ES2922879T3 - Proteínas recombinantes novedosas de la membrana externa de Brachyspira hyodysenteriae y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere en general al campo de las enfermedades diarreicas causadas por espiroquetas intestinales. En concreto, la invención se refiere a la prevención y/o tratamiento de infecciones por B. hyodysenteriae. En un aspecto, la invención se refiere a un nuevo polipéptido recombinante, en el que dicho polipéptido se puede combinar preferiblemente con uno o más polipéptidos recombinantes adicionales. En otro aspecto, se proporciona una composición inmunogénica que contiene dicho(s) polipéptido(s) recombinante(s) para usar en un método para tratar o prevenir los signos clínicos provocados por Brachyspira hyodysenteriae. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas recombinantes novedosas de la membrana externa de Brachyspira hyodysenteriae y usos de las mismas

Campo de la divulgación

La presente divulgación se refiere en general al campo de las enfermedades diarreicas provocadas por espiroquetas intestinales. Específicamente, la divulgación se refiere a un enfoque novedoso para inducir respuestas de anticuerpos sistémicas y secretoras contra cepas de Brachyspira hyodysenteriae. Más específicamente, la divulgación se refiere a la prevención y/o el tratamiento de infecciones por B. hyodysenteriae.

Introducción

Brachyspira hyodysenteriae es una espiroqueta intestinal anaerobia. La infección de los cerdos por esta espiroqueta provoca la disentería porcina (DS, del inglés swine dysentery), una enfermedad de cerdos endémica importante en Australia y a nivel mundial. La disentería porcina es una enfermedad diarreica mucohemorrágica contagiosa caracterizada por inflamación generalizada y necrosis de la superficie epitelial del intestino grueso. Las pérdidas económicas debidas a la disentería porcina dan como resultado principalmente el retardo del crecimiento, costos de medicación y mortalidad. Cuando la disentería porcina se establece en un criadero de cerdos, el espectro de la enfermedad puede variar de leve, temporal o no manifiesta a grave e incluso fatal. Las estrategias de medicación en los criaderos de cerdos individuales pueden enmascaras los signos clínicos y en algunos criaderos de cerdos la enfermedad puede pasar desapercibida, o puede solo sospecharse. Tanto si se produce una enfermedad evidente como si no, B. hyodysenteriae puede persistir en cerdos infectados, o en otros hospedadores portadores pasivos, tales como roedores, o en el ambiente. Todas estas fuentes poseen potencial de transmisión de la enfermedad a piaras no infectadas. La espiroqueta infecta ocasionalmente a pollos, gansos y otras especies de aves y mamíferos.

En la práctica, se emplearon varios métodos para controlar la disentería porcina, que varían desde el uso profiláctico de agentes antimicrobianos hasta la retirada completa de las piaras infectadas y la prevención de la reentrada de cerdos portadores infectados. Todas estas opciones son costosas y, para que sean completamente eficaces, precisan el uso de sofisticadas pruebas de diagnóstico para controlar el progreso.

La presente invención proporciona:

[1] El uso in vitro de un polipéptido recombinante que consiste en una secuencia que es idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o

que consiste en una secuencia que es idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y que adicionalmente tiene una etiqueta de afinidad unida para la detección de la presencia de Brachyspira hyodysenteriae.

[2] Uso de un kit de diagnóstico para la detección de la presencia de Brachyspira hyodysenteriae en un animal, en donde dicho kit contiene un polipéptido recombinante que consiste en una secuencia que es idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o

que consisten en una secuencia que es idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y que adicionalmente tiene una etiqueta de afinidad unida,

y en donde dicho uso no es un método de diagnóstico practicado en el cuerpo del animal.

[3] El uso de [2], en donde el kit contiene:

(a) una cantidad conocida de dicho polipéptido recombinante unida a una fase sólida para formar un inmunoabsorbente, y

(b) instrucciones para el uso de dicho kit de prueba.

[4] Uso in vitro de un kit para demostrar la presencia de una especie de Brachyspira, en donde dicho kit contiene:

(a) una cantidad predeterminada de un componente inmunoquímicamente reactivo marcado obtenido mediante la unión directa o indirecta de un polipéptido a un marcador detectable, en donde dicho polipéptido es

un polipéptido recombinante que consiste en una secuencia que es idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o que consiste en una secuencia que es idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y que adicionalmente tiene una etiqueta de afinidad unida; y

(b) instrucciones para el uso de dicho kit.

[5] El uso de una cualquiera de [1] a [4], en donde dicha etiqueta de afinidad se selecciona del grupo que consiste en etiqueta de polihistidina, proteína de unión a quitina (CBP, del inglés chitin binding protein), proteína de unión a maltosa (MBP, del inglés maltose binding protein) y glutatión-S-transferasa (GST).

Por tanto, la invención en sus diferentes aspectos y realizaciones se implementa de acuerdo con las reivindicaciones.

Es un objeto adicional de la presente divulgación proporcionar genes de B. hyodysenteriae y proteínas codificadas por los genes. Es un objeto adicional de la presente divulgación que las proteínas codificadas por los genes puedan utilizarse con fines diagnósticos. Se pueden utilizar las proteínas para diagnosticar infecciones de B. hyodysenteriae.

Como también se menciona a continuación, el término "proteína" y el término "polipéptido" se utilizan indistintamente en el presente documento. Preferentemente, la proteína o el polipéptido (o las proteínas o los polipéptidos), respectivamente, como se describe en el presente documento, es (o son) proteína(s) recombinante(s).

Es un objeto de la presente divulgación proporcionar genes de B. hyodysenteriae que tengan la secuencia de nucleótidos contenida en las SEQ ID NO: 2, 4 y 6, en donde el gen que tiene la secuencia de nucleótidos contenida en la SEQ ID NO: 2 también se denomina OMP10, el gen que tiene la secuencia de nucleótidos contenida en la SEQ ID NO: 4 también se denomina OMP6, y el gen que tiene la secuencia de nucleótidos contenida en la SEQ ID NO: 6 también se denomina OMP7.

Es también un objeto de la presente divulgación proporcionar secuencias de nucleótidos que sean idénticas a las SEQ ID NO: 2, 4 y 6, en que el porcentaje de identidad pueda ser de al menos el 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % y 70 % (y cada número entero de 100 a 70).

También es un objeto de la presente divulgación proporcionar plásmidos que contienen ADN que tiene la secuencia de las SEQ ID NO: 2, 4 y 6; y una célula que contengan los plásmidos que tienen la secuencia de las SEQ ID NO: 2, 4, y 6.

Es además un objeto de la presente divulgación proporcionar vectores de expresión procarióticos y/o eucarióticos que contienen ADN que tiene la secuencia de las SEQ ID NO: 2, 4 y 6.

Es un objeto de la presente divulgación tener proteínas recombinantes de B. hyodysenteriae novedosas que tienen la secuencia de aminoácidos contenida en las SEQ ID NO: 1, 3 y 5.

Es, por tanto, otro objeto de la presente divulgación tener proteínas que sean al menos el 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % y 70 % homologas (y cada número entero de 100 a 70) a las secuencias contenidas en las SEQ ID NO: 1, 3 y 5.

Es un aspecto adicional de la presente divulgación tener un kit de diagnóstico que contenga uno o más proteínas recombinantes que tienen una secuencia contenida en la SEQ ID NO: 1 o que sean al menos el 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % y 70 % homologas a la secuencia contenida en la SEQ ID NO: 1.

Es otro aspecto de la presente divulgación el uso de secuencias de nucleótidos que codifiquen las proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos contenidas en la SEQ ID NO: 1 y codifican las secuencias de aminoácidos que son al menos el 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % y 70 % homólogas (y cada número entero de 100 a 70) a las secuencias contenidas en la SEQ ID NO: 1.

La divulgación también cubre el uso de plásmidos y de vectores de expresión procarióticos y eucarióticos que contienen ADN que tiene una secuencia que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos contenida en la SEQ ID NO: 1, y que codifican secuencias de aminoácidos que son al menos el 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % y 70 % homologas (y cada número entero de 100 a 70) a las secuencias contenidas en las SEQ ID NO: 1. El uso de células que contienen estos plásmidos y de células que contienen estos vectores de expresión está incluido en la presente invención.

El término "animal", como se describe en el presente documento, se dirige a cualquier mamífero y ave; más preferentemente, pollo, ganso, pato, pavo, periquito, perro, gato, hámster, jerbo, conejo, hurón, caballo, vaca, oveja, cerdo, mono y ser humano.

Sumario detallado de la divulgación

Los artículos "un" y "una" se utilizan en la presente invención para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

El término "aminoácido" pretende abarcar todas las moléculas, ya sea naturales o sintéticas, que incluyen tanto una funcionalidad amino como una funcionalidad de ácido y con capacidad de ser incluidas en un polímero de aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de ejemplo incluyen aminoácidos que de origen natural; análogos, derivados y congéneres de los mismos; análogos de aminoácido que tienen cadenas laterales variantes y todos los estereoisómeros de cualquiera de los anteriores.

Un animal puede ser cualquier mamífero o un ave. Los ejemplos de mamíferos incluyen perro, gato, hámster, gerbo, conejo, hurón, caballo, vaca, oveja, cerdo, mono y ser humano. Los ejemplos de aves incluyen pollo, ganso, pato, pavo y periquito.

La expresión "resto conservado" se refiere a un aminoácido que es un miembro de un grupo de aminoácidos que tienen ciertas propiedades comunes. La expresión "substitución de aminoácidos conservativa" se refiere a la substitución (en forma conceptual o de otra forma) de un aminoácido de uno de dichos grupos por un aminoácido diferente del mismo grupo. Una forma funcional para definir las propiedades comunes entre aminoácidos individuales es analizar las frecuencias normalizadas de los cambios de aminoácidos entre proteínas correspondientes de organismos homólogos (Schulz, G. E. y R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). De acuerdo con dichos análisis, los grupos de aminoácidos pueden definirse cuando los aminoácidos dentro de un grupo se intercambian preferentemente entre sí, y por consiguiente se asemejan más entre sí en su impacto sobre la estructura de proteína global (Schulz, G. E. y R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Los ejemplos de grupos de aminoácidos definidos de esta forma incluyen: (i) un grupo con carga positiva que contiene Lys, Arg e His, (ii) un grupo con carga negativa que contiene Glu y Asp, (iii) un grupo aromático que contiene Phe, Tyr y Trp, (iv) un grupo de anillo de nitrógeno que contiene His y T rp, (v) un grupo alifático no polar grande que contiene Val, Leu y De, (vi) un grupo ligeramente polar que contiene Met y Cys, (vii) un grupo de resto pequeño que contiene Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln y Pro, (viii) un grupo alifático que contiene Val, Leu, De, Met y Cys, y (ix) un grupo de hidroxilo pequeño que contiene Ser y Thr.

Una "proteína de fusión"' o "péptido de fusión" se refiere a una proteína quimérica, como se conoce la expresión en la técnica, y puede construirse utilizando métodos conocidos en la técnica. En muchos ejemplos de proteínas de fusión existen dos diferentes secuencias de polipéptido, y en ciertos casos puede haber más. Las secuencias polinucleotídicas que codifican la proteína de fusión pueden unirse operativamente en marco de lectura de modo que la proteína de fusión pueda traducirse correctamente. Una proteína de fusión puede incluir secuencias de polipéptido de la misma especie o de especies diferentes. En diversos aspectos, el polipéptido de fusión puede contener una o más secuencias de aminoácidos unidas a un primer polipéptido. En el caso en donde se fusiona más de una secuencia de aminoácidos a un primer polipéptido, las secuencias de fusión pueden ser múltiples copias de la misma secuencia, o como alternativa, pueden ser secuencias de aminoácidos diferentes. Los polipéptidos de fusión pueden fusionarse al extremo N, al extremo C o al extremo N y el C del primer polipéptido. Las proteínas de fusión de ejemplo incluyen polipéptidos que contienen una etiqueta de glutatión S-transferasa (etiqueta-GST), una etiqueta de histidina (etiqueta His), un dominio de inmunoglobulina o un dominio de unión a inmunoglobulina.

