MX2010009516A

MX2010009516A - Secuencias novedosas de brachyspira, composiciones inmunogenicas, metodos para la preparacion y usos de las mismas.

Info

Publication number: MX2010009516A
Application number: MX2010009516A
Authority: MX
Inventors: Tom La; David J Hampson; Matthew I Bellgard; Nyree D Phillips
Original assignee: Spirogene Pty Ltd
Priority date: 2008-02-28
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2010-11-30
Also published as: BRPI0908410A2; EP2363407A1; CO6311109A2; KR20100135762A; CA2716973A1; WO2009105833A1; US20110064761A1; JP2011512803A; AU2009219116A1

Abstract

Se describen polinucleótido y aminoácidos novedosos de Brachyspira hyodysenteriae. Estas secuencias son útiles para el diagnóstico de enfermedad por B. hyodysenteriae en animales y como un tratamiento terapéutico o tratamiento profiláctico de enfermedad por B. hyodysenteriae en animales. Estas secuencias también pueden ser útiles para el diagnóstico y tratamiento terapéutico yío profiláctico de enfermedades en animales causadas por otras especies de Brachyspira.

Description

SECUENCIAS NOVEDOSAS DE BRACHYSPIRA. COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS. MÉTODOS PARA LA PREPARACIÓN Y USO DE LAS MISMAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a genes novedosos en Ja bacteria Brachyspira hyodysenteriae y las proteínas codificadas en la misma. La presente invención también se refiere al uso de estos genes y proteínas novedosas para la diagnosis de la enfermedad ocasionada por B. hyodysenteriae , vacunas contra la B. hyodysenteriae y para seleccionar los compuestos qúe matan la B. hyodysenteriae o bloquean los efectos pato.génicos de la B. hyodysenteriae. Estas secuencias también pueden ser útiles para el diagnóstico y tratamiento terapéutico y/<o profiláctico de enfermedades en animales ocasionadas por otras especies de Brachyspira , incluyendo B. intermedia, B. alvinipulli , B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii , y la B. pilosicoli . Antecedentes de la Invención La disentería en los cerdos es una enfermedad endémica importante de los cerdos en Australia y a nivel mundial. La disentería es una enfermedad diarreica mucohemorrágica contagiosa, caracterizada por una inflamación extensa y la necrosis de la superficie epitelial del intestino grueso. Las pérdidas económicas debidas a la disentería en los cerdos 1 I 0 I resultan principalmente del retardo del crecimiento, costos del medicamento y mortalidad. El agente causante de la disentería en los cerdos fue primero identificado como una espiroqueta i ¡. anaeróbica (Treponema hyodysenteriae) en 1971, y fue recientemente reasignada a los genes de Brachyspira como el B. hyodysenteriae . Donde es establecida la disentería de los cerdos en las porquerizas, el espectro de la enfermedad puede variar de ser leve, transitoria o poco aparente, a ser severa y hasta fatal. Las estrategias de medicación en las porquerizas individuales pueden ocultar los signos clínicos y en algunas porquerizas la enfermedad puede seguir sin notarse, o puede j solamente ser sospechada. Si ocurre una enfermedad ya sea o no obvia, la B. hyodysenteriae puede persistir en los1 cerdos infectados o hasta en los huéspedes del depósito tales como roedores o en el medio ambiente. Todas estas fuentes poseen un potencial para la transmisión de la enfermedad' a las manadas sin infectar. Las aves de corral comerciales también pueden ser colonizadas por B. hyodysenteriae , aunque no es clara la forma en que generalmente ocurre esto bajo las condiciones del campo. La colonización por parte de la B. hyodysenteriae promueve una fuerte respuesta inmunológica contra la espiroqueta, de ahí que la evidencia indirecta de la exposición a la espiroqueta puede ser obtenida midiendo los títulos de anticuerpos en circulación en la sangre de los animales infectados. Estos títulos de anticuerpos han sido reportados como que son mantenidos en niveles bajos, aún en animales que han sido recuperados de la disentería de los cerdps. Las pruebas serológicas para la detención de anticuerpos por lo tanto tienen un potencial considerable para detectar infecciones subclínicas y los cerdos portadores recuperados que tienén números no detectables de espiroquetas en sus intestinos gruesos. Estas pruebas serían particularmente valiosas para el uso fácil de una forma de equipo, tal como un ensayo inmuno-absorbente enlazado a la enzima. Se han desarrollado una variedad de técnicas para demostrar la presencia de I0s anticuerpos en la circulación contra la B. hyodyse'nteriáe , incluyendo las pruebas del anticuerpo fluorescente indirecto, las pruebas de hemaglutinación, pruebas de aglutinación de microtitulación, pruebas de fijación de complemento, y el ensayo de ELISA utilizando ya sea lipopolisacáridos o las espiroquetas completas sonicadas como antígenos. Todas estas pruebas han sufrido de problemas de especificidad!, como espiroquetas intestinales no patogénicas relacionadas que pueden inducir anticuerpos de reacción cruzada. Estas pruebas son útiles para detectar las manadas en donde es obvia la enfermedad y los títulos altos de anticuerpos en circulación, pero son problemáticas para identificar las manadas infectadas de manera sub-clínica y los cerdos individuales infectados. Por consiguiente, hasta la fecha, no están disponibles ensayos específicos y completamente sensibles para la detección de los anticuerpos contra la B. hyodysenteriae . La carencia ide lás pruebas de diagnóstico adecuadas han obstaculizado el control i de la disentería en los cerdos. Un número de métodos son empleados para controlar la disentería en los cerdos, variando desde el uso profiláctico de agentes antimicrobiales, para completar el desabasto ele manadas infectadas y la prevención de la nueva entrada de cerdos portadores infectados. Todas estas opciones son costosas, y si van a ser completamente efectivas, requieren el uso de pruebas de diagnóstico sofisticadas para monitorear el progreso. Generalmente, la detección de la disentería de los cerdos en las manadas con infecciones sub-clínicas, los animales portadores sanos individuales, continúa siendo un problema principal y está obstaculizando la implementacion de las medidas de control efectivas. Un diagnóstico definitivo dejla disentería en los cerdos tradicionalmente ha requerido el aislamiento e identificación de la B. hyodysenteriae de las feces o la mucosa de los cerdos enfermos. Los problemas principales comprendidos incluyen el crecimiento lento y requerimientos fastidiosos de nutrición de estas bacterias anaeróbicás y la confusión debido a la presencia de espiroquetas morfológicamente similares en la flora normal del intestino de i los cerdos. Una mejora importante en la diagnosis de los cerdos individuales afectados fue lograda con el desarrollo de los ensayos de reacción de cadena de polimerasa (PCR) para la detección de las espiroquetas de las feces. Desafortunadamente, en las aplicaciones prácticas el límite de detección de los PCRs hizo que no fuera posible detectar a los animales portadores con infecciones sub-cl ínicas. ; Como consecuencia de estos problemas de diagnóstico, existe uña necesidad clara de desarrollar una herramienta de diagnóstico simple y efectiva capaz de detectar la infección por B. hyodysenteriae en las manadas y en el nivel individual de cerdos. ¦ Una respuesta inmunológica fuerte es inducida contra la espiroqueta después de la colonización con la B. hyodysenteriae, y los cerdos recuperados de la disentería de los cerdos son protegidos de una nueva infección. A pesar de esto, los intentos para desarrollar vacunas para controlar la disentería en los cerdos han cumplido con un éxito muy limitado, ya sea debido a que han proporcionado protección inadecuada en base de una manada, o que han sido demasiado costosos y difíciles de producir para hacerlos comercialmente viables. Las vacunas de las bacterias proporcionan algún nivel ? de protección, pero tienden a ser específicos de los serogrupos de lipopolisacáridos, los cuales entonces requieren el| uso |de bacterias multivalentes. Además son difíciles y costosos de producir en gran escala debido a los requerimientos fastidiosos de crecimiento anaeróbico de la espiroqueta.

Se han hecho varios intentos para desarrollar vacunas vivas atenuadas para la disentería de los cerdos. Este método tiene la desventaja de que las cepas atenuadas muestran una colonización reducida, y de ahí que ocasionan un estímulo inmune reducido. Existe un rechazo por parte de los productores y veterinarios para utilizar vacunas vivas de la disentería de los cerdos debido a la posibilidad de reversión a la virulencia, especialmente debido a que se conoce muy poco acerca de la reglamentación genética y la organización en la B. hyodysenteriae. El uso de las vacunas de sub-unidad recombinante como una alternativa atractiva, debido a que los productos serian bien definidos (esencial para propósitos de registro), y relativamente fáciles de producir en gran escala. Hasta la fecha, el primer uso reportado de la proteína recombinante de la B. hyodysenteriae como un candidato para vacuna (una proteína flagelar de 38 kilodaltons) falló para evitar la colonización en los cerdos. Esta falla es probable que se relacione especialmente con la proteína recombinante particular utilizada, así como con otros problemas más inferiores( de lós sistemas de administración y rutas, rangos de dosificación, elección de los adyuvantes, etc. (Gabe, JD, Chahg, RJ, Slomiany, R, Andrews, WH y McCaman, MT (1995) el aislamiento de las proteínas extracitoplásmicas de la Serpulina hyodysenteriae B204 y la clonación molecular del gen 7aB1 que codifica la proteína flagelar de 38 kilodaltons. Infectijon and Immunity 63: páginas 142 a 148). Las primeras proteínas de B. hyodysenteriae recombinantes parcialmente protectoras reportadas utilizadas para la vacunación fue una lipoproteína de membrana externa de 29.7 kDa (Bhlp29.7, a la que también nos i referimos como BmpB y BIpA) la cual tenía una homología en las lipoproteínas de enlace de metionina de varias bacterias patogénicas. El uso de la proteína Bhlp29.7 recom¡binante etiquetada-his para la vacunación de cerdos, seguido por el refuerzo experimental con B. hyodysenteriae , dioj como resultado que del 17% al 40% de los cerdos vacunados desarrollaron la enfermedad comparados con de un 50%j al 70% de los cerdos de control sin vacunar que desarrollaron la enfermedad. Debido a la incidencia de la enfermedad para los cerdos vacunados con Bhlp29.7 fue significativamente (P=0.047) menor que la de los cerdos de control, pareció que el Bhlp29.7 tenía un potencial como un componente de una vacuna contra la disentería en los cerdos (La, T, Phillips, ND, Reichél, i MP y Hampson, DJ (2004). La protección de los cerdos de la disentería de los cerdos mediante la vacunación con el BmpB recombinante, una lipoproteína de membrana externa de 29.7 kDa en la Brachyspira hyodysenteriae . Veterinary Microbiology 102: páginas 97 a 109). Un número de otros intentos¡se h^n hecho para identificar las proteínas de envoltura externa de la B. hyodysenteriae que podrían ser utilizadas como los componentes recombinantes de la vacuna, pero nuevamente todavía no se ha hecho una vacuna exitosa. Un método mucho más global es necesario para la identificación de la protema recombinante inmunogénica potencialmente útil de la B. hyodysenteriae que es necesaria. Hasta la fecha, solamente un estudio que utiliza el ADN para la vacunación ha sido reportado. En estos estudios, el gen ftnA de la B. hyodysenteriae, que codifica la ferretina putativa, fue clonado en un plásmido de E. coli y el ADN plásmido utilizado para recubrir cuentas de oro para la vacunación balística. Un modelo múrido de disentería de cerdos fúe utilizado para determinar la naturaleza protectora de la f i vacunación con el ADN y/o las proteínas recombinantes. La vacunación con la proteína recombinante indujo una buena respuesta sistémica contra la ferretina, sin embargo, la vacunación con el ADN indujo solamente una respuesta sistémica detectable. La vacunación con ADN seguida por un refuerzo con una proteína recombinante indujo una respuesta inmune sistémica a la ferretina solamente después de reforzarla con proteína. Sin embargo, ninguno de los regímenes de 1 vacunación probados pudo proporcionar a los ratones una protección contra la colonización de B. hyodysenteriae y las lesiones asociadas. De manera interesante, la vacunación de los ratones con el ADN solo dio como resultado una exacerbación importante de la enfermedad (Davis, A.J., Smith, S.C. y Moore, RJ. (2005). El gen ftnA de la Brac yspira hyodysenteriae: vacuna de ADN y purificación PCR de tiempo real de la bacteria de un modelo de ratón de la enfermedad. Current Microbiology 50: páginas 285 a 291). Breve Descripción de la Invención Los inventores han identificado genes novedosos de la B. hyodysenteriae y las proteínas codificadas por estos genes. Han identificado además que estos genes y proteínas novedosos pueden ser utilizados para los propósitos terapéuticos y de diagnóstico. Además, los inventores han identificado que estos genes y/o las proteínas pueden ser utilizados como una vacuna contra la B. hyodysenteriae y/o diagnosticar infecciones ocasionadas por la B. hyodysenteriae . Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona polinucleótidos de B. hyodysenteriae novedosos que tienen una secuencia de nucleotidos contenida en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23. La presente invención también proporciona secuencias de nucleotidos que son homologas a las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23, en donde la homología puede ser del 95%, 90%, 85%, 80%, 75% y 70%. La presente invención también incluye una vacuna de ADN o una composición inmunogénica de ADN que contiene la secuencia de nucjeótid s de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23 y las secuencias que son 95%, 90%, 85%, 80%, 75%' y 70% homologas a estas secuencias. Esta invención incluye además un ensayo de diagnóstico que contiene el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 y 23 y las secuencias que son 95%, 90%, 85%, 80%, 75% y 70% homologas a estas secuencias. < ¡ En un aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende por lo menos dos polinucleotidos que codifican las moléculas de proteasa seleccionadas del grupo consistente de las SEQ ID Nos. 1 , 3, 5 y 7 para el tratamiento o prevención! de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. ! j En otro aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende por lo menos tres polinucleotidos que codifican moléculas de proteasa seleccionadas del grupo consistente de las SEQ ID Nos.! 1 , 3, 5 y 7 para el tratamiento o prevención de la disentería en los i ¦ cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae . i J Todavía en un aspecto particular de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende polinucleotidos que codifican moléculas de proteasa I seleccionadas del grupo consistente de: las SEQ ID Nos. 1 , 3, 5 y 7 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. j En un aspecto adicional de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende por lo menos dos polinucleótidos que codifican moléculas de lipasa y/o peptidasa seleccionadas del grupo consistente de las SEQ ID Nos. 9, 11, 13 y 15 para el tratamiento o prevención de la disentería en los ' cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. En otro aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende por lo menos tres polinucleótidos que codifican moléculas de lipasa y/o peptidasa seleccionadas del grupo consistente de las SEQ ID Nos. 9, 11, 13 y 15 para el tratamiento o prevenció'n de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae . Todavía en otro aspecto de la presente invención, ¡la composición de vacuna es una composición de vacuna que t consiste de polinucleótidos que codifican moléculas de lipasa y/o peptidasa seleccionadas del grupo consistente de las: SEQ ID Nos. 9, 11, 13 y 15 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae . En un aspecto adicional de la presente invención, la i composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende por lo menos dos polinucleótidos que codifican moléculas de toxina seleccionadas del grupo consistente de las SEQ ID Nos. 17, 19, 21 y 23 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. Todavía en otro aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende por lo menos tres polinucleotidos que codifican las i í moléculas de toxina seleccionadas del grupo consistente de las : i SEQ ID Nos. 17, 19, 21 y 23 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. i Todavía en otro aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacu'na que consiste de polinucleotidos que codifican las moléculas de toxina seleccionadas del grupo consistente de las: SEQ ID Nos. 17, 19, 21 y 23 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. i En otro aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende por lo menos un polinucleótido que codifica moléculas de hetjiolisina seleccionadas del grupo consistente de las SEQ ID Nos. 25, 27, i 29 y 31 junto con al menos un polinucleótido seleccionado del grupo consistente de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae.

En otro aspecto de la presente invención, la comp¡osición de vacuna es una composición de vacuna que comprende^: (i) por lo menos un polinucleótido que codifica una molécula de proteasa seleccionada del grupo consistente de las: SEQ ID Nos. 1 , 3, 5 y 7; y/o ' (ii) por lo menos un polinucleótido que codifica uña molécula de lipasa y/o peptidasa seleccionada del¡ grupo consistente de las: SEQ ID Nos. 9, 11, 13 y 15 y/o (iii) por lo menos un polinucléótido que codifica una molécula de toxina seleccionada del grupo consistente de lás: SEQ ID Nos. 17, 19, 21 y 23 y/o (iv) por lo menos un polinucleótido que codifica una molécula de hemolisina seleccionada del grupo consistente de las: SEQ ID Nos. 25, 27, 29 y 31 y/o para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira. ! La presente invención también proporciona plásmidos que contienen ADN que tienen la secuencia de las SEQ ID NOs: 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, y 31 ; vectores de expresión procarióticos y/o eucarióticos que contienen el ADN que tiene la secuencia de las SEQ ID NOs: 1, 3, !5, 7, ¡9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, y 31 ; y una célula que contiene los plásmidos que contienen el ADN que tiene la i : secuencia de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, y 31. : La presente invención también proporciona proteínas de B. hyodysenteriae novedosas que tienen la secuencia de aminoácidos contenida en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32. Esta invención también proporciona proteínas que son 95%, 90%, 85%, 80%, ¡ 75% y I 70% homologas a las secuencias contenidas en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32. La presente invención también proporciona una vacuna o composición inmunogénica que contiene las proteínas que tienen las secuencia de aminoácidos contenidas en las secuencias SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32 o las secuencias de aminoácidos que son 95%, 90%, 85%, 80%, 75% y 70% homologas a las secuencias contenidas en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32. En un aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende por jlo menos dos polipeptidos de proteasa seleccionados del grupo consistente de las SEQ ID Nos. 2, 4, 6 y 8 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. En otro aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende por lo menos tres polipéptidos de proteasa seleccionados del grupo consistente de las SEQ ID Nos. 2, 4, 6 y 8 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae . Todavía en otro aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende los polipéptidos de proteasa de las SEQ ID Nos. 2, 4, 6 y 8 para el tratamiento o prevención de la disentería en los I cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. En un aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende por los menos dos polipéptidos de lipasa y/o peptidasa seleccionados del grupo consistente de las SEQ ID Nos. 10, 12, 14 y 16 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos i asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. En otro aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende por lo menos tres polipéptidos de lipasa y/o peptidasa seleccionados del grupo consistente de las SEQ ID Nos. 10, 12, 14 y 16 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae . ¡ Todavía en otro aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que consiste de polipéptidos de lipasa y/o peptidasa seleccionados del grupo consistente de las: SEQ ID Nos. 10, 12, 14 y , 16 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. , En un aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende por lo menos dos polipéptidos de toxina seleccionados del grupo consistente de las SEQ ID Nos. 18, 20, 22 y 24 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. '¦ i En otro aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprendé por lo menos tres polipéptidos de toxina seleccionados de| grupo consistente de las SEQ ID Nos. 18, 20, 22 y 24 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. Todavía en otro aspecto de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna qüe consiste de polipéptidos de toxina seleccionados del grupo consistente de las: SEQ ID Nos. 18, 20, 22 y 24 para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerd'os asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. En un aspecto adicional de la presente invención, la composición de vacuna es una composición de vacuna que comprende: (i) por lo menos un polipéptido de proteasa seleccionado del grupo consistente de las: SEQ ID Nos. 2, 4, 6, u 8 y/p (¡i) por lo menos un polipéptido de lipasa y/o peptidasa ? seleccionado del grupo consistente de las: SEQ ID Nos. 10, 12, 14, ó 16 y/o (¡ü) por lo menos una toxina seleccionada del grupo consistente de las: SEQ ID Nos. 18, 20, 22 ó 24 y/o i (iv) por lo menos una hemolisina seleccionada del grupo consistente de las: SEQ ID Nos. 26, 28, 30 ó 32 , para el tratamiento o prevención de la disentería en los cerdos asociada con la Brachyspira hyodysenteriae. j Es un aspecto adicional de la presente invención tener un equipo de diagnóstico que contiene una o más proteínas que tienen una secuencia contenida en las SEQ ID NOs: 2, ¡4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32 o que son 95%, 90%, 85%, 80%, 75% y 70% homologas a las secuencias contenidas en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32. Es otro aspecto de la presente invención tener secuencias de nucleotidos las cuales codifican las proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos contenida en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32. La presente invención también cubre plásmidos, vectores de expresión eucarióticos y procarióticos, y vacunas de ADN las cuales contienen el ADN que tiene una secuencia que codifica la proteína que tiene una secuencia de aminoácidos contenida en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32. Las células que contienen estos plásmidos y vectores de expresión están incluidas en la presente invenciórji.

