BRPI0611833A2

BRPI0611833A2 - genes e proteìnas de brachyspira pilosicoli e uso dos mesmos para diagnóstico e terapia

Info

Publication number: BRPI0611833A2
Application number: BRPI0611833-0A
Authority: BR
Inventors: Matthew Bellgard; David John Hampson; Tom La
Original assignee: Novartis Ag; Murdoch Universty
Priority date: 2005-06-23
Filing date: 2006-06-21
Publication date: 2011-12-20
Also published as: CN101228276A; EP1896589A2; PE20070096A1; WO2006136392A2; TW200740997A; WO2006136392A3

Abstract

GENES E PROTEìNAS DE BRACHVSPIRA PILOSICOLI E USO DOS MESMOS PARA DIAGNóSTICO E TERAPIA. São descritos novos polinucleotídeo e aminoácidos de Brachyspira pilosicoli. Estas seqúências são úteis para diagnóstico de doença por B. pilosicoli em animais e como um tratamento terapêutico ou um tratamento profilático de doença por B. pilosicoli em animais. Estas seqúências também podem ser úteis para diagnóstico e tratamento terapêutico e/ou profilático de doenças em animais causadas por outras espécies de Brachyspira, incluindo B. intermedia, B. alvinipuili, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochil, e B. hyodysenteriae.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENES E PROTEÍNAS DE BRACHYSPIRA PILOSICOLI E USO DOS MESMOS PARA DIAGNÓSTICO E TERAPIA".

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a novos genes em Brachyspira pilosi- colie as proteínas codificadas na mesma. Esta invenção adicionalmente se refere ao uso destes novos genes e proteínas para diagnóstico de doença por B. pilosicoli, vacinas contra B. pilosicoli e para triagem para compostos que matam B. pilosicoli ou bloqueiam os efeitos patogênicos de B. pilosicoli.

Estas seqüências também podem ser úteis para diagnóstico e tratamento terapêutico e/ou profilático de doenças em animais causadas por outras espécies de Brachyspira1 incluindo B. intermedia, B. alvirtipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii, e B. hyodysenteriae.

Antecedentes da Invenção

Espiroquetose intestinal, também conhecida como espiroqueto- se colônica ou diarréia espiroquetal, é uma importante doença limitadora da produção de porcos e galinhas poedeiras adultas e frangos de produtores de grelhados. A espiroquetose intestinal resulta de infecção do intestino grosso com o espiroqueta intestinal Brachyspira (anteriormente Serpulina) pilosicoli. Esta espiroqueta também infecta uma série de outas espécies animais, inclusive cães e cavalos, bem como seres humanos. A doença associada é melhor entendida e tem sido mais estudada em porcos. A pre- valência da infecção na indústria de porcos australiana é incerta, mas estu- dos na Europa e na Escandinávia sugerem que 30% ou mais dos rebanhos de porcos estão infectados. A doença associada é uma colite /tiflite com diarréia intermitente e índices de crescimento reduzido. A importância eco- nômica da doença em porcos não está clara, mas pode ser grande porque está disseminada. B. pilosicoli também infecta comumente frangos adultos.

Em um levantamento recente na Austrália, foram recuperados espiroquetas intestinais de 43% de rebanhos de produtores de grelhados e 68% das cri- ações de galinhas poedeiras, e B. pilosicoli foi o espiroqueta envolvido em 44% de um subgrupo destes rebanhos. Rebanhos infectados em média tinham fezes 14% mais úmidas do que rebanhos não infectados. A infecção experimental de frangos de produtores de grelhados com um isolado de B. piIosicoli deste estudo resultou em um atraso significativo no início da produ- ção de ovos e uma redução sustentada na produção de ovos. Além de gali- nhas poedeiras, a falta de produção de ovos em criações de produtores de grelhados pode causar considerável disrupção de toda a indústria de aves a serem grelhadas. Os custos destes problemas são difíceis de estimar, mas as Indústrias são significativos na Austrália. A Indústria de Carne de Frango produz carne com um valor de varejo de 2,5 bilhões de dólares, enquanto a Indústria de Ovos produz ovos avaliados em 340 milhões de dólares.

O papel do B. pilosicoli como um patógeno de cães e outras es- pécies animais ainda não está firmemente estabelecido, embora pareça que seja capaz de ter impacto sobre a saúde em uma maior ou menor extensão dependendo de uma série de outros fatores. B. pilosicoli também infecta grandes números de pessoas nos países em desenvolvimento. Em países desenvolvidos a infecção está essencialmente confinada a indivíduos imu- nocomprometidos e machos homossexuais. Foi registrada como uma causa de espiroquetemia em indivíduos e/ou imunocomprometidos. A total exten- são do impacto patogênico de B. pilosicoli nestes grupos da população hu- mana ainda é debatida.

Têm sido feitas algumas tentativas para desenvolver meios para controlar infecções com B. pilosicoli. Onde a espiroquetose intestinal é iden- tificada como um problema em chiqueiros, os animais são rotineiramente tratados com antimicrobianos, embora a doença tenda a recorrer depois da retirada do tratamento. A doença em frangos não é bem entendida, e as in- dústrias de frangos não tentaram especificamente controlar a infecção. Há somente um estudo registrado do uso de uma vacina para controlar a espi- roquetose intestinal em porcos e esta bacterina autógena não teve êxito em oferecer proteção (Hampson DJ, Robertson ID, La T, Oxberry SL e Pethick DW. 2000. Influences of diet and vaccination on colonization of pigs by the spirochaete intestinal Brachyspira (SerpuIina) pilosicoli. Veterinary Microbio- Iogy 74:75-84). Não obstante, como há uma fixação de end-on específica da espiroqueta à mucosa do intestino grosso, parece provável que esta coloni- zação possa ser reduzida ou prevenida pelo uso de imunidade induzida por uma vacina adequada.

A presente invenção proporciona novas seqüências de aminoá- cido de B. pilosicoli e as seqüências de polinucleotídeo que codificam as mesmas, as quais não foram identificadas previamente. A presente invenção também demonstra que estas novas seqüências de aminoácido e seqüên- cias de DNA podem ser usadas para testes de diagnóstico e vacinas para B. pilosicoli. Estas seqüências também podem ser úteis para diagnóstico e tra- tamento terapêutico e/ou profilático de doenças em animais causadas por outras espécies de Brachyspira, inclusive B. intermedia, B. alvinipulli, B. aal- borgi, B. innocens, B. murdochii, e B. hyodysenteríae.

Breve Sumário da Invenção

É um objeto desta invenção ter novos genes de B. pilosicoli e as proteínas codificadas por estes genes. É um objeto adicional desta invenção que estes novos genes e as proteínas codificadas por estes genes possam ser usados para fins terapêuticos e diagnósticos. Uma pessoa pode usar os genes e/ou as proteínas em uma vacina contra B. pilosicoli e para diagnosti- car infecções por B. pilosicoli.

É um objeto desta invenção ter novos genes de B. pilosicoli ten- do a seqüência de nucleotídeo contida nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, e 9. É também um objeto desta invenção ter seqüências de nucleotídeos que são homólogas às SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, e 9 onde a homologia pode ser de 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70%. Esta invenção também inclui uma vacina do DNA ou composição imunogênica de DNA contendo a seqüência de nu- cleotídeo de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, e 9 e seqüências que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas a estas seqüências. Esta invenção adi- cionalmente inclui um ensaio de diagnóstico contendo DNA tendo a seqüên- cia de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, e 9 e seqüências que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas a estas seqüências.

É também um objeto desta invenção ter plasmídeos contendo DNA tendo a seqüência de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, e 9; vetores de expres- são procarióticos e/ou eucarióticos contendo DNA tendo a seqüência de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, e 9; e uma célula contendo os plasmídeos os quais contêm DNA tendo a seqüência de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, e 9.

É um objeto desta invenção ter novas proteínas de B. pilosicoli tendo a seqüência de aminoácido contida nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10. É outro objeto desta invenção ter proteínas que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas às seqüências contidas nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10. É também um objeto desta invenção para uma vacina ou composição imunogênica conter as proteínas tendo a seqüência de aminoácido contida nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10, ou seqüências de aminoácidos que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas às seqüências contidas nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10. É um aspecto adicional desta invenção ter um kit diagnóstico contendo uma ou mais proteínas tendo uma seqüência conti- da nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10 ou que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas às seqüências contidas nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10.

É outro aspecto desta invenção ter seqüências de nucleotídeos as quais codificam as proteínas tendo a seqüência de aminoácido contida nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10. A invenção também cobre plasmídeos, vetores de expressão eucarióticos e procarióticos, e vacinas de DNA as quais contêm DNA tendo uma seqüência a qual codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácido contida nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10. Célu- las as quais contêm estes plasmídeos e vetores de expressão são incluídas nesta invenção.

Esta invenção inclui anticorpos monoclonais que ligam a proteí- nas tendo uma seqüência de aminoácido contida nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10 ou ligam a proteínas que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% ho- mólogas às seqüências contidas nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10. Kits de diagnóstico contendo os anticorpos monoclonais que ligam a proteínas tendo uma seqüência de aminoácido contida nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10 ou ligam a proteínas que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas às seqüências contidas nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10 são incluídas nesta invenção. Estes kits de diagnóstico podem detectar a presença de B. pilosi- coli em um animal. O animal é preferencialmente qualquer mamífero e ave; mais preferencialmente, frango, ganso, pato, peru, periquito, cão, gato, hamster, gerbo, coelho, furão, cavalo, vaca, ovelha, porco, macaco, e humano.

A invenção também contempla o método para prevenir ou tratar uma infecção de B. pilosicoli em um animal administrando a um animal uma vacina do DNA contendo uma ou mais seqüências de nucleotídeos listadas nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, e 9 ou seqüências que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas a estas seqüências. Esta invenção também cobre um método para prevenir ou tratar uma infecção de B. pilosicoli em um animal administrando a um animal uma vacina contendo uma ou mais prote- ínas tendo a seqüência de aminoácido contendo nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10 ou seqüências que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas a estas seqüências. O animal é preferencialmente qualquer mamífero e ave; mais preferencialmente, frango, ganso, pato, peru, periquito, cão, gato, hamster, gerbo, coelho, furão, cavalo, vaca, ovelha, porco, macaco, e humano.

A invenção também contempla o método para produzir uma rea- ção imune em um animal administrando a um animal uma composição imu- nogênica contendo uma ou mais seqüências de nucleotídeos listadas nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, e 9 ou seqüências que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas a estas seqüências. Esta invenção também cobre um método para produzir uma reação imune em um animal administrando a um animal uma composição imunogênica contendo uma ou mais proteínas tendo a seqüência de aminoácido contendo nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, e 10 ou seqüências que são 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas a es- tas seqüências. O animal é preferencialmente qualquer mamífero e ave; mais preferencialmente, frango, ganso, pato, peru, periquito, cão, gato, hamster, gerbo, coelho, furão, cavalo, vaca, ovelha, porco, macaco, e humano.

Sumário Detalhado da Invenção

Os artigos "um" e "uma" são usados aqui, neste requerimento de patente, para referir a um ou a mais de um (isto é, a no mínimo um) do obje- to gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um ele- mento ou mais de um elemento.

O termo "aminoácido" pretende englobar todas as moléculas, quer naturais ou sintéticas, as quais incluem tanto uma funcionalidade amino quanto uma funcionalidade ácido e capaz de serem incluídas em um políme- ro de aminoácidos naturais. Aminoácidos típicos incluem aminoácidos natu- rais; análogos, derivados e congêneres dos mesmos; análogos de aminoáci- dos tendo cadeias laterais variantes; e todos os estereoisômeres de qual- quer um de quaisquer dos precedentes.

Um animal pode ser qualquer mamífero ou ave. Exemplos de mamíferos incluem cão, gato, hamster, gerbo, coelho, furão, cavalo, vaca, ovelha, porco, macaco, e humano. Exemplos de aves incluem frango, ganso, pato, peru, e periquito.

O termo "resíduo conservado" se refere a um aminoácido que é um membro de um grupo de aminoácidos tendo algumas propriedades co- muns. O termo "substituições de aminoácidos conservativas" se refere à substituição (conceitualmente ou de modo diverso) de um aminoácido de um grupo semelhante com um aminoácido diferente do mesmo grupo. Um modo funcional para definir propriedades comuns entre aminoácidos individuais é analisar as freqüências normalizadas de alterações de aminoáGidos entre proteínas correspondentes de organismos homólogos (Schulz, G. E. e R. H. Schinner., Principies of Protein Structure, Springer-Verlag). De acordo com as análises referidas, podem ser definidos grupos de aminoácidos onde a- minoácidos dentro de um grupo permutam preferencialmente uns com os outros, e portanto se assemelham uns aos outros mais em seu impacto so- bre a estrutura protéica global (Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principies of Protein Structure, Springer-Verlag). Exemplos de grupos de aminoácidos definidos nesta maneira incluem: (i) um grupo carregado positivamente con- tendo Lys, Arg e His, (ii) um grupo carregado negativamente contendo Glu e Asp, (iii) um grupamento aromático contendo Phe, Tyr e Trp, (iv) um grupo de anel de nitrogênio contendo His e Trp, (v) um grupo não polar alifático grande contendo Vai, Leu e De, (vi) um grupo ligeiramente polar contendo Met e Cys1 (vii) um grupo de resíduos pequenos contendo Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln e Pro, (viii) um grupo alifático contendo Vai, Leu, De, Met and Cys, e (ix) um gropo oxidrila pequeno contendo Ser e Thr.

Uma "proteína de fusão" ou "polipeptídeo de fusão" se refere a uma proteína quimérica como este termo é conhecido na técnica e pode ser considerado usando métodos conhecidos na técnica. Em muitos exemplos de proteínas de fusão, há duas seqüências de polipeptídeos diferentes, e em alguns casos, pode haver mais. As seqüências de polinucleotídeos codifi- cando a proteína de fusão podem ser encadeadas operavelmente in-frame de modo que a proteína de fusão pode ser traduzida corretamente. Uma pro- teína de fusão pode incluir seqüências de polipeptídeos da mesma espécie ou de diferentes espécies. Em várias modalidades, o polipeptídeo de fusão pode conter uma ou mais seqüências de aminoácidos encadeadas a um primeiro polipeptídeo. No caso onde mais de uma seqüência de aminoácido é fundida a um primeiro polipeptídeo, as seqüências de fusão podem ser múltiplas cópias da mesma seqüência, ou alternativamente, podem ser se- qüências de aminoácidos diferentes. Os polipeptídeos de fusão podem ser fundidos ao N-término, ao C-término, ou ao N- e C-término do primeiro poli- peptídeo. Proteínas de fusão típicas incluem polipeptídeos contendo uma etiqueta de glutationa S-transferase (GST-tag),-etiqueta de histidina (His- tag), um domínio imunoglobulina ou um domínio de ligação de imunoglobulina.

O termo "polipeptídeo isolado" se refere a um polipeptídeo, em algumas modalidades preparado a partir de DNA ou RNA recombinante, ou de origem sintética ou origem natural, ou alguma combinação das mesmas, o qual (1) não é associado com proteínas que são encontradas normalmente na natureza, (2) é separado da célula na qual ocorre normalmente, (3) é livre de outras proteínas da mesma fonte celular, (4) é expressado por uma célula de uma espécie diferente, ou (5) não ocorre na natureza. É possível para um polipeptídeo isolado existir mas não qualificar como um polipeptídeo purifi- cado. O termo "ácido nucléico isolado" e "polinucleotídeo isolado" se refere a um polinucleotídeo quer DNA genômico, cDNA, mRNA, tRNA, rR- NA, íRNA, ou um polinucleotídeo obtido de uma organela celular (tal como mitocôndria e cloroplasto), ou quer de origem sintética, qual (1) ) não é as- sociado com a célula na qual o "ácido nucléico isolado" é encontrado na na- tureza, ou (2) é encadeado operavelmente a um polinucleotídeo ao qual não é encadeado na natureza. É possível para um polinucleotídeo isolado existir mas não qualificar como um polinucleotídeo purificado.

O termo "ácido nucléico" e "polinucleotídeo" se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos, quer ribonucleotídeos ou desoxirribonu- cleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Os termos também devem ser entendidos para incluir, como equivalentes, aná- logos de ou RNA ou DNA feitos de análogos de nucleotídeos, e, conforme aplicável a modalidade sendo descrita, polinucleotídeos de filamento único (tais como de sentido ou anti-sentido) e de filamento duplo.

O termo "ácido nucléico da invenção" e "polinucleotídeo da in- venção" se refere a um ácido nucléico codificando um polipeptídeo da inven- ção. Um polinucleotídeo da invenção pode compreender todo, ou uma por- ção de, uma seqüência de ácido nucléico em questão; uma seqüência de nucleotídeo no mínimo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de ácido nucléico em questão; uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes a uma seqüência de ácido nucléico em questão; seqüências de nucleotídeos codificando polipep- tídeos que são funcionalmente equivalentes aos polipeptídeos da invenção; seqüências de nucleotídeos codificando polipeptídeos no mínimo cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% homólogas ou idênticas com uma seqüência de aminoácido em questão; seqüências de nucleotídeos co- dificando polipeptídeos tendo uma atividade de um polipeptídeo da invenção e tendo no mínimo cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais homologia ou identidade com uma seqüência de aminoácido em ques- tão; seqüências de nucleotídeos que diferem por 1 a cerca de 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 ou mais substituições, adições ou eliminações de núcleo- tídeos, tais como variantes alélicas, de uma seqüência de ácido nucléico em questão; ácidos nucléicos derivados de evolucionariamente relacionados com uma seqüência de ácido nucléico em questão; e complementos de, e seqüências de nucleotídeos resultantes da degeneração do código genético, para todos dos ácidos nucléicos precedentes e outros da invenção. Ácidos nucléicos da invenção também incluem homólogos, por exemplo, hortólogos e parálogos, de uma seqüência de ácido nucléico em questão e também va- riantes de uma seqüência de ácido nucléico em questão os quais foram có- don otimizados para expressão em um organismo em particular (por exem- plo, célula hospedeira).

O termo "operavelmente encadeadas", ao descrever a relação entre duas regiões de ácido nucléico, se refere a uma justaposição em que as regiões estão em uma relação permitindo que as mesmas funcionem em sua maneira pretendida. Por exemplo, uma seqüência controle "operavel- mente encadeada" a uma seqüência codificante é ligada em um modo tal que a expressão da seqüência codificante é realizada sob condições compa- tíveis com as seqüências controles, tal como quando as moléculas apropria- das (por exemplo, indutores e polimerases) são ligados à uma ou mais se- qüências controles ou regulatórias.