La expresión "poIipéptido aislado" se refiere a un polipéptido, en ciertos aspectos preparados a partir de ADN o ARN recombinante, o de origen sintético o de origen natural, o alguna combinación de los mismos, que (1) no está asociado con proteínas que se encuentran normalmente en la naturaleza, (2) se separa de la célula en la que se encuentra normalmente, (3) está libre de otras proteínas de la misma fuente celular, (4) se expresa mediante una célula de una especie diferente, o (5) no se encuentra en la naturaleza. Es posible que exista un polipéptido aislado pero que no se califique como polipéptido purificado.

La expresión "ácido nucleico aislado" y "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido, ya sea ADN genómico, ADNc, ARNm, ARNt, ARNr, ARNi, o un polinucleótido obtenido de un orgánulo celular (tal como mitocondria y cloroplasto), o ya sea de origen sintético, que (1) no está asociado con la célula en la que el "ácido nucleico aislado'' se encuentra en la naturaleza, o (2) está unido operativamente a un polinucleótido al cual no está unido en la naturaleza. Es posible que exista un polinucleótido aislado pero que no se califique como polinucleótido purificado.

La expresión "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos, o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. La expresión también debe entenderse que incluye, como equivalentes, análogos ya sea de ARN o ADN fabricados de análogos de nucleótido, y tal como es aplicable en el aspecto descrito, polinucleótidos monocatenarios (tal como de sentido o de antisentido) y bicatenarios.

La expresión "ácido nucleico de la divulgación" y "polinucleótido de la divulgación" se refiere a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la divulgación. Un polinucleótido de la divulgación puede comprender toda, o una parte de una secuencia de ácido nucleico objeto; una secuencia de nucleótidos al menos el 60 %, 70 %; 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a una secuencia de ácido nucleico objeto (y cada número entero entre 60 y 100); una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas a una secuencia de ácido nucleico objeto; secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que son funcionalmente equivalentes a polipéptidos de la divulgación; secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos al menos aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 85 %; 90 %, 95 %, 98 %, 99 % homologas o idénticas con una secuencia de aminoácidos objeto (y cada número entero entre 60 y 100); secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tiene una actividad del polipéptido de la presente invención y que tienen al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más de homología o identidad con la secuencia de aminoácidos objeto (y cada número entero entre 60 y 100); secuencias de nucleótidos que difieren en 1 hasta aproximadamente 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 o más substituciones, adiciones o deleciones de nucleótido, tal como variantes alélicas de una secuencia de ácido nucleico objeto; ácidos nucleicos obtenidos de y evolutivamente relacionados con una secuencia de ácido nucleico objeto; y complementos de, y secuencias de nucleótidos que son el resultado de la degeneración del código genético, para todos los ácidos nucleicos anteriores y otros de la divulgación. Los ácidos nucleicos de la divulgación también incluyen homólogos, por ejemplo, ortólogos y parálogos, de una secuencia de ácido nucleico objeto, y también variantes de la secuencia de ácido nucleico objeto con codones optimizados para la expresión en un organismo particular (por ejemplo, una célula hospedadora).

La expresión "unido operativamente", cuando describe la relación entre dos regiones de ácido nucleico, se refiere a una yuxtaposición, en donde las regiones están en una relación que les permite funcionar en su forma prevista. Por ejemplo, una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante, se liga de tal forma que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control, tal como cuando las moléculas adecuadas (por ejemplo, inductores y polimerasas) se unen a la secuencia(s) de control o reguladora(s).

El término "polipéptido" y los términos "proteína'" y "péptido" que se utilizan de manera indistinta en la presente invención, se refieren a un polímero de aminoácidos. Los polipéptidos de ejemplo incluyen productos génicos, proteínas de origen natural, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los anteriores.

La expresión "fragmento de polipéptido" o "fragmento" cuando se utiliza con referencia al polipéptido de referencia, se refiere a un polipéptido en el cual los restos de aminoácido se delecionan en comparación con el propio polipéptido de referencia, pero en donde la secuencia de aminoácidos restante es habitualmente idéntica a las posiciones correspondientes en el polipéptido de referencia. Dichas deleciones pueden producirse en el extremo amino o el extremo carboxilo del polipéptido de referencia, o como alternativa, en ambos. Los fragmentos normalmente son de al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de longitud, al menos 14 aminoácidos de longitud, al menos 20, 30, 40 o 50 aminoácidos de longitud, al menos 75 aminoácidos de longitud, o al menos 100, 150, 200, 300, 500 o más aminoácidos de longitud. Un fragmento puede conservar una o más actividades biológicas del polipéptido de referencia. En ciertos aspectos, un fragmento puede comprender un dominio que tiene la actividad biológica deseada, y opcionalmente aminoácidos adicionales en uno o ambos lados del dominio, cuyos aminoácidos adicionales pueden ser de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o hasta 100 o más restos. Además, los fragmentos pueden incluir un subfragmento de una región específica, subfragmento que retiene una función de la región de la cual se obtiene. En otro aspecto, un fragmento puede tener propiedades inmunogénicas.

La expresión término "polipéptido de la divulgación" se refiere a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos objeto, o un equivalente o fragmento de la misma. Los polipéptidos de la divulgación incluyen polipéptidos que contienen toda o parte de una secuencia de aminoácidos objeto; una secuencia de aminoácidos objeto con de 1 a aproximadamente 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 o más substituciones de aminoácido conservadas; una secuencia de aminoácidos que es al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % homologa a la secuencia de aminoácidos objeto (y cada número entero entre 60 y 100); y fragmentos funcionales de la misma. Los polipéptidos de la divulgación también incluyen homólogos, por ejemplo, ortólogos y parálogos, de una secuencia de aminoácidos objeto.

También es posible modificar la estructura de los polipéptidos de la divulgación para fines tales como aumentar la eficacia terapéutica o profiláctica, o la estabilidad (por ejemplo, tiempo de conservación ex vivo, resistencia a la degradación proteolítica in vivo, etc.). Dichos polipéptidos modificados, cuando se diseñan para conservar al menos una actividad de la forma de la proteína de origen natural, se consideran "equivalentes funcionales" de los polipéptidos descritos con mayor detalle en el presente documento. Dichos polipéptidos modificados pueden producirse, por ejemplo, mediante substitución, deleción o adición de aminoácidos, en que las substituciones pueden consistir en la totalidad o parte de las substituciones de aminoácido conservativas.

Por ejemplo, es razonable esperar que una substitución de aminoácido conservativa aislada, tal como la sustitución de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por serina, no tendrán un efecto importante en la actividad biológica de la molécula resultante. Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido da como resultado un homólogo funcional, esto puede determinarse fácilmente evaluando la capacidad del polipéptido variante para producir una respuesta similar a la de la proteína de tipo silvestre. Los polipéptidos en que ha tenido lugar más de una sustitución pueden probarse fácilmente en la misma forma.

El término "purificado" se refiere a una especie objeto que es la especie predominante presente (por ejemplo, en una base molar, es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). Una "fracción purificada" es una composición en que las especies objeto son al menos aproximadamente el 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies presentes. Al realizar la determinación de la pureza de una especie en solución o dispersión, el disolvente o matriz en el cual la especie se disuelve o dispersa habitualmente no se incluye en dicha determinación; más bien, únicamente las especies (incluyendo una de interés) disuelta o dispersas se toman en cuenta. Generalmente, una composición purificada tendrá una especie que es mayor aproximadamente al 80 % de todas las especies presentes en la composición, más de aproximadamente el 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de todas las especies presentes. Las especies objeto pueden purificarse hasta una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición a través de métodos de detección convencionales) en donde la composición es esencialmente una sola especie. Un experto en la materia puede purificar un polipéptido de la divulgación utilizando técnicas convencionales para la purificación de proteínas a la luz de las enseñanzas en el presente documento. La pureza de un polipéptido puede determinarse a través de varios métodos conocidos para los expertos en la materia, incluyendo, por ejemplo, análisis de secuencia de aminoácidos amino-terminal, electroforesis en gel, análisis de espectrometría de masas y métodos descritos en el presente documento.

Las expresiones "proteína recombinante" o "polipéptido recombinante" se refiere a un polipéptido que se produce mediante técnicas de ADN recombinante. Un ejemplo de dichas técnicas incluye el caso en que el a Dn que codifica la proteína expresada se inserta en un vector de expresión adecuado, el cual, a su vez, se utiliza para transformar una célula hospedadora para producir la proteína o polipéptido codificado por el ADN.

La expresión "secuencia reguladora" es una expresión genérica utilizada a lo largo de la presente memoria descriptiva, para referirse a secuencias polinucleotídicas, tal como señales de inicio, potenciadores, reguladores y promotores, que son necesarios o convenientes para afectar la expresión de las secuencias codificantes o no codificantes a las cuales se unen operativamente. Las secuencias reguladoras de ejemplo se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990), e incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos y tardíos de SV40, promotor temprano o inmediato de adenovirus o citomegalovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7, cuya expresión es dirigida por ARN polimerasa T7, las regiones operadoras y promotoras mayores del fago lambda, las regiones de control de la proteína de cubierta fd, el promotor de la 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, los promotores de la ácido fosfatasa (por ejemplo, Pho5), los promotores de los factores de apareamiento a de levadura, el promotor de polihedrón, del sistema de baculovirus y otras secuencias conocidas para controlar la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos. La naturaleza y uso de dichas secuencias de control puede diferir dependiendo del organismo hospedador. En procariotas, dichas secuencias reguladoras generalmente incluyen secuencias promotoras, de sitio de unión al ribosoma y de terminación de transcripción. La expresión "secuencia reguladora" está destinada a incluir, como mínimo, componentes cuya presencia puede influir en la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es conveniente, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañeros de fusión. En ciertos aspectos, la transcripción de una secuencia polinucleotídica está bajo el control de una secuencia promotora (u otra secuencia reguladora) que controla la expresión del polinucleótido en un tipo celular en el cual se pretende la expresión. También se entiende que el polinucleótido puede estar bajo el control de secuencias reguladoras que son las mismas o diferentes a las secuencias que controlan la expresión de la forma de origen natural del polinucleótido.

La expresión "homología de secuencia" se refiere a la proporción de coincidencias de bases entre dos secuencias de ácido nucleico o la proporción de coincidencias de aminoácidos entre dos secuencias de aminoácidos. Cuando la homología de secuencia se expresa como un porcentaje, por ejemplo, el 50 %, el porcentaje indica la proporción de coincidencias en la longitud de las secuencias a partir de una secuencia deseada que se compara con algunas otras secuencias. Se permiten huecos (en cualesquiera de las dos secuencias) para maximizar la coincidencia; habitualmente se utilizan longitudes de hueco de 15 bases o menos, se utilizan más frecuentemente 6 bases o menos, utilizándose 2 bases o menos incluso con más frecuencia. La expresión "identidad de secuencia" significa que las secuencias son idénticas (por ejemplo, sobre una base de nucleótido por nucleótido para los ácidos nucleicos o aminoácido por aminoácido para los polipéptidos) en una ventana de comparación. La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula mediante la comparación de dos secuencias alineadas en forma óptima en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales se producen los aminoácidos o nucleótidos idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Los métodos para calcular la identidad de secuencia son conocidos para los expertos en la materia y se describen con mayor detalle a continuación.

El término "soluble" como se utiliza en el presente documento con referencia a un polipéptido de la divulgación u otra proteína, significa que, al momento de la expresión en el cultivo celular, al menos cierta parte del polipéptido o proteína expresados permanecen en la fracción citoplásmica de la célula y no se fraccionan con los restos celulares al momento de la lisis y centrifugación del lisado. La solubilidad de un polipéptido puede aumentarse a través de una diversidad de métodos reconocidos en la técnica, incluyendo fusión a una secuencia de aminoácidos heteróloga, deleción de restos de aminoácidos, substitución de aminoácidos (por ejemplo, enriqueciendo la secuencia con restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófilas) y modificación química (por ejemplo, adición de grupos hidrófilos).