La presente invención incluye anticuerpos monoclonales que se enlazan a las proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos contenida en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32 o se enlazan a las proteínas que son 95%, 90%, 85%, 80%, 75% y 70% homologas a las secuencias contenidas en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32. Los equipos de diagnóstico que contienen los anticuerpos monoclonales que se enlazan a las proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos contenida en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32 o se enlazan a las proteínas que son 95%, 90%, 85%, 80%, 75% y 70% homologas a las secuencias contenidas en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6·, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32 que están incluidas en la presente invención. Estos equipos de diagnóstico pueden detectar la presencia de la B. hyodysenteriae en un animal. El animal preferentemente es un mamífero o un ave; y más particularmente, un pollo, ganso, pato, pavo, perico, perrjo, gato, hámster, jerbos, conejo, hurón, caballo, vaca, oveja, cerdo, mono, y humano. La presente invención también contempla el método de prevención o tratamiento de una infección ocasionada por B. hyodysenteriae en un animal mediante la administración a Un animal de una vacuna de ADN que contiene una o más secuencias de nucieótidos de la lista de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, y 31 O secuencias que son 95%, 90%, 85%, 80%, 75% y 70% homologas a estas secuencias. Esta invención también cubre un método de prevención o tratamiento de una infección ocasionada por B. hyodysenteriae en un animal administrando al animal una vacuna que contiene una o más proteínas que tie(nen la secuencias de aminoácidos contenidas en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32 o las secuencias que son 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ¡y 70% I homologas a estas secuencias. La presente invención también contempla el método ele generación de una respuesta inmune en un j animal administrando a un animal una composición inmunogénica que contiene una o más secuencias de nucleotidos de la lista de lás SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, y 3 o secuencias que son 95%, 90%, 85%, 80%, 75% y 70% homologas a estas secuencias. La presente invención también cubre un método de generación de una respuesta inmune en un animal administrando a un animal una composición inmunogénica que contiene una o más proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos contenidas en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32 o secuencias que son 95%, 90%, 85%, 80%, 75% |y 70% homologas a estas secuencias.