O termo "polipeptídeo", e os termos "proteína" e "peptídeo" os quais são usados de modo intercambiável aqui, neste requerimento de pa- tente, se referem a um polímero de aminoácidos. Polipeptídeos típicos inclu- em produtos genéticos, proteínas que ocorrem naturalmente, homólogos, hortólogos, parálogos, fragmentos, e outros equivalentes, variantes e análo- gos dos precedentes.

Os termos "fragmento de polipeptídeo" ou "fragmento", quando usados em referência a um polipeptídeo de referência, se refere a um poli- peptídeo no qual resíduos aminoácidos são eliminados comparados com o próprio polipeptídeo de referência, mas onde a seqüência de aminoácido remanescente é geralmente idêntica às posições correspondentes no poli- peptídeo de referência. As eliminações referidas podem ocorrer no término amino ou término carbóxi do polipeptídeo de referência, ou alternativamente em ambos. Fragmentos tipicamente têm no mínimo 5, 6, 8 ou 10 aminoáci- dos de extensão, no mínimo 14 aminoácidos de extensão, no mínimo 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos de extensão, no mínimo 75 aminoácidos de extensão, ou no mínimo 100, 150, 200, 300, 500 ou mais aminoácidos de extensão.

Um fragmento pode conservar uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, um fragmento pode compreender um domínio tendo a atividade biológica desejada, e opcional- mente aminoácidos adicionais sobre um ou ambos os lados do domínio, cu- jos aminoácidos adicionais podem numerar de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, ou até 100 ou mais resíduos. Além disso, fragmentos podem incluir um sub- fragmento de uma região específica, cujo sub-fragmento conserva uma fun- ção da região da qual é derivado. Em outra modalidade, um fragmento pode ter propriedades imunogênicas.

O termo "polipeptídeo da invenção" se refere a um polipeptídeo contendo uma seqüência de aminoácido em questão, ou um equivalente ou fragmento da mesma. Polipeptídeos da invenção incluem polipeptídeos con- tendo toda ou uma porção de uma seqüência de aminoácido em questão; uma seqüência de aminoácido em questão com 1 a cerca de 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 ou mais substituições de aminoácidos conservativas; uma seqüência de aminoácido que é no mínimo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácido em ques- tão; e fragmentos funcionais dos mesmos. Polipeptídeos da invenção tam- bém incluem homólogos, por exemplo, hortólogos e parálogos, de uma se- qüência de aminoácido em questão.

Também é possível modificar a estrutura dos polipeptídeos da invenção para fins tais como reforço da eficácia terapêuticos ou profilática, ou estabilidade (por exemplo, vida de prateleira ex vivo, resistência a degra- dação proteolítica in vivo, e etc.). Os polipeptídeos modificados referidos, quando designados para reterem no mínimo uma atividade da forma da pro- teína que ocorre naturalmente, são considerados "equivalentes funcionais" dos polipeptídeos descritos em mais detalhes aqui, neste requerimento de patente. Os polipeptídeos modificados referidos podem ser produzidos, por exemplo, por substituição, eliminação, ou adição de aminoácido, cujas subs- tituições podem consistir no todo ou em parte por substituições de aminoáci- dos conservativas.

Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição de ami- noácido conservativa isolada, tal como substituição de uma Ieucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, não terá um efeito importante sobre a atividade biológica da mo- lécula resultante. Se uma alteração na seqüência de aminoácido de um poli- peptídeo resulta em um homólogo funcional pode ser prontamente determi- nado avaliando a capacidade do polipeptídeo variante para produzir uma reação similar à da proteína selvagem. Polipeptídeos nos quais ocorreu mais de uma substituição podem ser prontamente testados na mesma maneira.

O termo "purificado" se refere a uma espécie fim que é a espécie predominante presente (isto é, em uma base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição). Uma "fração purificada" é uma composição em que a espécie fim é no mínimo cerca de 50 por cento (em uma base molar) de todas as espécies presentes. Ao fazer a determina- ção da pureza de uma espécie em solução ou dispersão, o solvente ou ma- triz no qual a espécie é dissolvido ou dispersado geralmente não é incluído em semelhantes determinações; ao invés, somente as espécies (incluindo a espécie de interesse) dissolvidas ou dispersadas são levadas em conta. Ge- neralmente, uma composição purificada terá uma espécie que é mais de cerca de 80% de todas as espécies presentes na composição, mais de cerca de 85%, 90%, 95%, 99% ou mais de todas as espécies presentes. A espécie fim pode ser purificada cada para homogeneidade essencial (espécies con- taminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de de- tecção convencionais) em que a composição é essencialmente uma única espécie. Um técnico versado pode purificar um polipeptídeo da invenção usando técnicas de rotina para purificação de proteína à luz dos ensinamen- tos aqui, neste requerimento de patente. A pureza de um polipeptídeo pode ser determinada por uma série de métodos de conhecimento daqueles ver- sados na técnica, incluindo por exemplo, análise de seqüência de aminoáci- do de terminal amino, eletroforese por gel, análise por espectrometria de massa e os métodos descritos aqui, neste requerimento de patente.

Os termos "proteína recombinante" ou "polipeptídeo recombinan- te" se referem a um polipeptídeo o qual é produzido por técnicas de DNA recombinante. Um exemplo de semelhantes técnicas inclui o caso quando DNA codificando a proteína expressada é inserido em um vetor de expres- são adequado o qual por sua vez é usado para transformar uma célula hos- pedeira para produzir a proteína ou polipeptídeo codificado pelo DNA.

O termo "seqüência regulatória" é um termo genérico usado do início ao fim da especificação para se referir a seqüências de polinucleotí- deos, tais como sinais de iniciação, reforçadores, reguladores e promotores, que são necessários ou desejáveis para afetar a expressão de seqüências codificantes e não codificantes às quais estão encadeadas operavelmente. Seqüências regulatórias típicas são descritas em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990), e incluem, por exemplo, os promotores precoces e tardios de SV40, promotor precoce imediato de adenovírus ou citomegalovírus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, T7 promotor cuja expressão é dirigida por T7 RNA polimerase, as principais regiões operadoras e promotoras de fago lâmbda, as regiões de controle para proteína da capa fd, o promotor para 3-fosfogIicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase ácida (por exemplo, Pho5), os promotores dos fatores de cru- zamento α (a-mating) de levedura, o promotor de poliedro do sistema de ba- culovírus e outras seqüências que se sabe que controlam a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e várias combi- nações das mesmas. A natureza e uso de semelhantes seqüências controle podem diferir dependendo do organismo hospedeiro. Em procariotas, as se- qüências regulatórias referidas geralmente incluem promotor, sítio de ligação ribossomal, e seqüências de terminação de transcrição. O termo "seqüência regulatória" pretende incluir, no mínimo, componentes cuja presençaç pode influenciar a expressão, e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, seqüências Iider e seqüências de parcei- ro de fusão. Em algumas modalidades, a transcrição de uma seqüência de polinucleotídeo é sob o controle de uma seqüência de promotor (ou outra seqüência regulatória) a qual controla a expressão do polinucleotídeo em um tipo celular no qual se pretende expressão. Também será entendido que o polinucleotídeo pode estar sob o controle de seqüências regulatórias as quais são sa mesmas ou diferentes destas seqüências as quais controlam expressão da forma que ocorre naturalmente do polinucleotídeo.

O termo "homologia de seqüência" se refere à proporção de combinações de bases entre duas seqüências de ácidos nucléicos ou a pro- porção de combinações de aminoácidos entre duas seqüências de aminoá- cidos. Quando a homologia de seqüência é expressada como uma percen- tagem, por exemplo, 50%, a percentagem denota a proporção de combina- ções sobre a extensão de seqüência de uma seqüência desejada que é comparada com alguma outra seqüência. Gaps (em quaisquer das duas se- qüências) são permitidos para maximizar a combinação; são geralmente u- sados extensões de gaps de 15 bases ou menos, são usadas mais freqüen- temente 6 bases ou mesno, com 2 bases ou mesno usadsa ainda mais fre- qüentemente. O termo "identidade de seqüência" significa que seqüências são idênticas (isto é, em uma base de nucleotídeo-por-nucleotídeo para áci- dos nucléicos^ ou base de aminoácido-por-aminoácido para polipeptídeos) sobre uma janela de comparação. O termo "percentagem de identidade de seqüência" é calculado comparando duas seqüências otimamente alinhadas sobre a janela de comparação, determinando o número de posições nas quais os aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ocorrem em ambas as se- qüências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o nú- mero de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percenta- gem de identidade de seqüência. Métodos para calcular identidade de se- qüência são de conhecimento daqueles versados na técnica e descritos em detalhes adicionais abaixo.

O termo "solúvel" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, com referência a um polipeptídeo da invenção ou outra proteína, significa que na expressão em cultura celular, no mínimo alguma porção do polipeptídeo ou proteína expressado permanece na fração citoplasmática da célula e não fraciona com os debris celulares na Iise e centrifugação do Usa- do. A solubilidade de um polipeptídeo pode ser aumentada por uma varieda- de de métodos reconhecidos na técnica, incluindo fusão a uma seqüência de aminoácido heteróloga, eliminação de resíduos aminoácidos, substituição de aminoácido (por exemplo, enriquecendo a seqüência com resíduos aminoá- cidos tendo cadeias laterais hidrofílicas), e modificação química (por exem- plo, adição de grupamentos hidrofílicos).

A solubilidade dos polipeptídeos pode ser medida usando uma variedade de técnicas reconhecidas na arte, incluindo, dispersão da luz di- nâmica para determinar o estado de agregação, absorção de UV, centrifuga- ção para separar material agregado de não agregado, e eletroforese por gel SDS (por exemplo, a quantidade de proteína na fração solúvel é comparada com a quantidade de proteína nas frações solúveis e insolúveis combina- das). Quando expressados em uma célula hospedeira, os polipeptídeos da invenção pode ser no mínimo cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais solúveis, por exemplo, no mínimo cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da quantidade total de proteína expressada na célula é encontrada na fração citoplasmática. Em algumas modalidades, um litro de uma cultura celular expressando um polipeptídeo da invenção produzirá no mínimo cerca de 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 miligramas ou mais de proteína solúvel. Em uma modalidade típica, um polipeptídeo da invenção é no mínimo cerca de 10% solúvel e produzirá no mínimo cerca de 1 miligrama de proteína a partir de um litro de uma cultura celular.

O termo "especificamente hibridiza" se refere a ligação de ácido nucléico detectável e específica. Polinucleotídeos, oligonucleotídeos e áci- dos nucléicos da invenção hibridizam seletivamente a filamentos de ácido nucléico sob hibridização e condições de lavagem que minimizam quantida- des apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucléicos não específica. Po- dem ser usadas condições estringentes para obter condições de hibridização seletivas conforme conhecido na técnica e discutido aqui, neste requerimen- to de patente. De modo geral, a homologia da seqüência de ácido nucléico entre os polinucleotídeos, oligonucleotídeos, e ácidos nucléicos da invenção e uma seqüência de ácido nucléico de interesse será no mínimo 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou mais. Em alguns ca- sos, condições de hibridização e Ievagem são realziadas sob condições es- tringentes de acordo com procedimentos de hibridização convencional e conforme descrito adicionalmente aqui, neste requerimento de patente.

Os termos "condições estringentes" ou "condições de hibridiza- ção estringentes" se referem a condições as quais promovem hibridização específica entre dois filamentos de polinucleotídeos complementares de mo- do a formar um duplex. Condições estringentes podem ser selecionadas pa- ra serem cerca de 5°C menores do que o ponto de fusão térmico (Tm) para um dado duplex de polinucleotídeo em uma força iônica e pH definidos. A extensão dos filamentos de polinucleotídeos complementares e seu teor de GC determinarão o Tm do duplex, e portanto as condições de hibridização necessárias para obter uma especificidade de hibridização desejada. OTm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma se- qüência de polinucleotídeo hibridiza a um filamento complementar perfeita- mente combinado. Em alguns casos pode ser desejável aumentar a estrin- gência das condições de hibridização para serem cerca de iguais à Tm para um duplex particular.

Estão disponíveis uma variedade de técnicas para estimar o Tm. Tipicamente, pares de bases G-C em um duplex são estimados para contri- buir cerca de 3°C para o Tm, enquanto pares de bases A-T são estimados para contribuir cerca de 2°C, até um máximo teórico de cerca de 80-100°C.

No entanto, estão disponíveis modelos mais sofisticados de Tm nos quais interações de empilhamento G-C, efeitos solventes, a temperatura de teste desejada e semelhantes são levados em conta. Por exemplo, po- dem ser designadas sondas para ter uma temperatura de dissociação (Td) de aproximadamente 60°C, usando a fórmula: Td = (((3 χ no. de GC) + (2 χ no. de AT)) χ 37) - 562)/no. de bp) - 5; onde no. de GC, no. de AT, e no. bp são o número de pares de bases guanina-citosina, o número de pares de bases adenina-timina, e o número de pares de bases o número de pares de bases total, respectivamente, envolvidos na formação do duplex.

Hibridização pode ser realizada em 5x SSC, 4x SSC1 3x SSC1 2x SSC, 1x SSC ou 0,2x SSC por no mínimo cerca de 1 hora, 2 horas, 5 horas, 12 horas, ou 24 horas. A temperatura da hibridização pode ser aumentada para ajustar a estringência da reação, por exemplo, a partir de cerca de 25°C (temperatura ambiente), a cerca de 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, ou 65°C. A rea- ção de hibridização também pode incluir outro agente afetando a estringên- cia, por exemplo, hibridização conduzida na presença de 50% de formamida aumenta a estringência de hibridização em uma temperatura definida.

A reação de hibridização pode ser seguida por uma única etapa de lavagem, ou duas ou mais etapas de lavagem, as quais podem estar na mesma ou em uma salinidade e temperatura diferentes. Por exemplo, a temperatura da lavagem pode ser aumentada para ajustar a estringência a partir de cerca de 25°C (temperatura ambiente), a cerca de 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, ou mais. A etapa de lavagem pode ser conduzida na pre- sença de um detergente, por exemplo, 0,1 ou 0,2% SDS. Por exemplo, hibri- dização pode ser seguida por duas etapas de lavagem a 65°C cada um por cerca de 20 minutos em 2x SSC, 0,1% SDS, e opcionalmente duas etapas de lavagem adicionais a 65°C cada uma por cerca de 20 minutos em 0,2x SSC, 0,1%SDS.

Condições de hibridização estringentes típicas incluem hibridiza- ção de um dia para o outro a 65°C em uma solução contendo 50% de for- mamida, 10x de Denhardt (0,2% de Ficoll, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de albumina sérica bovina) e 200 pg/ml de DNA carregador desnaturado, por exemplo, DNA de esperma de salmão cisalhado, seguido por dois etapas de lavagem a 65°C cada uma por cerca de 20 minutos em 2x SSC, 0,1% de SDS, e duas etapas de lavagem a 65°C cada uma por cerca de 20 minutos em 0,2x SSC, 0,1% de SDS.

Hibridização pode consistir de hibridizar dois ácidos nucléicos em solução, ou um ácido nucléico em solução a um ácido nucléico fixado a um suporte sólido, por exemplo, um filtro. Quando um ácido nucléico está sobre um suporte sólido, uma etapa de pré-hibridização pode ser conduzida antes da hibridização. Pré-hibridização pode ser realizada por no mínimo cerca de 1 hora, 3 horas ou 10 horas nas mesma solução e na mesma tem- peratura que a solução de hibridização (sem o filamento de polinucleotídeo complementar).

Condições de estringência apropriadas são de conhecimento daqueles versados na técnica ou podem ser determinadas experimentalmen- te pelo técnico versado. Vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-12.3.6; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning1 A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; S. Agrawal (ed.) Methods in Molecular Biology, volume 20; Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hy- bridization With Nucleic Acid Probes, e.g., part I chapter 2 "Overview of prin- ciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevi- er, New York; and Tibanyenda, N. et al., Eur. J. Biochem. 139:19 (1984) e Ebel, S. et al., Biochem. 31:12083 (1992).

O termo "vetor" se refere a um ácido nucléico capaz de transpor- tar outro ácido nucléico ao qual tenha sido encadeado. Um tipo de vetor o qual pode ser usado de acordo com a invenção é um epissoma, isto é, um ácido nucléico capaz de duplicação extra-cromossômica. Outros vetores in- cluem aqueles capazes de duplicação autônoma e expressão de ácidos nu- cléicos aos quais são encadeados. Vetores capazes de orientar a expressão de genes aos quais são encadeados operativamente são referidos aqui, nes- te requerimento de patente, como "vetores de expressão". Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante freqüentemen- te estão sob a forma de "plasmídeos" os quais se referem a moléculas de DNA de filamento duplo circulares as quais, em sua forma de vetor não são ligadas ao cromossoma. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" são usados de modo intercambiável uma vez que o plasmídeo é a forma de vetor usada mais comumente. No entanto, a invenção pretende incluir outras formas de vetores de expressão semelhantes as quais servem funções equi- valentes e as quais se tornam conhecidas na técnica subseqüentemente anexa.

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser usados como rea- gentes de diagnóstico para detectar a presença ou ausência das seqüências de DNA ou RNA alvo às quais ligam especificamente, tal como para deter- minar o nível de expressão de um ácido nucléico da invenção. Em um as- pecto, a presente invenção contempla um método para detectar a presença de um ácido nucléico da invenção ou uma porção do mesmo em uma amos- tra, o método das etapas de: (a) proporcionar um oligonucleotídeo de no mí- nimo oito nucleotídeos de extensão, o oligonucleotídeo sendo complementar a uma porção de um ácido nucléico da invenção; (b) contactar o oligonucleo- tídeo com uma amostra contendo no mínimo um ácido nucléico sob condi- ções que permitem hibridização do oligonucleotídeo com um ácido nucléico da invenção ou uma porção do meso; e (c) detectar hibridização do oligonu- cleotídeo a um ácido nucléico na amostra, deste modo detectando a presen- ça de um ácido nucléico da invenção ou uma porção do mesmo na amostra. Em outro aspecto, a presente invenção contempla um método para detectar a presença de um ácido nucléico da invenção ou uma porção do mesmo em uma amostra, (a) proporcionando um par de oligonucleotídeos de filamento único, cada um dos quais tem no mínimo oito nucleotídeos de extensão, complementares-a seqüências de um ácido nucléico da invenção, e em que as seqüências às quais os oligonucleotídeos são complementares têm no mínimo dez nucleotídeos à parte; e (b) contactando os oligonucleotídeos com uma amostra contendo no mínimo um ácido nucléico sob condições de hibridização; (c) amplificando a seqüência de nucleotídeo entre os dois pri- mers de oligonucleotídeos; e (d) detectando a presença da seqüência ampli- ficada, deste modo detectando a presença de um ácido nucléico da invenção ou uma porção do mesmo na amostra.