La solubilidad de los polipéptidos se puede medir utilizando una diversidad de técnicas reconocidas incluyendo dispersión de luz dinámica para determinar el estado de agregación, absorción UV, centrifugación para separar material agregado del no agregado y electroforesis en gel con SDS (por ejemplo, la cantidad de proteína en una fracción soluble se compara con la cantidad de proteína en las fracciones solubles e insolubles combinadas). Cuando se expresa en una célula hospedadora, los polipéptidos de la divulgación pueden ser al menos aproximadamente el 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %; 70 %, 80 %, 90 % o más solubles, por ejemplo, al menos aproximadamente el 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de la cantidad total de proteína expresada en las células que se encuentra en la fracción citoplásmica. En ciertos aspectos, un litro de cultivo de células que expresa un polipéptido de la divulgación producirá al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 miligramos o más de proteína soluble. En un aspecto de ejemplo, un polipéptido de la divulgación es al menos aproximadamente el 10 % soluble y producirá al menos aproximadamente 1 miligramo de proteína a partir de un litro de cultivo celular.

La expresión "hibrida en forma específica", se refiere a la unión específica de ácidos nucleicos. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y ácido nucleicos de la divulgación hibridan en forma selectiva a hebras de ácido nucleico en hibridación y condiciones de lavado que minimizan las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden utilizar condiciones rigurosas para lograr condiciones de hibridación selectivas como se sabe en la técnica y se analiza en el presente documento. Generalmente, la identidad de la secuencia ácido nucleico entre los poIinucIeótidos, oligonucleótidos y ácidos nucleicos de la divulgación y la secuencia de ácido nucleico de interés será de al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o más (y cada número entero entre 30 y 100). En ciertos casos las condiciones de hibridación y lavado se llevan a cabo en condiciones rigurosas de acuerdo con procedimientos de hibridación convencionales y como se describe adicionalmente a el presente documento.

Las expresiones "condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" se refieren a condiciones que favorecen la hibridación específica entre dos hebras de polinucleótido complementarias, para formar de esta manera un dúplex. Las condiciones rigurosas pueden ser seleccionadas para ser aproximadamente 5 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm) para un dúplex de polinucleótido a una fuerza iónica y pH definidos. La longitud de las hebras de polinucleótido complementarias y su contenido de GC determinará el Tm del dúplex, y por lo tanto las condiciones de hibridación necesarias para obtener una especificidad de hibridación deseada. La Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y pH definidos) en que el 50 % de la secuencia polinucleotídica hibrida con una hebra complementaria perfectamente coincidente. En ciertos casos, puede ser conveniente aumentar la rigurosidad de las condiciones de hibridación para que sean aproximadamente iguales a la Tm para un dúplex particular.

Está disponible una variedad de técnicas para estimar la Tm. Normalmente, los pares bases G-C en un dúplex se estiman para contribuir en aproximadamente 3 °C a la Tm, en tanto que los pares bases A-T se estiman para contribuir en aproximadamente 2 °C, hasta un máximo teórico de aproximadamente 80 a 100 °C.

Sin embargo, están disponibles modelos de Tm más sofisticados en que las interacciones de apilamiento G-C, los efectos del disolvente, la temperatura de ensayo deseada y similares se toman en cuenta. Por ejemplo, se pueden diseñar sondas para tener una temperatura de disociación (Td) de aproximadamente 60 °C, utilizando la formula: Td = (((3 x n.° de g C) (2 x n.° de AT)) x 37) - 562)/n.° de pb) - 5; en que n.° de GC, n.° de AT y n.° de pb son el número de pares de bases de guanina-citocina, el número de pares bases de adenina-timina y el número de pares bases totales, respectivamente, implicados en la formación del dúplex.

La hibridación se puede llevar a cabo en 5x SSC, 4x SSC, 3x SSC, 2x SSC, 1x SSC o 0,2x SSC durante al menos aproximadamente 1 hora, 2 horas, 5 horas, 12 horas o 24 horas. La temperatura de la hibridación puede aumentarse para ajustar la rigurosidad de la reacción, por ejemplo, de aproximadamente 25 °C (temperatura ambiente), hasta aproximadamente 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C o 65 °C. La reacción de hibridación también puede incluir otro agente que afecte la rigurosidad, por ejemplo, la hibridación llevada a cabo en presencia de formamida al 50 % aumenta la rigurosidad de la hibridación a una temperatura definida.

La reacción de hibridación puede estar seguida de una etapa de lavado única, o de dos o más etapas de lavado, las cuáles pueden estar a las mismas o a distintas salinidad y temperatura. Por ejemplo, la temperatura de lavado puede aumentarse para ajustar la rigurosidad de aproximadamente 25 °C (temperatura ambiente) a aproximadamente 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C o superior. La etapa de lavado puede realizarse en presencia de un detergente, por ejemplo, SDS al 0,1 o 0,2 %. Por ejemplo, la hibridación puede estar seguida de dos etapas de lavado a una temperatura de 65 °C cada una durante aproximadamente 20 minutos en 2x SSC, SDS al 0,1 % y, opcionalmente, dos etapas de lavado adicionales a 65 °C cada una durante aproximadamente 20 minutos en 0,2x SSC, SDS al 0,1 %.

Las condiciones de hibridación rigurosas de ejemplo incluyen hibridación durante la noche a 65 °C en una solución que contiene formamida al 50 %, 10x Denhardt (Ficoll al 0,2 %, polivinilpirrolidona al 0,2 %, seroalbúmina de bovina al 0,2 %) y 200 pg/ml de ADN portador desnaturalizado, por ejemplo, ADN de esperma de salmón cortado, seguido de dos etapas de lavado a una temperatura de 65 °C cada una durante aproximadamente 20 minutos en 2 x SSC, SDS al 0,1 %, y dos etapas de lavado a 65 °C cada una durante aproximadamente 20 minutos en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 %.

La hibridación puede consistir en hibridar los ácidos nucleicos en solución, o un ácido nucleico en solución con un ácido nucleico unido a un soporté sólido, por ejemplo, un filtro. Cuando un ácido nucleico está en un soporte sólido, se puede llevar a cabo una etapa de prehibridación antes de la hibridación. La prehibridación se puede llevar a cabo durante al menos 1 hora, 3 horas o 10 horas en la misma solución y a la misma temperatura que la solución de hibridación (sin la hebra polinucleotídica complementaria).

Los expertos en la materia conocen condiciones de rigurosidad adecuadas o pueden determinarlas de forma experimental. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1­ 12.3.6; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; S. Agrawal (ed.) Methods in Molecular Biology, volumen 20; Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization With Nucleic Acid Probes, por ejemplo, parte I capítulo 2 "Methods in Molecular Biology ", Elsevier, Nueva York; y Tibanyenda, N. et al., Eur. J. Biochem. 139:19 (1984) y Ebel, S. et al., Biochem. 31:12083 (1992).

El término "vector" se refiere a un ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector que se puede utilizar de acuerdo con la divulgación es un episoma, por ejemplo, un ácido nucleico capaz de replicación extracromosómica. Otros vectores incluyen los que tienen la capacidad de replicación autónoma y expresión de los ácidos nucleicos a los cuales están unidos. Los vectores capaces de dirigir la expresión de los genes a los cuales están unidos operativamente se denominan en el presente documento "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante con frecuencia están en la forma de "plásmidos", que se refieren a moléculas circulares de ADN bicatenario que, en su forma de vector no están unidos al cromosoma. En la presente memoria descriptiva, los términos "plásmido" y "vector" se utilizan de manera indistinta ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la divulgación pretende incluir otras formas de vectores de expresión que cumplan funciones equivalentes y que se conozcan en la técnica con posterioridad al presente documento.

En otro aspecto de la divulgación, el polinucleótido de la divulgación se proporciona en un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la divulgación y está unida operativamente al menos a una secuencia reguladora. Deberá entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar y/o el tipo de proteína deseada a expresar. El número de copias del vector, la capacidad de controlar dicho número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tales como marcadores antibióticos, deben ser considerados.

El polinucleótido de la divulgación puede utilizarse para provocar la expresión y sobreexpresión de un polipéptido de la divulgación en células propagadas en el cultivo, por ejemplo, para producir proteínas o polipéptidos, incluyendo proteínas o polipéptidos de fusión.

La presente divulgación concierne a una célula o hospedadora transfectada con un gen recombinante con el objeto de expresar un polipéptido de la presente divulgación. La célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariótica. Por ejemplo, un polipéptido de la presente divulgación se puede expresar en células, bacterianas tales como células de insecto E. coli, (baculovirus), células de levadura, plantas o mamíferos. Otras células hospedadoras adecuadas son conocidas para los expertos en la materia. Además, la célula hospedadora puede ser suplementada con moléculas de ARN que no se encuentran normalmente en el hospedador, para optimizar 'de esta forma la expresión del polipéptido. Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede ser alterada para optimizar la expresión en la célula hospedadora, aún la proteína producida puede tener alta homología con la proteína codificada en forma original. Otros métodos adecuados para maximizar la expresión del polipéptido serán conocidos para los expertos en la materia.

La presente divulgación concierne además a métodos para producir los polipéptidos de la divulgación. Por ejemplo, una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido de la divulgación puede cultivarse en condiciones adecuadas para permitir que se produzca la expresión del polipéptido. El polipéptido puede secretarse y aislarse de una mezcla de células y un medio que contiene el polipéptido. Como alternativa, el polipéptido puede retenerse en forma citoplásmica y las células recogerse, lisarse, y la proteína aislarse.

Un cultivo celular incluye células hospedadoras, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para el cultivo celular son conocidos en la técnica. El polipéptido puede aislarse del medio de cultivo celular, de las células hospedadoras o de ambos, utilizando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis y purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para epítopos particulares de un polipéptido de la divulgación.

Por tanto, una secuencia de nucleótidos que codifica todo o una parte seleccionada del polipéptido de la divulgación se puede utilizar para producir una forma recombinante de la proteína mediante procesos celulares microbianos o eucarióticos. El ligamiento de la secuencia en una construcción de poIinucIeótido, tal como un vector de expresión, y la transformación o transfección en hospedadores, ya sea eucariotas (levadura, aviar, insecto o mamífero), o procariotas (células bacterianas) son procedimientos convencionales. Se pueden emplear procedimientos similares o modificaciones de los mismos para preparar polipéptidos recombinantes de la presente divulgación mediante medios microbianos o tecnología de cultivo de tejidos.

Los vectores adecuados para la expresión de un polipéptido de la divulgación incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos obtenidos de pTrcHis, plásmidos obtenidos de pET, plásmidos obtenidos de pBR322, plásmidos obtenidos de pEMBL, plásmidos obtenidos de pEX, plásmidos obtenidos de pBTac y plásmidos obtenidos de pUC para la expresión en células procariotas tales como E. coli. Los diversos métodos empleados en la preparación de plásmidos y transformación de organismos hospedadores son bien conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como para eucariotas, así como los procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, de Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), capítulos 16 y 17.

Las secuencias codificantes de un polipéptido de interés pueden incorporarse como parte de un gen de fusión que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido diferente. La presente divulgación contempla un polinucleótido aislado que contiene un ácido nucleico de la divulgación y al menos una secuencia heteróloga que codifica un péptido heterólogo unido en marco de lectura a la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de la divulgación, para codificar una proteína de fusión que contenga el polipéptido heterólogo. El polipéptido heterólogo puede fusionarse (a) al extremo C del polipéptido de la divulgación, (b) al extremo N del polipéptido de la divulgación o (c) al extremo C y el extremo N del polipéptido de la divulgación. En ciertos casos, las secuencias heterólogas codifican un polipéptido que permite la detección, aislamiento, soIubiIización y/o estabilización del polipéptido al cual se fusiona. Aún en otros aspectos, las secuencias heterólogas codifican un polipéptido tal como una etiqueta de poli His, myc, HA, GST, proteína A, proteína G, péptido de unión a calmodulina, tiorredoxina, proteína de unión a maltosa, poli arginina, poli His-Asp, FLAG, una parte de una proteína inmunoglobulina y un péptido de transcitosis.