Descripción Detallada de la Invención Antes de describir la presente invención en detalle, ¡ deberá quedar entendido que la presente invención no está limitada a los métodos ejemplificados particularmente y pueden, por supuesto, variar. También deberá quedar entendido que la I terminología aquí utilizada es para propósitos de descripción de las modalidades particulares de la presente inyención solamente, y no pretenden estar limitando lo que solamente será limitado por las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente aquí citadas, ya sea supra o infra, son incorporadas a la presente descripción como referencia en su totalidad. Sin embargo, las publicaciones aquí mencionadas son citadas con el propósito de describir los protocolos, reactivos y vectores que son reportados en las publicaciones y los cuales podrían ser utilizados en relación con la presente invención. Nada de lo mencionado en esta descripción deberá ser interpretado como una admisión de que la presente invención no tiene el derecho de preceder dicha descripción en virtud de la invención anterior. Además, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales inmunológicas y biológicas moleculares y la farmacología dentro de la experiencia en la técnica. Dichas técnicas son bien conocidas para los expertos, y son explicadas completamente en la literatura. Consultar por ejemplo, los libros de Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher y Wingfield "Protocolos Actuales en Ciencias de Proteínas" (Current Protocols in Protein Science) (1999) Volumen I y II (John Wiley & Sons Inc.); Sambrook y asociados, "Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio" (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) (1989), 2a Edición (Cold Spring Harbor Laboratory press); y el libro de Prescott, Harley y Klein "Microbiología" (Microbiology) (1999), 4a Edición (WBC McGraw-Hill). Deberá observarse que como se usan en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de "un", "una", y "el", incluyen las referencias én plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "un gen" incluye una pluralidad de dichos genes, y una referencia a "un animal" es una referencia a uno o más animales y así sucesivamente. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen los ¡mismos significados que se tienen comúnmente por un experto en la técnica a la cual pertenece a la presente invención. lAunque i pueden ser utilizados cualesquiera materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en esta descripción para practicar o probar la presente invención, los materiales y métodos preferidos son descritos a continuación. En el aspecto más amplio de la presente invención se proporciona un polinucleótido novedoso de B. hyodysenteriáe que tiene la secuencia de nucleótidos contenida en las SEQ ÍD NOs: 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23 o una secuencia de aminoácidos (polipéptido) codificada por estos polinucleótidos. ! El término "aminoácidos" pretende cubrir todas las moléculas, ya sea naturales o sintéticas, que incluyen tanto la funcionalidad amino como una funcionalidad ácido y que tienen la capacidad de ser incluidos en un polímero de aminoácidos que ocurren de manera natural. Los aminoácidos de ejemplo incluyen aminoácidos que ocurren de manera natural, análogos, derivados y congéneros de los mismos; los análogos de aminoácidos que tienen cadenas laterales variantes; y todos los estereoisómeros de cualquiera de los anteriores. Un animal puede ser un mamífero o un ave que pueden i estar infectados con la bacteria Brachyspira, especialmente la B. hyodysenteriáe. Los ejemplos de animales incluyen ¡ perros, gatos, hámsters, jerbos, conejos, hurones, caballos, vacas, ovejas, cerdos, monos, y humanos. Los ejemplos de las aves incluyen pollos, gansos, patos, pavos, y pericos. Aquellos expertos en la técnica deberán apreciar que ciertas especies de Brachyspira tienen la capacidad de infectar un amplio rango ¡de huéspedes (ver, por ejemplo, Hampson y asociados, 2 06, en Emerging Infectious diseases, Vol. 12(5), páginas 869 a 870, incorporada a la presente invención en su totalidad corno referencia). Por consiguiente, el término "animal" como aquí se utiliza comprende un rango de animales, pero especialmente cerdos y aves de corral. El término "residuo conservado" se refiere a un aminoácido que es un miembro de un grupo de aminoácidos que tienen ciertas propiedades comunes. El término "substitución conservadora de aminoácidos" se refiere a la substitución (conceptualmente o de otra manera) de un aminoácido de uno de dichos grupos por un aminoácido del mismo g;rupo o diferente. Un modo funcional para definir las propiedades comunes entre los aminoácidos individuales es analizar los cambios de las frecuencias de los aminoácido.s en Itre la G s proteínas correspondientes de los organismos homólogos j i (Schulz, G. E. y R. H. Schinner., "Principios de la Estructura de las Proteínas" (Principies of Protein Structure), Springer-Verlag). De acuerdo con dichos análisis, los grupos de aminoácidos pueden ser definidos de manera que los aminoácidos dentro de un grupo se intercambian preferencialmente entre ellos, y por lo tanto se parecen más a i ! los otros en su impacto en la estructura general de la proteíha (Schulz, G. E. y R. H. Schirmer, "Principios de la Estructura de Proteínas" (Principies of Protein Structure), Spri nger-Verlag) . Los ejemplos de los grupos de aminoácidos definidos de esta manera incluyen: (i) un grupo cargado positivamente que I contiene Lys, Arg e His, (ii) un grupo cargado negativamente que contiene Glu y Asp, (iii) un grupo aromático que contiene Phe, Tyr y Trp, (iv) un grupo de anillo de nitrógeno que contiene His y Trp, (v) un grupo no polar alifático grande qúe contiene Val, Leu y De, (vi) un grupo ligeramente polar que contiene Met y Cys, (vi¡) un grupo de residuos pequeños que contiene Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln y Pro, (viii) un grupo alifático que contiene Val, Leu, He, Met y Cys, y (ix) un grupo hidroxilo pequeño que contiene Ser y Thr. Una "proteína de fusión" o "polipéptido de fusión" se refiere a una proteína quimérica como es conocido dicho término en la técnica y puede ser construido utilizando dichos términos utilizados en la técnica. En muchos ejemplos de proteínas de fusión, existen dos secuencias de polipéptidos diferentes, y en ciertos casos pueden haber más. Las 1 secuencias de polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión pueden ser enlazadas de manera operable en el marco de modo que las proteínas de fusión puedan ser traducidas de manera correcta. Una proteína de fusión puede incluir secuencias de polipéptidos de las mismas especies o de especies diferentes. En varias modalidades, el polipéptido de fusión puede contener una o más secuencias de aminoácidos enlazadas al primer polipéptido. En el caso en dondp están fusionadas una o más de una secuencia de aminoácidos al primer polipéptido, las secuencias de fusión pueden ser copias múltiples de la misma secuencia, o alternativamente, pueden ser secuencias de aminoácidos diferentes. Los polipéptidos de fusión pueden ser fusionados a la terminal-N, la terminaí-C, o a las terminales N- y C- para el primer polipéptido. Las proteínas de fusión de ejemplo incluyen polipéptidos que contienen etiqueta áe^ glutationa S-transferasa (etiqueta-GST), etiqueta de histidina (etiqueta-His), un dominio de ¡nmunoglobulinja o un dominio de enlace de inmunoglobulina. El término "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido, i i ! en ciertas modalidades preparado de un ADN o ARN recombinante, o de un origen sintético u origen natural, o i alguna combinación de los mismos, la cual (1) no está asociada con las proteínas que generalmente son encontradas en la naturaleza, (2) está separada de las células en las¡ cuales ocurre de manera normal, (3) está libre de otras proteínas de la misma fuente celular, (4) es expresada por una célula de una especie diferente, o (5) no ocurre en la naturaleza. Es posible que exista un polipéptido aislado, pero no califica como un I polipéptido purificado. Los términos "ácido nucleico aislado" y "polinucleótido aislado" se refieren a un polinucleótido ya sea de ADN genómico, cADN, mARN, tARN, rARN, ¡ARN, o un polinucleótido obtenido de una organela celular (tal como la mitocond^ia y el cloroplasto) , o de un origen sintético, el cual (1) no está asociado con la célula en la cual el "ácido nucleico aislado" es i encontrado en la naturaleza, o (2) es enlazado de manera operable a un polinucleótido al cual no está enlazado en la naturaleza. Es posible que un polinucleótido aislado exista, pero no califica como un polinucleótido purificado. Los términos "ácido nucleico'' y "polinucleótido" se refieren a una forma polimérica de nucleótidos, ya sea ribonucleótidos o desoxi-ribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Los términos deben también entenderse como que incluyen, como equivalentes, análogos ya sea para el ARN o ADN hechos de análogos nucleótidos, y como es aplicable a las modalidades que están siendo descritas, de un solo hilo (tal como sentido o antisentido) y polinucleótidos de hilo doble. Los términos "ácido nucleico de la presente invención" y "polinucleótido de la presente invención" se refieren a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención. Un polinucleótido de la presente invención puede comprender todos, o una porción de, una secuencia material de ácido nucleico; una secuencia de nucleótidos de por lo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de origen; una secuencia de nucleótidos que híbrida bajo condiciones severas a una secuencia de ácido nucleico de origen; secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que son equivalentes funcionalmente a los polipéptidos de la invención; secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que son por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% homologas o idénticas con una secuencia de origen de aminoácidos; secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienén una actividad de un polipéptido de la presente invención y que tienen por lo menos aproximadamente el 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más de homología o identidad con una secuencia de aminoácidos de origen; secuencias de nucleótidos que difieren desde 1 hasta aproximadamente 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 o más substituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos, tales como variantes alélicas, de la secuencia de ácido nucleico de origen; ácidos nucleicos derivados de y evolucional mente relacionados con una secuencia de ácido nucleico de origen; y los complementos de, y secuencias de nucleótidos resultantes de la degeneración del código genético, para todos los ácidos nucleicos anteriores y otros ¡ ácidos nucleicos de la presente invención. Los ácidos nucleicos de la presente invención también incluyen homólogos. Por ejemplo, i ortólogos y parálogos, de secuencias de ácido nucleico de origen y también variantes de las secuencias de ácido nucleico de origen las cuales han sido optimizadas en el codón para la expresión en un organismo particular (por ejemplo, una célula huésped). 1 El término "enlazado de manera operable", cuando se describe la relación entre dos regiones de ácido nucleico, se refiere a una yuxtaposición en donde las regiones se encuentran en una relación que permite que funcionentde una manera pretendida común. Por ejemplo, una secuencia de control "enlazada de manera operable" para codificar la secuencia está ligada de una manera a esa expresión de la secuencia de codificación que es lograda bajo condiciones compatibles con las consecuencias de control, tales como cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, inductores ! y polimerasas) son enlazadas al control o a las secuencias í ¦ regulatorias. El término "polipéptido", y los términos "proteína" y "péptido" que son utilizados de manera intercambiable en la presente descripción, se refieren a un polímero de aminoácidos. Los polipéptidos de ejemplo incluyen productos del gen, proteínas que ocurren naturalmente, homólogos, ortólogds, parálogos, fragmentos, y otros equivalentes, variantes y i i análogos a los anteriores. Los términos "fragmento de polipéptido" o "fragmento", cuando son utilizados en referencia a un polipéptido de referencia, se refieren a un polipéptido en el cual los rtesidu s de aminoácido son eliminados comparados con los polipéptidos de referencia mismos, pero en donde las secuencias restantes de aminoácidos son generalmente idénticas a las posiciones I I correspondientes al polipéptido de referencia. Dichas eliminaciones pueden incluir en la terminal amino d en -la terminal carboxi de los polipéptidos de referencia, o alternativamente en ambas. Los fragmentos generalmente s0n de por lo menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de largo, por lo menos ! i 14 aminoácidos de largo, por lo menos 20, 30, 40 ó 50 aminoácidos de largo, por lo menos 75 aminoácidos de largo, o por lo menos 100, 150, 200, 300, 500 o más aminoácidos de largo. Un fragmento puede retener una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En ciertas modalidades, un fragmento puede comprender un dominio que tiene una actividad biológica deseada, y opcional mente aminoácidos adicionales en uno o ambos lados del domjnio, en los cuales los aminoácidos adicionales pueden tener un número de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, o hasta 100 o más residuos. Además, los fragmentos pueden incluir un sub-fragmento^ de una región específica, la cual es un sub-fragmento que retiene una función de la región de la cual es derivado. En otra modalidad, un fragmento puede tener propiedades inmunogénicas. El término "polipéptido de la invención'' se refiere a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de '< I origen, o un equivalente o fragmento de la misma. Los ! ! polipéptidos de la presente invención incluyen polipéptidos que contienen todos o una porción de las secuencias de aminoácidos de origen; una secuencia de aminoácidos de origen con de 1 hasta aproximadamente 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50 , 75 o más substituciones de aminoácidos conservadoras; como la secuencia de aminoácidos que es por lo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de origen; y los fragmentos funcionales de la misma. Los polipéptidos de la presente invención también incluyen homólogos, por ejemplo, ortólogos y parálogos, de una secuencia de aminoácidos de origen. También es posible modificar las estructuras de lós polipéptidos de la presente invención para dichos propósitos tales como mejorar la eficacia terapéutica o profiláctica, o la estabilidad (por ejemplo, la vida en el almacén ex vivo, la resistencia a la degradación proteolítica in vivo, etc.). Dichos polipéptidos modificados, cuando son diseñados para jretener por lo menos una actividad de la forma de proteínas que ocurren naturalmente, son considerados "equivalentes i funcionales" de los polipéptidos descritos con mayor detalle en esta descripción. Dichos polipéptidos modificados pueden ser producidos, por ejemplo, mediante substituciones, eliminacionés o adiciones de aminoácidos, cuyas substituciones pueden consistir en substituciones completas o parciales conservadoras de los aminoácidos. Por ejemplo, es razonable esperar que una substitución conservadora de aminoácidos aislada, tal como el reemplazo de : í una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por Un glutamato, una treonina por una serina, no tendrá un efecto mayor en la actividad biológica de la molécula resultante. En donde puede ser determinada fácilmente si un cambió en la secuencia de aminoácidos del polipéptido da como resultado un homólogo funcional evaluando la capacidad del polipéptido variante para producir una respuesta similar a la de la proteína de tipo natural. Los polipéptidos en los cuales ha tenido lugar más de un reemplazo pueden ser fácilmente probados de la misma manera. El término "purificado" se refiere a una especie obj!eto que es una especie predominante presente (por ejemplo, en una base molar y que es más abundante que cualquier otra ¡especie individual en la composición). Una "fracción purificada" : es una j i composición en donde las especies objeto son por lo menos aproximadamente el 50% (en una base molar) de todas las especies presentes. Para hacer la determinación de la pureza o una especie en solución o dispersión, el solvente o matriz en la cual es disuelta o dispersada la especie generalmente no está incluida en dicha determinación; en vez de ello, solamente lás especies (incluyendo la de interés) disueltas o dispersadas son tomadas en cuenta. Generalmente, una composición purificada tendrá una especie que es más de aproximadamente el ,80% de todas las especies presentes en la composición, más de aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más de todas las especies presentes. Las especies objeto pueden ser purificadas en una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden ser detectadas en la composición mediante métodos convencionales de detección) en donde la composición es esencialmente una sola especie. Un experto en la técnica puede purificar un polipéptido de la invención utilizando técnicas estándar para la purificación de proteínas a la luz de lás enseñanzas de la presente invención. La pureza de un polipéptido puede ser determinada por un número de métodos conocidos en la técnica, que incluyen por ejemplo, análisis de las secuencias de aminoácidos de la terminal amino, electroforesis de gel, análisis de espectrometría de masa y los métodos aquí descritos. ! Los términos "proteína recombinante" o "polipéptido recombinante" se refieren a un polipéptido el cual es producido por técnicas de ADN recombinante. Un ejemplo de dichas técnicas incluye el caso cuando la codificación del ADN de ¡la proteína expresada es insertada en un vector de expresión adecuado el cual es a la vez utilizado para transforrnar una célula huésped para producir la proteína o polipéptido codificado por el ADN. El término "secuencia regulatoria" es un término genérico utilizado en toda la presente descripción para referirse a secuencias de polinucleótidos, tales como las señales dé inicio, mejoradoras, moduladoras y promotoras, que son necesarias o deseables para afectar la expresión de codificación y lás secuencias de no codificación a las cuales están enlazadas de manera operable. Las secuencias regulatorias de ejemplo $e describen en el libro de Goeddel; en "Tecnología de la Expresión del Gen: Métodos en Enzimología" (Gene Ex ressipn Technology: Methods in Enzymology) , Academic Press, San Diego, CA (1990), e incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos y tardíos del SV40, adenovirus o citomegalovirus tempranos inmediatos promotores, el sistema lac, el sistema tip, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión es detectada por la polimerasa T7 de ARN, las regiones mayores de operador y promotor de lambda fago, las regiones de control de la proteína de recubrimiento fd, el promotor para la cinasa 3-fosfoglicerato u otras enzimas glícolíticas, los promotores de ,la fosfatasa ácida (por ejemplo, Pho5), los promotores de los factores de acoplamiento a de levadura, los promotores de polihedro del sistema de baculovirus y otras secuencias conocidas que controla la expresión de genes de las células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y combinaciones (Je variaciones de las mismas. La naturaleza y uso de dichas secuencias de control puede diferir dependiendo del organismo huésped. En los procariotes, dichas secuencias regulatoriiás generalmente incluyen promotores, sitios de enlace del ribosoma, y secuencias de terminación de transcripción. El término "secuencia regulatoria" pretende incluir, como mínimo, componentes cuya presencia puede influir en la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y asociados de fusión! En ciertas modalidades, la transcripción de una secuencia de polinucleótidos se encuentra bajo el control de una secuencia promotora (u otra secuencia regulatoria) la cual controla la expresión del polinucleótido en un tipo de célula én la cual se pretende la expresión. También deberá quedar entendido que los polinucleótidos pueden estar bajo el control de las secuencias regulatorias las cuales son ¡guíales o diferentes a aquellas secuencias que controlan la expresión de la forma que ocurre de manera natural del polinucleótidol El término "homología de secuencia" se refiere a la proporción de acoplamientos de bases entre dos secuencias de ácidos nucleicos o la proporción de acoplamientos de aminoácidos entre dos secuencias de aminoácidos. Cuando la homología de la secuencia es expresada como un porcentaje, por ejemplo, el 50%, el porcentaje indica la proporción de acoplamiento en la longitud de la secuencia de una secuencia deseada que es comparada con alguna otra secuencia. Las aberturas (ya sea de las dos secuencias) son permitidas para maximizar el acoplamiento; las longitudes de las aberturas de 15 bases o menores generalmente son utilizadas, de 6 bases o menores son utilizadas más frecuentemente, siendo utilizadas las de dos bases todavía de una manera más frecuente. El término "identidad de secuencia" significa que las secuencias son idénticas (por ejemplo, en una base de nucleót|ido por nucleótido para los ácidos nucleicos o una base de aminoácido por aminoácido para los polipéptidos) sobre una ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" I es calculado comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales los aminoácidos o nucleótidos idénticos ocurren en ambas secuencias para producir el número de posiciones acopladas, dividiendo el número de posiciones acopladas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de la identidad de secuencia. Los métodos para calcular la identidad de secuencia son conocidos para los expertos en la técnica y descritos con mayor detalle más adelante. ¡ El término "soluble" como se usa en la presente i descripción con referencia a un polipéptido de la presente invención u otra proteína, significa que al momento de lia expresión en el cultivo celular, por lo menos alguna porción del polipéptido o proteína expresado permanece en la fracción citoplásmica de la célula y no se fracciona con los desechps celulares al momento de la lisis y centrifugación del lisato. La solubilidad de un polipéptido puede ser aumentada mediante una variedad de métodos reconocidos en la técnica, incluyendo la fusión a una secuencia de aminoácidos heteróloga, la eliminación de residuos de aminoácidos, la substitución de aminoácidos (por ejemplo, enriqueciendo la secuencia cpn residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrof ílicas) , y la modificación química (por ejemplo, la adición de un grupo hid rof ílico) . La solubilidad de los polipéptidos puede ser medida utilizando una variedad de técnicas reconocidas en él arte, incluyendo, la difusión de luz dinámica para determinar la condición de agregación, la absorción UV, centrifugación para separar los agregados del material no agregado, la electroforesis de gel SDS (por ejemplo, la cantidad de proteína en la fracción soluble comparada con la cantidad de proteína en las fracciones soluble e insoluble combinadas). Cuando es expresada en la célula huésped, los polipéptidos de la presente invención pueden ser por lo menos de aproximadamente el 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más solubles, por ejemplo, por lo menos aproximadamente el 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%', 90% o más de la cantidad total de la proteína expresada en las células se encuentra en la fracción del citoplasma. En ciertas modalidades, un litro de cultivo de células que expresan un polipéptido de la presente invención producirá por lo menos i aproximadamente 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 miligramos o más de la proteína soluble. En una modalidad de ejemplo, un polipéptido de la presente invención es por lo menos aproximadamente el 10% soluble y producirá por lo menos aproximadamente 1 miligramo de proteína de un cultivo de células de un litro. El término "híbrida específicamente" se refiere al enlace I ¡ de ácido nucleico detectable y específico. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención hibridan selectivamente a los hilos de ácido nucleico bajo las condiciones de hibridación y lavado que minimizan las cantidades apreciables del enlace que se puede detectar a los ácidos nucleicos no específicos. Las condiciones severas pueden ser utilizadas para lograr las condiciones selectivas de j hibridación como son conocidas en la técnica y explicadas en esta descripción. Generalmente, la homología de la secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, y ácidos nucleicos de la presente invención y la secuencia de ácido nucleico de interés será de por lo menos el 30%, 40%, i j 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, o más. En ciertos casos, las condiciones de hibridación y lavado se llevan a cabo bajo condiciones severas de acuerdo con lós procedimientos convencionales de hibridación y tal y como se describe más adelante. Los términos "condiciones severas" o "condiciones severas de hibridación" se refieren a condiciones las cuales promueven la hibridación específica entre dos hilos de polinucleótidos ( G complementarios como para formar un dúplex. Las condiciones severas pueden ser seleccionadas para que séan de aproximadamente de 5°C inferiores al punto de fusión ¡térmica (Tm) para un dúplex de polinucleótidos determinado en una resistencia iónica y pH definidos. La longitud de los hilos de polinucleótido complementarios y su contenido de GC determinarán la Tm del dúplex, y por lo tanto las condiciones de hibridación necesarias para obtener una especificidad deseada de hibridación. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definido) en la cual el 50% de las secuencias de polinucleótidos híbrida a un hilo complementario acoplado de manera perfecta. En ciertos casos, puede ser deseable I ¡ aumentar la severidad de las condiciones de hibridación para que sea aproximadamente igual a la Tm para un ¡ dúplex particular. I· Hay una variedad disponible de técnicas para calcular la Tm. Generalmente, los pares básicos G-C en un dúplex són estimados para contribuir en una temperatura de aproximadamente 3°C a la Tm, mientras que los pares básicos A-T son estimados que contribuyen en aproximadamente 2°C, hasta un máximo teórico de aproximadamente 80°C a 100°C. Sin embargo, los modelos más sofisticados de Tm están disponibles en los cuales las interacciones de apilado de G-C, los efectos del solvente, la temperatura deseada del ensayo' y similares son tomados en cuenta. Por ejemplo, las muestras pueden ser diseñadas para que tengan una temperatura de disociación (Td) de aproximadamente 60°C, utilizando la formula: Td = (((3 x #GC) + (2 x #AT)) x 37) - 562)/#bp); - 5; en donde #GC, #AT, y #bp son el número de pares básicos de guanina-citocina, el número de pares básicos de adeniria- timina, y el número de pares básicos totales, respectivamente, involucrados en la formación del dúplex. La hibridación se puede llevar a cabo en 5x SSC, 4x SSC, 3x SSC, 2x SSC, 1x SSC o 0.2x SSC durante aproximadamente 1 hora, 2 horas, 5 horas, 12 horas, o 24 horas. La temperatura de la hibridación puede ser aumentada para ajustar la severidad I de la reacción, por ejemplo, de aproximadamente 25°C (temperatura ambiente), hasta aproximadamente 45°C, 50°p, 55°C, 60°C, o 65°C. La reacción de hibridación también puede incluir otro agente que afecta la severidad, por ejemplo, la hibridación conducida en la presencia del 50% de form amida aumenta la severidad de hibridación en una temperatura definida. La reacción de hibridación puede ser seguida por un solo paso de lavado, o dos o más pasos de lavado, la cual puede ser en una salinidad y temperatura igual o diferente. Por ejemplo, la temperatura del lavado puede ser aumentada para ajustar la severidad de aproximadamente 25°C (temperatura ambiente), hasta aproximadamente 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, o' mayor. El paso de lavado puede ser conducido en la presencia de un detergente, por ejemplo, SDS al 0.1 ó 0.2%. Por ejemplo, la hibridación puede ser seguida por dos pasos de lavado a una temperatura de 65°C cada uno por aproximadamente 20 minutos t en 2x SSC, SDS al 0.1%, y opcionalmente dos pasos dé lavado adicionales a una temperatura de 65°C cada uno por aproximadamente 20 minutos en 0.2x SSC, SDS al 0.1%. | Las condiciones de hibridación severa de ejemplo incluyen la hibridación durante la noche a una temperatura de 65°C en una solución que contiene formamida al 50%, 10x Denhardt (Ficoll al 0.2%, polivinilpirrolidona la 0.2%, albúmina de suero i bovino al 0.2%) y 200 pg/ml de ADN del portador desnaturalizado, por ejemplo, salmón despojado del A!DN del I esperma, seguido por dos pasos de lavado a una temperatura de 65°C cada uno durante aproximadamente 20 minutos en 2x SSC, SDS al 0.1%, y dos pasos de lavado a una temperatura de 65°C cada uno por aproximadamente 20 minutos en 0.2x SSC, SDS al 0.1 %. ' ! La hibridación puede consistir de la hibridación de dos i ácidos nucleicos en solución, o un ácido nucleico en solución a un ácido nucleico enlazado a un soporte sólido, por ejemplo, un filtro. Cuando un ácido nucleico se encuentra en un (soporte sólido, el paso de prehibridación puede ser conducido antes de la hibridación. La prehibridación puede ser llevada a cabo por al menos aproximadamente 1 hora, 3 horas o 10 horas en la misma solución y en la misma temperatura que la solución de i i hibridación (sin el hilo complementario de polinucleótidos) . Las condiciones de severidad apropiadas son conocidas para aquellos expertos en la técnica o pueden ser determinadas experimentalmente por un experto en la técnica. Ver, por i i ejemplo, "Protocolos Actuales en Biología Molecular" (Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons, N.Y. (1989), páginas 6.3.1 a 12.3.6; Sambrook y asociados, 1989, "Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio" (Molecular Cloning, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Press, N.V.; S. Agrawal (ed.) "Métodos en Biología Molecular" (Methods in Molecular Biology), volumen 20; Tijssen (1993), "Técnicas de Laboratorio en Bioquímica y Biología Molecular - Hibridación con Muestras de Ácido Nucleico" (Laboratory Techniques lin Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization Whit Nucleic i ! Acid Probes), por ejemplo, parte I capítulo 2 "Revisión general de principios de hibridación y la estrategia de los ensayos de muestra de ácido nucleico" (Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays), Elsevier, Nueva York; y Tibanyenda, N. y asociados, Eur. J. Biochem. 139: página 19 (1984) y Ebel, S. y asociados, Biochem. 31: página 12083 (1992). El término "vector" se refiere a un ácido nucleico con capacidad de transportar a otro ácido nucleico al cual ha sido enlazado. Un tipo de vector el cual puede ser utilizado de acuerdo con la presente invención es un episoma, por ejemplo, un ácido nucleico capaz de una duplicación extra-cromosoma. Otros vectores incluyen los que son capaces de una dupücaci n autónoma y expresión de los ácidos nucleicos a losi cuales i | están enlazados. Los vectores con capacidad para dirigir la expresión de los genes a los cuales están enlazados operativamente son a los que nos referimos en la presente descripción como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante son con frecuencia en la forma de "plásmidos" los í cuales se refieren a las moléculas circulares de ADN de hilo doble las cuales, en su forma de vector no son enlazadas al cromosoma. En la presente solicitud, "plásmido" y "vector" se usan de manera intercambiable ya que el plásmido es lá forma más generalmente usada para el vector. Sin embargo, la I ! invención pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresión las cuales sirven para funciones equivalente^ y las cuales llegan a ser conocidas en la técnica posteriormente a las mismas. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser utilizados como reactivos de diagnóstico para detectar la presencia o ausencia de un ADN objetivo o secuencias de ARN a las cuales están enlazadas específicamente, tales como para determinar el nivel de expresión, del ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la presente invención contempla un método para detectar la presencia de un ácido nucleico de la invención o una porción del mismo en una muestra, el método tiene los pasos de: (a) proporcionar un oligonucleótido de por lo menos ocho nucleotidos de longitud, siendo complementario el oligonucleótido a una porción de ácido nucleico de la invención; (b) poner en contacto el oligonucleótido con una muestra que contiene por lo menos un ácido nucleico bajo condiciones que permiten la hibridación del oligonucleótido con un ácido í nucleico de la invención o una porción del mismo; y (c) detectar la hibridación del oligonucleótido a un ácido nucleico en la muestra, detectando de esta manera la presencia de un ácido nucleico de la invención o una porción del mismo en la muestra. En otro aspecto, la presente invención contempla un método para detectar la presencia de un ácido nucleico de la invención o una porción del mismo en una muestra, media te (a) proporcionar un par de oligonucleotidos de un solo hiló, cada uno de los cuales es de por lo menos de ocho nucleótidos de longitud, complementario a las secuencias de ácido nucleico de la presente invención, y en donde las secuencias a las cualés son complementarios los oligonucleotidos son por lo menos de diez nucleótidos separados, y (b) poner en contacto los oligonucleotidos con una muestra que contiene por lo menos un ácido nucleico bajo condiciones de hibridación; (c) amplificar la secuencia de nucleótidos entre los dos cebador ies d r e oligonucleotidos; y (d) detectar la presencia de la secuencia amplificada, detectando de este modo la presencia de un ácido nucleico de la presente invención o una porción del mismo en la muestra. En otro aspecto de la presente invención, el polinucleótido i de la invención se proporciona en un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido de la presente invención y está enlazado de manera operable a por lo menos una secuencia regulatoria. Deberá quedar entendido que el diseño del vector de expresión puede depender de dichos factores como la elección de la célula huésped que va a ser transformada y/o el tipo de proteína i deseada para ser expresada. El número de copias del vector, la capacidad para controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como marcadores de antibiótico, debe de ser considerada. Un vector de expresión que contiene el polinucleótido de la presente invención entonces puede ser utilizado cómo un agente farmacéutico para tratar a un animal infectado con ß. hyodysenteriae o como una vacuna (también como un ; agente farmacéutico) para prevenir que el animal sea infectado con la bacteria B. hyodysenteriae , o para reducir los síntomas y el curso de la enfermedad si el animal llega a quedar infectado. Una manera de utilizar un vector de expresión como un agente farmacéutico es administrar la vacuna de ácido nucleico al animal en riesgo de ser infectado o al animal después de haber sido infectado. La tecnología de la vacuna de ácido nucleico es bien descrita en la técnica. Algunas descripciones se pueden encontrar en la Patente Norteamericana 6,562,376 (hHóoper y asociados); la Patente Norteamericana 5,589,466 (Feigner, ¡ y asociados); la Patente Norteamericana 6,673,776 (Feigner, y asociados); y la Patente Norteamericana 6,710,035 (Feigner, y i asociados). Las vacunas de ácido nucleico pueden ser inyectadas en el músculo o intradérmicamente, pueden ser electroporadas dentro del animal (ver el documento WO 01/23537, King y asociados; y el documento WO 01/68889, Malone y asociados), por medio de composiciones de lípidos (ver la Patente Norteamericana 5,703,055, Feigner, y asociados), u otros mecanismos conocidos en el campo técnico.