Em outro aspecto da invenção, o polinucleotídeo da invenção é proporcionado em um vetor de expressão contendo uma seqüência de nu- cleotídeo codificando um polipeptídeo da invenção e encadeado operavel- mente a no mínimo uma seqüência regulatória. Deve ser entendido que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a esco- lha da célula hospedeira para ser transformada e/ou o tipo de proteína que se deseja que seja expressada. O número de cópias do vetor, a capacidade para controlar este número de cópias e a expressão de qualquer outra prote- ína codificada pelo vetor, tal como marcadores antibióticos, devem ser con- siderados.

Um vetor de expressão contendo o polinucleotídeo da invenção pode ser então usado como um agente farmacêutico para tratar um animal infectado com B. pilosicoli ou como uma vacina (também um agente farma- cêutico) para evitar que um animal seja infectado com B. pilosicoli, ou para reduzir os sintomas e o curso da doença se o animal se tornar infectado. Uma maneira de usar um vetor de expressão como um agente farmacêutico é administrar uma vacina de ácido nucléico ao animal em risco de ser infec- tado ou ao animal depois de ser infectado. Tecnologia de vacinas de ácido nucléico é descrita de modo geral na arte. Algumas descrições podem ser encontradas na Patente dos Estados Unidos No. 6.562.376 (Hooper et al.); na Patente dos Estados Unidos No. 5.589.466 (Felgner, et al.); na Patente dos Estados Unidos No. 6.673.776 (Felgner, et al.); e na Patente dos Esta- dos Unidos No. 6.710.035 (Felgner, et al.). Vacinas de ácido nucléico podem ser injetadas-no músculo ou por via intradérmica, podem ser eletroporadas no animal (vide a publicação de Patente Internacional No. WO 01/23537, King et al.; e a publicação de Patente Internacional No. WO 01/68889, Malo- ne et al.), através de composições de lipídeos (vide a Patente dos Estados Unidos No. 5.703.055, Felgner, et al), ou outros mecanismos conhecidos no campo da técnica.

Vetores de expressão também podem ser transfectados em bac- térias as quais podem ser administradas ao animal alvo para induzir uma reação imune para a proteína codificada pelos nucleotídeos desta invenção contida no vetor de expressão. O vetor de expressão pode conter seqüên- cias de expressão eucarióticas tais que os nucleotídeos desta invenção são transcritos e traduzidos no animal hospedeiro. Alternativamente, o vetor de expressão pode ser transcrito nas bactérias e em seguida traduzido no ani- mal hospedeiro. As bactérias usadas como um carregador do vetor de ex- pressão devem ser atenuadas mas ainda invasivas. Pode-se usar Shigella spp., Salmonella spp., Escherichia spp., e Aeromonas spp., para nomear somente umas poucas, que foram atenuadas mas ainda são invasivas. E- xemplos destes métodos podem ser encontrados na Patente dos Estados Unidos No. 5.824.538 (Branstrom et al); na Patente dos Estados Unidos No. 5.877.159 (Powell, et al.); na Patente dos Estados Unidos No. 6.150.170 (Powell, et al.); na Patente dos Estados Unidos No. 6.500.419 (Hone, et al.); e na Patente dos Estados Unidos No. 6.682.729 (Powell, et al.).

Alternativamente, os polinucleotídeos desta invenção podem ser colocados em alguns vírus os quais agem como um vetor. Vetores virais po- dem ou expressar as proteínas desta invenção sobre a superfície do vírus, ou carregar polinucleotídeos desta invenção em um célula animal onde o polinucleotídeo é transcrito e traduzido em uma proteína. O animal infectado com os vetores virais podem desenvolver uma reação imune para as proteí- nas codificadas pelos polinucleotídeos desta invenção. Deste modo pode-se aliviar ou prevenir uma infecção por B. pilosicoli no animal o qual recebeu os vetores virais. Exemplos de vetores virais podem ser encontrados na Paten- te dos Estados Unidos No. 5.283.191 (Morgan et al.); na Patente dos Esta- dos Unidos No. 5.554.525 (Sondermeijer et al) e na Patente dos Estados Unidos No. 5.712.118 (Murphy).

O polinucleotídeo da invenção pode ser usado para causar ex- pressão e superexpressão de um polipeptídeo da invenção em células pro- pagadas em cultura, por exemplo, para produzir proteínas ou polipeptídeos, incluindo proteínas de fusão ou polipeptídeos.

Esta invenção diz respeito a uma célula hospedeira transfectada com um gene recombinante de modo a expressar um polipeptídeo da inven- ção. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucarióti- ca. Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser expressado em cé- lulas bacterianas, tais como E. coli, células de inseto (baculovirus), células de levedura, de plantas, ou de mamíferos. Nos casos quando a célula hos- pedeira é humana, pode estar ou não em um sujeito vivo. Outras células hospedeiras adequadas são de conhecimento daqueles versados na técnica. Adicionalmente, a célula hospedeira pode ser suplementada com moléculas de tRNA não tipicamente encontradas no hospedeiro de modo a otimizar a expressão do polipeptídeo. Alternativamente, a seqüência de nucleotídeo pode ser alterada para otimizar a expressão na célula hospedeira, contudo a proteína produzida teria alta homologia com a proteína originalmente codifi- cada. Outros métodos adequados para maximizar a expressão do polipeptí- deo serão de conhecimento daqueles versados na técnica.

A presente invenção adicionalmente diz respeito a métodos para produzir os polipeptídeos da invenção. Por exemplo, uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão codificando um polipeptídeo da invenção pode ser cultivada sob condições apropriadas para permitir que ocorra a expressão do polipeptídeo. O polipeptídeo pode ser secretado e isolado de uma mistura de células e meio contendo o polipeptídeo. Alternati- vãmente, o polipeptídeo pode ser retido citoplasmicamente e as células co- lhidas, Iisadas e a proteína isolada.

Uma cultura celular inclui células hospedeiras, meio e outros subprodutos. Meios adequados para cultura celular são de conhecimento geral na técnica. O polipeptídeo pode ser isolado do meio da cultura celular, das células hospedeiras, ou ambos usando técnicas conhecidas na arte para purificar proteínas, incluindo cromatografia de permuta iônica, cromatografia de filtração por gel, ultrafiltração, eletroforese, e purificação por imunoafini- dade com anticorpos específicos para epítopes particulares de um polipeptí- deo da invenção.

Portanto, uma seqüência de nucleotídeo codificando toda ou uma porção selecionada do polipeptídeo da invenção, pode ser usada para produzir uma forma recombinante da proteína através de processos celula- res microbianos ou eucarióticos. Ligação da seqüência em um constructo de polinucleotídeo, tal como um vetor de expressão, e transformação ou trans- fecção em hospedeiros, quer eucarióticos (células de levedura, avícolas, de inseto ou de mamífero) ou procarióticos (células bacterianas), são procedi- mentos de rotina. Procedimentos similares, ou modificações dos mesmos, podem ser empregados para preparar polipeptídeos recombinantes da in- venção por meios microbianos ou tecnologia de cultura de tecido.

Vetores adequados para a expressão de um polipeptídeo da in- venção incluem plasmídeos dos tipos: plasmídeos derivados de pTrcHis, plasmídeos derivados de pET, plasmídeos derivados de pBR322, plasmí- deos derivados de pEMBL, plasmídeos derivados de pEX, plasmídeos deri- vados de pBTac e plasmídeos derivados de pUC para expressão em células procarióticas, tais como E. coli. Os vários métodos empregados na prepara- ção dos plasmídeos e transformação de organismos hospedeiros são de conhecimento geral na técnica. Para outros sistemas de expressão adequa- dos para tanto células procarióticas quanto eucarióticas, bem como proce- dimentos recombinantes gerais, vide Molecular Cloning, A Laboratory Manu- al, 2nd Ed., ed. por Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor La- boratory Press, 1989) Capítulos 16 e 17.

Seqüências codificantes para um polipeptídeo de interesse po- dem ser incorporadas como uma parte de um gene de fusão incluindo uma seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo diferente. A presente invenção contempla um polinucleotídeo isolado contendo um ácido nucléico da invenção e no mínimo uma seqüência heteróloga codificando um peptí- deo heterólogo encadeado in-frame à seqüência de nucleotídeo do ácido nucléico da invenção de modo a codificar uma proteína de fusão contendo o polipeptídeo heterólogo. O polipeptídeo heterólogo pode ser fundido a (a) o C-término do polipeptídeo da invenção, (b) o N-término do polipeptídeo da invenção, ou (c) o C-término e o N-término do polipeptídeo da invenção. Em alguns casos, a seqüência heteróloga codifica um polipeptídeo permitindo a detecção, o isolamento, solubilização e/ou estabilização do polipeptídeo ao qual é fundida. Em ainda outras modalidades, a seqüência heteróloga codifi- ca um polipeptídeo tal como uma poly His tag, myc, HA, GST, proteína A, proteína G, peptídeo de ligação de calmodulina, tioredoxina, proteína de Ii- gação de maltose, poly arginina, poly His-Asp, FLAG, uma porção de uma proteína imunoglobulina, e um peptídeo de transcitose.

Sistemas de expressão de fusão podem ser úteis quando é de- sejável produzir um fragmento imunogênico de um polipeptídeo da invenção.

Por exemplo, a proteína do capsídeo VP6 de rotavírus pode ser usada como uma proteína de carregador imunológico para porções de polipeptídeo, quer na forma monomérica ou sob a forma de uma partícula viral. As seqüências de ácidos nucléicos correspondentes à porção de um polipeptídeo da inven- ção ao qual anticorpos devem ser cultivados podem ser incorporados em um constructo de gene de fusão o qual inclui seqüências codificantes para uma proteína estrutural de vírus de vaccinia tardia para produzir uma série de vírus recombinantes expressando proteínas de fusão compreendendo uma porção de a proteína como parte do vírion. O antígeno de superfície de he- patite B também pode ser utilizado neste papel do mesmo modo. Do mesmo modo, constructos quiméricos codificando para proteínas de fusão contendo uma porção de um polipeptídeo da invenção e a proteína do capsídeo de poliovírus podem ser criadas para reforçar a imunogenicidade (vide, por e- xemplo, a Publicação de Patente Européia EP NO: 0259149; e Evans et al., (1989) Nature 339:385; Huang et al., (1988) J. Viroi 62:3855; e Schlienger et al., (1992) J. ViroL 66:2).

Proteínas de fusão podem facilitar a expressão e/ou purificação de proteínas. Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser produzido como uma proteína de fusão glutationa-S-transferase (GST). As proteínas de fusão GST referidas podem ser usadas para simplificar a purificação de um polipeptídeo da invenção, tal como através do uso de matrizes derivadas de glutationa (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)). Em outra modalidade, um gene de fusão codificando para uma seqüência Iider de purificação, tal como uma poly-(His)/seqüência de sítio de clivagem de enteroquinase no N- término da porção desejada da proteína recombinante, pode permitir a purifi- cação da proteína de fusão expressada por cromatografia por afinidade u- sando uma resina metálica Ni2+. A seqüência líder de purificação pode ser então subseqüentemente removida por tratamento com enteroquinase para proporcionar a proteína purificada (por exemplo, vide Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411: 177; e Janknecht et al., PNAS USA 88:8972). São de conhecimento geral técnicas para fabricar genes de fu- são. Essencialmente, a junção de vários fragmentos de DNA codificando para diferentes seqüências de polipeptídeos é realizada de acordo com téc- nicas convencionais, empregando términos de extremidade cega ou de ex- tremidade em ziquezague para ligação, digestão por enzima de restrição para proporcionar términos apropriados, preenchimento de extremidades coesivas conforme apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar junção indesejável, e ligação enzimática. Em outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizado- res de DNA automatizados. Alternativamente, amplificação por PCR de fragmentos genéticos pode ser realizada usando primers de âncora os quais dão origem a projeções complementares entre dois fragmentos genéticos consecutivos os quais podem ser subseqüentemente anelados para produzir uma seqüência genética quimérica (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).

Em outras modalidades, a invenção proporciona ácidos nucléi- cos da invenção imobilizados sobre uma superfície sólida, incluindo, lâmi- nas, lâminas de microtítulo, slides, contas, partículas, esferas, filmes, fila- mentos, precipitados, géis, chapas, túbulo, recipientes, capilares, pads, es- pátulas, e etc. Os ácidos nucléicos da invenção podem ser imobilizados so- bre um chip como parte de um array. O array pode conter um ou mais poli- nucleotídeos da invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em uma modalidade, o chip contém um ou mais polinucleotídeos da invenção como parte de um array de seqüências de polinucleotídeos da mesma espécie patogênica que o referido um ou mais polinucleotídeos.

Em uma forma preferencial da invenção são proporcionados po- lipeptídeos de B. pilosicoli isolados conforme descrito aqui, neste requeri- mento de patente, e também as seqüências de polinucleotídeos codificando estes polipeptídeos. Mais desejavelmente os polipeptídeos de B. pilosicoli são proporcionados em forma substancialmente purificada.

Polipeptídeos preferenciais da invenção terão uma ou mais pro- priedades biológicas (por exemplo, in vivo, in vitro ou propriedades imunoló- gicas) do polipeptídeo de extensão total nativo. Polipeptídeos não funcionais também estão incluídos dentro do âmbito da invenção porque podem ser úteis, por exemplo, como antagonistas dos polipeptídeos funcionais. As pro- priedades biológicas de análogos, fragmentos, ou derivados relativos a sel- vagens podem ser determinadas, por exemplo, por meio de testes biológicos.

Polipeptídeos, incluindo análogos, fragmentos e derivados, po- dem ser preparados sinteticamente (por exemplo, usando as técnicas de conhecimento geral de fase sólida ou síntese de peptídeo de fase de solu- ção). Preferencialmente, são empregadas técnicas sintéticas de fase sólida.

Alternativamente, os polipeptídeos da invenção podem ser preparados u- sando técnicas de engenharia genética de conhecimento geral, conforme descrito abaixo. Em ainda outra modalidade, os polipeptídeos podem ser purificados (por exemplo, por purificação por imunoafinidade) a partir de um fluido biológico, tal como mas não limitado a plasma, fezes, soro, ou urina de animais, incluindo, mas não limitados a, porco, frango, ganso, pato, peru, periquito, humano, macaco, cão, gato, cavalo, hamster, gerbo, coelho, furão, cavalo, gado vacuum, e ovelha. Um animal pode ser qualquer mamífero, peixe, ou ave.

Os análogos de polipeptídeos de B. pilosicoli incluem os polipep- tídeos tendo a seqüência de aminoácido, em que um ou mais dos aminoáci- dos são substituídos com outro aminoácido cujas substituições não alteram substancialmente a atividade biológica da molécula.

De acordo com a invenção, os polipeptídeos da invenção produ- zidos de modo recombinante ou por síntese química e fragmentos ou outros derivados ou análogos dos mesmos, incluindo proteínas de fusão, podem ser usados como um imunogênio para produzir anticorpos que reconhecem os polipeptídeos.

Uma molécula é "antigênica" quando é capaz de interagir especi- ficamente com uma molécula de reconhecimento de antígeno do sistema imune, tal como uma imunoglobulina (anticorpo) ou receptor de antígeno de células T. Uma seqüência de aminoácidos antigênica contém no mínimo cerca de 5, e preferencialmente no mínimo cerca de 10, aminoácidos. Uma porção antigênica de uma molécula pode ser a porção que é imunodominan- te para anticorpo ou reconhecimento de receptor de células T, ou pode ser uma porção usadas para produzir um anticorpo para a molécula conjugando a porção antigênica a uma molécula de carregador para imunização. Uma molécula que é antigênica não precisa ser a própria imunogênica, isto é, ca- paz de provocar uma reação imune sem um carregador.

Um "anticorpo" é qualquer imunoglobulina, incluindo anticorpos e fragmentos dos mesmos, que liga um epítope específico. O termo engloba anticorpos policlonais,. monoclonais, e quiméricos, o último mencionado des- crito em mais detalhes nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.816.397 e 4.816.567, bem como porções de ligação de antígeno de anticorpos, incluin- do Fab, F(ab')2 e F(v) (incluindo anticorpos de cadeia única). Por conseguin- te, a expressão "molécula de anticorpo" em suas várias formas gramaticais conforme usado aqui, neste requerimento de patente, contempla tanto uma molécula de imunoglobulina intacta quanto uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina contendo o sítio de combinação de anticorpo. Um "sítio de combinação de anticorpo" é a porção estrutural de uma molécula de anticorpo consitindo de regiões variáveis de cadeia pesada e leve e hipervariáveis que liga especificamente um antígeno.

Moléculas de anticorpos típicas são moléculas de imunoglobuli- na intactas, substancialmente moléculas de imunoglobulina intactas e as porções de uma molécula de imunoglobulina que contém o parátope, inclu- indo as porções conhecidas na técnica como Fab, Fab', F(ab')2 e F(v), cujas porções são preferenciais para uso nos métodos terapêuticos descritos aqui, neste requerimento de patente.

Porções Fab e F(ab')2 de moléculas de anticorpos são prepara- das pela reação proteolítica de papaína e pepsina, respectivamente, sobre moléculas de anticorpos substancialmente intactas por métodos que são de conhecimento geral. Vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 4.342.566 para Theofilopolous et al. Porções de moléculas de anticorpos Fab' também são de conhecimento geral e são produzidas a partir de por- ções F(ab')2 seguidas por redução com mercaptoetanol das ligações dissul- feto encadeando as duas porções de cadeia pesada, e seguida por alquila- ção da proteína resultante mercaptan com um reagente tal como iodoaceta- mida. Um anticorpo contendo moléculas de anticorpos intactas é preferencial aqui, neste requerimento de patente.

A expressão "anticorpo monoclonal" em suas várias formas gra- maticais se refere a um anticorpo tendo somente uma espécie de sítio de combinação de anticorpo capaz de imunorreagir com um antígeno particular.

Um anticorpo monoclonal portanto tipicamente apresenta uma única afinida- de de ligação para qualquer antígeno com o qual imunorreage. Um anticorpo monoclonal portanto pode conter uma molécula de anticorpo tendo uma plu- ralidade de sítios de combinação de anticorpo, cada um imunoespecífico para um antígeno diferente; por exemplo, um anticorpo monoclonal biespecí- fico (quimérico).