Las proteínas de fusión pueden facilitar la expresión y/o purificación de proteínas. Por ejemplo, un polipéptido de la presente divulgación puede generarse como una proteína de fusión de glutatión-S-transferasa (GST). Dichas proteínas de fusión de GST pueden utilizarse para simplificar la purificación de un polipéptido de la divulgación, tal como a través del uso de matrices obtenidas de glutatión (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds: Ausubel et al., (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)). En otro aspecto, un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia de poli-(His)/sitios de escisión de enterocinasa en el extremo N de la parte deseada de la proteína recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada mediante cromatografía de afinidad utilizando una resina de metal Ni2+. La secuencia líder de purificación posteriormente puede eliminarse mediante tratamiento con enterocinasa para proporcionar la proteína purificada (véase, por ejemplo, Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177 y Janknecht et al., PNAS USA 88:8972).;

Son bien conocidas las técnicas para fabricar genes de fusión. Esencialmente, la unión de los diversos fragmentos de ADN que codifican para diferentes secuencias de polipéptido se lleva a cabo de acuerdo con técnicas convencionales, empleando extremos romos o escalonados para el ligamiento, digestión por enzimas de restricción para proporcionar el extremo adecuado, rellenado de extremos cohesivos según sea adecuado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión no deseada y ligamiento enzimático. En otro aspecto, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Como alternativa, la amplificación por PCR de los fragmentos génicos puede llevarse a cabo utilizando cebadores ancla que dan lugar a protuberancias complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente pueden aparearse para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).

En una forma preferida de la divulgación se proporcionan polipéptidos de B. hyodysenteriae aislados como se describe en el presente documento, y también las secuencias polinucleotídicas que codifican estos polipéptidos. En forma más conveniente, los polipéptidos de B. hyodysenteriae se proporcionan substancialmente en forma purificada.

Los polipéptidos preferidos de la presente divulgación tendrán una o más propiedades biológicas (por ejemplo, propiedades in vivo, in vitro o inmunológicas) del polipéptido de longitud total nativo.

Los polipéptidos, incluyendo análogos, fragmentos y derivados se pueden preparar en forma sintética (por ejemplo, utilizando las técnicas bien conocidas de síntesis de péptidos en fase sólida o de fase en solución). Preferentemente, sé emplean técnicas sintéticas de fase sólida. Como alternativa, los polipéptidos de la divulgación se pueden preparar utilizando técnicas de ingeniería genéticas bien conocidas tal como se describe a continuación. Aún en otro aspecto, los polipéptidos se pueden purificar (por ejemplo, mediante purificación por inmunoafinidad) de un fluido biológico, tal como, pero sin limitación, plasma, heces, suero u orina de animales incluyendo, pero sin limitación, cerdo, pollo, ganso, pato, pavo, periquito, ser humano, mono, perro, gato, caballo, hámster, gerbo, conejo, hurón, caballo, ganado y ovejas. Un animal puede ser cualquier mamífero o ave.

Los análogos de polipéptido de B. hyodysenteriae incluyen los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos, en donde uno o más de los aminoácidos son substituidos por otro aminoácido en que las substituciones no alteran substancialmente la actividad biológica de la molécula.

La divulgación también cubre métodos de diagnóstico y pronósti

utilizando un polipéptido de la divulgación y/o anticuerpos que se unen al polipéptido de la divulgación y kits útiles para el diagnóstico y pronóstico de infecciones por B. hyodysenteriae.

Los métodos de diagnóstico y pronóstico generalmente se realizarán utilizando una muestra biológica obtenida de un animal, tal como pollo o cerdo. Una "muestra" se refiere al tejido o fluido de un animal del que se sospecha contiene especies de Brachyspira, tales como B. hyodysenteriae, o sus polinucleótidos o sus polipéptidos. Los ejemplos de tales tejido o fluidos incluyen, pero sin limitación, plasma, suero, material fecal, orina, pulmón, corazón, músculo esquelético, estómago, intestinos y constituyentes de cultivo celular in vitro.

La divulgación proporciona métodos para detectar la presencia de un polipéptido de la presente divulgación en una muestra con las siguientes etapas: (a) poner en contacto una muestra de la que se sospecha contiene un polipéptido de la divulgación con un anticuerpo (preferentemente unido a un soporte sólido) que se une específicamente al polipéptido de la divulgación en condiciones que permiten la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y el polipéptido de la divulgación; y (b) detectar la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y el polipéptido de la divulgación en la muestra, en donde la detección de la formación de complejos de reacción indica la presencia del polipéptido de la divulgación en la muestra.

Preferentemente, el anticuerpo utilizado en este método se obtiene de un anticuerpo policlonal purificado por afinidad, y más preferentemente, un anticuerpo monoclonal. Además, es preferible que las moléculas de anticuerpo utilizadas en el presente documento estén en forma de moléculas de anticuerpo completo o de partes Fab, Fab', F(ab')² o F(v).

Los métodos particularmente preferidos para detectar B. hyodysenteriae basándose en el método anterior incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas, radioinmunoensayos, ensayos inmunorradiométricos y ensayos inmunoenzimáticos, incluyendo ensayos de tipo sándwich utilizando anticuerpos monoclonales y/o policlonales.

Tres de dichos procedimientos que son especialmente útiles utilizan cualquier polipéptido de la divulgación (o un fragmento del mismo) marcado con un marcador detectable, un anticuerpo Abi marcado con un marcador detectable, o un anticuerpo Ab² marcado con un marcador detectable. Los procedimientos se pueden resumir mediante las siguientes ecuaciones, en donde el asterisco indica que la partícula está marcada y "AÁ' significa el polipéptido de la divulgación:

A. AA* Abi = AA*Abi

B. AA Ab*i = AA Ab*i

C. AA Abi Ab2* = Abi AA Ab2*

Los procedimientos y su aplicación son familiares para los expertos en la materia y, por consiguiente, se pueden utilizar dentro del alcance de la presente divulgación. El procedimiento "competitivo", Procedimiento A, se describe en las Patentes de EE.UU. N.° 3.654.090 y 3.850.752. El Procedimiento B es representativo de técnicas de ensayo competitivo bien conocidas. El Procedimiento C, el procedimiento de "tipo sándwich", se describe en las Patentes de EE.Uu . N.° RE 31.006 y 4.016.043. Se conocen y se pueden utilizar aún otros procedimientos, tales como el procedimiento de "anticuerpo doble" o "DASP".

En cada caso, el polipéptido de la divulgación forma complejos con uno o más anticuerpos o compañeros de unión y un miembro del complejo se marca con un marcador detectable. El hecho de que el complejo se haya formado, y si se desea, la cantidad del mismo puede determinarse a través de métodos aplicables a la detección de marcadores.

Se podrá apreciar a partir de lo anterior, que una propiedad característica del Ab² es que reaccionará con Abi. Esta reacción se debe a que Abi, producido en una especie de mamífero, se ha utilizado en otras especies como antígeno para producir el anticuerpo, Ab². Por ejemplo, Ab² puede producirse en cabras utilizando anticuerpos de conejo como antígenos. Por consiguiente, Ab² puede ser el anticuerpo anti-conejo producido en cabras. Para fines de la presente descripción y las reivindicaciones, Abi se denominará anticuerpo primario y Ab² se denominará anticuerpo secundario o anti-Abi.

Los marcadores más comúnmente empleados para estos estudios son elementos radioactivos, enzimas, productos químicos que fluorescen cuando se exponen a luz ultravioleta y otros. Los ejemplos y materiales fluorescentes capaces de utilizarse como marcadores incluyen fluoresceína, rodamina y auramina. Un material de detección particular es un anticuerpo anti-conejo preparado en cabras y conjugado con fluoresceína a través de un isotiocianato. Los ejemplos del isótopo preferido incluyen 3H, i4C, 32P, 35S, 36CI, 5iCr, 57Co, 58Co,59Fe, 90Y, i25l, i3 il y i86Re. El marcador radioactivo puede detectarse a través de cualquiera de los procedimientos de conteo actualmente disponibles. Aunque se pueden utilizar muchas enzimas, los ejemplos de enzimas preferidas son peroxidasa, p-glucuronidasa, p-D-glucosidasa, p-D-galactosidasa, ureasa, glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las enzimas se conjugan a la partícula seleccionada mediante la reacción con moléculas de conteo tales como carbodiimidas, diisocianato y glutaraldehído, y similares. Loa marcadores enzimáticos pueden detectarse a través de cualquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o gasométricas actualmente utilizadas. Las Patentes de EE.UU. N.° 3.654.090; 3.850.752 y 4.0i6.043 se mencionan a modo de ejemplo por su divulgación de material y métodos de marcaje alternativos.

La divulgación también proporciona un método para detectar anticuerpos para un polipéptido de la divulgación en muestras biológicas, utilizando las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la divulgación o un fragmento del mismo; (b) incubar una muestra biológica con dicho polipéptido de la divulgación en condiciones que permitan la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno y (c) determinar si se forma el complejo de anticuerpo-antígeno con el polipéptido de la divulgación.

En otro aspecto de la divulgación se proporcionan métodos in vitro para evaluar el nivel de anticuerpos para un polipéptido de la divulgación en una muestra biológica utilizando las siguientes etapas: (a) detectar la formación de

i0

complejos de reacción en una muestra biológica de acuerdo con el método indicado anteriormente; y (b) evaluar la cantidad de complejos de reacción formados, cantidad de complejos de reacción que corresponde al nivel de polipéptido de la divulgación en la muestra biológica.

La divulgación también incluye kits para la exploración de animales sospechosos de estar infectados con una especie de Brachyspira, tal como B. hyodysenteriae, o para confirmar que un animal está infectado con una especie de Brachyspira, tal como B. hyodysenteriae. En un aspecto adicional de la divulgación, los kits adecuados para su uso por parte de un especialista pueden prepararse para determinar la presencia o ausencia de especies de Brachyspira, incluyendo, pero sin limitación, B. hyodysenteriae, B. suanatina, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii y B. pilosicoli en animales que se sospecha que están infectados, o para medir en forma cuantitativa una especie Brachyspira, incluyendo, pero sin limitación, una infección por B. hyodysenteriae, B. suanatina, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi y B. pilosicoli. De acuerdo con las técnicas de pruebas analizadas anteriormente, dichos kits pueden contener al menos una versión marcada de una de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento o su compañero de unión, por ejemplo, un anticuerpo específico para esta, e instrucciones dependiendo del método seleccionado, por ejemplo, "competitivo" "de tipo sándwich", "DASP" y similares. Como alternativa, dichos kits pueden contener al menos una secuencia polinucleotídica complementaria a una parte de una de las secuencias polinucleotídicas descritas en el presente documento junto con instrucciones para su uso. Los kits también pueden contener reactivos periféricos tales como tampones, estabilizantes, etc.

Por consiguiente, un kit de prueba para la demostración de la presencia de una especie de Brachyspira, incluyendo, pero sin limitación B. hyodysenteriae, B. suanatina, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii, y B. pilosicoli, pueden contener lo siguiente:

(a) una cantidad predeterminada de al menos un componente inmunoquímicamente reactivo marcado obtenido mediante la unión directa o indirecta de una de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento o un compañero de unión especifico de la misma a un marcador detectable;

(b) otros reactivos; y

(c) instrucciones para el uso de dicho kit.

Más específicamente, el kit de prueba de diagnóstico puede contener:

(a) una cantidad conocida de una de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento como se describe anteriormente (o un compañero de unión) generalmente unida a una fase sólida para formar un inmunoabsorbente, o como alternativa, unida a una etiqueta adecuada, o hay una pluralidad de tales productos finales, etc.;

(b) si es necesario, otros reactivos; y

(c) instrucciones para el uso de dicho kit de prueba.

En una variación adicional, el kit de prueba puede contener:

(a) un componente marcado que se ha obtenido acoplando una de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento a un marcador detectable;

(b) uno o más reactivos inmunoquímicos adicionales de los cuales al menos un reactivo es un ligando o un ligando inmovilizado, ligando que se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un ligando capaz de unirse al componente marcado (a);

(ii) un ligando capaz de unirse a un compañero de unión del componente marcado (a);

(iii) un ligando capaz de unirse a al menos uno de los componentes a determinar; o

(iv) un ligando capaz de unirse a al menos uno de los compañeros de unión de al menos uno de los componentes a determinar; y

(c) instrucciones para la ejecución de un protocolo para la detección y/o determinación de uno o más componentes de una reacción inmunoquímica entre una de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento y un compañero de unión específico de las mismas.