Los vectores de expresión también pueden ser transfectados en las bacterias los cuales pueden sjer administrados al animal objetivo para inducir la respuesta I inmune a la proteína codificada por los nucleótidos de esta invención contenidos en el vector de expresión. El vector de expresión puede contener secuencias de expresión ecucarióticas de modo que los nucleótidos de la presente invención son transcritos y traducidos en el animal huésped. Alternativamente, el vector de expresión puede ser transcrito en la bacteria y luego traducido al animal huésped. Las bacterias utilizadas como vehículo del vector de expresión deben ser atenuadas pero todavía invasivas. Se pueden utilizar Shigella ¡ i spp., Salmonella spp., Escherichia spp., y Aeromonas spp., solo para nombrar algunas cuantas, que han sido atenuadas pero todavía invasivas. Los ejemplos de estos métodos se pueden í encontrar en la Patente Norteamericana 5,824,538 (Branstrom y asociados); la Patente Norteamericana 5,877,159 (Powell, y asociados); la Patente Norteamericana 6,150,170 (Powell, y asociados); la Patente Norteamericana 6,500,419 (Hone, y í asociados); y la Patente Norteamericana 6,682,729 (Powell, y asociados) . Alternativamente, los polinucleótidos de la presente invención pueden ser colocados en ciertos virus los, cuales accionan un vector. Los vectores virales pueden ya sea expresar las proteínas de la presente invención en la superficie del virus, o ser portadores de los polinucleótidos de la presente invención en una célula de animal en donde el polinucleotido es transcrito y traducido a la proteína. El animal infectado ¡con los vectores virales puede desarrollar una respuesta inmune a las proteínas codificadas por los polinucleótidos de la pjresente invención. Por lo tanto se puede aliviar o prevenir una infección por B. hyodysenteriae en el animal que recibió los vectores virales. Los ejemplos de los vectores virales se pueden encontrar en la Patente Norteamericana No. 5,283,191 (Morgpn y asociados); la Patente- Norteamericana No. 5,554,525 (Sondermeijer y asociados) y Patente Norteamericana No. 5,712,1 18 (Murphy). ! El polinucleotido de la presente invención puede ser I utilizado para ocasionar la expresión o sobre-expresión de un polipéptido de la presente invención en células propagadas en cultivo, por ejemplo, para producir proteínas o polipéptidos, incluyendo proteínas de fusión o polipéptidos. La presente invención pertenece a una célula huésped transf ectada con un gen recombinante con el objeto de expresar un polipéptido de la presente invención. La célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un polipéptido de la presente invención puede ser expresado por células bacteriales, tales como E. coli, 'células de insectos (baculovirus) , levadura, plantas, o células de mamífero. En esos casos en donde las células son humanas, puede o no ser un sujeto vivo. Otras células huésped adecuadas son conocidas para los expertos en la técnica. Adicionalmente, las células huésped pueden ser suplementadás con moléculas de tARN que no se encuentran generalmente en el huésped como para optimizar la expresión del polipéptido. i Alternativamente, la secuencia de nucleótidos puede ser alterada para optimizar la expresión en la célula huésped, y todavía la proteína producida tendría una alta homología con la proteína codificada originalmente. Otros métodos adecuados para maximizar la expresión de los polipéptidos serán i conocidos para los expertos en la técnica. La presente invención pertenece además a métodos de producción de polipéptidos de la presente invención. Por 1 ejemplo, una célula huésped transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido de la invención puede ser cultivada bajo condiciones apropiadas para permitir que ocurra la expresión del polipéptido. Los polipéptidos pueden ser secretados y aislados de una mezcla de células y el me;dio que contiene el polipéptido. Alternativamente, el polipéptido puede ser retenido de manera citoplásmica y las células recolectadas, i lisadas y la proteína aislada. Un cultivo de células incluye células huésped, medios y otros derivados. Los medios adecuados para el cultivo de células son bien conocidos en la técnica. El polipéptido puede ser aislado de un medio de cultivo de células, células huésped, i !. o ambos utilizando técnicas conocidas en el arte para la purificación de proteínas, incluyendo cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de filtración de gél, u Itraf i Itración , electroforesis, y purificación por inmuno-afinidad con anticuerpos específicos para epítopes particulares de un polipéptido de la presente invención. ' Por lo tanto, las secuencias de nucleótidos que codifican todo o una porción seleccionada del polipéptido de la invención, pueden ser utilizadas para producir una forma recombinante de la proteína por medio de procesos microbiales o celulares eucarióticos. Ligando la secuencia en una construcción de polinucleótidos, tal como un vector de expresión, y transformando o transfectando los huéspedes, ya sea eucarióticos (de levadura, aves, insectos o mamíferos) o procarióticos (células bacteriales), son procedimientos estándar. Se pueden emplear procedimientos similares, o modificaciones de los mismos, para preparar polipéptidos recombinantes de la presente invención por medios microbiales o tecnología de cultivo de tejidos. Los vectores adecuados para la expresión de un polipéptido de la presente invención incluyen plásmidos¡ de los tipos de: plásmidos derivados de pTrcHis, plásmidos derivados de pET, plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procarióticas, tales como E. coli. Los diferentes métodos empleados en la preparación de los plásmidos y la transformación de los organismos huésped son bien conocidos en la técnica. Para otros sistemas adecuados de ex|pres¡< n tanto para células ecucarióticas como procarióticas, así como los procedimientos recom binantes en general, consultar el libro "Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio" (Molecular Cloning, A Laboratory Manual), 2a Ed., editores Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Capítulos 16 y 17. j La codificación de secuencias para un polipéptido de interés puede ser incorporada como parte de un gen dé fusión que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica polipéptidos diferentes. La presente invención conternpla Un polinucleótido aislado que contiene un ácido nucleico de la invención y por lo menos una secuencia heteróloga que codifica ! j el péptido heterólogo enlazado en el marco a la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de la presente invención como para codificar una proteína de fusión que contiene los polipéptidos heterólogos. El polipéptido heterológo puede ser fusionado a (a) la terminal-C del polipéptido de la invención, (b) la terminal-N del polipéptido de la invención, o (c) la termina C y la terminal-N del polipéptido de la invención. En ciertos casos, la secuencia heterologa codifica un polipéptido y permite la detección, aislamiento, solubilización y/o estabilización del polipéptido al cual es fusionado. Todavía en otras modalidades, la secuencia heterologa codifica un polipéptido tal comojun poli í His tag, myc, HA, GST, proteína A, proteína G, péptido de enlace de calmodulina, tio-redoxina, proteína de enlace de maltosa, poli arginina, poli His-Asp, FLAG, una porción de una proteína de inmunoglobulina, y un péptido de transcitosis. Los sistemas de expresión de fusión pueden ser útiles cuando se desea producir un fragmento inmunogénico' de un polipéptido de la invención. Por ejemplo, la proteína cápsida VP6 del rotavirus puede ser utilizada como una proteína portadora inmunológica para porciones del polipéptido, | ya sea en una forma monomérica o en la forma de una partícula viral. Las secuencias de ácido nucleico correspondientes a la iporcion de un polipéptido de la invención a las cuales pueden ser incorporados los anticuerpos que van a ser originados en la construcción del gen de fusión el cual incluye secuen jcias de codificación para las últimas proteínas estructurales del virus de vacuna para producir un conjunto de virus recombinantes que expresan proteínas de fusión que comprenden una porción de la proteína como parte del virión. El antígeno de superficie de la Hepatitis B también puede ser utilizado en este rol. De un modo similar, las construcciones quiméricas que codifican las proteínas de fusión que contienen una porción de un polipéptido de la presente invención y la proteína cápsida del poliovirus pueden ser creadas para mejorar la inmunogenicidad (ver, por ejemplo, la Publicación Europea No. 0259149; y el artículo de Evans y asociados, (1989) Nature 339: página 385; el dé Huang y asociados, (1988) J. Virol. 62: página 3855; y el de Sc lieng¡er y asociados, (1992) J. Virol. 66: página 2). Las proteínas de fusión pueden facilitar la expresión y/o purificación de las proteínas. Por ejemplo, un polipéptido de la presente invención puede ser generado como una proteína de fusión de glutationa-S-transferasa (GST). Dicha protéína de fusión GST puede ser utilizada para simplificar la purificación de un polipéptido de la invención, tal como a través del; uso de matrices derivadas de glutationa (ver, por ejemplo, el libro de "Protocolos Actuales en Biología Molecular" (Current Protocols in Molecular Biology), eds. Ausubel y asociados, (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)). En otra modalidad, un gen de fusión que codifica para una purificación de la secuencia líder, tal como un i sitio de disociación de poli-(His)/enterocinasa de la secuencia en la terminal-N de la porción deseada de la proteína recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada mediante cromatografía de afinidad utilizando una resina de metal Ni2 + . La secuencia líder de purificación puede entonces ser removida posteriormente mediante el i I tratamiento con enterocinasa para producir una proteína purificada (por ejemplo, ver la publicación de Hochuli y asociados, (1987) J. Chromatography 411: página 177; y la de ! | Janknecht y asociados, PNAS EUA 88: página 8972). Las técnicas para hacer los genes de fusión son bién conocidas. Esencialmente, la unión de varios fragmentos de í . | ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptidos se realiza de acuerdo con técnicas convencionales, empleando la ligación de puntas desafiladas o terminales de extremo i escalonado, la digestión de enzimas de restricción para producir las terminales apropiadas, llenando de extremps cohesivos según sea apropiado, el tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseable y la ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión puede ser sintetizado mediante técnicas convencionales incluyendo j ¡ si ntetizadores automáticos de ADN. Alternativamente, se puede llevar a cabo la amplificación PCR de fragmentos del gen i utilizando cebadores ancla los cuales originan los colgantes de complementaridad entre dos fragmentos de gen consecutivas los cuales pueden ser subsecuentemente recocidos para f generar una secuencia de gen quimérica (ver, por ejemplo, "Protocolos Actuales de Biología Molecular" (Current Protocóls in Molecular Biology), eds. Ausubel y asociados, John Wiley & Sons: 1992). En otras modalidades, la presente invención proporciona ácidos nucleicos de la invención inmovilizados en superficie sólida, incluyendo, placas, placas de microtitulación, diapositivas, cuentas, partículas, esferas, películas, hilos, i precipitados, geles, hojas, tubos, contenedores, capilares, almohadillas, empalmes, etc. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser inmovilizados en un chip como parte de una adaptación. La adaptación puede tener uno o mas polinucleótidos de la invención como aquí se describen. En una modalidad, el chip contiene uno o más polinucleótidos de la invención como parte de una adaptación de secuencias de ! polinucleótidos de la misma especie patogénica de dicho polinucleótido. En una forma preferida de la presente invención se I proporcionan polipéptidos de B. hyodysenteriae aislados como aquí se describieron, y también las secuencias de polinucleótidos que codifican estos polipéptidos. De una manera más deseable, se proporcionan los polipéptidos de B. hyodysenteriae en una forma su bstancial mente pura. Los polipéptidos preferidos de la presente invención tendrán una o más propiedades biológicas (por ejemplo, \in vivo, in vitro o propiedades inmunológicas) de los polipéptidos de longitud completa naturales. Los polipéptidos no funcionales ? i también están incluidos dentro del alcance de la presente invención debido a que pueden ser útiles, por ejemplo,, como antagonistas de los polipéptidos funcionales. Las propiedades biológicas de los análogos, fragmentos o derivados relacionados con el tipo natural pueden ser determinados, por ejemplo, por medio de ensayos biológicos. Los polipéptidos, incluyendo análogos, fragmentos y derivados, pueden ser preparados sintéticamente (por ejemplo, utilizando técnicas bien conocidas de fase sólida o síntesis de péptidos de fase de solución). Preferentemente, se emplean técnicas sintéticas de fase sólida. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden ser preparados utilizando técnicas de ingeniería genética bien conocidas, como se describieron anteriormente. Todavía en otra modalidad, lós polipéptidos pueden ser purificados (por ejemplo, mediante la purificación por inmuno-afinidad) de fluidos biológicos, talés como pero sin limitarse a plasma, materias fecales, suero, u orina de animales, incluyendo, pero sin limitarse a, cerdos, pollos, gansos, patos, pavos, pericos, humanos, monos, ' perros, gatos, caballos, hámsters, jerbos, conejos, hurones, caballos, ganado y ovejas. Los análogos de polipéptidos de B. hyodysenteriae incluyen aquellos polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos, en donde uno o más de los aminoácidos son substituidos por otros aminoácidos cuyas substituciones no alteran substancialmente la actividad biológica de la molécula.

De acuerdo con la presente invención, los polipéptidos de la invención producidos de manera recombinante o mediante síntesis química y fragmentos u otros derivados o análogos de los mismos, incluyendo proteínas de fusión, pueden ser utilizados como un inmunógeno para generar anticuerpos que reconocen los polipéptidos. j Una molécula es "antigénica" cuando tiene la capacidad de interactuar específicamente con una molécula de reconocimiento del antígeno del sistema inmune, tal como una ¡nmunoglobulina (anticuerpo) o un receptor del antígeno de la célula T. Una secuencia de aminoácidos antigénica contiene por lo menos aproximadamente 5, y preferentemente por I o: menos aproximadamente 10 aminoácidos. Una porción antigénica ele una molécula puede ser la porción que es inmunodominante para el anticuerpo o el reconocimiento del receptor de lá célula T, o puede ser una porción utilizada para generar un anticuerpo para la molécula conjugando la porción antigénica a upa molécula portadora para la inmunización. Una molécula; que es 1 antigénica no necesita ser inmunogénica por si misma, por ejemplo, con capacidad de promover una respuesta inmune sin un vehículo. ; Un "anticuerpo" es cualquier ¡nmunoglobulina, incluyendo anticuerpos o fragmentos de los mismos, que se enlaza a un epítope específico. El término comprende anticuerpos policlonales, monoclonales, y quiméricos, habiendo sido descritos con mayor detalle los íntimos mencionados i en lás Patentes Norteamericanas Nos. 4,816,397 y 4,816,567, así como las porciones de enlace de antígeno de los anticuerpos, incluyendo Fab, F(ab')2 y F(v) (incluyendo anticuerpos de una sola cadena). Por consiguiente, la frase "molécula de anticuerpo" en sus diferentes formas gramaticales como se usa en la presente descripción contempla ambos una molécula de Í inmunoglobulina intacta y una porción activa inmunológicamente de una molécula de inmunoglobulina que contiene el sitio ele combinación del anticuerpo. Un "sitio de combinación del anticuerpo" es la porción estructural de una molécula de anticuerpo que comprende regiones hipervariables y variables de cadena pesada y ligera que se enlazan específicamente al antígeno. Las moléculas de anticuerpo de ejemplo son moléculas ele inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina substancialmente intactas y aquellas porciones de una molécula de inmunoglobulina que contiene el paratope, incluyendo aquellas porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab', F(ab')2 y F(v), cuyas porciones son preferidas para utilizarse en los métodos terapéuticos aquí descritos. I Las porciones Fab y F(ab')2 de las moléculas de anticuerpo son preparadas mediante la reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, en moléculas de anticuerpos substancialmente intactas mediante métodos bien conocidos. Ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,342,566 otorgada a Theof ilopolous y asociados. Las porciones de molécula de anticuerpo Fab' también son bien conocidas y son producidas de porciones F(ab')2 seguidas por la reducción con mercaptoetanol de los enlaces de disulfuro que enlazan dos porciones de cadena pesada, y seguido por la alquilación del mercaptano de proteína resultante con un reactivo tal como yodoacetamida. Un anticuerpo que contiene moléculas intactas de anticuerpo es preferido en la presente invención. La frase "anticuerpo monoclonal" en sus diferentes! formjas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene solamente una especie de un sitio de combinación de anticuerpo capaz de inmuno-reaccionar con un antígeno particular. Un anticuerpo monoclonal por lo tanto generalmente muestra una sola afinidad de enlace para cualquier antígeno con el cual inmuno-reacciona. Un anticuerpo monoclonal puede por lo tanto contener una molécula de anticuerpo que tiene una pluralidad i de sitios de combinación del anticuerpo, cada una inmuno-específica para un antígeno diferente; por ejemplo, jU n anticuerpo monoclonal bi-específ ico (quimérico). El término "adyuvante" se refiere a un compuesto o mezcla que mejora la respuesta inmune para un antígeno. Un adyuvante puede servir como un depósito de tejidos que libera lentamente el antígeno y también como un activador del sistema linfoide que mejora de manera no específica la respuesta inmune [Hood y asociados, en Immunology, página 384, Segunda Edición., Benjamin/Cummings, Menlo Park, California (1984)]. Con frecuencia, una vacuna primaria con un antígeho solo, en la ausencia de un adyuvante, fallará para promover una respuesta inmune celular o humoral. Los adyuvantes incluyen, pero no están limitados a, el adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, substancias activas de ? , superficie tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o hidrocarburos, hemocianinas de penetración magnética, dinitrofejnol, j y adyuvantes humanos potencial mente útiles tales como BCG (bacille Calmette-G uerin) y Corynebacterium parvum. Preferentemente, el adyuvante es farmacéuticamente aceptable.

Varios procedimientos conocidos en la técnica pueden ser utilizados para la producción de anticuerpos policíonales para los polipéptidos de la presente invención. Para la producción de anticuerpos, varios animales huésped pueden ser inmunizadas mediante la inyección con el polipéptido de la invención, incluyendo pero sin limitarse a conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. En una modalidad, un polipéptido de la invención : i puede ser conjugado a un portador inmunogénico, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de penetración magnética (KLH). Varios adyuvantes pueden ser utilizados para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie del huésped, incluyendo pero sin limitarse a Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, substancias activas de superficie tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de penetración magnética, dinitrof enol, y potencialmente adyuvantes humanos útiles tales como BCG (bacille Calmette-G uerin) y Corynebacterium parvum. Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia un polipéptido de la invención, pueden ser utilizadas I cualquier técnica que proporcione la producción de las I moléculas del anticuerpo mediante líneas celulares continuas en el cultivo. Estos incluyen pero no están limitados a la técnica de hibridoma originalmente desarrollada por Kohler y asociados, (1975) Nature, 256: páginás 495 a 497, la técnica trioma, la técnica de hibridoma humano de célula-B [kozbor y asociados., (1983) Immunology Today, 4: página 72], y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos [Colé y asociados., (1985) in Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, paginas 77 a 96, Alan R. Liss, Inc.]. Las líneas celulares que producen anticuerpos inmortales pueden ser creadas mediante técnicas diferentes a la fusión, tales como la transformación directa ¡de los linfocitos B con un ADN oncogénico, o la transf ección con el virus de Epstein-Barr. Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; i 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; y 4,493,890. En una modalidad adicional de la presente invención, los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos en animales libres de gérmenes utilizando tecnologías recientes. De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos de pollos o cerdos ? pueden ser utilizados y pueden ser obtenidos utilizando hibridomas de pollos o cerdos o transformando las células B con el virus EBV in vitro. De hecho, de acuerdo con la presente invención, las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" [Morrison y asociados., (1984) J. Bacterio/., páginas 159 a 870; Neuberger y asociados., (1984) Nature, 312: páginas 604 a 608; Takeda y asociados,1 (1985) í i Nature, 314: páginas 452 a 454] empalmando los genes de una molécula de anticuerpo de ratón específica para un pol¡ipóptido de la invención junto con los genes de una molécula de anticuerpo de una actividad biológica apropiada pueden ser utilizados; dichos anticuerpos se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Dichos anticuerpos quiméricos son preferidos para utilizarse en la terapia de enfermedades] o padecimientos intestinales (descritos anteriormente), ya que es mucho menos probable que los anticuerpos xendgénicos induzcan una respuesta inmune, en particular una respuesta alérgica, por ellos mismos.