O termo "adjuvante" se refere a um composto ou mistura que reforça a reação imune para um antígeno. Um adjuvante pode servir como um depósito de tecido que libera lentamente o antígeno e também como um ativador de sistema linfóide que reforça não especificamente a reação imune [Hood et aí., in Immunology, p. 384, Second Ed., Benjamin/Cummings, Men- lo Park, Califórnia (1984)]. Freqüentemente, um teste primário com um antí- geno somente, na ausência de um adjuvante, não terá êxito para provocar uma reação imune humoral ou celular. Adjuvantes incluem, mas não estão limitadas a, adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, saponina, géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias surfa- tantes tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emul- sões de óleos ou hidrocarbonetos, hemocianinas de lampreia de Fissurella, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (ba- cilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Preferencialmente, o adju- vante é farmaceuticamente aceitável.

Vários procedimentos conhecidos na técnica podem ser usados para a produção de anticorpos policlonais para os polipeptídeos da inven- ção. Para a produção de anticorpo, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injeção com o polipeptídeo da invenção, incluindo mas não limitada a coelhos, camundongos, ratos, ovelhas, cabras, e etc. Em uma modalidade, um polipeptídeo da invenção pode ser conjugado a um carre- gador imunogênico, por exemplo, albumina sérica bovina (BSA) ou hemoci- anina de lampreia de Fissurella (KLH). Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a reação imunológica, dependendo da espécie hospedeira, incluindo mas não limitados a adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias surfatantes tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianinas de lampreia de Fissurella, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo Calmette-Gueriri) e Corynebac- terium parvum.

Para preparação de anticorpos monoclonais dirigidos para um polipeptídeo da invenção, pode ser usada qualquer técnica que proporciona a produção de moléculas de anticorpos por linhagens celulares contínuas em cultura. Estas incluem mas não est ão limitadas à técnica do hibridoma desenvolvida originalmente por Kohler et ai, (1975) Nature, 256:495-497, à técnica do trioma, à técnica do hibridoma de células B humanas [Kozbor et ai, (1983) Immunology Today, 4:72], e à técnica do EBV-hibridoma para produzir anticorpos monoclonais humanos [Cole et ai, (1985) in Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc.]. Linhagens celulares produtoras de anticorpos imortais podem ser criadas por técnicas diferentes de fusão, tais como transformação direta de linfócitos B com DNA oncogênico, ou transfecção com vírus Epstein-Barr. Vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.451.570; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632; e 4,493,890.

Em uma modalidade adicional da invenção, anticorpos monoclo- nais podem ser produzidos em animais germ-free utilizando tecnologia re- cente. De acordo com a invenção, anticorpos de frango ou suíno podem ser usados e podem ser obtidos usando hibridomas de frango ou suíno ou trans- formando células B com vírus de EBV in vitro. De fato, de acordo com a in- venção, podem ser usadas técnicas desenvolvidas para a produção de "anti- corpos quiméricos" [Morrison et ai, (1984) J. Bacteriol., 159-870; Neuberger et al, (1984) Nature, 312:604-608; Takeda et al, (1985) Nature, 314:452-454] unindo os genes de uma molécula de anticorpo de camundon- go específica para um polipeptídeo da invenção junto com genes de uma molécula de anticorpo de atividade biológica apropriada; os anticorpos refe- ridos estão dentro do âmbito desta invenção. Os anticorpos quiméricos refe- ridos são preferenciais para uso em terapia de doenças ou distúrbios intesti- nais (descritos abaixo), uma vez que os anticorpos são muito menos prová- veis do que anticorpos xenogênicos para induzir uma reação imune, em par- ticular uma reação alérgica, sozinhos.

De acordo com a invenção, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (Patente dos Estados Unidos No. 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única específicos para um polipeptídeo da invenção. Uma modalidade adicional da invenção utiliza as técnicas descritas para a construção de bibliotecas de expressão Fab [Huse et al, (1989) Science, 246:1275-1281] para permitir identificação rápida e fácil de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada para um polipeptídeo da invenção.

Fragmentos de anticorpos, os quais contêm o idiotipo da molé- cuia de anticorpo, podem ser produzidos por técnicas conhecidas. Por e- xemplo, os fragmentos referidos incluem mas não estão limitados a: o frag- mento F(ab')2 o qual pode ser produzido por digestão por pepsina da molé- cula de anticorpo; os fragmentos Fab1 os quais podem ser gerados reduzindo as pontes dissulfeto do fragmento F(ab')2, e os fragmentos Fab os quais po- dem ser gerados tratando a molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor.

Na produção de anticorpos, triagem para o anticorpo desejado pode ser realizada por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, radioimu- noensaio, ELISA, imunoensaios "sanduíche", ensaios imunorradiométricos, reações de difusão do gel-precipitina (gel-diffusion-precipitirí), ensaios de imunodifusão, imunoensaios in situ (usando ouro coloidal, etiquetas enzimá- ticas ou de radioisótopos, por exemplo), Western blots, reações de precipita- ção, testes de aglutinação (por exemplo, testes de aglutinação de gel, testes de hemaglutinação), testes de fixação do complemento, ensaios de imuno- fluorescência, testes de proteína A, ensaios de imunoeletroforese, e etc. Em uma modalidade, a ligação de anticorpo é detectada detectando uma etique- ta sobre o anticorpo primário. Em outra modalidade, o anticorpo primário é detectado detectando ligação de um anticorpo secundário ou reagente para o anticorpo primário. Em uma modalidade adicional, o anticorpo secundário é etiquetado. Muitos meios são conhecidos na técnica para detectar ligação em um imunoensaio e estão dentro do âmbito da presente invenção. Por exemplo, para selecionar anticorpos que reconhecem um epítope específico de um polipeptídeo da invenção, pode-se testar hibridomas gerados para um produto que liga a um fragmento de um polipeptídeo da invenção contendo o epítope referido.

A invenção também cobre métodos de diagnóstico e prognóstico para detectar a presença de B. pilosicoli usando um polipeptídeo da inven- ção e/ou anticorpos os quais ligam ao polipeptídeo da invenção e kits úteis para diagnóstico e prognóstico de infecções por B. pilosicoli.

Métodos de diagnóstico e prognóstico geralmente serão condu- zidos usando uma amostra biológica obtida de um animal, tal como frango ou suíno. Uma "amostra" se refere a tecido ou fluido de um animal suspeito de conter uma espécie de Brachyspira, tal como B. pilosicoli, ou seus polinu- cleotídeos ou seus polipeptídeos. Exemplos de semelhante tecido ou fluidos incluem, mas não estão limitados a, plasma, soro, material fecal, urina, pul- mão, coração, músculo esquelético, estômago, intestinos, e constituintes de cultura celular in vitro.

A invenção proporciona métodos para detectar a presença de um polipeptídeo da invenção em uma amostra, com as seguintes etapas: (a) contactar uma amostra suspeita de conter um polipeptídeo da invenção com um anticorpo (preferencialmente ligado a um suporte sólido) que especifica- mente liga ao polipeptídeo da invenção sob condições as quais possibilitam a formação de complexos de reação compreendendo o anticorpo e o poli- peptídeo da invenção; e (b) detectar a formação de complexos de reação compreendendo o anticorpo e polipeptídeo da invenção na amostra, em que detecção da formação de complexos de reação indica a presença de o poli- peptídeo da invenção na amostra.

Preferencialmente, o anticorpo usado neste método é derivado de um anticorpo policlonal purificado por afinidade, e mais preferencialmente um anticorpo monoclonal. Além disso, é preferencial para as moléculas de anticorpos usadas aqui, neste requerimento de patente, estar sob a forma de porções Fab, Fab', F(ab')2 ou F(v) ou moléculas de anticorpos inteiras.

Métodos particularmente preferenciais para detectar B. pilosicoli com base no método acima incluem ensaios imunossorventes ligados a en- zimas, radioimunoensaios, ensaios imunorradiométricos e ensioa imunoen- zimáticos, incluindo ensaios de sanduíche usando anticorpos monoclonais e/ou policlonais.

Três procedimentos semelhantes que são especialmente úteis utilizam qualquer polipeptídeo da invenção (ou um fragmento do mesmo) marcado com uma etiqueta detectável, anticorpo Abi marcado com uma eti- queta detectável, ou anticorpo Ab2 marcado com uma etiqueta detectável. Os procedimentos podem ser resumidos pelas seguintes equações em que o asterisco indica que a partícula é marcada e "AA" significa o polipeptídeo da invenção:

A. AA* + Abi = AAiAb1

B. AA +Abi1 =AA Ab1*

C. AA + Ab1 + Ab2* = Ab1 AA Ab2*

Os procedimentos e sua aplicação são todos familiares para os versados na técnica e por conseguinte podem ser utilizados dentro do âmbi- to da presente invenção. O procedimento "competitivo", Procedimento A, é descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 3.654.090 e 3.850.752. O Procedimento B é representativo de técnicas de testes competitivos de co- nhecimento geral. O Procedimento C, o procedimento de "sanduíche", é descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nos. RE 31.006 e 4.016.043. Ain- da outros procedimentos são conhecidos, tais como o procedimento de "du- plo anticorpo" ou "DASP", e podem ser usados. Em cada caso, o polipeptídeo da invenção forma complexos com um ou mais anticorpos ou parceiros de ligação e um membro do complexo é marcado com uma etiqueta detectável. O fato de que se formou um comple- xo e, caso desejado, a quantidade do mesmo, pode ser determinada por mé- todos conhecidos aplicáveis para a detecção de etiquetas.

Será previsto a partir do acima, que uma propriedade caracterís- tica de Ab2 é que reagirá com Ab1. Esta reação é porque Ab1, cultivado em uma espécie mamífera, foi usado em outra espécie como um antígeno para cultivar o anticorpo, Ab2. Por exemplo, Ab2 pode ser cultivado em cabras u- sando anticorpos de coelho como antígenos. Portanto Ab2 seria o anticorpo anti-coelho cultivado em cabras. Para os fins desta descrição e reivindica- ções, Ab1 será referido como um anticorpo primário, e Ab2 será referido co- mo um anticorpo secundário ou anti-Ab-1.

As etiquetas mais comumente empregadas para estes estudos são elementos radioativos, enzimas, produtos químicos que fluorescem quando expostos à luz ultravioleta, e outros. Exemplos de materiais fluores- centes capazes de serem utilizados como etiquetas incluem fluoresceína, rodamina e auramina. Um material de detecção em particular é anticorpo anti-coelho preparado em cabras e conjugado com fluoresceína através de um isotiocianato. Exemplos de isótopo preferencial incluem 3H1 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, e 186Re. A etiqueta radioativa pode ser detectada por qualquer um dos procedimentos de contagem atualmente disponíveis. Enquanto muitas enzimas podem ser usadas, exemplos de en- zimas preferenciais são peroxidase, β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, glucose oxidase mais peroxidase e fosfatase al- calina. Enzimas são conjugadas à partícula selecionada por reação com mo- léculas de ligação por ponte tais como carbodiimidas, diisocianatos, glutaral- deído e semelhantes. Etiquetas enzimáticas podem ser detectadas por quaisquer das técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectro- fotométricas, amperométricas ou gasométricas atualmente utilizadas. As Pa- tentes dos Estados Unidos Nos. 3.654.090; 3.850.752; e 4.016.043 são refe- ridas a título de exemplo por sua revelação de material e métodos de marca; ção alternativos.

A invenção também proporciona um método para detectar anti- corpos para um polipeptídeo da invenção em amostras biológicas, usando as seguintes etapas: (a) proporcionar um polipeptídeo da invenção ou um fragmento do mesmo; (b) incubar uma amostra biológica com o referido poli- peptídeo da invenção sob condições as quais possibilitam a formação de um complexo antígeno-anticorpo; e (c) determinar se é formado um complexo antígeno-anticorpo com o polipeptídeo da invenção.

Em outra modalidade da invenção são proporcionados métodos in vitro para avaliar o nível de anticorpos para um polipeptídeo da invenção em uma amostra biológica usando as seguintes etapas: (a) detectar a for- mação de complexos da reação em uma amostra biológica de acordo com o método mencionado acima; e (b) avaliar a quantidade de complexos da rea- ção formados, cuja quantidade de complexos da reação corresponde ao ní- vel de polipeptídeo da invenção na amostra biológica.

Além disso são proporcionados métodos in vitro para monitorar o tratamento terapêutico de uma doença associada com B. pilosicoli em um hospedeiro animal avaliando, conforme descrito acima, os níveis de anticor- pos para um polipeptídeo da invenção em uma série de amostras biológicas obtidas em diferentes pontos de tempo a partir de um hospedeiro animaj submetido ao referido tratamento terapêutico.

A presente invenção adicionalmente proporciona métodos para detectar a presença ou ausência de B. pilosicoli em uma amostra biológica:

(a) trazendo a amostra biológica em contato com uma sonda de polinucleotí- deos ou primer de polinucleotídeo da invenção sob condições de hibridiza- ção adequadas; e (b) detectando qualquer duplex formado entre a sonda ou primer e ácido nucléico na amostra.

De acordo com uma modalidade da invenção, a detecção de B. pilosicoli pode ser realizada amplificando diretamente seqüências de polinu- cleotídeos da amostra biológica, usando técnicas conhecidas e em seguida detectando a presença de polinucleotídeo da invenção seqüências.

Em uma forma da invenção, a seqüência de ácido nucléico alvo é amplificada por PCR e em seguida detectada usando qualquer um dos métodos específicos mencionados acima. Outras técnicas de diagnóstico úteis para detectar a presença de seqüências de polinucleotídeos incluem, mas não estão limitadas a: 1) PCR alelo-específica; 2) análise de conforma- ção de filamento único; 3) eletroforese por gel de gradiente desnaturante; 4) ensaios de proteção de RNase; 5) o uso de proteínas as quais reconhecem combinações incompletas de nucleotídeos, tais como a proteína de E. coli mutS; 6) oligonucleotídeos alelo-específicos; e 7) hibridização in situ fluorescente.

Além dos métodos acima, seqüências de polinucleotídeos po- dem ser detectadas usando tecnologia de sonda convencional. Quando são usadas sondas para detectar a presença das seqüências de polinucleotídeos desejadas, a amostra biológica a ser analisada, tal como sangue ou soro, pode ser tratada, caso desejado, para extrair os ácidos nucléicos. As se- qüências de polinucleotídeos da amostra podem ser preparadas em vários modos para facilitar a detecção da seqüência alvo; por exemplo, desnatura- ção, digestão de restrição, eletroforese ou dot blotting. A região alvo da se- qüência de polinucleotídeo da amostra geralmente deve ser no mínimo par- cialmente de filamento único para formar híbridos com a seqüência de dire- cionamento (targeting sequence) da sonda. Se a seqüência for naturalmente de filamento único, não será necessária desnaturação. No entanto, se a se- qüência for de filamento duplo, a seqüência provavelmente precisará ser desnaturada. Pode ser realizada desnaturação por várias técnicas conheci- das na arte.

Seqüências de polinucleotídeos da amostra e sondas são incu- badas sob condições que promovem formação de híbridos estáveis da se- qüência alvo na sonda com a seqüência de polinucleotídeo desejada putati- va na amostra. Preferencialmente, condições de alta estringência são usa- das de modo a prevenir falsos positivos.

Detecção, se houver, do híbrido resultante é geralmente realiza- da pelo uso de sondas marcadas. Alternativamente, a sonda pode ser não marcada, mas pode ser detectável por ligação específica com um Iigante que é marcado, quer diretamente ou indiretamente. Etiquetas e métodos a- dequados para marcar sondas e Iigantes são conhecidos na técnica, e inclu- em, por exemplo, etiquetas radioativas as quais podem ser incorporadas por métodos conhecidos (por exemplo, nick-translation, priming aleatório ou ki- nasing), biotina, grupamentos fluorescentes, grupamentos quimiluminescen- tes (por exemplo, dioxetanos, particularmente dioxetanos engatilhados), en- zimas, anticorpos e semelhantes. Variações deste esquema básico são co- nhecidas na técnica, e incluem as variações que facilitam a separação dos híbridos a serem detectados de materiais extrínsecos e/ou que amplificam o sinal da porção marcada.

Também é contemplado dentro do âmbito desta invenção que os testes de sondas de ácido nucléico desta invenção possam empregar um coquetel de sondas de ácido nucléico capaz de detectar as seqüências de polinucleotídeos desejadas desta invenção. Portanto, em um exemplo para detectar a presença de seqüências de polinucleotídeos desta invenção em uma amostra celular, é empregada mais de uma sonda complementar a al- gumas seqüências de polinucleotídeos e em particular o número de diferen- tes sondas é alternativamente 2, 3, ou 5 seqüências de sondas de ácidos nucléicos diferentes.

As seqüências de polinucleotídeos descritas aqui, neste reque- rimento de patente, (preferencialmente sob a forma de sondas) também po- dem ser imobilizadas a um suporte de fase sólida para a detecção de espé- cies de Brachyspira, inclusive mas não limitado a B. hyodysenteríae, B, in- termedia, B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii, e B. pilosicoli.

Alternativamente as seqüências de polinucleotídeos descritas aqui, neste requerimento de patente, formarão parte de uma biblioteca de moléculas de DNA que podem ser usadas para detectar simultaneamente uma série de diferentes genes de espécies de Brachyspira, tais como B. pilosicoli. Em uma forma alternatica adicional da invenção seqüências de polinucleotídeos descritas aqui, neste requerimento de patente, junto com outras seqüências de polinucleotídeos (tal como de outras bactérias ou vírus) podem ser imobi- lizadas sobre um suporte sólido de uma maneira tal permitindo identificação da presença de uma espécie de Brachyspira, tal como B. pilosicoli e/ou qualquer uma das outras seqüências de polinucleotídeos ligadas sobre o suporte sólido.

Foram descritas na arte técnicas para produzir bibliotecas imobi- lizadas de moléculas de DNA. Geralmente, a maior parte dos métodos da técnica anterior descrevem a síntese de bibliotecas de moléculas de ácido nucléico de filamento único, usando, por exemplo, técnicas de mascaramen- to para construir várias permutações de seqüências nas várias posições dis- tintas sobre o substrato sólido. A Patente dos Estados Unidos No. 5.837.832 descreve um método aperfeiçoado para produzir séries de DNA imobilizado para substratos de silício à base de tecnologia de integração em escala mui- to grande. Em particular, a Patente dos Estados Unidos No. 5.837.832 des- creve uma estratégia denominada "tiling" para sintetizar séries específicas de sondas em localizações definidas espacialmente sobre um substrato que pode ser usado para produzir as bibliotecas de DNA imobilizado da presente invenção. A Patente dos Estados Unidos No. 5.837.832 também proporciona referências para técnicas anteriores que também podem ser usadas. Portan- to podem ser sintetizadas sondas de seqüências de polinucleotídeos in situ sobre a superfície do substrato.