En un aspecto, la divulgación se dirige así a un polipéptido recombinante que comprende o consiste en una secuencia que es al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 %, aún más preferentemente al menos el 95 % o en particular el 100 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1. En lo sucesivo, el polipéptido recombinante también se denomina "polipéptido recombinante de la divulgación".

La expresión "polipéptido recombinante", como se usa en el presente documento, se refiere en particular a una molécula proteica que se expresa a partir de una molécula de ADN recombinante.

Se entiende además que la expresión "polipéptido recombinante que consiste en una secuencia" en particular también se refiere a cualquier modificación o modificaciones cotraduccionales y/o postraduccionales de la secuencia efectuada por la célula en la que se expresa el polipéptido. Por tanto, la expresión "polipéptido recombinante que consiste en una secuencia", como se describe en el presente documento, también se dirige a la secuencia que tiene una o más modificaciones efectuadas por la célula en la que se expresa el polipéptido, en particular modificaciones de restos de aminoácidos efectuadas en la biosíntesis de la proteína y/o en el procesamiento de la proteína, preferentemente seleccionadas del grupo que consiste en glucosilaciones, fosforilaciones y acetilaciones.

La expresión "polipéptido recombinante que consiste en una secuencia" comprende también, en particular, cualquier etiqueta proteica unida al polipéptido respectivo, tal como cualquier secuencia peptídica injertada genéticamente en la proteína recombinante respectiva con un fin técnico, en particular una etiqueta de afinidad añadida a la proteína de manera que la proteína pueda purificarse a partir de su fuente biológica bruta utilizando una técnica de afinidad. La expresión "polipéptido recombinante que consiste en una secuencia Y" se refiere, por tanto, en particular, a una proteína recombinante que tiene la secuencia Y y, adicionalmente, una etiqueta de afinidad unida, preferentemente, a la secuencia Y, en donde la etiqueta de afinidad se selecciona, en particular, del grupo que consiste en etiqueta de polihistidina, proteína de unión a quitina (CBP), proteína de unión a maltosa (MBP) y glutatión-S-transferasa (GST). La etiqueta de polihistidina es preferentemente un motivo de aminoácidos que consiste en al menos cinco restos de histidina en el extremo N o C de la proteína, en donde una etiqueta de hexa histidina (etiqueta 6xHis) es particularmente preferida.

Preferentemente, el polipéptido recombinante de la divulgación se produce o es obtenible mediante un sistema de expresión de baculovirus, en particular en células de insecto cultivadas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad provocada por Brachyspira hyodysenteriae" se refiere en particular a la disentería provocada por Brachyspira hyodysenteriae, más particularmente a la disentería porcina.

La expresión "signos clínicos provocados por Brachyspira hyodysenteriae" se refiere en particular a cualquier signo clínico seleccionado de moco y/o sangre en las heces (disentería), diarrea, pérdida de peso, lesiones en el intestino grueso, espiroquetas (Brachyspira hyodysenteriae) en el intestino grueso.

Como se usa en el presente documento, se entiende en particular que la expresión "idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: X" es equivalente a la expresión "idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: X en toda la longitud de la SEQ ID NO: X" o a la expresión "idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: X en toda la longitud de la SEQ ID NO: X", respectivamente. En este contexto, "X" es cualquier número entero seleccionado de 1 a 6, de modo que "SEQ ID NO: X" representa cualquiera de las SEQ ID NO mencionadas en el presente documento.

Aún otro aspecto de la divulgación se refiere al uso de un plásmido, preferentemente un vector de expresión, que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica el polipéptido recombinante de la divulgación. Aún otro aspecto de la divulgación se refiere al uso de una célula que comprende un plásmido, preferentemente un vector de expresión, que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica el polipéptido recombinante de la divulgación.

Ejemplos

1.0. Secuenciación del genoma parcial de Brachyspira hyodysenteriae (cepa WA1)

1.1. Materiales y métodos

1.1.1. Secuenciación genómica

Se efectuó secuenciación indiscriminada sobre un aislado de campo porcino australiano de B. hyodysenteriae (cepa WA1). Esta cepa se caracterizado bien y demostró ser virulenta después de la exposición experimental de cerdos. La espiroqueta se cultiva en un caldo de soja triptona anaeróbico y se purifica el ADN genómico de alto peso molecular adecuado para la preparación de bibliotecas de ADN genómico utilizando un gradiente de cloruro de cesio y siguiendo un método convencional de extracción con bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB). El ADN genómico se corta mecánicamente y el ADN fragmentado se clona en el sistema de vector pSMART. Se construyen una biblioteca de inserto pequeño (2-3 kb) y una biblioteca de inserto mediano (3-10 kb) en la versión con copias de bajo nivel del pSMART. Se efectúa secuenciación completa del genoma utilizando un enfoque híbrido de Sanger/pirosecuenciación. La primera ronda de secuenciación se realiza mediante secuenciación de Sanger de las bibliotecas pSMART. La segunda ronda de secuenciación de alto rendimiento se realiza utilizando el enfoque de pirosecuenciación en un instrumento Roche-454 GS20. Por último, los huecos restantes en la secuencia genómica se cierran mediante recorrido por PCR (PCR walking) entre secuencias contiguas no enlazadas para finalizar la secuencia genómica. 1.1.2. Anotación

Todas secuencias genómicas genoma para B. hyodysenteriae se ensamblan y anotan por parte de la Australian Genome Research Facility (AGRF) en Queensland y en la Universidad de Murdoch por el Centre for Comparative Genomics (CCG). Se utiliza una diversidad de herramientas de bioinformática de dominio público para analizar y volver a analizar las secuencias como parte de un procedimiento de garantía de la calidad en el análisis de datos. Se predicen marcos abiertos de lectura (los ORF) utilizando una diversidad de programas que incluyen GeneMark, GLIMMER, ORPHEUS, SELFID y GetORF. Los posibles ORF se examinan en cuanto a la homología (ADN y proteína) con bases de datos internacionales existentes utilizando búsquedas, incluyendo BLAST y FASTA. Se lleva a cabo análisis filogenético y otros análisis de evolución molecular con los genes identificados y con otras especies para ayudar en la asignación de la función. El análisis in silico del genoma parcialmente secuenciado produce un listado completo de todos los ORF predichos presentes en los datos de secuencia disponibles.

1.1.3. Análisis de la distribución génica utilizando reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se diseñan y optimizan dos pares de cebadores que se aparean con distintas regiones de la región codificante del gen diana para su detección por PCR. Los análisis de la distribución de los genes diana de B. hyodysenteriae se realizan en 23 cepas de B. hyodysenteriae, incluyendo dos cepas que han demostrado ser no virulentas. Los conjuntos de cebadores utilizados en el análisis de distribución se muestran en la Tabla 1. El análisis por PCR se realiza en un volumen total de 25 pl utilizando la ADN polimerasa Taq. La mezcla de amplificación consiste en un tampón de PCR 1 X (que contiene MgCl2 1,5 mM), 1 U de ADN polimerasa Taq, 0,2 mM de cada dNTP, 0,5 pM del par de cebadores y 1 pl de ADN molde cromosómico purificado. Las condiciones de ciclado incluyen una etapa inicial de desnaturalización del molde de 5 min a 94 °C, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, apareamiento a 50 °C durante 15 s y extensión de cebadores a 72 °C durante 1 min. Los productos de PCR se someten a electroforesis en geles de agarosa al 1% (p/v) en tampón TAE 1 X (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM), tinción con una solución de bromuro de etidio 1 mg/ml y visualización con luz ultravioleta (UV).

1.2. Resultados y análisis

1.2.1. Bioinformática

La secuenciación del genoma de B. hyodysenteriae WA1 da como resultado la identificación de un genoma de 3.000. 694.pb y un plásmido circular extracromosómico de 35.940 pb. Se predice que el genoma codifica 2.551 ORF y el plásmido codifica 32 ORF. La comparación de los ORF predichos con genes presentes en el ácido nucleico y bases de datos de proteínas indica aproximadamente un 50 % de los ORF predichos con supuesta función. El 30 % de los ORF restantes no tiene función conocida.

1.2.2. Candidatos de vacuna

Los ORF que muestran una fuerte similitud con proteínas de la superficie externa bacteriana presentes en las bases de datos públicas se seleccionan como posibles dianas de vacunas. La Tabla 2 muestra los genes seleccionados como posibles dianas de vacunas y su supuesta función.

1.2.3. Distribución de genes

La distribución general de genes de cada ORF se resume en la Tabla 3. La distribución se determina a partir del resultado acumulado de la PCR utilizando hasta dos conjuntos distintos de cebadores. Todos los ORF están presentes en el 100 % de las cepas de B. hyodysenteriae probadas.

2.0. Clonación, expresión y purificación de los componentes de vacunas.

2.1. Materiales y métodos

2.1.1. Extracción del plásmido

Se siembran en estrías sobre placas de agar Luria-Bertani (LB) suplementadas con ampicilina 100 mg/ml e incubadas a 37 °C durante 16 h clones Escherichia coli JM 109 que albergan el plásmido pTrcHis (Invitrogen) a partir del almacenamiento de reserva en glicerol. Se utiliza una colonia individual para inocular 10 ml de caldo LB complementado con ampicilina 100 mg/ml, y se incuba el cultivo del caldo a 37 °C durante 12 h con agitación. Todo el cultivo se centrifuga durante la noche a 5.000 x g durante 10 minutos, y se extrae el plásmido que contiene las células utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). El plásmido purificado se cuantifica utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 y la concentración de ADN se ajusta a 100 pg/ml mediante dilución con tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). El plásmido pTrcHis purificado se almacena a -20 °C.

2.1.2. Preparación del vector

Se digieren dos pg del plásmido pTrcHis purificado a 37 °C durante 1 a 4 h en un volumen total de 50 pl que contiene Tris-HCI 100 mM (pH 7,5), NaCI 50 mM, MgCh10 mM, DTT 1 mM, seroalbúmina bovina (BSA) 100 pg/ml y 5 U de Xhol y EcoRI. El vector pTrcHis linealizado se purifica utilizando el kit UltraClean PCR Clean-up Kit (Mo Bio Laboratories). El vector lineal purificado se cuantifica utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 y la concentración de ADN se ajusta a 50 pg/ml mediante dilución con tampón TE. El vector linealizado se almacena a -20 °C.

2.1.3. Preparación del inserto

21.3.1. Diseño de cebadores

Los pares de cebadores se diseñan para amplificar la mayor parte posible de la región codificante del gen diana. Todas las secuencias de cebadores incluyen sitios terminales de reconocimiento de enzimas de restricción para permitir el ligamiento de los extremos cohesivos del amplicón resultante en el vector linealizado pTrcHis. Las secuencias de cebadores utilizadas para la clonación se muestran en la Tabla 5. La traducción del casete de expresión quimérico pTrcHis se deduce utilizando Vector NTI Advance versión 10 (Invitrogen) para confirmar que los insertos génicos se expresarán en el marco de lectura correcto.

2.1.3.2. Amplificación de los insertos génicos

T odos los insertos génicos se amplifican mediante PCR en un volumen total de 100 pl utilizando ADN polimerasa T aq y ADN polimerasa Pfu. La mezcla de amplificación consiste en tampón de PCR 1x (que contiene 1,5 mM de MgCh), 1 U de ADN polimerasa Taq, 0,01 de ADN polimerasa Pfu, 0,2 mM de cada dNTP, 0,5 pM del par de cebadores adecuados y 1 pl de ADN cromosómico purificado. El ADN cromosómico se prepara a partir de la misma cepa de B. hyodysenteriae utilizada para secuenciación de genoma. Las condiciones de ciclado implican una etapa de desnaturalización de molde inicial de 5 min a una temperatura de 94 °C, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, apareamiento a 50 °C durante 15 s y extensión de cebadores a 72 °C durante 1 min. Los productos de PCR se someten a electroforesis en geles de agarosa al 1 % (p/v) en tampón TAE 1x, se tiñen con una solución bromuro de etidio 1 pg/ml y se observan a luz UV. Después de verificar la presencia del producto de PCR de tamaño correcto, la reacción PCR se purifica utilizando el kit UltraClean PCR Clean-up Kit (Mo Bio Laboratories).