De acuerdo con la presente invención, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena ? (Patente Norteamericana No. 4,946,778) pueden ser adaptados para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos para un polipéptido de la invención. Una modalidad adicional de la presente invención utiliza las técnicas descritas para la construcción de las librerías de expresión Fab [Huse y asociados, (1989) Science, 246: páginas 1275 a 1281] para permitir la identificación rápida y fácil de los fragmentos Fab monoclonales con una especificidad deseada para un polipéptido de la invención. Los fragmentos de anticuerpos, que contienen el idiotipo i ! de la molécula del anticuerpo, pueden ser generados por técnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen pero no están limitados a: el fragmento F(ab')2 el cual puede ser producido mediante la digestión de pepsina de una molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden ser generados reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')¿, y lós fragmentos Fab que pueden ser generados tratando las moléculas del anticuerpo con papaína y un agente de reducciójn.

En la producción de anticuerpos, la selección del anticuerpo deseado se puede realizar mediante técnicas conocidas en el arte, por ejemplo, radioinmunoensayo, ¡ ELIsk, inmunoensayos de "emparedado", ensayos inmuno-radiométricos, reacciones de precipítina de difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos en e) sitio, (utilizando oro coloidal, enzimas y etiquetas de radioisótopo, por ejemplo), Western blots, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación de gel, ensayos de hemaglutinación) , ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de i proteína A, ensayos de inmuno-electroforesis, etc. En una modalidad, el enlace del anticuerpo es encontrado detectando una etiqueta en el anticuerpo primario. En otra modalidad, el anticuerpo primario es encontrado detectando el enlace de un segundo anticuerpo o un reactivo para el anticuerpo primario. En una modalidad adicional, el anticuerpo secundario es etiquetado. Se conocen en la técnica muchos medios para detectar el enlace en un inmunoensayo y se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un epítope espec fico de un polipéptido de la invención, se pueden ensayar los hibridomas generados para un producto que enlaza a un fragmento de un polipéptido de la invención que contiene dicho i epítope. La presente invención también cubre métodos de diagnóstico y pronóstico para detectar la presencia de la B. hyodysenteriae utilizando un polipéptido de la invención y/o anticuerpos que se enlazan al polipéptido de la invención y los equipos útiles para la diagnosis y pronóstico de las infeccionas í por B. hyodysenteriae. Los métodos de diagnóstico y pronóstico generalmente serán conducidos utilizando muestras biológicas obtenidas de un animal, tal como un pollo o cerdo. Una "muestra" se refiere a un tejido o fluido del animal que se sospecha que contiene la especie Brachyspira , tal como B. hyodysenteriae, o sus polinucleótidos o sus polipéptidos. Los ejemplos de dichos tejidos o fluidos incluyen, pero sin limitarse a, plasma; suero, materias fecales, orina, del pulmón, corazón, músculo esquelético, estómago, intestinos, o constituyentes delj cultivo celular in vi tro. La presente invención proporciona métodos para detectar la presencia de un polipéptido de la invención en una muestra, con los siguientes pasos: (a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene un polipéptido de la invención con un anticuerpo (preferentemente enlazado a un soporte sólido) que se enlaza específicamente al polipéptido de la invención bajo condiciones que permiten la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y el polipéptido de la invención; y (b) detectando la formación de los i | complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y el polipéptido de la invención en la muestra, en donde la | detección de la formación de los complejos de reacción indica la presencia del polipéptido de la invención en la muestra. Preferentemente, el anticuerpo utilizado en este método es derivado de un anticuerpo policlonal purificado por afinidad, y más preferentemente un anticuerpo monoclonal. Además, es preferible que las moléculas del anticuerpo aquí utilizadas se;an en la forma de porciones Fab, Fab', F(ab')2 o F(v) o moléculas completas del anticuerpo. Los métodos particularmente preferidos para detectar la bacteria B. hyodysenteriae basados en el método |anteríor incluyen los ensayos inmunoabsorbentes enlazados por enzima, los radioinmunoensayos, los ensayos inmuno-radiométricos y los ensayos inmunoenzimáticos, incluyendo los ensayos de emparedado que utilizan anticuerpos monoclonales y/o policlonales. i Tres de dichos procedimientos que son especialmente útiles usan ya sea el polipéptido de la invención (o un fragmento del mismo) etiquetado con una etiqueta que se puede detectar, un anticuerpo Abi etiquetado con una etiqueta que se puede detectar, o un anticuerpo Ab2 etiquetado con una etiqueta que se puede detectar. Los procedimientos pueden ser resumidos por las siguientes ecuaciones en donde el asterisco ' j indica que la partícula es etiquetada y "AA" permanece para los polipéptidos de la presente invención: i B. AA + Ab*, = AA Ab,* j C. AA + Ab! + Ab2* = Ab! AA Ab2* \ Los expertos en la técnica están familiarizados con los I procedimientos y su aplicación y por consiguiente pueden ser utilizados dentro del alcance de la presente invención. El procedimiento "competitivo", el Procedimiento A, se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 3,654,090 y 3,850,752. El Procedimiento B es representativo de técnicas de ensayo competitivas bien conocidas, el Procedimiento C, el I procedimiento "emparedado", se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. RE 31,006 y 4,016,043. Todavía son conocidos otros procedimientos, tales como el "anticuerpo doble" o procedimiento "DASP", y pueden ser utilizados. En cada caso, el polipéptido de la invención forma complejos con uno o más anticuerpos o asociados de enlace y un miembro del complejo es etiquetado con una etiqueta que se puede detectar. El hecho de que un complejo se haya formado y, si se desea, la cantidad del mismo, puede ser determinado por métodos aplicables a la detección de las etiquetas. I Se podrá ver por lo anterior, que la propiedad característica del Ab2 es que reaccionará con el Abi. Esta reacción es debida a que el Abi, originado en una especie de i mamífero, ha sido utilizado en otras especies como un ajntíge o para originar el anticuerpo Ab2. Por ejemplo, el anticuerpo Ab2 puede ser originado en las cabras utilizando anticuerpos de conejo como antígenos. Por lo tanto el anticuerpo Ab2 ?erá íin anticuerpo anti-conejo creado en las cabras. Para propósitos de esta descripción y las reivindicaciones, al anticuerpo Abi nós referiremos como un anticuerpo primario, y al anticuerpo Ab2 no referiremos como un anticuerpo secundario o anti-At . Las etiquetas más comúnmente empleadas para estos estudios son elementos radioactivos, enzimas, químicos que fluorecen cuando son expuestos a la luz ultravioleta, y otros. Los ejemplos de los materiales fluorescentes capaces de ser utilizados como etiquetas incluyen f luoresceína, rodamina y auramina. Un material de detección partic anti-conejo preparado en las cabras fluoresceína a través de un isotiocianato. isótopos preferidos incluyen 36CI, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125l, 13 , radioactiva puede ser detectada por cualesquiera de los procedimientos de conteo que están actualmente disponibles. Aunque muchas enzimas pueden ser utilizadas, los ejemplos de las enzimas preferidas son peroxidasa, ß-glucuronidasa, ß-D-glucosidasa, ß-D-galactosidasa, ureasa, glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las enzimas son conjugadas a las partículas seleccionadas mediante la reacción con moléculas de puente tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldeh ido y similares. Las etiquetas de enzimas pueden ser detectadas por cualquiera de las técnicas colorir étricas, espectofotométricas, fluoroespectrofotornétncás, i i amperométricas, y gasométricas actualmente utilizadas. Las Patentes Norteamericanas Nos. 3,654,090; 3,850,752; y 4,016,043 son a las que nos referimos a modo de ejemplo por su descripción de los materiales y métodos alternativos de etiquetación. La presente invención también proporciona un método de detección de anticuerpos a un polipéptido de la presente invención en muestras biológicas, utilizando los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido de la invención o un fragmento del mismo; (b) incubar una muestra biológica de dicho polipéptido de la invención bajo condiciones que pjermitjen la formación de un complejo de anticuerpo-antígenoj; y (c) determinar si el complejo de anticuerpo-antígeno icón el polipéptido de la invención es formado. En otra modalidad de la invención, se proporcionan métodos in vitro para evaluar el nivel de anticuerpos a un polipéptido de la invención en una muestra biológica utilizando los siguientes pasos: (a) detectar la formación de compiejos de reacción en una muestra biológica de acuerdo con el método indicado anteriormente; y (b) evaluar la cantidad de complejos de reacción formados, cuya cantidad de complejos de reacción corresponde al nivel del polipéptido de la invención en la muestra biológica. Adicionalmente se proporcionan métodos in vitreo para i ' ¡! monitorear el tratamiento terapéutico de una enfermedad asociada con la B. hyodysenteriae en un animal huésped evaluando, como se describió anteriormente, los niveles de I anticuerpos al polipéptido de la invención en una serie de muestras biológicas obtenidas en diferentes puntos del tiempo de un animal huésped que padece de dicho tratamiento terapéutico. La presente invención proporciona además métodos para detectar la presencia o ausencia de la bacteria B. hyodysenteriae en una muestra biológica mediante: (a) formar un puente en la muestra biológica en contacto con una muestra de polinucleotido o cebador de polinucleotido de la presente ! ! invención bajo condiciones adecuadas de hibridación!; y (b) detectar cualquier dúplex formado entre la muestra o el cebador y el ácido nucleico en la muestra. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la detección de la bacteria B. hyodysenteriae puede ser realizada amplificando directamente las secuencias de polinucleótidos de la muestra biológica, utilizando técnicjas conocidas y luego detectando la presencia del polinucleotido de las secuencias de la invención. ' En una forma de la invención, la secuencia objetivo de ácido nucleico es amplificada mediante PCR y luego detectada 1 utilizando cualquiera de los métodos específicos mencionados anteriormente. Otras técnicas de diagnóstico útiles para la detección de la presencia de secuencias de polinucleótidos incluyen, pero no están limitadas a: 1) PCR específico del alelo; 2) análisis de conformación de un solo hilo; 3) electrof oresis de desnaturalización de gel de gradiente; 4) ensayos de protección de RNase; 5) el uso de proteínas que reconocen los malos acoplamientos de los nucleótidos, tales como la proteína mutS de E. coli; 6) oligonucleótidos específicos del alelo; y 7) hibridación fluorescente en el sitio. Además de los métodos anteriores, las secuencias de polinucleótidos pueden ser detectadas utilizando la tecnología de muestra convencional. Cuando las muestras son utilizadas para detectar la presencia de las secuencias deseadas de polinucleótidos, la muestra biológica que va a ser analizada tal como sangre o suero, puede ser tratada, si se desea, p ra extraer los ácidos nucleicos. Las secuencias de polinucleótidos de muestras pueden ser preparadas de diferentes maneras para facilitar la detección de la secuencia objetivo; por ejemplo, la desnaturalización, digestión de restricción, electroforesis y manchado por puntos. La región objetivo de la muestra de la secuencia de polinucleótidos generalmente debe ser por lo menos parcialmente de un solo hilo para formar híbridos con las secuencias objetivo de la muestra. Si la secuencia es de un solo hilo naturalmente, no se requerirá la desnaturalización. Sin embargo, si la secuencia es de hilo doble, la secuencia probablemente necesitará ser desnaturalizada. La desnaturalización se puede llevar a cabo por diferentjes técnicas conocidas en el arte. Las secuencias de muestras de polinucleótidos y las muestras son incubadas bajo condiciones que promueven la formación de híbridos estables de la secuencia objetivo en la muestra con la secuencia de polinucleótidos putativa deseada en la muestra. Preferentemente, las condiciones de alta severidad son utilizadas con el objeto de prevenir los positivos falsos. La detección, si la hay, del híbrido resultante I generalmente se lleva a cabo mediante el uso de muestras etiquetadas. Alternativamente, la muestra puede ¡ser no etiquetada, pero puede ser detectable mediante el; enlace específico con un ligando que está etiquetado, ya sea directa o indirectamente. Las etiquetas adecuadas y métodos para la etiquetación de muestras y Mgandos son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, etiquetas radioactivas las cuales pueden ser incorporadas por métodos conocidjos (por ejemplo, translación de la construcción, preparación ale toriá o i i catalización) , biotina, grupos fluorescentes, j grupos quimioluminiscentes (por ejemplo, dioxetanos, particularmente dioxetanos detonados), enzimas, anticuerpos y similares. Las variaciones de este esquema básico son conocidas en la técnica, e incluyen aquellas variaciones que facilitan la separación de los híbridos que van a ser detectados de los materiales extraños y/o amplifican la señal de la porción etiquetada. También está contemplado dentro del alcance de jla presente invención que los ensayos de las muestras de ácido nucleico de la presente invención pueden emplear un cocktail de muestras de ácido nucleico con capacidad de detectar las secuencias deseadas de polinucleotidos de esta invención. Por lo tanto, en un ejemplo para detectar la presencia de secuencias de polinucleotidos de la presente invención en una muestra de célula, más de una muestra complementaria a una secuencia de polinucleotidos es empleada y en particular el número de diferentes muestras es alternativamente de 2, 3, ó 5 diferentes secuencias de muestras de ácido nucleico. j Las secuencias de polinucleotidos aquí descritas (preferentemente en la forma de muestras) también pueden ser inmovilizadas a un soporte de fase sólida para la detección jde especies de Brachyspira , incluyendo pero sin limitarse a B. hyodysenteriae, B.. intermedia , B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii , y B. pilosicoli . Alternativamente, las i secuencias de polinucleótido aquí descritas formarán parte de una librería de moléculas de ADN que puede ser utilizada para detectar simultáneamente un número de diferentes genes de la especie Brachyspira, tales como B. hyodysenteriae. ¡En una forma alternativa adicional de la presente invención, las secuencias de polinucleotidos aquí descritas junto con las otras secuencias de polinucleotidos (tales como de otras bacterias o virus) pueden ser inmovilizadas en un soporte sólido de una manera tal que permite la identificación de la presencia de upa I previamente formada aplicada a una posición separada en el substrato sólido. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos pueden ser impresas directamente en el substrato utilizando aparatos robóticos equipados ya sea con pernos o aparatos piezo eléctricos. Las secuencias de librería ge en o en regiones separadas de un puede ser poroso para permitir la inmovilización dentro del substrato o substancialmente no poroso, en cuyo cjaso las í secuencias de librería son típicamente inmovilizadas en la superficie del substrato. El substrato sólido se puede hacer de cualquier material al cual se pueden enlazar los polipeptidós, ya sea directa o indirectamente. Los ejemplos de los substratos sólidos adecuados incluyen vidrios planos, obleas de silicón, mica, cerámica y polímeros orgánicos tales como plásticos, incluyendo poliestireno y polimetacrilato. Puede ser | p o s i ti I e I también utilizar membranas semi-permeables tales como membranas de nitrocelulosa o nylon, las cuales son ampliamente disponibles. Las membranas semi-permeables pueden ser montadas en un soporte sólido más robusto t'al como un vidrio. Las superficies pueden ser recubiertas opcionalmente con una capa de metal, tal como oro, platino u otro metal ¡de transición. '¦ Preferentemente, el substrato sólido es generalmente un material que tiene una superficie rígida o semi-rígida. En I i modalidades preferidas, por lo menos una superficie del substrato será substancial mente plana, aunque en algunas modalidades puede ser deseable separar físicamente las regiones de síntesis para diferentes polímeros con, por ejemplo, regiones elevadas o trincheras grabadas al agua fuerte. También se prefiere que el substrato sólido sea adecuado para la aplicación de alta densidad de secuencias de ADN en áreas separadas típicamente de 50 a 100 µ?t?, dando una densidad de 10000 a 40000 puntos/cm"2. El substrato sólido es convenientemente dividido n secciones. Esto se puede lograr mediante técnicas como el fotograbado al agua fuerte, o mediante la aplicación de tintas hidrofóbicas, por ejemplo, tintas basadas en teflón (¿el-line, EUA) . Las posiciones separadas, en la cuales cada miembro diferente de la librería es localizado pueden tener cualquier i I forma conveniente, por ejemplo, circular, rectangular, elíptica, en forma de cuña, etc. El enlace de las secuencias de polinucleótidos al substrato puede ser mediante medios covalentes ¡ o no covalentes. Las secuencias de polinucleótidos pueden ser enlazadas al substrato por medio de una capa de moléculas a las cuales se enlazan las secuencias de la librería. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos pueden ser etiquetadas con biotina y el substrato es recubierto con avidina y/o estreptavidina. Una característica conveniente del uso de las secuencias biotiniladas de polinucleótidos es que la eficiencia del acoplamiento al substrato sólido puede ^er determinada fácilmente. Debido a que las secuencias de polinucleótidos pueden enlazarse solamente de manera deficiente a algunos sustratos sólidos, con frecuencia es necesario proporcionar una interfase química entre el substrato sólido (tal como en este caso el vidrio) y las secuencias de ácido nucleico. Los ejemplos de las interfases químicas adecuadas incluyen hexaetilénglicol. Otro ejemplo es el| uso de vidrio recubierto con polilisina, siendo entonces la polilisina modificada químicamente utilizando procedimientos estándar para introducir un ligando de afinidad. Otros métodos ¡para el enlace de moléculas a la superficie del substrato sólido mediante el uso de agentes de acoplamiento son conocidos en la técnica, ver por ejemplo, el documento WO 98/49557. El enlace de las secuencias complementarias de polinucleótidos a la librería inmovilizada de ácido nucleico puede ser determinado por una variedad de medios tales coijio cambios en las características ópticas de la secuencia de enlace del polinucleótido (por ejemplo, mediante el uso de bromuro de etidio) o mediante el uso de ácidos nucleicos etiquetados, tales como polipéptidos etiquetados con fluoroforos. Otras técnicas de detección que no requieren el uso de etiquetas incluyen técnicas ópticas tales como optoacústica, ref lectometría, elipsometría y resonancia de superficie de plasmón (ver el documento WO 97/49989). Por lo tanto, la presente invención proporciona jun substrato sólido que tiene inmovilizado en el mismoj por lo menos un polinucleótido de la presente invención, y preferentemente dos o más secuencias diferentes de pol i n ucleótidos de la presente invención. La presente invención también puede ser utilizada de manera profiláctica o terapéutica, la cual puede ser utilizada para el propósito de estimular las respuestas portadas|por las células y humorales en los animales, tales como los pollos y cerdos, proporcionando de esta manera protección contra la j colonización con especies de Brachyspira , incluyendo †ero sin limitarse a B. hyodysenteriae, B. intermedia , B. alvinijulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii, y B. pilosicoli . La infección natural con una especie de Brachyspira , tal como la B. hyodysenteriae induce los títulos de anticuerpo en circulación contra las proteínas aquí descritas. Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos aquí descritas o partes de las mismas, tienen el potencial de formar la base de un profiláctico o terapéutico administrado sistémicamente u oralmente para proporcionar protección contra la espiroquetosis intestinal. Es bien apreciado por los expertos en la técnica que existe un alto grado de conservación de las secuencias entre las especies de Brachyspira . Por ejemplo, como se muestra mas atrás, la toxina de ß. hyodysenteriae (H46) y la proteína de membrana exterior (H114) tienen un alto grado de similitud entre un número de especies de Brachyspira. Las similitudes de los nucleotidos de especies cruzadas para la lipasa de e. hyodysenteriae (H46). Especies de Brachyspira Similitud en un nivel de nucleotidos (%) H46 Brachyspira hyodysenteriae 100 Brachyspira pilosicoli 81.9 Brachyspira intermedia 95.5 Brachyspira murdochii 85.9 Brachyspira alvinipulli 84.8 ! La similitud de nucleotidos de especies cruzadas para la toxina de B. hyodysenteriae (H72) Especies de Brachyspira Similitud en un nivel de nucleotidos (%) H72 i Brachyspira hyodysenteriae 100 ' Brachyspira pilosicoli 83.3 Brachyspira intermedia 95.0 Brachyspira murdochii 87.3 Brachyspira alvinipulli 85.8 También como se muestra en el Ejemplo 22, las secuencias de nucleotidos y aminoácidos de la presente invención tienen la capacidad de producir la reactividad cruzada en un rango de especies de Brachyspira no solamente para B. otras especies de Brachyspira no solamente para ß. hyodysenteriae . i Por consiguiente, en una modalidad la presente invención I proporciona las secuencias de aminoácidos aquí descritas o fragmentos de las mismas o anticuerpos que se enlazan a Ijas secuencias de aminoácidos o las secuencias de polinucleotidos aquí descritas en una cantidad terapéuticamente éfectiva mezcladas con un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable. J La frase "cantidad efectiva terapéuticamente" como se usa en la presente descripción significa una cantidad suficiente para reducir por lo menos aproximadamente ej 15%, preferentemente por lo menos el 50%, más preferentemente por lo menos el 90%, y todavía más preferentemente prevenir, un ? ! déficit clínicamente importante en la actividad, función y respuesta del huésped animal. Alternativamente, una cantidad terapéuticamente efectiva es suficiente para ocasionar una mejora de un padecimiento significante clínicamentej en el huésped animal. J La frase "farmacéuticamente aceptable" se rejfiere entidades moleculares y composiciones que son tolerables fisiológicamente y que no producen generalmente una rjeaccijón alérgica o adversa similar, tales como el malestar gástrico similares, cuando son administrados a un mamífero. El ¡término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente vehículo con el cual es administrado el compuesto. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceite, incluyendo aquellos de petróleo, dé origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de frijol soya, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Las soluciones de agua o salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, son preferentemente empleadas como vehículos, particularmente para soluciones inyebtables. I Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en el libro de Martin "Ciencias Farmacéuticas de Remington" (Remington's Pharmaceutical Sciences), 18a Ed., Mack Publishing C6., Easton, PA, (1990). ! En una forma más específica de la presente invención se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades terapéuticamente efectivas de las secuencias de aminoácidos aquí descritas o un análogo, fragmento o derivado de las mismo y anticuerpos de las mismas junto con diluyentes, conservadores, solubilizadores, emulsif icadores, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones incluyen diluyentes de diferente contenido regulador (por i ejemplo, Tris-HCI, acetato, fosfato), pH y resistencia ¡jónica y aditivos tales como detergentes y agentes de solubilización (por ejemplo, Tween 80, Polisorbato 80), anti-oxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de ^sodió), conservadores (por ejemplo, Timersol, alcohol bencílico) y substancias de volumen (por ejemplo, lactosa, manitol). El material puede ser incorporado en preparaciones de particulado Norteamericana No. 5,914,123 (Arntzen, y asociados); la Patente Norteamericana No. 6,034,298 (Lam, y asociados); y la Patente Norteamericana No. 6,136,320 (Arntzen, y asociados)! Deberá apreciarse que las composiciones farmacéuticas proporcionadas de acuerdo con la presente invención pueden ser administradas por medios conocidos en la técnica. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas para administración son administradas mediante inyección, oralmente, o mediante la ruta pulmonar o nasal. Las secuencias de aminoácidos aquí descritas o anticuerpos derivadosj de los mismos son más preferentemente administrados por med;io de la ruta Intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, o subcutánea. Alternativamente, las secuencias de aminoácidos aquí descritas o anticuerpos derivados de los mismos, formulados de manera correcta, pueden ser administrados mediante la administración nasal u oral. En una modalidad específica de la presente invención, una i composición de vacuna puede ser una "vacuna de combinación" con uno o más polinucleótidos o secuencias de polipéptidos de la invención, los cuales tienen un rol funcional similar que es combinado en una vacuna. Por ejemplo, los siguientes cuatro grupos funcionales pueden ser combinados como se identifican en las siguientes tablas: > Grupo: Proteasas Gen Secuencia de Polinucleótidos Secuencia de Polipéptidos NAV-H197 SEQ ID No.1 SEQ ID No.2 ' NAV-H188 SEQ ID No.3 SEQ ID No.4 i NAV-H185 SEQ ID No.5 SEQ ID No.6 NAV-H179 SEQ ID No.7 SEQ ID No.8 Grupo: Lipasas/Peptidasas Gen Secuencia de Polinucleótidos Secuencia de Polipéptidos NAV-H191 SEQ ID No.9 SEQ ID No.10 NAV-H186 SEQ ID No.11 SEQ ID No.12 NAV-H184 SEQ ID No.13 SEQ ID No.14 NAV-H46 SEQ ID No.15 SEQ ID No.16 Grupo: Toxinas Gen Secuencia de Polinucleótidos Secuencia de Polipéptidos NAV-H177 SEQ ID No.17 SEQ ID No.18 NAV-H72 SEQ ID No.19 SEQ ID No.20 NAV-H66 SEQ ID No.21 SEQ ID No.22 NAV-H40 SEQ ID No.23 SEQ ID No.24 Grupo: Hemolisinas Gen Secuencia de Polinucleótidos Secuencia de Polipéptidos NAV-H68 SEQ ID No.25 SEQ ID No.26 NAV-H43 SEQ ID No.27 SEQ ID No.28 NAV-H33 SEQ ID No.29 SEQ ID No.30 j NAV-H32 SEQ ID No.31 SEQ ID No.32 ¡ Un pre-requisito para vacunas de combinación es una falta de competencia (por ejemplo, entre antígenos) y una alta compatibilidad con respecto al sujeto que va a ser inmunizado. De acuerdo con el estándar internacional aplicado en relación con la inmunización, las vacunas de combinación deben de i conferir una protección la cual es comparable a la ¡lograda mediante vacunaciones separadas. Sin embargo, la combinación de antígenos es un proceso complicado el cual está asociado con un número de problemas e incertidumbres.