Alternativamente, moléculas de filamento único podem ser sinte- tizadas do substrato sólido e cada seqüência pré-formada aplicada a uma posição distinta sobre o substrato sólido. Por exemplo, seqüências de poli- nucleotídeos podem ser impressas diretamente sobre o substrato usando dispositivos robóticos equipados com quer dispositivos pins ou pizo-elétricos.

As seqüências das bibliotecas são tipicamente imobilizadas so- bre ou em regiões distintas de um substrato sólido. O substrato pode ser poroso para permitir imobilização dentro do substrato ou substancialmente não poroso, em cujo caso as seqüências da biblioteca são tipicamente imo- bilizadas sobre a superfície do substrato. O substrato sólido pode ser feito de qualquer material ao qual polipeptídeos podem ligar, quer diretamente ou indiretamente. Exemplos de substratos sólidos adequados incluem vidro la- minado, pastilhas de silício, mica, cerâmicas e polímeros orgânicos tais co- mo plásticos, incluindo poliestirenoe polimetacrilato. Também pode ser pos- sível usar membranas semi-permeáveis tais como membranas de nitrocelu- lose ou nylon, as quais estão amplamente disponíveis. As membranas semi- permeáveis podem ser montadas sobre uma superfície sólida mais robusta tal como vidro. As superfícies podem ser opcionalmente revestidas com uma camada de metal, tal como ouro, platina ou outro metal de transição.

Preferencialmente, o substrato sólido é geralmente um material tendo uma superfície rígida ou semi-rígida. Em modalidades preferenciais, no mínimo uma superfície do substrato será substancialmente plana, embora em algumas modalidades possa ser desejável separar fisicamente regiões de síntese para diferentes polímeros com, por exemplo, regiões aumentadas ou sulcos cauterizados. É também preferencial que o substrato sólido seja adequado para a aplicação de seqüências de DNA de alta densidade em áreas distintas de tipicamente a patrir de 50 a 100 pm, dando uma densida- de de 10000 a 40000 pontos/cm"2.

O substrato sólido é convenientemente dividido em seções. Isto pode ser realizado por técnicas tais como fotocauterização, ou pela aplica- ção de tintas hidrofóbicas, por exemplo tintas à base de teflon (Cel-line, EU-A).

Posições distintas, nas quais cada membro diferente da bibliote- ca está localizado podem ter qualquer forma conveniente, por exemplo, cir- cular, retangular, elíptica, em forma de cunha, e etc.

A fixação das seqüências de polinucleotídeos ao substrato pode ser por meios covalentes ou não covalentes. As seqüências de polinucleotí- deos podem ser fixadas ao substrato através de uma camada de moléculas à qual ligam as seqüências da biblioteca. Por exemplo, as seqüências de polinucleotídeos podem ser marcadas com biotina e o substrato revestido com avidina e/ou estreptavidina. Uma característica conveniente para usar seqüências de polinucleotídeos biotinilados é que a eficiência de acoplamen- to ao substrato sólido pode ser facilmente determinada. Como as seqüências de polinucleotídeos podem ligar somente fracamente a alguns substratos sólidos, freqüentemente é necessário proporcionar uma interface química entre o substrato sólido (tal como no caso de vidro) e as seqüências de áci- dos nucléicos. Exemplos de interfaces químicas adequadas incluem hexaeti- leno glicol. Outro exemplo é o uso de vidro revestido de polilisina, a polilisina sendo então quimicamente modificada usando procedimentos de rotina para introduzir um ligante de afinidade. Outros métodos para fixar moléculas às superfícies de substrato sólido pelo uso de agentes de acoplamento são co- nhecidos na técnica, vide, por exemplo, a publicação de patente internacio- nal No. W098/49557.

A ligação de seqüências de polinucleotídeos complementares à biblioteca de ácidos nucléicos imobilizados pode ser determinada por uma variedade de meios tais como alterações nas características óticas da se- qüência de polinucleotídeo ligada (isto é pelo uso de brometo de etídio) ou pelo uso de ácidos nucléicos marcados, tais como polipeptídeos marcados com fluoróforos. Outras técnicas de detecção que não requerem o uso de etiquetas incluem técnicas óticas tais como optoacústica, reflectometria, e- lipsometria e ressonância de plasmon superficial (vide a publicação de pa- tente internacional No. W097/49989).

Portanto, a presente invenção proporciona um substrato sólido tendo imobilizado sobre o mesmo no mínimo um polinucleotídeo da presente invenção, preferencialmente duas ou mais diferentes seqüências de polinu- cleotídeos da presente invenção.

A presente invenção também pode ser usada como um profiláti- co ou terapêutico, o qual pode ser utilizado para o fim de estimular reações mediadas por células e humorais em animais, tais como frangos e suínos, deste modo proporcionando proteção contra colonização com espécies de Brachyspira, inclusive mas não limitadas a B. hyodysenteriae, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innoceris, B. murdochii, e B. pilosicoli. Infecção natural com uma espécie de Brachyspira, tal como B. pilosicoli, induz títulos de anticorpos circulantes contra as proteínas descritas aqui, neste requeri- mento de patente. O animal tratado pode ser qualquer mamífero ou ave, tal como mas não limitado a, frango, ganso, pato, peru, periquito, cão, gato, hamster, gerbo, coelho, furão, cavalo, vaca, ovelha, porco, macaco, e huma- no. Portanto, as seqüências de aminoácidos descritas aqui, neste requeri- mento de patente, ou partes das mesmas, têm o potencial para formar a ba- se de um profilático ou terapêutico administrado sistemicamente ou por via oral para proporcionar proteção contra espiroquetose intestinal.

Por conseguinte, em uma modalidade a presente invenção pro- porciona as seqüências de aminoácidos descritas aqui, neste requerimento de patente, ou fragmentos das mesmas ou anticorpos que ligam as seqüên- cias de aminoácidos ou as seqüências de polinucleotídeos descritas aqui, neste requerimento de patente, em uma quantidade terapeuticamente eficaz misturados com um carregador, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" é usada aqui, neste requerimento de patente, para significar uma quantidade suficiente para reduzir por no mínimo cerca de 15%, preferencialmente por no mínimo 50%, mais preferencialmente por no mínimo 90%, e ainda mais preferenci- almente prevenir, um déficit clinicamente importante na atividade, função e reação do hospedeiro animal. Alternativamente, uma quantidade terapeuti- camente eficaz é suficiente para causar uma melhora em uma condição cli- nicamente importante no hospedeiro animal.

A expressão "farmaceuticamente aceitável" se refere a entidades moleculares e composições que são fisiologicamenta toleráveis e não pro- duzem tipicamente uma reação alérgica ou similarmente desfavorável, tal como indisposição gástrica e semelhantes, quando administradas a um ani- mal. O termo "carregador" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com o qual o composto é administrado. Os carregadores farmacêuti- cos referidos podem ser líquidos estereis, tais como água e óleos, incluindo os de origem vegetal ou sintética, de petróleo, animal, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhantes. Água ou soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol são preferen- cialmente empregadas como carregadores, particularmente para soluções injetáveis. Carregadores farmacêuticos adequados são descritos em Martin, Remington1S Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Eas- ton, ΡΑ, (1990).

Em uma forma mais específica da invenção são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo quantidades terapeuticamente eficazes das seqüências de aminoácidos descritas aqui, neste requerimento de patente, ou um análogo, fragmento ou produto derivado das mesmas ou anticorpos das mesmas junto com diluentes, preservantes, solubilizantes, emulsificantes, adjuvantes e/ou carregadores farmaceuticamente aceitáveis. As composições referidas incluem diluentes de vários teores de tampão (por exemplo, Tris-HCI, acetato, fosfato), pH e força iônica e aditivos tais como detergentes e agentes solubilizantes (por exemplo, Tween 80, Polysorbate 80), anti-oxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), preservantes (por exemplo, Thimersol, álcool benzílico) e substâncias de volume (por exemplo, lactose, manitol). O material pode ser incorporado em preparações de particulados de compostos poliméricos tais como ácido poli- láctico, ácido poliglicólico, e etc. ou em lipossomas. Também pode ser usado ácido hilaurônico. As composições referidas podem influenciar o estado físi- co, estabilidade, índice de liberação in vivo, e índice de clearance in vivo das presentes proteínas e derivados. Vide, por exemplo, Martin, Remington1S Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712 que são aqui, a este requerimento de patente, incorporadas por meio de referência, As composições podem ser preparadas em forma líquida, ou podem estar em pó seco, tal como forma liofilizada.

Alternativamente, os polinucleotídeos da invenção podem ser otimizados para expressão em plantas (por exemplo, milho). A planta pode ser transformada com plasmídeos contendo os polinucleotídeos otimizados. Em seguida a planta é cultivada, e as proteínas da invenção são expressa- das na planta, ou a versão de planta-otimizada é expressada. A planta é co- lhida posteriormente, e a seção da planta contendo as proteínas da invenção é processada em alimento para o animal. Este alimento animal conferirá i- munidade contra B. piiosicoli quando comido pelo animal. Exemplos de téc- nica anterior detalhando estes métodos podem ser encontrados na Patente dos Estados Unidos No. 5.914.123 (Arntzen, et al.); na Patente dos Estados Unidos No. 6.034.298 (Lam, et al.); e na Patente dos Estados Unidos No. 6.136.320 (Arntzen, et al.).

Será reconhecido que composições farmacêuticas proporciona- das de acordo com a invenção podem ser administradas por quaisquer mei- os conhecidos na técnica. Preferencialmente, as composições farmacêuticas para administração são administradas por injeção, por via oral, ou pela via pulmonar, ou nasal. As seqüências de aminoácidos descritas aqui, neste requerimento de patente, ou anticorpos derivados das mesmas são mais preferencialmente liberados por vias de administração intravenosa, intraarte- rial, intraperitoneal, intramuscular, ou subcutânea. Alternativamente, a se- qüência de aminoácido descrita aqui, neste requerimento de patente, ou an- ticorpos derivados da mesma, convenientemente formuladios, podem ser administrados por administração nasal ou oral.

Também englobado pela presente invenção é o uso de seqüên- cias de polinucleotídeos da invenção, bem como seqüências de polinucleotí- deos anti-sentido e de ribozima hibridizáveis a uma seqüência de polinucleo- tídeo codificando uma seqüência de aminoácido de acordo com a invenção, para fabricação de um medicamento para modulação de uma doença asso- ciada com B. pilosicoli.

Seqüências de polinucleotídeos codificando constructos anti- sentido ou ribozimas para uso em métodos terapêuticos são desejavelmente administrados diretamente como um constructo de ácido nucléico nu. A cap- tação de constructos de ácido nucléico nu por células bacterianas é reforça- da por várias técnicas de transfecção conhecidas, por exemplo, as técnicas incluindo o uso de agentes de transfecção. Exemplos destes agentes inclu- em agentes catiônicos (por exemplo fosfato de cálcio e DEAE-dextrano) e lipofectantes. Tipicamente, os constructos de ácido nucléico são misturados com o agente de transfecção para produzir uma composição.

Alternativamente o constructo anti-sentido ou ribozimas podem ser combinados com um carregador ou diluente farmaceuticamente aceitável para produzir uma composição farmacêutica. Carregadores e diluentes ade- quados incluem soluções salinas isotônicas, por exemplo, salina tamponada com fosfato. A composição pode ser formulada para administração parente- ral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, intraocular, oral ou transdérmi- ca. As vias de administração descritas são pretendidas somente como um guia uma vez que um profissional versado será capaz de determinar pron- tamente a via ótima de administração e qualquer dosagem para qualquer animal e condição em particular.

A invenção também inclui kits para triar animais suspeitos de estarem infectados com uma espécie de Brachyspira, tal como B. pilosicoli ou para confirmar que um animal está infectado com uma espécie de Bra- chyspira, tal como B. pilosicoli. Em uma modalidade adicional desta inven- ção, kits adequados para uso por um especialista podem ser preparados para determinar a presença ou ausência de espécies de Brachyspira, inclu- indo mas não limitada a B. hyodysenteriae, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii, e B. pilosicoli em animais com suspeita de infecção ou para medir quantitativamente uma infecção por espécies de Brachyspira, incluindo mas não limitada a infecção por B. hyodysenteriae, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi e B. pilosicoli. O animal testado pode ser qualquer mamífero ou ave, tal como mas não limitado a, frango, ganso, pato, peru, periquito, cão, gato, hamster, gerbo, coelho, furão, cavalo, vaca, ove- lha, porco, macaco, e humano. De acordo com as técnicas de experimenta- ção discutidas acima, os kits referidos podem conter no mínimo uma versão marcada de uma das seqüências de aminoácidos descritas aqui, neste re- querimento de patente, ou seu parceiro de ligação, por exemplo, um anticor- po específico para esse fim, e instruções dependendo do método seleciona- do, por exemplo, "competitivo," "sanduíche," "DASP" e semelhantes. Alterna- tivamente, os kits referidos podem conter no mínimo um seqüência de poli- nucleotídeo complementar a uma porção de uma das seqüências de polinu- cleotídeos descritas aqui, neste requerimento de patente, junto com instru- ções para seu uso. Os kits também podem conter reagentes periféricos tais como tampões, estabilizantes, e etc.

Por conseguinte, um kit de teste para a demonstração da pre- sença de uma espécie de Brachyspira, incluindo mas não limitada a B. hyodysenteríae, Β. intermedia, Β. alvinipulli, Β. aalborgi, Β. innocens, Β. mur- dochii, e B. pilosicoli, pode conter os seguintes:

(a) uma quantidade predeterminada de no mínimo um compo- nente imunoquimicamente reativo marcado obtido pela fixação direta ou indi- reta de uma das seqüências de aminoácidos descritas aqui, neste requeri- mento de patente, ou um parceiro de ligação específico para esse fim, a uma etiqueta detectável;

(b) outros reagentes; e

(c) instruções para uso do referido kit.

Mais especificamente, o kit de teste diagnóstico pode conter:

(a) uma quantidade conhecida de uma das seqüências de ami- noácidos descritas aqui, neste requerimento de patente, conforme descrito acima (ou um parceiro de ligação) geralmente ligada a uma fase sólida para formar um imunossorvente, ou na alternativa, ligada a uma etiqueta adequa- da, ou há um plural de semelhantes produtos finais, e etc;

(b) caso necessário, outros reagentes; e

(c) instruções para uso do referido kit de teste.

Em uma variação adicional, o kit de teste pode conter:

(a) um componente marcado o qual foi obtido por ligação de uma das seqüências de aminoácidos descritass aqui, neste requerimento de patente, a uma etiqueta detectável;

(b) um ou mais reagentes imunoquímicos adicionais dos quais no mínimo um reagente é um Iigante ou um Iigante imobilizado, cujo Iigante é selecionado entre o grupo consistindo de:

(i) um Iigante capaz de ligar com o componente marcado (a);

(ii) um Iigante capaz de ligar com um parceiro de ligação do componente marcado (a);

(iii) um Iigante capaz de ligar com no mínimo um do um ou mais componentes a serem determinados; ou

(iv) um Iigante capaz de ligar com no mínimo um dos parceiros de ligação de no mínimo um do um ou mais componentes a serem determi- nados; e (c) instruções para a performance de um protocolo para a detec- ção e/ou determinação de um ou mais componentes de uma reação imuno- química entre uma das seqüências de aminoácidos descritas aqui, neste requerimento de patente, e um parceiro de ligação específico para esse fim.

Nesta invenção, somente o clone AC1 (a seqüência de DNA es- tá na SEQ ID NO: 1 e a seqüência de aminoácido está na SEQ ID NO: 2) é identificado por triagem de uma biblioteca de bacteriófagos com um anticor- po monoclonal específico contraS. pilosicoli o qual reagiu com uma proteína da membrana externa de 30 kDa. Os outros clones, NAV- P4, NAV-P6, NAV- P11, e NAV-P14, são obtidos por triagem de uma biblioteca genômica de shot-gun preparada usando um isolado de B. pilosicoli (cepa 95/1000) de campo porcino australiano. Todos os clones são triados para homologia com seqüências conhecidas, clonados em vetores de expressão pTrcHis, as pro- teínas são expressadas, e testadas in vitro e in vivo, conforme descrito abaixo.

Identificação de seqüências AC1

A produção do anticorpo monoclonal é descrita em Lee, B.J. e Hampson, D.J., A monoclonal antibody reacting with the cell envelope of spi- rochaetes isolated from cases of intestinal spirochaetosis in pigs and hu- mans, FEMS Microbiology Letters, 131:178-184 (1995). O protocolo para produzir o anticorpo monoclonal é como se segue: B. pilosicoli cepa 3295 é cultivado para log-phase tardia em 200 ml de caldo de tripticase soja suple- mentado com 2% de soro fetal bovino e uma solução a 1 % de colesterol e- tanólico, e é peletizado por centrifugação 6.800 χ g por dez minutos em tem- peratura ambiente. As bactérias são ressuspendidas e lavadas em PBS três vezes com centrifugação para peletizar as células depois de cada lavagem. Os espiroquetas são ressuspendidas em 20 ml de tampão de extração con- tendo 0,1% (em v/v) de Triton X-114, 10 mM de Tris-HCI (pH 7.5), e 5 mM de EDTA e suavemente misturados por 18 horas a 4°C. O debri celular é peleti- zado por centrifugação a 20.000 χ g por 30 minutos a 4°C, e a fase aquosa (fração solúvel) é precipitada com 10 volumes de acetona gelada. A proteína precipitada é colhida por centrifugação a 1000 χ g por 10 minutos, e o pélete é ressuspendido com 20 ml de PBS. As proteínas da membrana externa ex- traídas são quantificadas usando o kit Biorad Protein Assay Kit (Biorad). Pa- drão da proteína albumina sérica bovina (BSA) disponível comercialmente (Sigma) é diluído serialmente com PBS em 2 vezes diluições seriais de 6,25 ug/ml a 100 pg/ml. As proteínas extraídas também são diluídas com o mes- mo tampão em 2 vezes diluições seriais de 2 vezes a 32 vezes. Vinte μl do reagente do Biorad Protein Assay é adicionado às cavidades de uma lâmina de microtítulo de 96 cavidades. Oitenta μΙ dos padrões de proteína corres- pondentes e a amostra de proteínas da membrana são adicionadas às cavi- dades apropriadas, e a lâmina de microtítulo é suavemente turbilhonada pa- ra misturar. Os padrões de BSA são realizados em triplicata, e as amostras de proteínas da membrana diluídas são realizadas em duplicata. A lâmina de microtítulo é em seguida colocada dentro da leitora de microlâminas (Biorad Model 3550-UV), e a densidade ótica a 600 nm é registrada. A curva padrão gerada a partir da densidade ótica da BSA padrão é usada para interpolar a concentração da amostra de proteínas da membrana externa extraídas.