2.1.3.3. Digestión con enzima de restricción de los insertos génicos

Treinta pl del producto de PCR purificado se digieren en un volumen total de 50 pl con 1 U de Xhol y 1 U de EcoRI. El ADN de inserto digerido se purifica utilizando el kit UltraClean PCR Clean-up Kit (Mo Bio Laboratories). El ADN de inserto digerido purificado se cuantifica utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000, y la concentración de ADN se ajusta a 20 pg/ml mediante dilución con tampón TE. El ADN de inserto purificado tratado con enzimas de restricción se utiliza inmediatamente para ligamiento en el vector.

2.1.4. Ligamiento de los insertos génicos en el vector pTrcHis

Las reacciones de ligamiento se llevan a cabo en un volumen total de 20 pl. Cien ng de pTrcHis linealizado se incubaron con 20 ng de inserto tratado con enzimas de restricción a 160 °C durante 16 h en Tris-HCI 30 mM (pH 7,8), MgCl² 10 mM, DTT 10 mM y ATP 1 mM que contiene 1 U de ADN ligasa T4 (Promega). También se incluye una reacción de ligamiento idéntica que no contiene ADN de inserto como control negativo de recircularización del vector.

2.1.5. Transformación de ligamientos de pTrcHis en células E. coli

Se descongelan células E. coli JM 109 competentes del almacenamiento a -80 °C en hielo y se transfirieren 50 pl de las células en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml enfriados con hielo que contienen 5 pl de reacciones de ligamiento durante la noche. Los tubos se mezclan mediante un golpeteo suave en la parte del fondo de cada tubo sobre la mesa de laboratorio y se dejan en hielo durante 30 min. Las células se someten posteriormente a choque térmico colocando los tubos en un baño de agua a 42 °C durante 45 s antes de regresar el tubo al hielo durante 2 min. Las células transformadas se recuperan en 1 ml de caldo LB durante 1 h a 37 °C con mezclado suave. Las células recuperadas se recogen a 2.500 x g durante 5 min, y las células se resuspenden en 50 pl de caldo LB recién preparado. Los 50 pl de células resuspendidas se dispersan de manera uniforme en una placa de agar LB que contiene ampicilina 100 mg/l utilizando una varilla de vidrio estéril. Las placas se incuban a 37 °C durante 16 h.

2.1.6. Detección de construcciones recombinantes de pTrcHis en E. coli mediante PCR

Se siembran en estrías doce colonias transformantes individuales de cada construcción sobre placas de agar LB recién preparadas que contienen ampicilina 100 mg/l, y se incuban a 37 °C durante 16 h. Se resuspende una colonia de cada evento de transformación en 50 pl de tampón ^t E y se hierve durante 1 min. Se utilizan dos pl de células hervidas como molde para PCR. La mezcla de amplificación consiste en tampón de PCR 1x (que contiene 1,5 mM de MgCh), 1 U de ADN polimerasa Taq, 0,2 mM de cada dNTP, 0,5 pM de cebador pTrcHis-F (5'- CAATTTATCAGACAATCTGTGTG-3') y 0,5 pM de cebador pTrcHis-R (5'-TGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCG-3'). Las condiciones de ciclado implican una etapa de desnaturalización de molde inicial de 5 min a 94 °C, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, apareamiento a 60 °C durante 15 s y una extensión de cebadores a 72 °C durante 1 min. Los productos de PCR se someten a electroforesis en geles de agarosa al 1 % (p/v) en tampón TAE 1x, se tiñen con solución de bromuro de etidio 1 |jg/ml y se observan con luz UV.

2.1.7. Expresión piloto de proteínas recombinantes etiquetadas con His

Se inoculan tres colonias aisladas de E. coli JM109 portando las construcciones recombinantes en 3 ml de caldo LB en un tubo de 5 ml que contiene ampicilina 100 mg/l y IPTG 1 mM, y se incuban a 37 °C durante 16 h con agitación. Las células se recogen mediante centrifugación a 5.000 x g durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante se descarta y cada sedimento se resuspende con 1 ml de tampón de lisis de desnaturalización Ni-NTA (NaH2PO4100 mM, Tris-HCI 10 mM, GuCl 6 M, pH 8,0). Después de someter a agitación vorticial el tubo durante 1 min, se centrifugan los restos celulares mediante centrifugación a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo y se almacena a -20 °C hasta el análisis.

2.1.8. Electroforesis de gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE)

El análisis de proteínas por SDS-PAGE implica la separación electroforética utilizando un sistema de tampón de T ris-glicina discontinuo. Se mezclan treinta j l de proteína con 10 j l de tampón de tratamiento de muestra 4x (T ris-HCI 250 mM, pH 6,0, SDS al 8 % p/v, DTT 200 mM, glicerol al 40 % v/v y azul bromofenol al 0,04 % p/v). Las muestras se hierven durante 5 min inmediatamente antes de cargar 10 j l de la muestra en los pocillos del gel. El gel comprende un gel de compactación (Tris-HCI 125 mM pH 6,8, acrilamida al 4 % p/v, bis-acrilamida al 0,15 % p/v y SDS al 0,1 % p/v) y un gel de separación (Tris-HCI 375 mM pH 8,8, acrilamida al 12 % p/v, bis-acrilamida al 0,31 % p/v y SDS al 0,1 % p/v). Estos geles se polimerizan mediante la adición de una solución de sulfato de amonio con TEMED al 0,1 % (v/v) y al 0,05 % (p/v) preparada recientemente y se vierten en la celda de doble plancha mini-Protean (Bio-Rad). Las muestras se corrieron a 150 V a temperatura ambiente (TA) hasta que el frente de colorante azul de bromofenol alcanza la parte del fondo del gel. Los patrones de peso molecular transferidos previamente se someten a electroforesis en paralelo con las muestras con el fin de permitir estimaciones del peso molecular. Después de la electroforesis, el gel se tiñe inmediatamente utilizando Azul Coomassie Brilliant G250 o se somete a electrotransferencia en una membrana de nitrocelulosa para transferencia de Western.

2.1.9. Análisis de transferencias de western

La transferencia electroforética de las proteínas separadas del gel SDS-PAGE a la membrana de nitrocelulosa se lleva a cabo utilizando el sistema de tampón de transferencia Towbin. Después de la electroforesis, el gel se equilibra en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol al 20 % v/v, pH 8,3) durante 15 min. Las proteínas del gel se transfieren a la membrana de nitrocelulosa utilizando el aparato de trans-transferencia mini-Protean (Bio-Rad). La membrana de nitrocelulosa transferida que contiene la proteína separada se bloquea con 10 ml de solución salina tamponada-tris (TBS; Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5) que contiene leche en polvo al 5 % (p/v) durante 1 h a TA. La membrana se lava con TBS que contiene Tween 20 al 0,1 % (v/v) (TBST) y posteriormente se incuba con 10 ml de anticuerpo anti-his de ratón (diluido 5.000 veces con TBST) durante 1 h a TA. Después de lavar tres veces durante 5 min con TBST, la membrana se incuba con 10 ml de IgG anti-ratón de cabra (molécula completa)-AP diluida 5.000 veces en TBST durante 1 h a TA. La membrana se revela para la visualización utilizando el kit Alkaline Phosphatase Substrate Kit (Bio-Rad).

2.1.10. Verificación del marco abierto de lectura de las construcciones de pTrcHis recombinantes mediante análisis de secuencia directo

Se inoculan clones de E. coli para cada construcción en 10 ml de caldo LB con ampicilina 100 mg/l y se incuban a 37 °C durante 12 h con agitación. Se centrifuga el cultivo de una noche a 5.000 x g durante 10 min, y el plásmido contenido en las células se extrae utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep kit. El plásmido purificado se cuantifica utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND- 1000. Los plásmidos purificados se someten a secuenciación directa automatizada del casete de expresión de pTrcHis utilizando los cebadores pTrcHis-F y pTrcHis-R. Cada reacción de secuenciación se llevó a cabo en un volumen de 10 j l consistentes en 200 ng de ADN plasmídico, 2 pmol de cebador, 4 j l de una mezcla de reacción ABI PRISM™ BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems) y 1 j l de tampón de dilución 5x. Las condiciones de ciclado implican una etapa de desnaturalización de 2 min a 96 °C, seguido de 25 ciclos de desnaturalización a 96 °C durante 10 s y una etapa de apareamiento y extensión de cebadores combinadas a 60 °C durante 4 min. Los terminadores de colorante residuales se eliminan de los productos de secuenciación mediante precipitación con etanol al 95 % (v/v) que contiene acetato de sodio 85 mM (pH 5,2), EDTA 3 mM (pH 8) y se seca al vacío. Los plásmidos se secuencian por duplicado utilizando cada cebador. Los productos de secuenciación se analizan utilizando un Secuenciador ADN ABI 373A DNA Sequencer (PE Applied Biosystems).

2.1.11. Serología utilizando proteína recombinante purificada

Se diluyen 10 jg de proteína recombinante purificada en 10 ml de tampón de carbonato y se añaden 100 j l a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos. La proteína se deja recubrir durante la noche a 4 °C. La placa se bloquea con 150 j l de PBS-BSA (1 % p/v) en cada pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) con mezclado y luego se lava tres veces con 150 j l de PBST (0,05 % v/v). Los sueros de cerdo se diluyen 1:800 en 100 j l de PBST-BSA (0,1% p/v) y se incuban a TA durante 2 horas con mezclado. Las placas se lavan antes de añadir 100 |jl de anti-IgG de cerdo (molécula entera) en cabra-HRP diluida 1:5.000 en PBST. Tras incubar durante 1 hora a TA, se lavan las placas y se añaden 100 j l de sustrato TMB. Se deja que el color se desarrolle durante 10 minutos a TA antes de detenerlo con la adición de 50 j l de ácido sulfúrico 1 M. La densidad óptica de cada pocillo se lee a 450 nm. En este análisis se utiliza suero agrupado de cerdos de distinta procedencia y estado de salud. Esto incluye cerdos procedentes de piaras de alto estado sanitario (N1-N3), cerdos hiperinmunizados (M1-M3), cerdos sometidos a exposición experimental (H1-H5) y cerdos restablecidos de distintas piaras (H6-H13).

2.2. Resultados y discusión

2.2.1. Construcción de las construcciones de pTrcHis recombinantes

La clonación de los diversos insertos en el vector de expresión pTrcHis produce construcciones recombinantes de diversos tamaños. La secuenciación de nucleótidos de las construcciones de pTrcHis verifica que el casete de expresión está en el marco correcto para todas las construcciones. La traducción predicha del casete de expresión de pTrcHis indica que todas las proteínas recombinantes etiquetadas con his y la secuencia de aminoácidos deducida de las proteínas nativas de la espiroqueta son idénticas.

2.2.2. Expresión y purificación de proteínas recombinantes

La expresión de los clones de E. coli recombinantes seleccionados se realiza inicialmente a escala preparativa. Todos los genes clonados producen proteínas recombinantes que poseen la fusión con hexa-histidina (4 kDa) con un peso molecular aparente similar al peso molecular predicho de la proteína nativa (Tabla 4). Las proteínas recombinantes son altamente reactivas en transferencia de western utilizando el anticuerpo anti-his. La purificación de las proteínas recombinantes etiquetadas con his mediante cromatografía de afinidad en condiciones desnaturalizantes es satisfactoria. El SDS-PAGE y la tinción con azul de Coomassie de todas las proteínas recombinantes mostraron que se logra una purificación de al menos el 70 %.

2.2.3. Serología

Todas las proteínas reaccionan fuertemente con el suero del cerdo hiperinmunizado con la bacterina de B. hyodysenteriae (M1; 1,5881±0,0662) y reacciona menos fuertemente con el suero de los cerdos hiperinmunizados con B. pilosicoli (M2; 1,0966±0,0358) y B. innocens (M3; 1,0920±0,0290), lo que indica cierto nivel de reactividad cruzada con los cerdos que reconocen otras Brachyspira spp. Las proteínas reaccionan más débilmente con el suero tomado de cerdos de alto estado sanitario (N1-N3; 0,2049 a 0,4485), seguido de cerdos sometidos a exposición experimental que muestran síntomas graves agudos de SD (H1-H5; 0,5456 a 0,9922), y más fuerte con cerdos que se han restablecido de la SD (H6-H13; 0,8075 a 1,3425). En conjunto, estos resultados indican que todas estas posibles proteínas de superficie son inmunogénicas en cerdos infectados de forma natural y experimental.