Conforme los componentes individuales de una vacuna de I combinación no son substancias inertes, la combinación de diferentes componentes en una mezcla puede influir de jmanera negativa en la inmunogenicidad de los componentes antigenicos individuales. Por ejemplo, las interacciones entre los diferentes antígenos o entre los antígenos y otros componentes generalmente utilizados en dichas vacunas pueden ocurrir debido a las diferencias en la carga, residuos químicos, detergentes, formaldehído, concentración de iones, etcj. Estbs cambios pueden ocurrir instantáneamente después de hacer I contacto con los diferentes antígenos entre ellos o co¡n otras substancias generalmente presentes en las formulaciones de vacuna. Además, estos cambios también pueden ocurrir con una demora importante después de la mezcla, por ejemplo, 'durante I el almacenamiento, embarque, etc. Sin embargo, no sé puede predecir hasta que grado puede ser influenciada la inmunogenicidad de los antígenos individuales mezclándolos en i una combinación. Como consecuencia, puede ocurrir una situación en la cual uno o más antígenos de la jvacui a solamente confieren una seroproteccion insuficiente contra una o más de las enfermedades que hacen que el producto sea inadecuado para la práctica médica. j La producción de vacunas de combinación efectivas es i una materia compleja la cual depende de interacciones multídimensionales entre los componentes individúale^ de vacuna y no permite extrapolar ningún efecto de los componentes observados cuando son administrados por separado. Se ha descubierto que las vacunas de combinación de acuerdo con la presente invención pueden ser combinadas con uno o más antígenos adicionales, y permanecer efectivos y i estables. El término "estable" como se usa en el contexto de la presente invención significa que la formulación de vacuna de combinación puede ser mantenida por un período de 8Í días o más preferentemente 14 días a temperatura ambiente sin pérdida substancial con respecto a la inmunogenicidad y estabilidad de sus diferentes compuestos del antígeno. Con el objeto de mejorar la estabilidad, se pueden agregar agentes de estabilización tales como sacarosa a la composición de vacuna. En vez de sacarosa o además de la misma, se pueden utilizar otros estabilizadores, por ejemplo, albúmina de suero humano, mañosa, trehalosa, manita, o poligelina como agentes de i estabilización. Las vacunas de la presente invención exh!iben ún valor de pH preferentemente entre 5.0 y 8.0, más preferentemente entre 6.0 y 7.0, en donde el valor de pH de 6.8 y 7.8 es el más preferido. j El término "efectivo" como se usa en la p!resente 1 j descripción, se refiere al hecho de que la secuencia de ¡la invención en administración sola o repetida al sujeto (por ejemplo, un mamífero) confiere protección contra una enfermedad específica. Como se usa en la presente descripción, los términos "que i confieren protección" significan que la secuencia de la presente invención, al momento de la administración, induce una respuesta inmunologica en el sujeto vacunado cuya respuesta tiene la capacidad de proteger a dicho sujeto, de los síntomas j de la infección subsecuente. También está comprendido por la uso de secuencias de polinucleótidos de así como secuencias antisentido y polin que se pueden hidrolizar a una secuencia de polinucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la presente invención, para la manufactura de un medicamento para la regulación de una enfermedad asociada con la bacteria ß. hyodysenteriae . i Las secuencias de polinucleótidos que codifican las construcciones y ribozimas antisentido para utilizarse en los métodos terapéuticos son administradas de manera deseable directamente como una construcción simple de ácido nucleico. La asimilación de las construcciones de ácido nucleico simples por las células de las bacterias es mejorada mediante varias técnicas conocidas de transf ección , por ejemplo, aquel ílas que incluyen el uso de agentes de transfección . Los ejemplos de estos agentes incluyen agentes catiónicos (por ejemplo, fosfato de calcio y DEAE-dextrano) y I i pofectantes . Generalmente, las construcciones de ácido nucleico son mezcladas con el agente de transfección para producir una composición. Alternativamente, la construcción antisentido o ribozima puede ser combinada con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica. Los vehículos y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotónicas, por ejemplo, solución salina regulada por fosfato. La composición puede ser formulada para la administración parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraocular, oral o transdérmica. Las rutas de administración descritas se pretenden solamente como una guía ya que un experto en la técnica podrá determinar fácilmente la ruta de administración óptima y cualquier dosificación para cualquier animal o padecimiento particular. La presente invención también incluye equipos para seleccionar animales que se sospecha que están siendo infectados con una especie de Brachyspira , tal como 8. hyodysenteriae o para confirmar que un animal está infectado con una especie de Brachyspira, tal como B. hyodysenteriae. En una modalidad adicional de la presente invención, los equipos adecuados para utilizarse por un especialista pueden ser preparados para determinar la presencia o ausencia de especies de Brachyspira , incluyendo pero sin limitarse a B. hyodysenteriae, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii, y B. pilosicoli en animales que Se sospecha que están infectados o para medir de manera cuantitativa una especie de Brachyspira , incluyendo pero sin limitarse a una infección por B. hyodysenteriae, B. intermedia , B. alvinipulli , B. aalborgi y B. pilosicoli . De acuerdo con las técnicas de prueba explicadas anteriormente, dichos equipos pueden contener por lo menos una versión etiquetada de| una de las secuencias de aminoácidos aquí descritas o sus asociados de enlace, por ejemplo, un anticuerpo específico para la misma, y las instrucciones dependiendo del método seleccionajdo, por ejemplo, "competitivo", "emparedado", "DASP" y similares. Alternativamente, dichos equipos pueden contener por lo menos una secuencia de polinucleótidos complementaria a una jporción de una de las secuencias de polinucleótidos aquí descritas junto con las instrucciones para su uso. Los equipos también pueden contener reactivos periféricos tales como reguladores, estabilizadores, etc. Por consiguiente, un equipo de prueba para la demostración de la presencia de especies de Brachyspira , incluyendo pero sin limitarse a ß. hyodysenteriae, \B. intermedia , B. alvinipulli , B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii , y B. pilosicoli , puede contener lo siguiente: (a) una cantidad previamente determinada de al menos un componente reactivo etiquetado inmunoquímicamente obtenido mediante el enlace directo o indirecto de una de las secuencias i de aminoácidos aquí descritas o un asociado de ¡ enlace específico a los mismos, para una etiqueta que se puede detectar; (b) otros reactivos; y ! (c) instrucciones para el uso de dicho equipo. Más específicamente, el equipo de prueba de diagnóstico puede contener: ! ? (a) una cantidad conocida de una de las secuencias de aminoácidos aquí descritas tal y como se describieron anteriormente (o un asociado de enlace) generalmente enlazado a una fase sólida para formar un inmunoabsorbente, o alternativamente, enlazados a una etiqueta adecuada o existe un plural de dichos productos finales, etc.; (b) de ser necesario, otros reactivos; y (c) instrucciones para el uso de dicho equipo de prueba. En una variación adicional, el equipo de prueba puede contener: Un componente etiquetado el cual ha sido obtenido j acoplando una de las secuencias de aminoácidos aquí descritas como una etiqueta que se puede detectar; (b) uno o más reactivos inmunoquímicos adicionales de los cuales por lo menos un reactivo es un ligando o un ligando inmovilizado, cuyo ligando es seleccionado del grupo consistente de: (i) un ligando con capacidad de enlace con el componente etiquetado (a); (ii) un ligando con capacidad de enlace con un asociado de enlace del componente etiquetado (a); i i (iii) un ligando con capacidad de enlace con al menos uno de los componentes que van a ser determinados; o (iv) un ligando con capacidad de enlace con al menos uno de los asociados de enlace de por lo unos de los componentes que van a ser determinados; y (c) direcciones para el funcionamiento de un protocolo para la detección y/o determinación de uno o más componentes de una reacción inmunoquímica entre una de las secuencias de aminoácidos aquí descritas y un asociado de enlace específico para las mismas. En una modalidad, la presente invención proporciona un equipo simple de punto de cuidado que utiliza los principios similares a los equipos de prueba de suero utilizados ampliamente, para la detección rápida de los anticuerpos en circulación en el animal para los polipéptidos de la invención que permitirán que el profesional del cuidado de la salud o veterinario diagnostique rápidamente la infección por Brachyspira , e instituya rápidamente medidas probadas y Los métodos y equipos de la presente invención tambi n i pueden proporcionar medios para detectar o monitorear la infección por Brachyspira incluyendo el cambio en la condición. Pueden ser especialmente útiles para detectar la infección por ' ; ! Brachyspira en etapa temprana. Por lo tanto, la presente invención también proporciona medios para que el profesional de la salud o veterinario monitoreé el progreso de la infección por Brachyspira (si empeora, mejora o permanece igual) durante y después del tratamiento. Generalmente, el profesional de cuidado de la salud o veterinario establecería un protocolo para recolectar y analizar una cantidad de muestras biológijcas del animal en intervalos seleccionados. Generalmente, la muestra es obtenida de manera intermitente durante el período prescrito. El período de tiempo entre el muestreado intermitente puede ser dictado por el padecimiento del animal, y puede encontrarse en un rango de una muestra cada 24 horas a upa muestra tomada con separación de días, semanas y hasta 1 ( meses. Un equipo de punto de cuidado para utilizarse en el método generalmente comprende medios que tienen fijados' a los mismos uno o más polipéptidos de captura, en donde la muestra se pone en contacto con los medios para exponer los polipéptidos de captura a los anticuerpos en circulación contenidos en la- muestra. El equipo incluye medios de adquisición que pueden comprender un implemento, tál como una aguja o vacunador, que tiene una superficie que comprende i i los medios. Los medios de adquisición también pueden comprender un contenedor para aceptar la muestra, en donde el contenedor tiene una superficie de contacto con el suero que comprende los medios. En otra modalidad típica, el ensayo para detectar el complejo de los anticuerpos en circulación y I p s polipéptidos de captura puede comprender un análisis de ELISA, y puede ser utilizado para cuantificar la cantidad de anticuerpos en circulación para los polipéptidos de la presente invención en una muestra. En una modalidad alternativa, los ! J medios de adquisición pueden comprender un implemento que comprende un cassette que contiene los medios. Un método y equipo de la presente invención para detectar los anticuerpos en circulación para los polipéptidoSj de la presente invención se puede hacer adaptando los métodos y equipos conocidos en la técnica para la detección rápida de otras proteínas y ligandos en la muestra biológica. Los ejemplos de los métodos y equipos que pueden ser adaptados a la presente invención se describen en la ¡Patente Norteamericana No. 5,656,503, emitida a May y asociados, en Agosto 12,1997, la Patente Norteamericana No. 6,5j00,627, emitida a O'Conner y asociados, en Diciembre 31 , 2002, la Patente Norteamericana No. 4,870,007, emitida a Smitii-Levyis en Septiembre 26, 1989, la Patente Norteamericana No. 5,273,743, emitida a Ahlem y asociados, en diciembre 28,1993, y. la Patente Norteamericana No. 4,632,901 , emitida a Valkers y asociados, en Diciembre 30, 1986, todas las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia. Un método rápido de un paso para detectar los j anticuerpos en circulación para los polipéptidos de la presente invención puede reducir el tiempo para detectar el desarrollo de la infección por Brachyspira. Un método típico puede comprender los pasos de: obtener una muestra de un an|imal en riesgo o que se sospecha que tiene una infección por Brachyspira; mezclar una porción de la muestra con uno o más polipéptidos de detección los cuales se jenlazan específicamente a uno de los anticuerpos en circulación, como para iniciar el enlace de los polipéptidos de detección a los anticuerpos en circulación en la muestra; poniendo en contacto la mezcla de la muestra y los polipéptidos de detección con un anticuerpo de captura inmovilizado el cual se enlaza específicamente con los polipéptidos de detección, los; cuales capturan los anticuerpos cuya captura no hace reaccionar de manera cruzada los anticuerpos con el polipéptido de detección, como para enlazar el polipéptido de detección a los anticuerpos t en circulación, y los anticuerpos en circulación al anticuerpo de captura, para formar un complejo que se puede detectar, removiendo el polipéptido de detección no enlazado; y cualquier muestra no enlazada del complejo, y detectando el polipéptido de detección del complejo. El polipéptido que se puede detectar puede ser etiquetado con un marcador que se puede detectar, tal como una etiqueta radioactiva, enzima, tinte biológico, cuenta magnética, o biotina, que son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos siguientes se proporcionan con el propósito de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la presente invención. ! EJEMPLO 1: ELABORACIÓN DE LA SECUENCIA DEL GENOMA Un aislado del campo porcino Australiano ¡de B. hyodysenteriae (cepa WA1) se somete a la elaboración de secuencia tipo escopeta. Esta cepa ha sido bien caracterizada y i mostrada como virulenta después del desafío experimental de los cerdos. La espiroqueta se cultiva en un cultivo de caldo de soya de tripticasa anaeróbica y 100 pg de ADN que' fueron extractados utilizando el método de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) para preparar un ADN de cromosomas de alta calidad adecuado para la preparación de las librerías de ADN genómico. El ADN genómico es cortado utilizando el H ¡drocortador GeneMachines, y el ADN fragmentado es procesado para la clonación de acuerdo con el I protocolo recomendado por los proveedores del sistema del vector pSMART (Lucigen). Un inserto pequeño de una librería (de 2 a 3 kb) y un inserto medio de una librería (de 3 a 10 kb) son construidos en una versión de copias bajas del vector pSMART. i EJEMPLO 2: ANOTACIÓN , Las secuencias parciales del genoma para la B. hyodysenteriae son ensambladas y anotadas por la Instalación de Investigación Australiana del Genoma (AGRF) en Queensland y la Universidad de Murdoch por el Centro de Bioinformática y Computación Biológica (CBBC). El CBBC utiliza espejos actualizados de las bases de datos internacionales principales y ha desarrollado un software y bioinformática del extremo principal para la anotación de i l características en secuencias grandes de genomas. Uñ rango de herramientas de bioinformática de dominio público son utilizadas para analizar y volver a analizar las secuencias como parte de un procedimiento de aseguramiento de calidad en los análisis de datos. Los marcos de lectura abierta (ORFs) són pronosticados utilizando una variedad de programas incluyendo los programas GeneMark, GLIMMER, ORPHEUS, SEjLFID y I GetORF. Los ORFs putativos son examinados por homología (ADN y proteína) con las bases de datos internacionales existentes que utilizan investigaciones que incluyen BLAST y FASTA. Todos los ORFs pronosticados son analizados para determinar su localización celular utilizando programas tales como PSI-BLAST, FASTA, MOTIFS, Fl N D P ATTE R N S> PHD, I SIGNALP y PSORT. Las bases de datos que incluyen Interpro, Prosite, ProDom, Pfam y Blocks son utilizadas para pronosticar i j las proteínas asociadas a la superficie tales como los dbminips transmembrana, los péptidos principales, homologías para conocer proteínas de superficie, firma de lipoproteína, patrones de anclaje de membrana exterior y dominios de enlace de la célula huésped. Se realizan análisis f ilogenéticos y de otra evolución molecular con los genes identificados y con las otras especies para ayudar en la asignación de la función. El análisis en sílice de ambos genomas a los que se les elaboró |de uña manera parcial la secuencia ha producido una lista extensa de todos los ORFs pronosticados presentes en los datos de secuencia disponibles. Cada ORF es investigado 'por la información descriptiva tal como el peso molecular pronosticado, el punto isoeléctrico, la hidrofobicidad, y la ? I localización subcelular para hacer posible la correlación con las propiedades in vitro del producto del gen natural. Los genes pronosticados que codifican las proteínas similares| a lós componentes localizados en la superficie y los factores de virulencia en otras bacterias patogénicas son seleccionados como objetivos de vacuna potenciales. EJEMPLO 3: ANÁLISIS DE LA DISTRIBUCIÓN DEL GEN UTILIZANDO EL POR ¡ Uno o más pares de cebadores los cuales se recocen en diferentes regiones de la región de codificación del gen objetivo son diseñados y optimizados para la detección por PCR. El análisis de distribución de los genes objetivo de la B. hyodysenteriae es realizado en 23 cepas de B. hyodysenteriae, incluyendo dos cepas las cuales han mostrado ser avirulentas. Los conjuntos de cebadores utilizados en el análisis de distribución se muestran en la Tabla 1. El análisis PCR se lleva j a cabo en un volumen total de 25 µ? utilizando la polimerasa de ADN Taq. La mezcla de amplificación consistía de un regulador 1x PCR (con un contenido de 1.5 mM de MgC12), 1 U de polimerasa de ADN Taq, 0.2 mM de cada dNTP, 0.5 µ? del par de cebadores, y 1 µ? del ADN de plantilla del cromosoma purificado. Las condiciones de ciclado compr o inicial de desnaturalización de la plantilla de a temperatura de 94°C, seguida por e desnaturalización a una temperatura de 94°C durante 30 segundos, recociéndola a una temperatura de 50°C durante 15 segundos, y la extensión del cebador a una temperatura de 72°C durante 1 minuto. Los productos PCR son sometidos a electrof oresis en geles de agarosa al 1% (p/v) en un regulador 1x TAE (40 mM de Tris-acetato, 1 mM de EDTA), teñido con 1 pg/ml de solución de bromuro de etidio y visto con una luz ultravioleta (UV).

