋白質もブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼ消化を受けるまでＮ−末端アミノ酸配列に対してブロックされていることがわかった。第二に、それらの推定されるアミノ酸配列の分析はＬ−Ｘ−Ｙ−Ｃ信号ペプチダーゼII分解部位より前の信号ペプチドを示している。第三に、ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２はＬ．kirschneriの[³ Ｈ]パルミテート固有標識付けにより標識が付けられている。最後に、ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２はトリトンＸ−１１４洗剤相の中に選択的に分布する。ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２は両者ともトリトンＸ−１１４洗剤相中に分布するが、それらはＬ．interrogansセロバル・ポモナ中では Zuernerら｛Zuerner， et al., Microbial．Pathogenesis，10:311-322(1991)｝により同定された３１ −ｋＤａ蛋白質とは異なるようである。ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２に対する抗血清は１−ｋＤａより明らかに大きいＬ．interrogans serovar ポモナ抗原と反応した（図１０および図１１）。前記の事項は説明のためであって、本発明の範囲を限定するものでない。実際に、当技術の専門家であれば本明細書の教示に基づいて、過度の実験なしで、別の態様を容易に企画し製造することができる。本明細書に挙げた全ての刊行物および特許出願は引用することにより個別に示されているのと同じ程度まで本発明の内容となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/12 Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｆ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２よりなる群から選択される蛋白質のアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。２．還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、蛋白質ＬｉｐＬ１が約３５ｋＤａの分子量を有し、蛋白質ＬｉｐＬ２が約４１ｋＤａの分子量を有する、請求の範囲第１項記載の単離された蛋白質。３．蛋白質が図２、図５のアミノ酸配列、およびそれぞれ信号ペプチド配列のない前記のアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を本質的に有する、請求の範囲第１項記載の単離された蛋白質。４．ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２よりなる群から選択される実質的に純粋な蛋白質。５．ＳＥＱＩＤＮＯ.３、ＳＥＱＩＤＮＯ.６、およびそれぞれ信号ペプチド配列のない前記のものよりなる群から選択されるアミノ酸配列。６．ＳＥＱＩＤＮＯ.１、２、４、５および信号ペプチド配列を暗号化する領域のない前記のものよりなる群から選択される核酸配列。７．請求の範囲第１項記載の単離された蛋白質を暗号化する核酸配列。８．請求の範囲第７項記載の核酸配列を含む組み換えベクター。９．請求の範囲第８項記載のベクターにより形質転換された細胞。１０．細胞が原核生物である、請求の範囲第９項記載の細胞。１１．原核生物が大腸菌である、請求の範囲第１０項記載の原核生物。１２．請求の範囲第７項記載の核酸配列を有する宿主を形質転換し、そして核酸配列を宿主中で発現させる段階を含む、ＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２のアミノ酸配列を含む蛋白質を製造する方法。１３．さらに蛋白質を単離する段階も含む、請求の範囲第１２項記載の方法。１４．宿主が原核生物である、請求の範囲第１３項記載の方法。１５．免疫学的に有効な量のＬｉｐＬ１、ＬｉｐＬ２を単独でまたは組み合わせて製薬用に認められる担体中に含む、動物に病原性レプトスピラに対する免疫応答を誘発するために有用な製薬学的組成物。１６．製薬用に認められる担体がアジュバントを含有する、請求の範囲第１５項記載の製薬学的組成物。１７．動物を請求の範囲第１５項記載の組成物で免疫感作することを含む、動物に病原性レプトスピラに対する免疫応答を誘発する方法。１８．免疫学的に有効な量のＬｉｐＬ１、ＬｉｐＬ２、または両者と結合する抗体を製薬用に認められる担体中に含む、動物に病原性レプトスピラに対する免疫応答を誘発するために有用な製薬学的組成物。１９．ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２よりなる群から選択される蛋白質を結合できる抗体。２０．抗体がポリクローン性である、請求の範囲第１９項記載の抗体。２１．抗体がモノクローン性である、請求の範囲第２０項記載の抗体。２２．ＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２を暗号化する核酸配列と結合可能な核酸配列プローブとサンプルを接触させかつそのような結合を検出する段階を含む、サンプル中でレプトスピラを検出する方法。２３．ＬｉｐＬ１またはＬｉｐＬ２と結合可能な抗体とサンプルを接触させ、そしてそのような結合を検出する段階を含む、サンプル中でレプトスピラを検出する方法。２４．サンプルが生物学的サンプルである、請求の範囲第２３項記載の方法。２５．サンプルが哺乳動物からのものである、請求の範囲第２４項記載の方法。２６．抗原を結合可能な抗体をサンプル中で検出する方法であって、抗体が抗原と結合可能な条件下でサンプルと抗原を接触させ、そして抗原に対する抗体の結合を検出することを含み、抗原がＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２よりなる群から選択される方法。２７．抗原に検出可能に標識が付けられる、請求の範囲第２６項記載の方法。２８．ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２よりなる群から選択される抗原を検出するために有用なキットであって、抗原を結合可能な試薬を含有する１個又はそれ以上の容器を有するキット。２９．試薬が抗体および抗原に特異的な核酸配列よりなる群から選択される、請求の範囲第２８項記載のキット。３０．ＬｉｐＬ１およびＬｉｐＬ２よりなる群から選択される抗原を含有する１個以上の容器を有する、抗原に対する抗体の検出に有用なキット。３１．レプトスピラが病原性である、請求の範囲第２２項記載の方法。３２．レプトスピラが病原性である、請求の範囲第２３項記載の方法。３３．ＳＥＱＩＤＮＯ.１、２、４、５および信号ペプチド配列を暗号化する領域のない前記のものよりなる群から選択される核酸配列を含む実質的に純粋なポリヌクレオチド組成物。３４．さらに製薬用に認められる担体も含む、請求の範囲第３３項記載の実質的に純粋なポリヌクレオチド組成物。