3.0. Expresión y purificación de proteínas para la formulación de vacunas.

3.1. Materiales y métodos

3.1.1. Expresión y purificación de proteínas recombinantes etiquetadas con His

Se inocula una colonia individual de la construcción de pTrcHis recombinante en E. coli JM 109 en 50 ml de caldo LB, en un matraz cónico de 250 ml que contiene ampicilina 100 mg/l y se incuba a 37 °C durante 16 h con agitación. Se inocula un matraz cónico de 5 l que contiene 1 l de caldo LB complementado con ampicilina 100 mg/l con 25 ml del cultivo de una noche y se incuba a 37 °C hasta que la densidad óptica de las células a 600 nm es de 0,5. El procedimiento de cultivo se induce agregando IPTG a una concentración final de 1 mM, y las células se devuelven a los 37 °C con agitación. Después de 5 h de inducción, el cultivo se transfiere a frascos de centrifugación de 250 ml, y los frascos se centrifugan en 3.000 x g durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante se descarta, y cada sedimento se resuspende con 8 ml de tampón de lisis desnaturalizante Ni-NTA (NaH2PO4 100 mM, 10 mM Tris-HCI, GuCl 6 M, pH 8,0). Las células resuspendidas se almacenan a -20 °C durante una noche.

La suspensión celular se retira del almacenamiento a -20 °C y se descongela en hielo. El lisado celular se sónica posteriormente en hielo tres veces durante 30 s con incubación de 1 min en hielo entre rondas de tratamiento con ultrasonidos. Las células lisadas se aclaran mediante centrifugación a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C, y el sobrenadante se transfiere a una columna de 15 ml que contiene 0,5 ml de volumen de lecho de resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen). Se deja que la proteína recombinante etiquetada con Hisp se una a la resina durante 1 h a 4 °C con mezclado de principio a fin. La resina se lava posteriormente con 30 ml de tampón de lavado desnaturalizante Ni-NTA (NaH2PO4100 mM, Tris-HCI 10 mM, urea 8 M, imidazol 20 mM, pH 8,3) antes de la elución con 15 ml de tampón de elución desnaturalizante Ni-NTA (NaH2PO4100 mM, Tris-HCI 10 mM, urea 8 M, imidazol 250 mM, pH 8,0). Se recogen tres fracciones de 5 ml de fracción eluida y se almacenan a 4 °C. Se tratan treinta j l de cada fracción eluida con 10 j l de tampón de tratamiento de muestra 4x y se hierve durante 5 min. Las muestras se someten a SDS-PAGE y se tiñen con Coomassie Brilliant Blue G250 (Bio-Rad).

3.1.2. Replegamiento y liofilización de la proteína recombinante etiquetada con His purificada

Las proteínas eluidas se recogen y transfieren en un tubo de diálisis hidratado con un límite peso molecular (LPM) de 3.500 Da. Se toma una alícuota de 200 pl de la fracción eluida agrupada para la cuantificación utilizando el ensayo comercial Protein Assay (Bio-Rad). Las proteínas se repliegan utilizando el kit Novagen Protein Re-folding Kit. Las proteínas replegadas se transfieren del tubo de diálisis a tubos de centrifugación de 50 ml (40 ml de volumen máximo) y los tubos se colocan a -80 °C durante la noche. Los tubos se colocan en un liofilizador y se liofilizan hasta la sequedad. Las proteínas liofilizadas se rehidratan posteriormente con PBS a una concentración de 2 mg/ml y se almacenan a -20 °C.

3.2. Resultados y análisis

3.2.1. Expresión y purificación de proteínas recombinantes

La expresión de los clones recombinantes de E. coli a mediana escala para generar suficiente proteína recombinante para la formulación de vacunas es satisfactoria. La purificación de las proteínas recombinantes mediante cromatografía de afinidad en condiciones desnaturalizantes produce una pureza de al menos el 70 %. Utilizando este protocolo de expresión se obtienen sistemáticamente rendimientos de proteína recombinante de 1 mg/l.

4.0. Estudios de protección en cerdos

En los estudios de protección se probaron, entre otras, tres formulaciones de vacuna que contenían pares de las tres proteínas recombinantes (proteína OMP6, proteína OMP7 y proteína OMP10) y que se describen a continuación en detalle.

4.1. Materiales y métodos

4.1.1. Cerdos y alojamiento

Cada grupo de prueba incluía 11 cerdos macho castrados (Large White x Landrace x Duroc) de aproximadamente 5 -5,5 semanas de edad adquiridos en una explotación porcina comercial de la que se sabe que está libre de disentería porcina, basándose en el historial clínico y las pruebas microbiológicas.

4.1.2. Preparaciones de vacunas

Las tres proteínas recombinantes se expresan, purifican y cuantifican en condiciones de mediana escala. Cada vacuna consistía en una emulsión que comprendía el 20 % (v/v) de Emulsigen® (adyuvante de agua en aceite) y el 80 % (v/v) de proteína recombinante resuspendida en solución salina tamponada con fosfato (SOP: VACCPREP001:01). Dos ml de vacuna contenían 500 pg de cada una de las proteínas recombinantes para el grupo de tratamiento, como se enumera en la Tabla 4.

4.1.3. Sangrado y vacunación

Cuando los cerdos tenían aproximadamente 6 - 6,5 semanas de edad, se tomaron hisopados rectales para el cultivo de Brachyspira y se pesaron los cerdos, se sangraron individualmente de la vena cava anterior utilizando vacutainer y una aguja de calibre 20, y luego se vacunaron por vía intramuscular en el cuello con 2 ml de la vacuna apropiada. Los cerdos de control recibieron adyuvante en PBS. T res semanas después, los cerdos se sangraron de nuevo y recibieron una segunda vacunación intramuscular en el cuello. A continuación, se los transfirió a una dieta experimental de fase 2 elaborada en forma de papilla.

4.1.4. Infección experimental

Dos semanas después de la segunda vacunación, los cerdos se pesaron, se sangraron y se expusieron experimentalmente a una mezcla de cepas de B. hyodysenteriae. Brevemente, se utilizó una sonda gástrica para dosificar a cada cerdo, de manera que cada animal recibió una suspensión de 100 ml de mezclas de cultivo de caldo en fase logarítmica media (~108 células/ml) que contenía cinco cepas de B. hyodysenteriae junto con agar picado procedente de una placa de agar sangre con un crecimiento denso de espiroquetas en ella. Este procedimiento se repitió diariamente en los dos días siguientes. En los dos días siguientes se inoculó la comida de los cerdos con más espiroquetas, de manera que cada cerdo recibía ~ 2 placas de agar sangre con un crecimiento denso de espiroquetas.

4.1.5. Control de la salud

Los cerdos se observaron diariamente en cuanto a signos de mala salud. A partir de tres días después del final de la infección experimental, se tomaron hisopados rectales de cada cerdo dos veces por semana y se cultivaron para B. hyodysenteriae. Cuando se observaba una diarrea con sangre y moco frescos, los cerdos se registraban como enfermos de disentería porcina y se retiraban para su examen cadavérico en un plazo de 48 horas, dependiendo de la disponibilidad de las instalaciones para autopsias. Otros cerdos que desarrollaron diarrea crónica sin sangre ni moco y que perdieron estado físico también se retiraron por motivos de bienestar. El resto de los cerdos que no desarrollaron signos clínicos se sacrificaron cinco semanas después del inicio de la infección experimental.

4.1.6. Examen cadavérico

Los cerdos se aturdieron utilizando una pistola de aturdimiento y se desangraron cortando la arteria carótida. Se recogió sangre para serología. Se abrió el animal y se extrajo el tubo intestinal. Se abrió el intestino grueso en toda su longitud y se recogió el contenido intestinal del ciego y del colon proximal para el cultivo de espiroquetas. Se colocaron porciones de la pared del colon en los mismos lugares en formalina al 10 % tamponada para su posterior examen histológico. Se registraron las observaciones de los cambios patológicos macroscópicos y su distribución en el intestino grueso.

4.1.7. Cultivo de espiroquetas

Las muestras se cultivaron para la detección de especies de Brachyspira y cualquier crecimiento positivo se sometió a amplificación por PCR para B. hyodysenteriae.

4.1.8. Ensayos de ELISA

Los niveles de anticuerpos en suero contra las proteínas recombinantes individuales de cada vacuna se miden utilizando un enfoque de ELISA indirecto. Los niveles de anticuerpos en el suero del grupo de control y de los grupos vacunados contra Bpmp72 recombinante, una proteína de la envoltura externa de Brachyspira pilosicoli, y contra preparaciones de células enteras de cada una de las cinco cepas de B. hyodysenteriae utilizadas para la infección, y la combinación de las cinco cepas, también se midieron en ELISA.

4.2. Resultados

4.2.1. Niveles de anticuerpos

Los niveles de anticuerpos en suero para los grupos de prueba con respecto al tiempo y la vacunación mostraron niveles de anticuerpos contra las tres proteínas recombinantes, respectivamente. Para cada uno de los tres antígenos del ELISA, los cerdos vacunados con la proteína correspondiente mostraron buenos aumentos secundarios en los niveles de anticuerpos contra ese antígeno, aunque las respuestas primarias fueron bajas. Los cerdos de control no vacunados sólo mostraron aumentos menores de los niveles de anticuerpos en relación con el tiempo. Hubo algunos aumentos en los niveles de anticuerpos en los cerdos que no se vacunaron con el antígeno correspondiente, presumiblemente debido a la reactividad cruzada entre antígenos, más notable con el antígeno de ELISA OMP10 en los cerdos vacunados con la combinación que contenía OMP6 OMP7.

En la autopsia, después de la infección experimental, los niveles medios de anticuerpos contra estas proteínas no se elevaron más, y en la mayoría de los casos se redujeron, y en ocasiones sustancialmente. Las desviaciones típicas de los valores fueron similares pre- y posinfección.

Los niveles de anticuerpos en los grupos de cerdos de prueba contra la proteína de superficie recombinante no relacionada Bpmp72 de B. pilosicoli fueron uniformemente bajos y generalmente no aumentaron con el tiempo.

Los niveles de anticuerpos en suero de los cerdos en los grupos de prueba contra cinco preparaciones individuales de células enteras de B. hyodysenteriae que representan las cepas de exposición, y una mezcla de las cinco cepas, para todas las preparaciones individuales y para la combinación, los niveles de anticuerpos sólo aumentaron marginalmente preinfección en todos los grupos de cerdos, y luego aumentaron sustancialmente posinfección.

En cuanto al aumento relativo para cada uno de los grupos de tratamiento para cada una de las preparaciones de antígeno de células enteras con el tiempo, se observaron pequeños aumentos posvacunación contra todas las preparaciones, pero de nuevo fueron más prominentes posinfección. Los niveles de anticuerpos para la preparación elaborada a partir de la cepa BW1 fueron mayores en cada ELISA posinfección, pero la diferencia no fue marcada, y los niveles de anticuerpos frente a todas las cepas aumentaron.

4.2.2. Excreción fecal de espiroquetas

No se encontraron especies de Brachyspira en las heces de los cerdos en el momento de la compra o antes de la infección. El patrón de excreción fecal de B. hyodysenteriae con el tiempo por parte de cerdos individuales después de la infección se muestra en la Tabla 6. Todos los cerdos excretaron un gran número de espiroquetas en múltiples tiempos de muestreo antes del final del experimento en el día 31.

4.2.3. Signos clínicos

Los cerdos que tenían disentería, o diarrea crónica y pérdida de peso que obligaban a sacrificarlos por motivos de bienestar, se retiraron antes del final del experimento (día 31) para la autopsia (Tabla 7). El mayor número de cerdos se retiró 10 días después del inicio de la infección experimental, lo que pone de manifiesto la gravedad de la exposición.