TABLA 1 CEBADORES DE O Ll G O N U C LEÓTI DOS UTILIZADOS EN EL ANÁLISIS DE DISTRIBUCIÓN PCR DE LOS GENES CANDIDATOS PARA VACUNAS CONTRA ß. HYODYSENtERIAE i EJEMPLO 4: BIOINFORMÁTICA La elaboración de secuencias tipo escopeta del genoma ele B. hyodysenteriae dio como resultado un 73% (2,347.8 kb de Un 2,300 kb pronosticado) del genoma al que se le iba a labor¡ar la secuencia. Estas secuencias comprenden 171 contiguos con i un tamaño promedio de los contiguos de 13.7 kb. De los 171 contiguos, se pronosticaron 1,860 marcos de lectura ¡abierta (ORFs). La comparación de los ORFs pronosticados con los genes presentes en el ácido nucleico y en las bases de datos de las proteínas indicaron que aproximadamente el 70% de cada especie tiene homología con los genes contenidos en las bases de datos. El 30% restante de los ORFs pronosticados de cada genoma no tienen identidad conocida. EJEMPLO 5: CANDIDATOS DE VACUNA Los ORFs que muestran homología fuerte con las proteínas asociadas con la virulencia putativa presentes en lás bases de datos públicas son seleccionados como objetivos de vacuna. La Tabla 2 muestra los genes seleccionados conho objetivos de vacuna y su similitud con otros genes conocidos.

TABLA 2 FUNCIÓN DE LOS GENES DE B. hyodysenteriae BASAübs EN LA SIMILITUD CON LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE PROTEÍNAS BACTERIALES SIMILARES OBTENIDAS DE LA BASE DE DATOS SWISS-PROT Identidad Similitud Gen Función (aminoácidos; (aminoácidos) Hemolisina Proteína hemolitica (HIpA) de Nosioc sp. NAV-H32 49/137 (35%) 77/137(56%) Sec. de nucleótidos SEQ ID No.25 Sec. de aminoácidos SEQ ID No.26 Hemolisina Proteina hemolitica de Prevotella intermedia NAV-H33 64/117 (54%) 83/11,7 (70%) Sec. de nucleótidos SEQ ID No.27 Sec. de aminoácidos SEQ ID No.28 Toxina Transglucosilasa litica de mureina (contiene LysM/dominios de 120/449 NAV-H40 invasina) 185/449(41%). Sec. de nucleótidos SEQ ID No.19 (26%) Sec. de aminoácidos SEQ ID No.20 i Hemolisina 1 Hemolisinas y proteínas relacionadas de Anabaena variabais 150/425 NAV-H43 242/425 (56%) Sec. de nucleótidos SEQ ID No.29 (35%) Sec. de aminoácidos SEQ ID No.30 Lipasa Lisofosfolipasa 116/299 NAV-H46 188/299 (62%) Sec. de nucleótidos SEQ ID No.15 (38%) Sec. de aminoácidos SEQ ID No.16 Toxina Toxina (YoeB) de Escherichia coli NAV-H66 42/85 (58%) 60/85 (76%) Sec. de nucleótidos SEQ ID No.21 1 Sec. de aminoácidos SEQ ID No.22 Hemolisina Proteina relacionada con hemolisina de Dehalococcoides sp. 121/415 NAV-H68 204/415(49%) Sec. de nucleótidos SEQ ID No.31 (29%) Sec. de aminoácidos SEQ ID No.32 Toxina 1 Transglucosilato lítico de mureina (posiblemente enlazado a la NAV-H72 membrana exterior) 51/141 (36%) 6/141 (53%) Sec. de nucleótidos SEQ ID No.23 Sec. de aminoácidos SEQ ID No.24 Toxina NAV- Toxina (YoeB) de Actinobacillus pleuropneumoniae 44/86 (51%) 64/86 (74%) H177 Sec. de nucleótidos SEQ ID No.17 Sec. de aminoácidos SEQ ID No.18 Proteasa NAV- Proteasa CIpX dependiente de ATP 227/388 291/388 (75%) H179 Sec. de nucleótidos SEQ ID No.1 (58%) Sec. de aminoácidos SEQ ID No.2 Peptidasa NAV- 148/445 Sec. de nucleótidos SEQ ID No.9 241/445(54%) H184 (33%) Sec. de aminoácidos SEQ ID No.10 NAV- Proteasa 199/455 289/455 (63%) H185 Metaloproteasa de zinc asociado con la membrana (43%) Sec. de nucleótidos SEQ ID No.3 Sec. de aminoácidos. SEQ ID No.4 Peptidasa NAV- Peptidasa dependiente de Zn 132/406 234/40|6 (57%) H186 Sec. de nucleótidos SEQ ID No.11 (32%) Sec. de aminoácidos SEQ ID No.12 Proteasa NAV- Ciclasa de adenilato 147/509 1 269/509 (52%) H188 Sec. de nucleótidos SEQ ID No.5 (28%) Sec. de aminoácidos SEQ ID No.6 Lipasa NAV- Sec. de nucleótidos SEQ ID No.13 70/223 (31%) 117/223 (52%) H191 Sec. de aminoácidos SEQ ID No.14 Proteasa NAV- Proteasa de serina similar a la tripsina 184/445 267/445 (60%) H197 Sec. de nucleótidos SEQ ID No.7 (41%) Sec. de aminoácidos SEQ ID No.8 EJEMPLO 6: DISTRIBUCIÓN DEL GEN ; La distribución general del gen de cada ORF se resume én la Tabla 3. Un total de 23 cepas de B. hyodysenteriae spn analizadas. La distribución es determinada de los resultados acumulativos del PCR utilizando hasta dos conjuntos diferentes de cebadores. Todos los ORFs están presentes en una cantidad del 87% al 100% de la cepa probada de B. hyodysenteriae .

TABLA 3 DISTRIBUCIÓN DEL GEN DE LOS CANDIDATOS DE VACUNA; CONTRA LA BACTERIA B. hyodysenteriae ANALIZADOS POR PCR UTILIZANDO UN PANEL DE 23 CEPAS DIFERENTES ! EJEMPLO 7: EXTRACCIÓN DE PLÁSMIDOS Los clones de Escherichia coli JM 109 que forman un puente con el plásmido pET-19b (Novagen) son rayados | a partir del almacenamiento del material de glicerol sobre pla !cas ' d Ie i ! agar de Luria-Bertani (LB) su plementadas con 100 r¡ng/l de I ampicilina e incubadas a una temperatura de 37°C durante 16 horas. Una sola colonia es utilizada para inocular 10; mi del caldo LB suplementado con 100 mg/l de ampicilina y el cultivo del caldo fue incubado a una temperatura de 37°C durante ¡I 2 horas con agitación. Durante la noche el cultivo completo es i ¦ centrifugado a una velocidad de 5,000 x g durante 10 minutos y el plásmido contenido en las células extractado utilizando un i Equipo QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido purificado ¡es cuantificado utilizando un fluorómetro y la concentración de ADN ajustada a 100 pg/ml mediante la dilución con TE '(10 mM de Tris-HCI, 1 mM de EDTA, pH 8.0) regulador. El plásmido j i pET-19b purificado es almacenado a una temperatura de -20°C. EJEMPLO 8: PREPARACIÓN DEL VECTOR · 2 del plásmido pET-19b purificado es digerido a una temperatura de 37°C durante un período de 1 a 4 horas en un volumen total de 50 µ? con un contenido de 50 mM de Tris-HCI 1 (pH 7.5), 100 mM de NaCI, 10 mM de MgC12, 0.1 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) y 5 U de Ndel y; BamHI (Fermentas). Los vectores alineados son verificados mediante electroforesis con 1 µ? de la reacción de digestión a través de un gel de agarosa al 1% (p/v) en un regulador 1x TAE en 90 V durante 1 hora. El ADN sometido a electroforado es teñido con 1 pg/ml de bromuro de etidio y visto con una luz UV. |, Los vectores pET-19b alineados son purificados utilizando el Equipo de Limpieza de PCR UltraClean (Mo Bio Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los vjectorés i ! lineales purificados son cuantif icados utilizando el espectrofotometro NanoDrop ND1000 y la concentración de ADN ajustada a 50 g/ml mediante dilución con regulador TE. Los vectores alineados son almacenados a una temperatura de -20°C. ¡ EJEMPLO 9: PREPARACIÓN DEL INSERTO - DISEÑO DEL CEBADOR | I Los pares de cebadores son diseñados para amplificar tanto de la región de codificación del gen objetivo cojmo sea posible. Todas las secuencias de cebadores incluyen los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción terminales para hacer posible la ligación del extremo cohesivo del a;mplicón i ! resultante en el vector pET-19b alineado. Las secuencias del cebador utilizadas para la clonación se muestran en la Tabla 4.

Los cebadores son probados utilizando el programa Amplify 3.0 j (Universidad de Wisconsin) y las secuencias teóricas del amplicón son insertadas en la posición adecuada, en la ¡ i secuencia del vector pET-19b. La traducción deducida del cassette de expresión pET-19b quimérico se lleva a cabo i utilizando la versión 10 del Vector NTI Advance (Invitrogén) para confirmar que los insertos del gen estarían en el marco de lectura correcto.

TABLA 4 CEBADORES DE O Ll G O N U CLEÓTI DO S UTILIZADOS EN CLONACIÓN DE LOS GENES DE B. Hyodysenteriae EN EL VECTOR pET-19b. EL PESO MOLECULAR APARENTE ES DETERMINADO A PARTIR DE SDS-PAGE dNTP, 0.5 µ? del par del cebador apropiado y 1 µ? ele ADN purificado del cromosoma. El ADN del cromosoma es preparado de la misma cepa de B. hyodysenteriae utilizada para la ! elaboración de secuencia del genoma. Las condiciones de ciclado comprenden un paso de desnaturalización de plantilla inicial de 5 minutos a una temperatura de 94°C, seguidoj por 30 ciclos de desnaturalización a una temperatura de 94°C 'durante 30 segundos, recociéndola a una temperatura de 50°C durante 15 segundos, y la extensión del cebador a una temperatura de 72°C durante 1 minuto. Los productos PCR son sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 1% (p/v) en un re¡guladíor 1x TAE, teñidos con 1 pg/ml de una solución de bromuro de etidio y visto con una luz UV. Después de verificar la presencia del producto PCR de tamaño correcto, la reacción PCR és purificada utilizando el Equipo de Limpieza UltraClean (Mo Bio Laboratories). EJEMPLO 11: RESTRICCIÓN DE LA ENZIMA DE DIGESTIÓN DE LOS INSERTOS DEL GEN 30 µ? del producto PCR purificado es digerido en un volumen total de 50 µ? con 1 U de Ndel y 1 U de BamHI. El ADN del inserto digerido es purificado utilizando el Equipo be Limpieza UltraClean PCR (Mo Bio Laboratories). El ADN del inserto digerido es cuantificado utilizando el espectrofotometro NanoDrop ND1000 y la concentración de ADN ajustada a ¡I 0 pg/ml mediante la dilución con un regulador TE. El ADN del inserto restringido purificado es utilizado inmediatamente para la ligación del vector. EJEMPLO 12: LIGACIÓN DE LOS INSERTOS DEL GEN EN EL VECTOR pET-19B Las reacciones de ligación son las realizadas J volumen total de 20 µ?. 25 ng de pTrcHis alineado es in con una cantidad equimolar del inserto restringido a una temperatura de 16°C durante 16 horas en 30 mM de Tris- HCI (pH 7.8), 10 mM de MgC12, 10 mM de DTT y 1 mM de ATP con un contenido de 1 U de ligasa de ADN T4 (Fermentas). Una reacción de ligación idéntica que no contiene insertos de ADN también es incluida como un control negativo de re-circulación del vector. ¡ j EJEMPLO 13: TRANSFORMACIÓN DE LAS LIGACIONES pET-19B EN CÉLULAS JM 109 DE E. COLI \ Las células JM 109 de E. coli competentes son ? descongeladas del almacenamiento a una temperatura de -80°C en hielo y luego se transfieren 50 µ? de las células a tubos de I i microfuga de 1.5 mi de baño de hielo que contienen 5 µ? de reacciones de ligación durante la noche. Los tubjos son mezclados mediante golpes ligeros al fondo de cada tub'o en el banco y se dejan en el hielo durante 30 minutos. Entonces las células son sometidas a choque de calor colocando los ¡tubos a ? un baño de agua a una temperatura de 42°C durante 45 segundos antes de regresar el tubo al hielo durante 2 minutos. i j Las células transformadas son recuperadas en 1 mi de cjaldo de LB durante 1 hora a una temperatura de 37°C con unajmezcla suave. Las células recuperadas son recolectadas en ui a Í , velocidad de 2,500 x g durante 5 minutos y las células se i ; vuelven a suspender en 50 µ? de caldo LB fresco. Lajs 50 µ? completas de las células suspendidas de nuevo son esparcidas de manera uniforme sobre una placa de agar de LB jcon Ln i contenido de 100 mg/l de ampicilina utilizando una vajrilla de vidrio estéril. Las placas son incubadas a una temperatura de 37°C durante 16 horas. ! EJEMPLO 14: DETECCIÓN DE LAS CONSTRUCCIONES pET- i 19b RECOMBINANTES EN E. COLI POR PCR ' I Doce colonias sencillas transformantes de; cada construcción son rayadas sobre placas de agar LB frescas con un contenido de 100 mg/l de ampicilina e incubadas' a una temperatura de 37°C durante 16 horas. Una sola colonia de j cada evento de transformación se vuelve a suspender en 50 µ? de regulador de TE y se hierven durante 1 minuto. 2 µ? de células hervidas son utilizadas como plantilla para el PCR. La I !' mezcla de amplificación consiste de un regulador 1x PCR (que contiene 1.5 mM de MgCl2), 1 U de polimerasa de ADN Táq, 0.2 mM de cada dNTP, 0.5 µ? del cebador pET-19t^F (5'-GGAATTGTGAGCGGATAAC-3') y 0.5 µ? del cebador pET.-19b-R (5'-GCAAAAAACCCCTCAAGAC-3'). Las condiciones de jciclacio i i comprenden un paso inicial de desnaturalización de la plantilla ! ! de 5 minutos a una temperatura de 94°C seguida por 30 ciclos i de desnaturalización a una temperatura de 94°C durante 30 t segundos, recocido a una temperatura de 60°C durante 15 i segundos, y una extensión del cebador a una temperatura de ? 72°C durante 1 minuto. Los productos PCR son sometidos I ' electrof oresis en geles de agarosa al 1% (p/v) en un rejgulador i 1x TAE, teñido con 1 pg/ml de solución de bromuro de ¡etidio y vista con una luz UV. EJEMPLO 15: PURIFICACIÓN DE LOS PLÁSMIDOS pET-19b RECOMBINANTES Un clon JM 109 de E. coli que hace puente con los plásmidos pET-19b ligados exitosamente son inoculados en 5 mi de caldo de LB suplementado con 100 mg/l de ampicilina y el cultivo del caldo es incubado a una temperatura de 37°C durante 12 horas con agitación. El cultivo completo es centrifugado durante la noche a una velocidad de 5,000 x g durante 10 minutos y el plásmido contenido en las células extractado utilizando el Equipo QIAprep Spin iniprep (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El pjlásmido pET-19b recombinante purificado es almacenado |a una temperatura de -20°C. I i EJEMPLO 16: TRANSFORMACIÓN DE PLÁSMIDOS pET-19b RECOMBINANTES EN CÉLULAS BL21 (DE3) DE E. COLI, Las células BL21 (DE3) de E. coli competentes s0n descongeladas del almacenamiento a una temperatura de -80°C sobre hielo y luego 20 µ? de las células son transferidas a tubos de microfuga de 1.5 mi de hielo frío que contienen 1 µ? del plásmido pET-19b purificado recombinante. Los tubos son mezclados mediante golpes suaves en el fondo de cada tubo sobre el banco y se dejan sobre hielo durante 30 minutos.