Camundongos fêmeas Balb/cJ são imunizados por via intraperi- toneal com 0,5 ml de preparação de vacina consistindo de 0,25 ml de proteí- nas da membrana externa de B. pilosicoli extraída (com um teor protéico de aproximadamente 400 pg/ml) emulsificado com 0,25 ml de adjuvante com- pleto de Freund. Os camundongos recebem então semanalmente injeções das proteínas da membrana externa de B. pilosicoli sem adjuvante por seis semanas. Quatro dias depois da última injeção, o baço dos camundongos são recolhidos. As células são isoladas e são fundidas com células de mie- loma NS-1 usando polietileno glicol e os sobrenadantes são triados usando um ELISA com 100 μΙ de proteína da membrana externa de B. pilosicoli cepa 3295 (5 pg/ml) por cavidade como antígeno revestido por lâmina. As condi- ções de teste envolvem um revestimento antigênico de um dia para o outro em 100 μl de 0,1 M de tampão de carbonato (pH 9.6) a 4°C seguido por blo- queio de sítios não ligados com 150 μΙ de PBS contendo 1% (em peso / vo- lume) de BSA (Sigma). As cavidades são lavadas três vezes com 150 μΙ de PBST (0,05% em v/v de Tween 20) antes da adição de sobrenadantes da cultura celular não diluídos. Depois de 2 horas de incubação em temperatura ambiente (RT), as cavidades são lavadas (como acima), e os anticorpos de camundongo ligados são detectados com IgG anti-camundongo de cabra (molécula inteira)-peroxidase de raiz-forte (Sigma) diluída 5.000 vezes em PBST. As cavidades são lavadas três vezes com 150 μl de PBST (como a- cima). O desenvolvimento de cor envolveu o substrato K-Blue TMB disponí- vel comercialmente (ELISA Systems) e se deixa ocorrer por 15 minutos em temperatura ambiente. O desenvolvimento de cor é interrompido pela adição de 50 μl de ácido sulfúrico a 1 M, e a absorvência da reação do substrato colorido é registrada a 450 nm usando a leitora de microlâmina (Biorad Mo- delo 3550-UV).

Um anticorpo monoclonal (BJUACl) liga a uma proteína do en- velope externo de 30 kDa de B. pilosicoli conforme determinado através de um Western blot das proteínas da membrana externa de B. pilosicoli. A pre- paração de membrana externa de B. pilosicoli é passada sobre um SDS- PAGE a 12% descontínuo e transferida (blotted) em nitrocelulose. As proteí- nas transferidas são imunocoradas com sobrenadante de células de hibri- doma não diluídas do clone BJL/AC1 seguido por detecção com soro anti- camundongo de cabra conjugado a peroxidase de raiz-forte (Biorad) e de- senvolvido usando 4-cloro-1-naftol. A natureza da proteína do antígeno é confirmada tratando este com proteinase K (2 mg/ml) em tampão de protei- nase K (150 mM de Tris-HCI, 7 mM de EDTA, 0,05% de SDS1 pH 8.0) a 55°C por duas horas, em seguida realizando um Western blot sobre a amos- tra digerida usando o anticorpo monoclonal BJL7AC1.

Para obter uma quantidade utilizável de anticorpo monoclonal BUACl, estoques congelados de hibridoma são tirados de nitrogênio líquido e imediatamente degelados em um banho-maria a 37°C. As células degela- das são transferidas para um tubo de centrífuga de 10 ml contendo 9 ml de DMEM pré-aquecido e centrifugado a 1.000 χ g por 5 minutos. O sobrena- dante é descartado, e o pélete celular é ressuspendido com 2 ml de DMEM suplementado com 100 μΜ de hipoxantina, 0,4 μΜ de aminopterina, 16 μΜ de timidina, 0,58 mg/ml de glutamina, 0,22 mg/ml de piruvato de sódio, 200 i.u./ml de penicilina, 200 pg/ml de estreptomicina, 0,05 mg/ml de gentamicina (DMEM-HAT) e contendo 20% (em v/v) de soro de feto de vitelo. Os hibri- domas são primeiro recuperados em lâminas de cultura de tecido de fundo liso de 96 cavidades, em seguida em lâminas de cultura de tecido de 24 ca- vidades, e finalmente em frascos de cultura de tecido de 25 cm2. Durante a cultura dos frascos, o meio DMEM-HAT é suplementado com 10% (em v/v) de soro de feto de vitelo. Neste estágio, as células de hibridoma são deixa- das para crescer até as células estarem no ponto de morte e em seguida o sobrenadante da cultura é clarificado por centrifugação a 2.500 χ g por 5 mi- nutos. Antes de armazenamento a -20°C, o sobrenadante da cultura de teci- do é testado por análise Western blot contra uma preparação de célula total de B. pilosicoli. O sobrenadante da cultura de tecido não diluído contendo o mAb é usado em todos os testes de plaque Iift e Western blotting, a menos que determinado de modo diverso.

Uma biblioteca genômica de B. pilosicoli cepa P43/6/78T é gera- da usando um kit tecidual QIAamp (Qiagen) usando o seguinte protocolo. Uma cultura de caldo puro de B. pilosicoli P43/6/78T é centrifugada a 6800 χ g por 10 minutos em temperatura ambiente. As células são ressuspendidas em 180 μl de tampão ATL ao qual 20 μl de proteinase K (20 mg/ml) é adicio- nado e incubado a 55°C até ocorrer lise completa. DNA livre de RNA é obti- do por incubação do extratro em temperatura ambiente por 5 minutos com 2 mg/ml de RNase A. Duzentos μl de tampão AL é adicionado antes de incu- bação a 70°C por 10 minutos. Depois da adição de 200 μl de etanol a amos- tra foi passada através de uma coluna de rotação QIAamp a 8000 χ g por 1 minuto. A coluna é lavada duas vezes com 500 μl de tampão AWL, e o DNA genômico é elutriado com 200 μl de tampão AE pré-aquecido até 70°C. Um digesto parcial de DNA genômico P43/6/78T é preparado restringindo 50 μl do DNA purificado com 0,5 U de Sau3A1 por 1 hora. O DNA digerido parci- almente é eletroforesado em um gel agarose a 0,4 % (em peso / volume) em 1X TBE (90 mM de Tris-borato e 1 mM de EDTA pH 8.0). Fragmentos de 2 a 7 kb de tamanho são excisados do gel e são dissolvidos em 1 ml de água estéril a 70°C. O agarose dissolvido é extraído duas vezes com uma solução de fenohclorofórmio, e a fase aquosa é precipitada com isopropanol. O DNA parcialmente digerido precipitado é ressuspendido em 20 uL de 10 mM de Tris-HCI (pH 7.5). Os fragmentos de DNA parcialmente digeridos são ligados em braços de bacteriófago SamHI λ (Stratagene) e acondicionados em par- tículas de fago usando os extratos de acondicionamento Gigapack II. Fago acondicionado é amplificado em E. coliXL1-MRF' para formar uma biblioteca genômica aleatória.

A biblioteca de λ bacteriófagos é tríada para expressão do antí- geno de B. pilosicolide 30 kDa usando mAb BJL/ACI em um teste de plaque lift. 200 μl de E. coli XLt-BIue é cultivado em caldo de Luria-Bertani (LB) su- plementado com 0,2% (em peso / volume) de maltose e 10 mM de MgSO4, ajustado para uma densidade ótica de 1,0 a 600 nm e misturado em tubos de 10 ml com 100 μΙ de suspensão da biblioteca contendo 5 χ 104 bacterió- fagos formadores de placa. Depois de incubação por 15 minutos a 37°C, 3 ml de agar superior LB estéril fundido a 48°C é adicionado a cada tubo, mis- turado, e é imediatamente vertido sobre uma lâmina de agar LB e turbilho- nado para distribuição uniforme. Depois do agar superior endurecer por 15 minutos em temperatura ambiente, as lâminas são incubadas a 37°C por 6 a 8 horas até as placas terem aproximadamente 1 mm de diâmetro. Filtros de discos de nitrocelulose impregnados com 10 mM de isopropil tio-p-3-D- galactosídeo (IPTG) são cuidadosamente colocados sobre as lâminas as quais são incubadas por outras 4 a 6 horas a 37°C. Os filtros de nitrocelulo- se são removidos para salina Tris-tamponada (TBS) e são bloqueados com 5% (em peso / volume) de leite em pó desnatado em TBS por 1 hora em temperatura ambiente. Depois de incubação com mAb BJL/AC1 por 1 hora, lavando duas vezes por 10 minutos cada em TBS, e incubando por 1 hora em uma diluição a 2000 vezes em soro anti-camundongo de cabra conjuga- do a peroxidase de raiz-forte (HRP) (Biorad Laboratories, CA, U.S.A.), as placas que reagem com o mAb são visualizadas usando peróxido de hídro- gênio e 4-cloro-1-naftol. Clones que reagem com mAb BJL/AC 1 são selecio- nados, e são excisados em fagomídeo pBK-CMV por co-infecção de E.coli XL1-MRF' com o ExAssist™ Interference-Resistant Helper Phage (Stratage- ne, La Jolla, CA).

Os clones de E. coli abrigando os plasmídeos recombinantes são riscados sobre lâminas de agar LB suplementadas com 50 mg/L de ca- namicina e incubadas a 37°C de um dia para o outro. Uma única colônia é usada para inocular 10 ml de caldo LB suplementado com 50 mg/l de cana- micina, 1 mM de PMSF de 1 mM de IPTG. A cultura do caldo é incubada a 37°C por 12 horas com vibração. Um ml de cada cultura é centrifugado a 2.500 χ g por 15 minutos e é lavada três vezes. O processo de lavagem en- volve ressuspensão do pélete celular com 1 ml de salina tamponada com fosfato (PBS) e centrifugação a 2.500 χ g. Os péletes celulares lavados são ressuspendidos em 100 μΙ de PBS pronto para SDS-PAGE e Western blotting.

Análise SDS-PAGE da proteína envolve separação eletroforética usando um sistema tampão de Tris-glicina descontínuo. Trinta μΙ de amostra de proteína são misturados com 10 μΙ de 4x tampão de tratamento da amos- tra (250 mM de Tris-HCI (pH 6.0), 8% (em peso / volume) de SDS, 200 mM de DTT1 40% (em v/v) de glicerol e 0,04 % (em peso / volume) de azul de bromofenol). As amostras são fervidas por 5 minutos imediatamente antes de carregar 10 μΙ da amostra para cavidades no gel. O gel compreende um gel de empilhâmento (125 mM de Tris-HCI ph 6.8, 4% em peso/volume de acilamida, 0,15% em peso/volume de bis-acrilamida e 0,1% em peso/volume de SDS) e um gel de separação (375 mM de Tris-HCI ph 8.8, 12% em pe- so/volume de acilamida, 0,31% em peso/volume de bis-acrilamida e 0,1% em peso/volume de SDS). Estes géis são polimerizados pela adição de 0,1% (em v/v) de TEMED e 0,05% (em peso / volume) de solução de sulfato de amônio recém preparada e fundidos no mini-Protean dual slab cell (Biorad). As amostras são passadas a 150 V em temperatura ambiente (RT) até o tampão de amostra (dye front) de azul de bromofenol atingir o fundo do gel. Padrões de peso molecular pré-corados são eletroforesados em paralelo com as amostras de modo a permitir estimativas de peso molecular. Depois da eletroforese, o gel é imediatamente submetido a eletro-transferência so- bre membrana de nitrocelulose para Western blotting. Transferência eletroforética de proteínas separadas do gel SDS- PAGE para membrana de nitrocelulose é realizada usando o sistema tam- pão de transferência Towbin. Depois da eletroforese, o gel é equilibrado em tampão de transferência (25 mM de Tris, 192 mM de glicina, 20% em v/v de metanol, pH 8.3) por 15 minutos. As proteínas no gel são transferidas para membrana de nitrocelulose (Protran) usando o equipamento de transblot mini-Protean (Biorad) a 30 V de um dia para o outro a 4°C. A membrana de nitrocelulose recém transferida contendo as proteínas separadas é bloquea- da com 10 ml de salina Tris-tamponada (TBS) contendo 5% (em peso / vo- lume), de leite em pó desnatado por 1 hora em temperatura ambiente. A membrana é lavada com TBS contendo 0,1% (em v/v) de Tween 20 (TBST) e em seguida incubada com 10 mL de AHPS (diluído 5.000 vezes com TBST) por 1 hora em temperatura ambiente. Depois de lavar três vezes por 5 minutos com TBST, a membrana é incubada com 10 mL de IgG anti-suína de cabra (molécula inteira)-HRP diluída 5.000 vezes em TBST por 1 hora em temperatura ambiente. A membrana é desenvolvida com 10 mL com solução de substrato DAB (0,5 mg/ml de 3,3'-diaminobenzidina, 0,003% em pe- so/volume de peróxido de hidrogênio, TBS). A reação de desenvolvimento é interrompida lavando a membrana com água destilada. A membrana é em seguida secada e escaneada para apresentação.

A biblioteca de fagos de S. pilosicoli produz seis clones que ex- pressam uma proteína com o peso molecular de 30 kDa. A proteína de todos estes clones reage fortemente com mAb BJL/AC1.

Um plasmídeo (AC1) é escolhido para seqüenciamento direto do inserto genômico de B. pilosicoli usando o seqüenciador de DNA ABI 373A (ABI 373A DNA Sequencer, PE Applied Biosystems). O plasmídeo é purifi- cado a partir das células de E. coli usando o kit QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). As seqüências de inserto iniciais são obtidas usando oligonucleo- tídeos T3 e T7 disponíveis comercialmente os quais anelara às regiões veto- riais flanquando quaisquer extremidades do inserto. Os oligonucleotídeos requeridos para identificar completamente a seqüência de inserto são desig- nados com base na seqüência da extremidade 3'-OH de cada uma das se- qüências de insertos recém obtidas (Tabela 1). Cada reação de seqüencia- mento é realizada em um volume de 10 μΙ consistindo de 300 ng de fagomí- deo, 4 pmol de primer, e 4 μΙ da mistura ABI PRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems). As condições de ciclagem são uma etapa de desnaturação de 2 minutos a 96°C, seguida por 25 ciclos de desnaturação a 96°C por 10 segundos, anelando na temperatu- ra de fusão do primer (vide a Tabela 1) por 5 segundos, e extensão de pri- mer a 60°C por 4 minutos. Terminadores de corantes residuais são removi- dos dos produtos de seqüenciamento por precipitação com 95% (em v/v) de etanol contendo 120 mM de acetato de sódio (pH 4.6), e secado a vácuo. Os produtos de seqüenciamento são analisados usando um ABI 373A DNA Se- quencer.

Sequence Resultados de seqüências são editados e compilados usando SeqEd v1.0.3 (PE Applied Biosystems). As seqüências de nucleotí- deos são analisadas usando Vector NTI version 6 (InforMax) e o programa do Genetics Computer Group da Universidade de Wisconsin. A fase de leitu- ra aberta (ORF) hipotética deduzida foi usada para pesquisar para homolo- gia contra todos os bancos de dados de seqüências disponíveis no National Center of Bioinformatics (NCBI). A ORF carece de homologia para qualquer proteína conhecida (vide a Tabela 2). As seqüências de DNA e de aminoáci- dos de AC1 são encontrada nas SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente. A ORF do clone tem 824 bp de extensão e codifica uma proteína com um peso estimado de 30,6 kDa.

Tabela 1

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Preparação de biblioteca genômica para seqüenciamento por shot-gun

Uma biblioteca genômica é preparada usando um isolado de campo porcino australiano de B. pilosicoli (cepa 95/1000). Esta cepa foi bem caracterizada e foi mostrado que é virulento depois de prova experimental dos porcos. O método de brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) é usado para preparar DNA cromossômico de alta qualidade adequado para prepa- ração de bibliotecas de DNA genômico. B. pilosicoli é cultivado em 100 ml de cultura anaeróbica de caldo de tripticase soja para uma célula densidade de 109 células/ml. As células são colhidas a 4.000 χ g por 10 minutos, e o pélete celular é ressuspendido em tampão TE a 9,5 ml. SDS é adicionado para uma concentração final de 0,5 % (em peso / volume), e as células são Iisa- das a 37°C por 1 hora com 100 pg de Proteinase K. NaCI é adicionado para uma concentração final de 0,7 Me 1,5 ml de solução de CTAB/NaCI (10% em peso/volume de CTAB, 0,7 M de NaCI) é adicionado antes de incubar a solução a 65°C por 20 minutos. O Iisado é extraído com um volume igual de clorofórmio / álcool isoamílico, e o tubo é centrifugado a 6.000 χ g por 10 minutos para separar as fases. A fase aquosa é transferida para um tubo fresco e 0,6 volume de isopropanol são adicionados para precipitar o DNA de alto peso molecular. O DNA precipitado é coletado usando uma haste de vidro recurvado e transferido para um tubo contendo 1 ml de 70 % (em v/v) de etanol. O tubo é centrifugado a 10.000 χ g e o DNA peletizado é redissol- vido em 4 ml de tampão TE de um dia para o outro. Um gradiente de cloreto de césio contendo 1,05 g/ml de CsCI e 0,5 mg/ml de brometo de etídio é preparado usando a solução de DNA redissolvida. O gradiente é transferido para tubos de centrífuga seláveis de 4 ml e centrifugado a 70.000 χ g de um dia para o outro a 15°C. O DNA separado é visualizado sob uma luz ultravio- leta, e o DNA de alto peso molecular é retirado do gradiente usando uma agulha de 15 g. O brometo de etídio é removido do DNA por extração se- qüencial com isopropanol saturado com CsCI. O DNA cromossômico purifi- cado é dialisado contra 2 litros de tampão TE e precipitado com isopropanol.

O DNA genômico ressuspendido é cisalhado usando um GeneMachines Hy- droshear (Genomic Solutions, Ann Arbor, Ml), e o DNA cisalhado é preen- chido usando Klenow DNA polimerase para gerar fragmentos de extremida- de cega. Cem ng dos fragmentos de DNA de extremidade cega é ligado com 25 ng de vetor pSMART VC (Lucigen, Meddleton, Wl) usando DNA Iigase CIoneSmart. O DNA ligado é então eletroporado em células de E. coli eletro- competentes. Uma biblioteca de pequenos insertos (2 a 3 kb) e uma bibliote- ca de insertos médios (3 a 10 kb) é construída na versão de cópia pequena do vetor pSMART VC.