El menor número de cerdos retirados antes del final del experimento fue del grupo (OMP7+OMP10) (2 cerdos), y el mayor número de cerdos retirados fue del grupo de control (10 cerdos). En los otros dos grupos se retiraron ocho cerdos (OMP6+OMP7) y siete cerdos (OMP6+OMP10) debido a la enfermedad.

Al final del experimento, el día 31 después del inicio de la infección, se registró que todos los cerdos restantes tenían disentería o diarrea en la autopsia.

4.3 Hallazgos cadavéricos

En la Tabla 8 se presenta un resumen de los resultados cadavéricos a nivel de los cerdos, y en la Tabla 9 se presenta un resumen de los resultados a nivel de los grupos. Todos los cerdos menos uno (grupo 2) tenían algunas lesiones en el intestino grueso en el momento del sacrificio (Tabla 10). Los 11 cerdos de control tenían lesiones moderadas o graves en el intestino grueso en el momento del sacrificio. El grupo 2 tenía el mayor número de cerdos con solo lesiones leves (4 cerdos) y el menor número con lesiones graves (3 cerdos). Al comparar las lesiones combinadas normales/leves/moderadas con las lesiones moderadas/moderadamente graves/graves, el grupo 2 tuvo el mayor número de cerdos con lesiones menos graves, y también tuvo el menor número de cerdos con las lesiones graves (Tabla 11).

Los ciegos y los colones de todos los cerdos estaban fuertemente colonizados por espiroquetas en la autopsia.

Discusión y conclusiones

En este experimento, 10/11 cerdos de control (91 %) desarrollaron signos clínicos de disentería porcina antes del final del experimento, y los 11 tenían lesiones graves en el intestino grueso en la autopsia. Estos resultados indican que el método utilizado para inducir enfermedad fue muy eficaz. Los niveles de anticuerpos fueron elevados contra las preparaciones de células enteras de las cinco cepas infectantes, lo que sugiere que todas proliferaron en estos cerdos. Sin embargo, como los niveles de anticuerpos contra la cepa BW1 fueron los más altos, puede ser que esta cepa haya proliferado más.

Las respuestas serológicas a la vacunación fueron uniformes en todos los grupos. La respuesta a la primera vacunación fue relativamente débil en todos los casos, aunque la respuesta secundaria fue sólida. Una característica posterior sorprendente fue la reducción de los niveles de anticuerpos contra los antígenos específicos en casi todos los casos tras la infección (en la autopsia). Los niveles de anticuerpos contra estas proteínas no disminuyeron en los cerdos que no se habían vacunados con ellas (aunque tenían algunos niveles [relativamente bajos] de anticuerpos de reacción cruzada), y los niveles de anticuerpos contra las preparaciones de células enteras aumentaron en todos los grupos posinfección. Es posible que los anticuerpos en suero contra los componentes de vacuna fueran exportados y consumidos en el colon de estos cerdos, todos ellos muy colonizados. Sin embargo, la naturaleza específica de antígeno de este descenso en los niveles de anticuerpos sugiere la posibilidad de que se genere alguna forma de tolerancia específica de antígeno, quizás asociada a la alta concentración de antígeno (proteína) utilizada en estas vacunas. Las concentraciones de proteína utilizadas pueden estar muy cerca de algún nivel por encima del cual se genera tolerancia.

De los grupos vacunados, el grupo 2 mostró el mejor nivel de protección contra el desarrollo de lesiones colónicas, y el grupo 2 tuvo el menor número de cerdos eliminados antes del final del experimento.

En conjunto, los resultados muestran que OMP10 puede conferir protección.

Tabla 1: Cebadores oligonucleotídicos utilizados en el análisis de la distribución de PCR de los genes candidatos a la vacuna para B. hyodysenteriae.

Gen Nombre del cebador Secuencia del cebador (5'-3')

OMP6 OMP6-F130 GAACCAAAACCAGAAGAAGTAG (SEQ ID NO: 7)

OMP6-R432 TTTAGCCCTTACAACAGAAAG (SEQ ID NO: 8) OMP7 OMP7-F14 TTTTACTTATGTCAGTAGTTATTATAGCAG (SEQ ID NO: 9) OMP7-R575 AAATCGTTATACTTTTTCAAATCATC (SEQ ID NO: 10)

OMP10 OMP10-F118 TTCAGAAATAGTAAAAATCAGAGAG (SEQ ID NO: 11)

OMP10-R646 TTGGGAATCTTGCTGC (SEQ ID NO: 12)

Tabla 2: Posible función de los genes de B. hyodysenteriae basada en la similitud con la secuencia de aminoácidos de proteínas bacterianas similares obtenida de la base de datos SWISS-PROT.

Gen Posible función Valor de E OMP6 Familia de proteínas OmpA 4e-115 OMP7 lipoproteína de la membrana externa asociada a 1e-144

peptidoglucano

OMP10 Familia de proteínas OmpA 4e-159

Tabla 3: Distribución de los genes de las vacunas candidatas de B. hyodysenteriae. La distribución de los genes se analizó mediante PCR utilizando un conjunto de 23 cepas distintas.

Gen Distribución (%)

OMP6 100

OMP7 100

OMP10 100

Tabla 4: Componentes proteicos recombinantes utilizados en las siete vacunas. Cada grupo consistía en 11 cerdos. El grupo de control negativo recibió sólo adyuvante. La identidad de las proteínas se muestra en el cuadro de abajo. Grupo Antígeno de vacuna

1 OMP6, OMP7

2 OMP7, OMP10

3 OMP6, OMP10

4 Control negativo

Tabla 6: Puntuaciones de excreción fecal de Brachyspira hyodysenteriae en los días de muestreo

Días después del primer día de infección experimental N.° de

_cerdo Grupo Preinfección 7 10 14 17 21 24 28 16 1 0 0 5 5 5 Muerto

24 1 0 5 5 5 5 5 Muerto

28 1 0 5 Muerto

31 1 0 5 5 5 5 5 Muerto

34 1 0 5 5 5 5 5

37* 1 0 5 5 5 5 5 Muerto

60 1 0 5 5 5 5 5 5 5 61 1 0 5 Muerto

75 1 0 1 5 5 5 5 5 5 76 1 0 1 3 5 5 5 5 5 82 1 0 4 5 5 5 5 5 5

1 2 0 5 5 5 5 5 5 5

7 2 0 0 0 5 5 5 5 5

27 2 0 3 5 5 5 5 5 5 40 2 0 5 5 5 5 5 Muerto

42 2 0 5 Muerto

45 2 0 3 5 5 5 5 5 5 53 2 0 5 Muerto

59 2 0 5 5 5 5 5 Muerto

67 2 0 5 Muerto

70 2 0 5 5 Muerto

72 2 0 5 5 5 5 5 5 5 3 3 0 4 5 5 5 5 Muerto

14 3 0 5 Muerto

19 3 0 5 Muerto

20 3 0 5 5 5 5 Muerto

30 3 0 5 5 5 5 Muerto

48 3 0 5 5 5 5 5 5 5 52 3 0 5 5 5 5 5 5 5 62 3 0 5 5 Muerto

65 3 0 5 Muerto

69 3 0 5 5 Muerto

90 3 0 5 5 5 5 5 5 5 6 4 0 4 3 5 5 5 5 5 15 4 0 5 5 5 5 5 5 5 17 4 0 5 5 5 5 5 5 5 23 4 0 5 5 5 Muerto

38 4 0 0 5 5 5 5 5 46 4 0 0 5 5 5 5 5 5 64 4 0 5 Muerto

71 4 0 0 3 5 5 5 5 5 77 4 0 5 5 5 5 5 5 5 80 4 0 0 5 5 5 5 5 5 86 4 0 5 4 3 5 5 5 5 2 5 0 0 4 5 5 5 5 5 10 5 0 5 5 5 5 5 5 5

12 5 0 5 5 5 Muerto

18 5 0 5 5 Muerto

43 5 0 5 5 5 Muerto

47 5 0 5 5 5 5 5 Muerto 55 5 0 5 5 5 Muerto

68 5 0 5 5 5 5 5 Muerto 74 5 0 0 5 3 5 Muerto

81 5 0 5 5 5 5 5 Muerto 85 5 0 5 5 5 5 5 5 5 (continuación)

Días después del primer día de infección experimental N.° de

_cerdo Grupo Preinfección 7 10 14 17 21 24 28 4 6 0 5 5 5 Muerto

8 6 0 5 Muerto

13 6 0 0 5 5 5 5 5 5

26 6 0 5 5 5 5 5 5 5

44 6 0 5 Muerto

49 6 0 5 5 5 5 5 5 5

56 6 0 5 Muerto

58 6 0 5 5 5 5 5 5 5

73 6 0 2 4 5 5 5 5 5

83 6 0 0 4 5 5 5 5 5

89 6 0 4 5 5 5 5 5 5

9 7 0 5 5 5 5 5 5 5

11 7 0 0 5 5 5 5 5 5

22 7 0 3 3 4 5 Muerto

25 7 0 5 Muerto

32 7 0 5 Muerto

39 7 0 5 5 5 Muerto

54 7 0 5 Muerto

66 7 0 4 5 5 5 5 5 5

78 7 0 5 5 5 5 5 5 5

84 7 0 5 5 5 Muerto

9 7 0 5 5 5 5 5 5 5

21* C 0 5 Muerto

29 C 0 5 Muerto

35 C 0 5 Muerto

36 C 0 5 5 5 Muerto

41 C 0 5 5 5 5 Muerto

50 C 0 5 5 5 Muerto

51 C 0 5 5 Muerto

57 C 0 5 5 5 5 5 5 5

63 C 0 5 5 5 Muerto

79 C 0 5 5 5 Muerto

88 C 0 5 Muerto

Puntuaciones fecales donde 0 = no hay B. hyodysenteriae; 0,5 = espiroquetas en los cortes de la placa; 1 = espiroquetas en la primera estría de la placa; 2 = espiroquetas en la segunda estría; 3 = espiroquetas en la tercera estría, y así sucesivamente hasta 5 = toda la superficie de la placa cubierta de espiroquetas.

Muerto; cerdo no disponible para el muestreo fecales porque fue sacrificado. Los cerdos restantes se sacrificaron 5 semanas después del inicio del proceso de infección.

* El cerdo murió antes de la PM (autopsia). Se obtuvieron cultivos y observaciones en la necropsia, pero no se recuperó sangre/suero.__________________________________________________________________________

Tabla 7: Resumen del número de cerdos retirados para la autopsia en distintos momentos tras la infección experimental.









Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Uso in vitro de un polipéptido recombinante que consiste en una secuencia que es idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o que consiste en una secuencia que es idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y que tiene adicionalmente una etiqueta de afinidad unida para la detección de la presencia de Brachyspira hyodysenteriae.

2. Uso de un kit de diagnóstico para la detección de la presencia de Brachyspira hyodysenteriae en un animal, en donde dicho kit contiene un polipéptido recombinante que consiste en una secuencia que es idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o que consiste en una secuencia que es idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y que tiene adicionalmente una etiqueta de afinidad unida,

y en donde dicho uso no es un método de diagnóstico practicado en el cuerpo del animal.

3. El uso de la reivindicación 2, en donde el kit contiene:

(a) una cantidad conocida de dicho polipéptido recombinante unida a una fase sólida para formar un inmunoabsorbente, y

(b) instrucciones para el uso de dicho kit de prueba.

4. Uso in vitro de un kit para demostrar la presencia de una especie de Brachyspira, en donde dicho kit contiene:

(a) una cantidad predeterminada de un componente inmunoquímicamente reactivo marcado obtenido mediante la unión directa o indirecta de un polipéptido a un marcador detectable, en donde dicho polipéptido es

un polipéptido recombinante que consiste en una secuencia que es idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o que consiste en una secuencia que es idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y que tiene adicionalmente una etiqueta de afinidad unida; y

(b) instrucciones para el uso de dicho kit.

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha etiqueta de afinidad se selecciona del grupo que consiste en etiqueta de polihistidina, proteína de unión a quitina (CBP), proteína de unión a maltosa (MBP) y glutatión transferasa (GST).