Luego las células son sometidas a choque de calor colocando los tubos en baños de agua a una temperatura de 42°C ¡durante I i' 45 segundos antes de regresar el tubo al hielo durante 2 I minutos. Las células transformadas son recuperadas en ¡1 mi de caldo de LB durante 1 hora a una temperatura de 37°C con 192 mM de glicina, metanol al 20% v/v, pH 8.3) durante 15 minutos. Las proteínas en el gel son transferidas a la membrana de nitrocelulosa utilizando un aparato transblot mini-Protean (Bio-Rad). Después del ensamble del sujetador del gel ele acuerdo con las instrucciones del fabricante, la transferencia electroforética se lleva a cabo en 30 V durante la noche a una temperatura de 4°C. La membrana de nitrocelulojsa recientemente transferida con un contenido de proteíha separada es bloqueada con 10 mi de solución salina regulada con tris (TBS; 20 mM de Tris-HCI, 500 mM de NaCI, pH 7.5) con un contenido de polvo de leche pulverizada al 5% (p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana es lavada con TBS con un contenido de Tween 20 (TBST) al 0.1% (v/v)¡y luego i incubada con 10 mi de anticuerpo anti-his de ratón (diluido 5,000 veces con TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavarla tres veces durante 5 minutos con TBST, la membrana es incubada con 10 mL de IgG anti-ratón dje cabra (molécula completa)-AP diluida 5,000 veces en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana es desarrollada i ¡ utilizando un Equipo de Substrato de Fosfatasa Alcalina (Bio-Rad). La reacción de desarrollo es detenida lavando la membrana con agua destilada. Luego la membrana es secada y explorada para determinar su presentación. j EJEMPLO 20: EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ETIQUETADAS-HIS R ECOM Bl N ANTES Una sola colonia del plásmido pET-19b recombinante en células BL21 (DE3) de E. coli es inoculado en 20 mi de caldo LB en un tubo de centrífuga de 50 mi con un contenido de 100 mg/l de ampicilina e incubado a una temperatura de 37°C dur!ante 16 horas con agitación. Un matraz cónico de 2 I con un contenido de 500 mi de caldo LB suplementado con 100 mg/l de ampicilina es inoculado con 10 mi de cultivo durante la noche e incubado a una temperatura de 37°C hasta que la densidad óptica de las células a 600 nm es de 0.5 (aproximadamente de 3 a 4¡horas). Luego el cultivo es inducido agregando IPTG ja ujia concentración final de 1 mM y las células regresadas a una temperatura de 37°C con agitación. Después de 6 horas de inducción, el cultivo es transferido a dos botellas de centrífuga de 250 mi y las botellas son centrifugadas a una velocidad de 5,000 x g durante 10 minutos a una temperatura de 25°C. El sobrenadante es descartado y cada gránulo se vuelve a i suspender con 4 mi de regulador de lisis natural Ni-NTA¡(50 mM i de NaH2P04, 300 mM de NaCI, 10 mM de imidazol, pH 8.0). Las células que se volvieron a suspender son conjuntadas y almacenadas durante la noche a una temperatura de -20qC. La suspensión de células es sacada del almacenamiento a una temperatura de -20°C y descongeladas en hielo. 5 µ? de j ADNse I (10 mg/ml) es agregado al lisato descongelado e incubado sobre hielo durante 1 hora. El lisato es centrifugado, a una velocidad de 20,000 x g durante 15 minutos a uha temperatura de 4°C. El sobrenadante es transferidoj a uña columna de 10 mi con un contenido de 1 mi de volumen del lecho de una resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen). La proteína etiquetada-his recombinante se permite que se enlace a la resina durante 1 hora a una temperatura de 4°C con una mezcla de extremo a extremo. Luego la resina es lavada con 30 mi de regulador de lavado natural de Ni-NTA (50 mM de NaH2P04, 300 mM de NaCI, 20 mM de imidazol, pH 8.0) antes de la elución con 9 mi de regulador de elución natural Ni-NTA¡(50 mM de NaH2P04, 300 mM de NaCI, 250 mM de imidazol, ?? 8.0). Tres fracciones de 3 mi del eluato son recolectadas y almacenadas a una temperatura de 4°C. 30 µ? de cada eluato es tratado con 10 µ? de un regulador de tratamiento de muestra 4x y hervido durante 5 minutos. Las muestras son some'tidas a SDS-PAGE y teñidas con Azul Coomassie Brillante G250. El gel teñido es equilibrado en agua destilada durante 1 hora y secado entre dos laminas de celulosa durante la noche a temperatura ambiente. > EJEMPLO 21: DIÁLISIS Y Ll O Fl Ll ZAC I Ó N DE LA PRQTEÍNA ETIQUETADA-HIS RECOMBINANTE PURIFICADA Las proteínas eluidas son conjuntadas y transferidas a un tubo de diálisis y tratado con un corte de peso moleculíar (MWCO) de 3,500 Da. Un alícuota de 200 µ? del' eluato conjuntado es tomado y cuantificado utilizando un Ensayo de Proteína comercial (Bio-Rad). Las proteínas son dializadas contra 2 litros de agua destilada a una temperatura de 4°C con agitación. El regulador de diálisis es cambiado 8 veces en intervalos de 12 horas. Las proteínas dializadas son transferidas del tubo de diálisis a un tubo de centrífuga de 50 mi (volumen máximo 40 mi) y los tubos son colocados durante la noche a una temperatura de -80°C. Los tubos son colocados en el secador por congelación y liofilizados hasta el secado. i ( Las proteínas liofilizadas entonces se vuelven a hidratar cpn í i PBS a una concentración calculada de 2 mg/ml y son almacenadas a una temperatura de -20°C. EJEMPLO 22: SEROLOGÍA UTILIZANDO PROTEICA RECOMBINANTE 10 pg de proteína recombinante purificada es diluida en 10 mi de regulador de carbonato y 100 µ? son agregadas a cada depósito en una placa de microtitulación de 96 depósitos. La proteína se permite que se recubra durante la noche' a una temperatura de 4°C. La placa es bloqueada con 150 µ? de PBS-BSA (1% p/v) en cada depósito durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) con mezcla y luego lavada tres veces con 150 µ? de PBST (0.05% v/v). Los sueros de cerdo son diluidos 1¡:800 en 100 µ? de PBST-BSA (0.1% p/v) e incubados a temperatura ! i ambiente durante 2 horas con mezclado. Las placas son ¡lavadas '· l', í , | antes de agregar 100 µ? de IgG anti-cerdo de cabra (molécula [ i completa)-HRP diluido 1:5,000 en PBST. Después de 'incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas son lavadas todas estas proteínas de toxinas son inmunogénicas en cerdos infectados de manera natural y de manera experimental. TABLA 5A REACTIVIDAD DE PROTEÍNAS DE TOXINA CON SUERÓ DE CERDOS SALUDABLES Y SUERO DE CERDOS HIPERINMUNIZADOS N1, N2, N3; suero recolectado de cerdos de condiciones de alta salud; M1 ; suero de cerdos hiperinmunizados con la bacteriiia de B. hyodysenteriae; M2; suero de cerdos hiperinmunizados con bacterina B. pilosicoli; M3; suero de cerdos hiperinmunizados con bacterina B. innocens.

G en o a? TABLA 5B REACTIVIDAD DE PROTEÍNAS DE TOXINA CON SUERO DE CERDOS INFECTADOS NATURALMENTE Y EXPERIMENTALMENTE H l, H2, H3, H4, H5; suero recolectado de cerdos infectados experimentalmente muestran signos clínicos agudos severos de SO H6, H7, H8, H9, H 10, H l 1 , H 12, H 13, suero recolectado de cerdos comerciales recuperados de SD EJEMPLO 23: ELABORACIÓN DE LAS CONSTRUCCIONES pET-19b RECOMBINANTES La clonación de varios insertos en el vector de expresión pET-19b produjeron construcciones recombinantes de varios tamaños. La elaboración de secuencias de nucleótidos de las construcciones pET-19b verificaron que el cassette de expresión se encuentra en el cuadro correcto para todas las construcciones. La traducción pronosticada del cassette de RECOMBINANTES La expresión de los clones seleccionados de E. coli recombinantes se llevó a cabo en una escala media para generar suficientes proteínas recombinantes para la vacjunaci n de los ratones. Todos los genes clonados produjeron prjoteínas I recombinantes que poseen la fusión hexa-histidina con un peso molecular aparente similar al peso molecular pronosticado de;la proteína natural como se muestra en la Tabla 4. Todas las proteínas recombinantes fueron altamente reactivas ' en el análisis western blotting utilizando un anticuerpo anti-jhis. La purificación de las proteínas recombinantes etiquetadas-his es mediante cromatografía de afinidad bajo condiciones de desnaturalización. El SDS-PAGE y la tinción con Azul Coomassie de todas las proteínas recombinantes muestran purificación de las proteínas. EJEMPLO 25: VACUNACIÓN DE CERDOS UTILIZANDO LAS PROTEÍNAS ETI QU ETADAS-H I S RECOMBINANTES PURIFICADAS Cuatro proteínas etiquetadas-his recombinantes purificadas (0.5 mg de cada una) fueron conjuntadas en un volumen total de 1 mi. Se hicieron cuatro vacunas: a) Hemolisina recombinante consistente de: NAV-H32, NAV-H33, NAV-H43 y NAV-H68; j b) Toxina recombinante consistente de: NAV-H40, NAV-H66, NAV-H72 y NAV-H177; c) Lipasa/Peptidasa recombinante consistente de: NAV-H46, NAV-H184, NAV-H86 y NAV-H191; d) Proteasa recombinante consistente de: NAV-H179, NAV- H185, NAV-H188 y NAV-H197. Los cuatro grupos de cerdos sero-negativos (de 5 semanas de edad) fueron inyectados ¡ntramuscularmente con 2 mi de vacuna consistente de 2 mg del antígeno conjuntado emulsificado con un adyuvante de agua en aceite. Los cerdos fueron vacunados dos veces ¡ntramuscularmente en la parte trasera del cuello a las 5 semanas de edad y a las 8 semanas de edad. Todos los cerdos fueron sangrados inmediatamente i antes de la primera vacunación, inmediatamente antes de la segunda vacunación y dos semanas después de la s,egunda vacunación. El suero fue recolectado de la sangre y utilizado para medir la capacidad de respuesta inmune a las proteínas contenidas en las vacunas. Debido a que las cuatro proteínas i i son combinadas en cada vacuna, el suero de cada gr|upo de cerdos es probado contra todas las cuatro proteínas individualmente. El análisis de ELISA fue realizado de lá misma manera que se señaló en el Ejemplo 22. Como se muestra en la Tabla 6, todos los ¡ cerdos respondieron de manera fuerte al régimen de vacunación administrado con niveles de anticuerpo crecientes significativamente después de las primeras inyecciones intramusculares (11.60 veces a 17.69 veces de aumentó; P<0.001) y las segundas inyecciones intramusculares (2.41 veces a 2.78 veces de aumento; P<0.001). Estos resjultados demuestran claramente la inmunogenicidad de esas prjoteínas de toxina en los cerdos y la efectividad del régimen de vacunación para inducir altos niveles de anticuerpos en los cerdos.

TABLA 6 INMUNOGENICIDAD DE LAS PROTEÍNAS DE TOXIjNA EN LOS CERDOS SEGUIDOS DE VACUNACIÓN INTRAMUSCULAR. TODOS LOS VALORES DEL ANÁLISIS ELISA SON EXPRESADOS COMO EL PROMEDIO ENTRE LA ABSORBANCIA ± DESVIACIÓN ESTÁNDAR EJEMPLO 26: PROTECCION DE LOS CERDOS MEDIANTE LA I VACUNACIÓN CON PROTEÍNAS ETI Q U ETAPAS- H I RECOMBINANTES PURIFICADAS Cuatro proteínas etiquetadas-his recomblinantes purificadas (0.5 mg de cada una) son recolectadas en un volumen total de 1 mi. Se hicieron cuatro vacunas: a) Hemolisina recombinante consistente de: NAV-H32, NAV-H33, NAV-H43 y NAV-H68; j j b) Toxina recombinante consistente de: NAV-H40, NAy-H66, NAV-H72 y NAV-H177; c) Lipasa/Peptidasa recombinante consistente de|: NAy- H46, NAV-H184, NAV-H186 y NAV-H191; d) Proteasa recombinante consistente de: NAV-H179, NAV-H185, NAV-H188 y NAV-H197. Cuatro grupos de cerdos sero-negativos (de 5 semanas de edad) son inyectados intramuscularmente con 2 mi de la vacuna consistente de 2 mg del antígeno conjuntado emulsificado con un adyuvante de agua en aceite. Un quinto grupo de diez cerdos sero-negativos son utilizados como controles negativos y luego son vacunados de manera ficticia con PBS emulsificada en el adyuvante. Todos los cerdos son vacunados dos! veces intramuscularmente en la parte trasera del cuello a las 5 semanas de edad y a las 8 semanas de edad. Todos los cerdos son vacunados con 100 mi del cultivo de B. hyodysenteriae activo (~109 células/ml) mediante el lavado gástrico a las diez semanas de edad, y los cerdos se observan diariamente por signos clínicos de la disentería de los cerdos durante el experimento (hasta seis semanas posteriores a la vacuna) y én el examen post-mortem. Dos veces a la semana, todos los cerdos son examinados rectalmente por un cultivo bacteriológico selectivo. i I

Claims

126 11. Una composición inmunogénica que comprende Un plásmido tal y como se describe en la reivindicación 7 o la reivindicación 8, un polipéptido tal y como se describe en la reivindicación 4 o la reivindicación 5, una célula tal y domo se describe en la reivindicación 9 o una proteína tal y c.omo se describe en la reivindicación 10. 12. Una composición de vacuna para la prevención de la infección por Brachyspira que comprende un plásmido tal y ° ! como se describe en la reivindicación 7 o la reivindicación 8, un polipéptido tal y como se describe en la reivindicación 4 o la reivindicación 5, una célula tal y como se describe! en la reivindicación 9 o una proteína tal y como se describe en la reivindicación 10. 13. Una composición de vacuna tal y como se describe en la reivindicación 12, caracterizada porque la infección por Brachyspira es una infección con Brachyspira hyodysenteriae. 14. Una composición de vacuna tal y como se describe 1 en la reivindicación 12 o la reivindicación 13, caracterizada porque la composición comprende por lo menos dos de: a. una molécula de toxina seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOs: 18, 20, 22, y 24; b. una molécula de lipasa y/o peptidasa seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOs: 10, 12, 14, y 1,6; c. una molécula de proteasa seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, y 8; y ; d. determinar si el complejo de anticuerpo-antígeno con uno o más polipéptidos es formado, en donde la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno indica que el animal está infectado con Brachyspira. 17. Un método tal y como se describe en la reivindicación 16, caracterizado porque la infección por Brachyspira es la infección con Brachyspira hyodysenteripe . 18. Un método tal y como se describe en la reivindicación 16 o la reivindicación 17, caracterizado porque el paso b comprende además la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOs: 26, 28, 30, y 32. 19. Un equipo para el diagnostico de la infección por Brachyspira que comprende uno o más polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, y 24.