Seqüenciamento genômico

Depois de ser obtida a biblioteca genômica, clones individuais de E. coli contendo o vetor pSMART VC são escolhidos. O DNA de plasmídeo é purificado e seqüenciado. Os plasmídeos purificados são submetidos a se- qüenciamento direto automatizado do vetor pSMART VC usando os primers forward e reverso específicos para o vetor pSMART VC. Cada reação de seqüenciamento é realizada em um volume de 10 μΙ consistindo de 200 ng de DNA de plasmídeo, 2 pmol de primer, e 4 μΙ da mistura de reação ABI PRISM™ BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix (PE Ap- plied Biosystems, Foster City, CA). As condições de ciclagem envolvem uma etapa desnaturante de 2 minutos a 96°C, seguida por 25 ciclos de desnatu- ração a 96°C por 10 segundos, e uma etapa combinada de anelamento e extensão de primer a 60°C por 4 minutos. Terminadores de corantes residu- ais são removidos dos produtos de seqüenciamento por precipitação com 95% (em v/v) de etanol contendo 85 mM de acetato de sódio (pH 5.2), 3 mM de EDTA (pH 8), e secados a vácuo. Os plasmídeos são seqüenciados em duplicata usando cada primer. Produtos de seqüenciamento são analisados usando um ABI 373A DNA Sequencer (PE Applied Biosystems).

Anotação

Seqüências de genoma parciais para B. pilosicoli são reunidas e anotadas usando uma gama de ferramentas de bioinformática de domínio público para analisar e re-analisar as seqüências como parte de um proce- dimento de confirmação de qualidade sobre análise de dados. Fases de lei- tura aberta (ORFs) são previstos usando uma variedade de programas inclu- indo GeneMark1 GLIMMER, ORPHEUS, SELFID e GetORF. ORFs putativas são examinadas para homologia (DNA e proteína) com bancos de dados internacionais existentes usando pesquisas incluindo BLAST e FASTA. To- das as ORFs previstas são analisadas para determinar sua localização celu- lar usando programas incluindo PSI-BLAST, FASTA, MOTIFS1 FINDPAT- TERNS1 PHD, SIGNALP e PSORT. Bancos de dados incluindo Interpro, Prosite, ProDom, Pfam e Blocks são usados para prever proteínas associa- das com a superfície tais como domínios transmembrana, peptídeos lideres, homologias com proteínas de superfície conhecidas, assinatura de Iipoprote- ína, motivos de ancoragem de membrana externa e domínios de ligação de célula hospedeira. Análise filogenética e análise de evolução molecular di- versa é conduzida com os genes identificados e com outras espécies para ajudar na atribuição de função. A análise in silico de ambos os genomas se- qüenciados parcialmente produz uma lista completa de todas as ORFs pre- vistas presentes nos dados de seqüência disponíveis. Cada ORF é interro- gado para informação descritiva tal como peso molecular previsto, ponto i- soelétrico, hidrofobicidade, e localização subcelular para permitir correlação com as propriedades in vitro do produto genético nativo. Genes previstos ps quais codificam proteínas similares a componentes localizados na superfície e/ou fatores de virulência em outras bactérias patogênicas são selecionados como potenciais alvos de vacina.

Resultados de Bioinformática

O seqüenciamento por shotgun do genoma de B. pilosicoli resul- ta em 84% (2058,6 kb de uma previsão de 2450 kb) do genoma sendo se- qüenciado. A seqüência de B. pilosicoli consiste de 134 contigs com um ta- manho de contig médio de 132 kb. Para B. pilosicoli, 1892 fases de leitura aberta (ORFs) são previstas a partir de 134 contigs. A comparação das ORFs previstas com genes presentes nos bancos de dados de ácidos nu- cléicos e proteínas indicam que aproximadamente 70% das ORFs têm ho- mologia com genes contidos nos bancos de dados públicos. Os 30% restan- tes das ORFs previstas não têm identidade conhecida. Candidatos a Vacinas

Para ajudar a reduzir o número de ORFs que seriam testados como um candidato a vacina, foi estabelecido um teste de duas partes. É necessário que os potenciais candidatos a vacina tenham alguma, se bem que menor, homologia com outer proteínas da superfície externa e fatores de virulência presentes nos bancos de dados públicos. As ORFs dos poten- ciais candidatos a vacina também têm de estar presentes em muitas cepas de β. pilosicoli. Das 1892 ORFs obtidas no seqüenciamento de shotgun ge- nômico, muitas passaram um ou ambos prongs deste teste mas os resulta- dos de somente quatro são apresentados aqui. A Tabela 2 mostra quatro clones obtidos do seqüenciamento genômico de shot-gun selecionado como potenciais alvos de vacina e sua similaridade com outras seqüências de a- minoácidos conhecidas obtidas do banco de dados SWISS-PROT. A Tabela 2 também proporciona informação sobre a falta de homologia de ORF de AC1 com qualquer proteína conhecida. É observado que a percentagem de identidade dos aminoácidos não sobe acima de 41% enquanto a percenta- gem de similaridade dos aminoácidos permanece menor do que 61%, indi- cando deste modo que estas ORFs são únicas.

Tabela 2

<table>table see original document page 56</column></row><table> <table>table see original document page 57</column></row><table>

As seqüências de DNA e de aminoácidos de NAV-P4 são encon- trada nas SEQ ID N-: 3 e 4, respectivamente. As seqüências de DNA e de aminoácidos de NAV-P6 são encontrada nas SEQ ID N-: 5 e 6, respectiva- mente. As seqüências de DNA e de aminoácidos de NAV-P11 são encontra- da nas SEQ ID N-: 7 e 8, respectivamente. As seqüências de DNA e de a- minoácidos de NAV-P14 são encontrada nas SEQ ID N-: 9 e 10, respecti- vamente.

Análise de distribuição genética usando reação de cadeia polimerase (PCR)

Dois pares de primers os quais anelam a diferentes regiões da região codificando o gene alvo são designados e otimisados para detecção por PCR. Primers individuais são designados usando Oligo Explorer 1.2 e são selecionadas séries de primers com temperaturas de fusão calculadas de aproximadamente 55-60°C. Estas séries de primers também são selecio- nadas para gerar produtos de PCR maiores do que 200 bp. Uma temperatu- ra de recozimento de primer de média estringência de 50°C é selecionada para a análise de distribuição por PCR. As condições de média estringência permitiriam potenciais seqüências menores combinadas incompletamente (devido a diferenças de cepas) ocorrendo nos sítios de ligação de primers para não afetar a ligação de primers. Análises da distribuição dos cinco ge- nes alvo de B. pilosicoli são realizadas sobre 19 cepas de B. pilosicoli. Sé- ries de primers usados na análise da distribuição são mostrados na Tabela 3. Análise por PCR é realizada em um volume total de 25 μl usando Taq DNA polimerase (Biotech International, Thurmont, MD). A mistura de amplifi- cação consiste de 1x tampão PCR (contendo 1,5 mM de MgCI2), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 0,5 μΜ do par de primers, e 1 μl de DNA modelo cromos- sômico purificado. Condições de cling ciclagem envolvem uma etapa de desnaturação modelo inicial de 5 minutos a 94°C, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, recozimento a 50°C por 15 segun- dos, e extensão de primer a 68°C por 4 minutos. Os produtos de PCR são submetidos a eletroforese em 1% (em peso / volume) de géis agarose em 1x tampão TAE (40 mM de Tris-acetato, 1 mM de EDTA), corando com uma solução a 1 μg/ml de brometo de etídio e visualizando sobre luz UV.

Todas as cinco das ORFs de B. pilosicoli selecionadas como candidatos a vacina estão presentes em cada cepa testada.

Tabela 3

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As cinco ORFs selecionadas para experimentação adicional co- mo candidatos a vacina potenciais são a seguir clonadas em vetores de ex- pressão, expressadas, purificadas, e avaliadas para imunogenicidade.

Extração de Plasm ídeo pTrcHis

Clones de Escherichia coli JM109 abrigando o plasmídeo pTr- cHis (Invitrogen, Carlsbad, CA) são riscados de armazenamento de estoque de glicerol sobre lâminas de agar Luria-Bertani (LB) suplementadas com 100 mg/l de ampicilina e incubadas a 37°C por 16 horas. Uma única colônia é usada para inocular 10 ml de caldo LB suplementado com 100 mg/l de ampi- cilina, e a cultura do caldo é incubada a 37°C por 12 horas com vibração. Toda a cultura de um dia para o outro é centrifugada a 5.000 χ g por 10 mi- nutos, e o plasmídeo contido nas células é extraído usando o kit QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Doncaster VIC). As células peletizadas são res- suspendidas com 250 μl de tampão de ressuspensão celular P1 e em segui- da são lisadas com a adição de 250 μl de tampão de lise celular P2. As célu- las lisadas são neutralizadas com 350 μl de tampão de neutralização N3, e o debris celular precipitado é peletizado por centrifugação a 20.000 χ g por 10 minutos. O sobrenadante é transferido para uma coluna de rotação e centri- fugado a 10.000 χ g por 1 minuto. Depois de descartar o fluxo direto, 500 μl de tampão de lavagem PE é aplicado à coluna e centrifugado como antes. O fluxo direto é descartado, e a coluna é secado por centrifugação a 20.000 χ g por 3 minutos. O DNA de plasmídeo é elutriado da coluna com 100 μl de tampão de elutriação EB. O plasmídeo purificado é quantificado usando um fluorômetro de DNA Dynaquant (Hoefer, San Francisco, CA), e a concentra- ção de DNA é ajustada para 100 μg/ml por diluição com tampão TE. O plas- mídeo pTrcHis purificado é armazenado a -20°C.

Preparação de Vetor

Dois μg do plasmídeo pTrcHis purificado é digerido a 37°C por 1 a 4 horas em um volume total de 50 μl contendo 5 U de EcoRI (New En- gland Biolabs, Beverly, MA) e 5 U de Xhol (New England Biolabs) em 100 mM de Tris-HCI (pH 7.5), 50 mM de NaCI, 10 mM de MgCI2, 1 mM de DTT e 100 μg/ml de BSA. O vetor restrito é verificado por eletroforese de 1 μl da reação de digestão através de um 1 % (em peso / volume) de gel agarose em 1X tampão TAE a 90V por 1 hora. O DNA eletroforesado é corado comi μg/ml de brometo de etídio e é visualizado sobre luz ultravioleta (UV).

Vetor pTrcHis linearizado é purificado usando o kit UItraCIean PCR Clean-up Kit (Mo Bio Laboratories, Carlsbad; CA). Em resumo, a rea- ção de restrição (50 μl) é misturada com 250 μΙ de tampão SpinBind B1, e todo o volume é adicionado a uma coluna de rotação. Depois de centrifuga- ção a 8.000 χ g por 1 minuto, o fluxo direto é descartado e 300 μl de tampão SpinCIean B2 é adicionado à coluna. A coluna é centrifugada como antes, e o fluxo direto é descartado antes de secar a coluna a 20.000 χ g por 3 minu- tos. O vetor purificado é elutriado da coluna com 50 μΙ de tampão TE. Vetor linear purificado é quantified usando um fluorômetro, e a concentração de DNA é ajustada para 50 μg/ml por diluição com tampão TE. O vetor restrito purificado é armazenado a -20°C.

Design de Primer para Preparação de Inserto

Pares de primers são designados para amplificar tanto da região codificante do gene alvo quanto possível usando DNA genômico como o ponto de partida. Todas as seqüências de primers incluem sítios de enzima de restrição terminais para permitir ligação de extremidade coesiva do am- plicon resultante no vetor pTrcHis linearizado. As seqüências de primers u- sadas para clonagem são mostradas na Tabela 4. Os primers são testados usando Amplify 1.2 (University of Wisconsin, Madison, Wl) e a seqüência de amplicon teórica é inserida na posição apropriada na seqüência vetorial pTr- cHis. Translação deduzida do cassete de expressão pTrcHis quimérico é realizada usando Vector NTI versão 6 (InforMax) para confirmar que os in- sertos genéticos estariam na fase de leitura correta. A Tabela 4 também proporciona o peso molecular previsto da proteína nativa em daltons e o pe- so molecular aparente da proteína expressada em kDa conforme determina- do a partir da análise SDS-PAGE. A fusão de histidina da proteína recombi- nante acrescenta aproximadamente 4 kDa à proteína nativa.

Tabela 4

<table>table see original document page 61</column></row><table> Continuação. ..

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Amplificacão dos insertos genéticos

Usando DNA genômico, todos os insertos genéticos alvo são amplificados por PCR em um volume total de 100 μl usando Taq DNA poli- merase (Biotech International) e Pfu DNA polimerase (Promega, Madison, Wl). A mistura de amplificação consiste de 1 χ tampão de PCR (contendo 1,5 mM de MgCI2), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,01 U de Pfu DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP (Amersham Pharmacia Biotech), 0,5 μΜ do par de primers apropriado e 1 μl de DNA cromossômico purificado. O DNA cromos- sômico é preparada a partir da mesma cepa de B. pilosicoli usada para se- qüenciamento de genoma. As condições de ciclagem envolvem uma etapa de desnaturação modelo inicial de 5 minutos a 94°C, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, recozendo a 50°C por 15 segun- dos, e extensão de primers a 68°C por 4 minutos. Os produtos de PCR são submetidos a eletroforese em 1% (em peso / volume) de géis agarose em 1x tampão TAE, são corados com uma solução a 1 μς/ml de brometo de etídio e são visualizados sobre luz UV. Depois de verificar a presença do produto de PCR de tamanho correto, a reação de PCR jé purificada usando o kit Ul- traClean PCR Clean-up Kit (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA). A reação de PCR (100 μΙ) é misturada com 500 μΙ de tampão SpinBind B1, e todo o volume é adicionado a uma coluna de rotação. Depois de centrifugação a 8.000 χ g por 1 minuto, o fluxo direto é descartado, e 300 μΙ de tampão SpinCIean B2 é adicionado à coluna. A coluna é centrifugada como antes e o fluxo direto é descartado antes de secar a coluna a 20.000 χ g por 3 minu- tos. O vetor purificado é elutriado da coluna com 100 μΙ de tampão TE. Digestão por enzima de restrição dos insertos genéticos

Trinta μΙ do produto de PCR purificado é digerido em um volume total de 50 μΙ com 1 U de EcoRI e 1 U de Xhol em 100 mM de Tris-HCI (pH 7.5), 50 mM de NaCI, 10 mM de MgCI2, 1 mM de DTT e 100 μg/ml de BSA a 37°C por 1 a 4 horas. O DNA do inserto digerido é purificado usando o kit UItraCIean PCR Clean-up Kit (vide acima). DNA de inserto digerido purifica- do é quantificado usando um fluorômetro, e a concentração de DNA é ajus- tada para 20 μg/ml por diluição com tampão TE. O DNA de inserto restrito purificado é usado imediatamente para ligação de vetor.

Ligação dos insertos genéticos no vetor pTrcHis

Reações de ligação são todas realizadas em um volume total de 20 μl. Cem ng de pTrcHis Xho'\/EcoRI -Iinearizado é incubado com 20 ng de inserto X/701/EcoRI-restrito a 16°C por 16 horas em 30 mM de Tris-HCI (pH 7.8), 10 mM de MgCI2, 10 mM de DTT e 1 mM de ATP contendo 1 U de T4 25 DNA Iigase (Promega). Uma reação de ligação idêntica não contendo inserto de DNA também é incluída como um controle negativo de re-circularização de vetor.

Transformação de ligações pTrcHis em células de E. coli

Células de E. coli JM109 competentes (Promega) são degeladas de armazenamento sobre gelo a -80°C e em seguida 50 μΙ das células são transferidas para dentro de tubos de microfuge de 1,5 ml gelados contendo 5 μΙ das reações de ligação de um dia para o outro (equivalente a 25 ng de vetor pTrcHis). Os tubos são misturados batendo delicadamente o fundo de cada tubo sobre a bancada e deixados sobre gelo por 30 minutos. As células são em seguida submetidas a choque térmico colocando os tubos em um banho-maria a 42°C por 45 segundos antes de retornar o tubo ao gelo por 2 minutos. As células transformadas são recuperadas em 1 ml de caldo LB por 1 hora a 37°C com suave misturação. As células recuperadas são colhidas a 2.500 χ g por 5 minutos, e as células são ressuspendidas em 50 μΙ de caldo LB fresco. Todos os 50 μΙ de células ressuspendidas são espalhados uni- formemente sobre uma lâmina de agar LB contendo 100 mg/l de ampicilina usando uma haste de vidro estéril. As lâminas são incubadas a 37°C por 16 horas.

Detecção de constructos pTrcHis recombinantes em E. coli por PCR

Doze colônias de único mutante para cada constructo são risca- dos sobre lâminas de agar LB fresco contendo 100 mg/l de ampicilina e in- cubadas a 37°C por 16 horas. Uma única colônia de cada evento de trans- formação é ressuspendida em 50 μΙ de tampão TE e é fervida por 1 minuto. Doiz μΙ de células fervidas são usadas como modelo para PCR. A mistura de amplificação consiste de 1x tampão PCR (contendo 1,5 mM de MgCfe), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP, 0,5 μΜ do primer pTrcHis-F (5'-CAATTTATCAGACAATCTGTGTG-3' SEQ ID NO: 45) e OjS μΜ do primer pTrcHis-R (5'-TGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCG-3' SEQ ID NO: 46). As condições de ciclagem envolvem uma etapa de desnaturação modelo inicial de 5 minutos a 94°C, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, recozendo a 60°C por 15 segundos, e uma extensão de primers a 72°C por 1 minuto. Os produtos de PCR são submetidos a eletroforese em 1% (peso / volume) de géis agarose em 1 χ tampão TAE, são corados com uma solução a 1 μg/ml de brometo de etídio e são visualizados sobre luz UV. A clonagem dos vários insertos no vetor de expressão pTrcHis produz cons- tructos recombinantes de vários tamanhos.

Expressão piloto de proteínas recombinantes com etiqueta His

Cinco a dez colônias isoladas de constructo pTrcHis recombi- nante em E. coli JM109 são inoculadas em 3 ml de caldo LB em um tubo de 5 ml contendo 100 mg/l de ampicilina e 1 mM de IPTG e incubadas a 37°C por 16 horas com vibração. As células são colhidas por centrifugação a 5.000 χ g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante é descartado, e cada pélete é ressuspendido com 10 μΙ de tampão de Iise desnaturante Ni-NTA (100 mM de NaH2PO4, 10 mM de Tris-HCI, 8 M de uréia, pH 8.0). Depois de turbilho- nar o tubo por 1 minuto, o debris celular é peletizado por centrifugação a 10.000 χ g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante é transferido para um no- vo tubo e armazenado a -20°C até análise.

Eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)

Análise SDS-PAGE de proteína é realizada usando um sistema tampão de Tris-glicina descontínuo. Trinta μΙ de amostra de proteína são misturados com 10 μΙ de 4x tampão de tratamento da amostra (250 mM de Tris-HCI (pH 6.0), 8% (em peso / volume) de SDS, 200 mM de DTT, 40% (em v/v) de glicerol e 0,04 % (em peso / volume) de azul de bromofenol). As amostras são fervidas por 5 minutos imediatamente antes de carregar 10 μΙ da amostra para dentro de cavidades no gel. O gel compreende um gel de empilhamento (125 mM de Tris-HCI ph 6.8, 4% em peso/volume de acilami- da, 0,15% em peso/volume de bis-acrilamida e 0,1% em peso/volume de SDS) e um gel de separação (375 mM de Tris-HCI ph 8.8, 12% em pe- so/volume de acilamida, 0,31% em peso/volume de bis-acrilamida e 0,1% em peso/volume de SDS). Estes géis são polimerizados pela adição de 0,1% (v/v) de TEMED e 0,05% (em peso / volume) de solução de sulfato de amô- nio recém preparada e fundidos no mini-Protean dual slab cell (Biorad, Her- cules, Califórnia). As amostras são passadas a 150 V em temperatura ambi- ente (RT) até o corante de azul de bromofenol atingir o fundo do gel. Pa- drões de peso molecular pré-corados são eletroforesados em paralelo com as amostras de modo a permitir estimativas do peso molecular. Depois da eletroforese, o gel é imediatamente corado usando azul brilhante de Coo- massie G250 (Coomassie Brilliant Blue G250, Biorad) ou é submetido a ele- tro-transferência sobre membrana de nitrocelulose para Western blotting.

Análise Western Blot

Transferência eletroforética de proteínas separadas do gel SDS- PAGE para membrana de nitrocelulose é realizada usando o sistema tam- pão de transferência Towbin. Depois da eletroforese, o gel é equilibrado em tampão de transferência (25 mM de Tris1 192 mM de glicina, 20% em v/v de metanol, pH 8.3) por 15 minutos. As proteínas no gel são eletro-transferidas para membrana de nitrocelulose (Protran, Schleicher and Sehuell BioScien- ce, Inc., Keene, NH) usando o equipamento de transblot mini-Protean (Bio- rad) a 30 V de um dia para o outro a 4°C. A membrana de nitrocelulose re- cém transferida contendo as proteínas separadas é bloqueada com 10 ml de salina tris-tamponada (TBS) contendo 5% (em peso / volume) de leite em pó desnatado por 1 hora em temperatura ambiente. A membrana é lavada com TBS contendo 0,1% (em v/v) de Tween 20 (TBST) e em seguida é incubada com 10 mL de anticorpo anti-his de camundongo (diluído 5.000 vezes com TBST) por 1 hora em temperatura ambiente. Depois de lavar três vezes por 5 minutos com TBST, a membrana é incubada com 10 mL de IgG anti- camundongo de cabra (molécula inteira)-AP diluído 5.000 vezes em TBST por 1 hora em temperatura ambiente. A membrana é desenvolvida usando o kit de substrato de fosfatase alcalina (Alkaline Phosphatase Substrate Kit) (Biorad). A reação de desenvolvimento é interrompida lavando a membrana com água destilada. A membrana em seguida é secada e escaneada para apresentação.

Verificação de fase de leitura dos constructos pTrcHis recombinantes por análise de seqüência direta

Dois clones mutantes para cada constructo o qual produziu os produtos de PCR de tamanho correto são inoculados em 10 ml de caldo LB contendo 100 mg/l de ampicilina e incubados a 37°C por 12 horas com vi- bração. As culturas inteiras de um dia para o outro são centrifugadas a 5.000 χ g por 10 minutos, e o plasmídeo contido nas células são extraídso usando o QIAprep Spin Miniprep Kit conforme descrito previamente. O plasmídeo purificado é quantificado usando um fluorômetro. Ambos os plasmídeos puri- ficados são submetidos a seqüenciamento direto automatizado do cassete de expressão pTrcHis usando os primers pTrcHis-F e pTrcHis-R. Cada rea- ção de seqüenciamento é realizada em um volume de 10 μΙ consistindo de 200 ng de DNA de plasmídeo, 2 pmol de primer, e 4 μΙ da mistura ABI PRISM™ BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix (PE Ap- plied Biosystems, Foster City1 CA). As condições de ciclagem envolvem uma etapa desnaturante de 2 minutos a 96°C, seguida por 25 ciclos de desnatu- ração a 96°C por 10 segundos, e uma etapa de anelamento e extensão de primers combinados a 60°C por 4 minutos. Terminadores de corantes resi- duais são removidos dos produtos de seqüenciamento por precipitação com 95% (em v/v) de etanol contendo 85 mM de acetato de sódio (pH 5.2), 3 mM de EDTA (pH 8), e secados a vácuo. Os plasmídeos são seqüenciados em duplicata usando cada primer. Produtos de seqüenciamento são analisados usando um ABI 373A DNA Sequencer (PE Applied Biosystems). O seqüen- ciamento dos nucleotídeos dos constructos pTrcHis verifica que o cassete de expressão está na fase de leitura correto para todos os constructos. A trans- lação prevista do cassete de expressão pTrcHis indica que todas as proteí- nas recombinantes com etiqueta his e a seqüência de aminoácido deduzida das proteínas de B. pilosicoli nativas são idênticas.

Expressão e purificação de proteínas com etiqueta His recombinantes

Uma única colônia do constructo pTrcHis recombinante em E. coli JM109 é inoculado em 50 ml de caldo LB em um frasco cônico de 250 ml contendo 100 mg/l de ampicilina e incubada a 37°C por 16 horas com vibração. Um frasco cônico de 2 I contendo 1 I de caldo LB suplementado com 100 mg/l de ampicilina é inoculado com 10 ml da cultura de um dia para o outro e incubado a 37°C até a densidade ótica das células a 600 nm ser 0,5 (aproximadamente 3 a 4 horas). A cultura é em seguida induzida adicio- nando IPTG para uma concentração final de 1 mM, e as células são retorna- das a 37°C com vibração. Depois de 5 horas de indução, a cultura é transfe- rida para frascos de centrífuga de 250 ml, e os frascos são centrifugados a 5.000 χ g por 20 minutos a 4°C. O sobrenadante é descartado, e cada pélete é ressuspendido com 8 ml de tampão de lise desnaturante Ni-NTA (100 mM de NaH2PO4, 10 mM de Tris-HCI, 8 M de uréia, pH 8.0). As células ressus- pendidas são armazenadas a -20°C de um dia para o outro.

A suspensão celular é removida de armazenagem a -20°C e de- gelada sobre gelo. O lisado celular é em seguida sonicado sobre gelo 3 ve- zes por 30 segundos com 1 minuto de incubação sobre gelo entre rodadas de sonicação. As células Iisadas são clareadas por centrifugação a 20.000 χ g por 10 minutos a 4°C, e o sobrenadante é transferido para uma coluna de 15 ml contendo um volume de leito de 0,5 ml de resina agarose Ni-NTA (Qi- agen). A proteína His6-tagged recombinante é deixada para ligar à resina por 1 hora a 4°C com misturação end-over-end. A resina é em seguida lavada com 30 ml de tampão de lavagem desnaturante de Ni-NTA (100 mM de NaH2PO4, 10 mM de Tris-HCI, 8 M de uréia, pH 6.3) antes de elutriação com 12 ml de tampão de elutriação desnaturante de Ni-NTA (100 mM de NaH2PO4, 10 mM de Tris-HCI, 8 M de uréia, pH 4.5). Quatro frações de 3 ml do elutriado são coletadas e armazenados a 4°C. Trinta μΙ de cada elutriado é tratado com 10 μΙ de 4x tampão de tratamento da amostra e fervido por 5 minutos. As amostras são submetidas a SDS-PAGE e coradas com azul bri- lhante de Coomassie G250 (Biorad). O gel corado é equilibrado em água destilada por 1 hora e secado entre duas folhas de celulose de um dia para o outro em temperatura ambiente.

Expressão dos clones de E. coli recombinantes selecionados é realizada em média escala para gerar suficiente proteína recombinante para vacinação de camundongos (vide abaixo). Todas as proteínas recombinan- tes possuindo a fusão hexa-histidina (4 kDa) produzem uma proteína maior com um peso molecular aparente similar ao peso molecular previsto da pro- teína nativa (vide a Tabela 4). Estas proteínas são altamente reativas em Western blotting usando o anticorpo anti-His. Purificação das proteínas com etiqueta his recombinantes por cromatografia por afinidade sob condições desnaturantes tem êxito. SDS-PAGE e coloração com azul de Coomassie de todas as proteínas recombinantes mostram que é obtida uma purificação de no mínimo 85%. Rendimentos de proteína recombinante de 2 mg/L são obti- dos consistentemente usando este protocolo de expressão. Diálise e liofilizacão da proteína com etiqueta His recombinante purificada

As proteínas elutriadas são reunidas e transferidas para dentro de um tubo de diálise hidratado (Spectrum Laboratories, Inc., Los Angeles, CA) com um corte de peso molecular (MWCO) de 3.500 Da. Uma alíquota de 200 μΙ do elutriado reunido é tomada e quantificada usando um teste de proteína comercial (Protein Assay, Biorad). As proteínas são dialisadas con- tra 2 I de água destilada a 4°C com agitação. O tampão de diálise é trocado 8 vezes em intervalos de 12 horas. As proteínas dialisadas são transferidas do tubo de diálise para dentro de alguns tubos de centrífuga de 50 ml (40 ml de volume máximo), e os tubos são colocados a -80°C de um dia para o ou- tro. Os tubos são colocados dentro de um MAXI freeze-drier (Heto-Holten, Allerod, Dinamarca) e Iiofilizados até a secagem. As proteínas Iiofilizadas são em seguida reidratadas com PBS para uma concentração calculada de 2 mg/ml e armazenadas a -20°C. Depois de diálise e liofilização, antígeno recombinante estável é produzido com sucesso.

Sorologia usando proteína recombinante purificada

Vinte pg de proteína recombinante purificada é carregado em uma cavidade de 7 cm IEF1 eletroforesado através de um gel SDS-PAGE a 10% (em peso / volume), e eletro-transferido para membrana de nitrocelulo- se. A membrana é bloqueada com leite desnatado TBS (5% em peso / volu- me) e reunida em um equipamento multi-screen (Biorad). As cavidades são incubadas com 100 μΙ de soro de porco diluído (100 vezes) por 1 hora em temperatura ambiente. O soro de porco foi obtido de porcos em estado de excelente saúde (n = 3), porcos testados experimentalmente apresentando derramamento fecal (n = 6), e porcos infectados naturalmente apresentando derramamento fecal (n = 7). Em seguida a membrana é removida do equi- pamento e lavada três vezes com TBST (0,1% em v/v) antes de incubar com 10 ml de IgG anti-suína de cabra (molécula inteira)-AP (5.000 vezes) por 1 hora em temperatura ambiente. A membrana é lavada três vezes com TBST antes do desenvolvimento de cor usando um kit de substrato de fosfatase alcalina (Biorad). A membrana é lavada com água corrente quando tiver o- corrido desenvolvimento suficiente, secada e escaneada para apresentação.

Todas as proteínas clonadas são reconhecidas por 80-100% do painel de soro de porco, independente do estado de saúde, deste modo indi- cando que os genes tinham sido expressados in vivo e que os porcos foram capazes de induzir uma reação imune sistêmica depois de exposição ao es- piroqueta.

Vacinação de camundonqos usando as proteínas com etiqueta his recombi- nantes purificadas

Para cada uma das proteínas com etiqueta his recombinantes purificadas, dez camundongos são imunizados sistemicamente e oralmente para determinar se a proteína recombinante seria imunogênica. A proteína recombinante é emulsificada com 30% (v/v) de adjuvante de água em óleo e injetada por via intramuscular no músculo quadriceps de dez camundongos (Balb/cJ: machos de 5 semanas de idade). Todos os camundongos recebem 100 pg de proteína em um volume total de 100 μΙ. Três semanas depois da primeira vacinação, todos os camundongos recebem uma segunda vacina- ção intramuscular idêntica à primeira vacinação. Todos os camundongos são mortos duas semanas depois da segunda vacinação. São obtidos soros do coração post-mortem e testados na análise Western blot para anticorpos contra extratos celulares de B. pilosicoli.

Análise Western blot

Vinte pg de proteína recombinante purificada é carregado em uma cavidade de 7 cm IEF, eletroforesado através de um gel SDS-PAGE a 10% (em peso / volume), e eletro-transferido para membrana de nitrocelulo- se. A membrana é bloqueada com leite desnatado TBS (5% em peso / volu- me) e montada no equipamento multi-screen (Biorad). As cavidades são in- cubadas com 100 μΙ de soro de camundongo diluído (100 vezes) por 1 hora em temperatura ambiente. A membrana é removida do equipamento e Iava- da três vezes com TBST (0,1% em v/v) antes de incubar com 10 ml de IgG anti-camundongo de cabra (molécula inteira)-AP (5.000 vezes) por 1 hora em temperatura ambiente. A membrana é lavada três vezes com TBST an- tes do desenvolvimento de cor usando um kit de substrato de fosfatase alca- lina (Biorad). A membrana é lavada com água corrente quando tiver ocorrido desenvolvimento suficiente, secada e escaneada para apresentação.

Análise Western blot mostra um aumento significativo na reativi- dade de anticorpo nos camundongos para os antígenos da vacina recombi- nante depois de vacinação. Todos os camundongos reconhecem proteínas recombinantes as quais são similares em peso molecular às das proteínas recombinantes purificadas coradas com azul de Coomassie. Estes experi- mentos proporcionam evidência de que as proteínas recombinantes são i- munogênicas quando usadas para vacinar camundongos, e que o protocolo de vacinação empregado pode induzir títulos de anticorpos circulantes espe- cíficos contra o antígeno.

Vacinação de porcos usando as proteínas com etiqueta his recombinantes purificadas

Para cada uma das proteínas com etiqueta his recombinantes purificadas, dez porcos soro-negativis são injetados por via intramuscular com 1 mg do antígeno particular em 1 ml de volume de vacina. O antígeno é emulsificado com um volume igual de um adjuvante de água em óleo. Os porcos são vacinados com três semanas de idade e novamente com seis semanas de idade. Um segundo grupo de dez porcos soro-negativos é usa- do como controles negativos e são deixados não vacinados. Todos os por- cos são testados com 100 ml de uma cultura de B. pilosicoli ativa (~109 célu- las/ml) às oito semanas de idade, e os porcos são observados para sinais clínicos de infecção durante o experimento (até seis semanas pós-teste) e no exame post-mortem.

Kit de diagnóstico

É obtido soro de porcos em um chiqueiro com infecção conheci- da por B. pilosicoli, de porcos que se sabia que não estavam infectados com B. pilosicoli, e de porcos em um chiqueiro com estado de infecção descibge- cudi com B. pilosicoli. Vinte pg de proteína recombinante purificada é carre- gado em uma cavidade de 7 cm IEF, eletroforesados através de um gel SDS-PAGE a 10% (peso / volume), e eletro-transferidos para membrana de nitrocelulose. A membrana é bloqueada com leite desnatado TBS (5% em peso / volume) e montada no equipamento multi-screen (Biorad). As cavida- des são incubadas com 100 μΙ de soro de porco diluído (100 vezes) por 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida a membrana é removido do e- quipamento e lavada três vezes com TBST (0,1% em v/v) antes de incubar com 10 ml de IgG anti-suína de cabra (molécula inteira)-AP (5.000 vezes) por 1 hora em temperatura ambiente. A membrana é lavada três vezes com TBST antes do desenvolvimento de cor usando um kit de substrato de fosfa- tase alcalina (Biorad). A membrana é lavada com água corrente quando tiver ocorrido desenvolvimento suficiente, secada e escaneada para apresenta- ção. Os soros dos porcos que se sabia estarem infectados com B. pilosicoli (controles positivos) reagem com as proteínas recombinantes enquanto os soros dos porcos sem infecção (controles negativos) não reagem. Pode-se determinar se os porcos estão infectados com B. pilosicoli comparando os resultados com os controles positivo e negativo.

Apesar desta invenção ter sido descrita com uma referência a modalidades específicas, será óbvio para aqueles com conhecimento regular da técniac que variações nestes métodos e composições podem ser usadas e que se pretende que a invenção pode ser praticada de modo diverso das especificamente descritas aqui, neste requerimento de patente. Por conse- guinte esta invenção inclui todas as modificações englobadas dentro do es- pírito e do âmbito da invenção conforme definido pelas reivindicações. Listagem de Seqüências

<110> Novartis AG

Murdoch University David John Hampson Tom La

Matthew Bellgard

<120> "GENES E PROTEÍNAS DE BRACHYSPIRA PILOSICOLI E USO DOS MESMOS PARA

DIAGNÓSTICO E TERAPIA"

<130> H-34325

<150> AU2005903317

<151> 2005-06-23

<160> 56

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 824 <212> DNA

<213> Brachyspira pilosicoli <400> 1

atgaaaatcg ctaagataat ttttatactg caaactatac taatattatc atcttcgaat 60 gtttttgctg ttgtaacaag aagttatgca agcacaaaaa aaggttttta tgataatgga 120 ctttacaatg gaataatgct tacagagcaa ggttctttga gtttagctcc tctaatagag 180 aaagaaagtt ctatagacgg caaa:tatâ.ta tggaaaatct atcctgctaa agacggaagt 240 atgtatgctg ctataagcgg aaatggagct gagttatata aaaaaagtgc taatgaaact 300 aatttcagcc tttttgtaaa atctgataat gacaatgctt ttactgctgt aattacagat 360 gatgccggca atgtttatgc ggcagttgga ccttatgcta aaattatgaa atatgacagt 420 aacggaaaag agatttggtc taaagatgtt gatgatactt atatatggga catgaagttt 480 gatgctaatg gtaatttata tttagctgca ggcggaaaca atgcaagagt attaaaagta 540 tctgttgccg acggaaagat tactgaaata ttaaaaacag aatatgctca agctgaaaca 600 atatacaatg aagcaaatgc tatgtatact gctgaaacta aagattatag agtattagta 660 gataaacttt atacagcaaa agaggcttat ttagctttat ataataaaac taaagaacaa 720 tttgataaaa gtgatgaagc tttaactaaa gtaaaagagc gtttagctga acttgaagct 780 atggtaaaag agcttgaaac tttagagcaa gagcaacaaa gcta 824 <210> 2 <211> 274 <212> PRT

<213> Brachyspira pilosicoli <400> 2

Met Lys Ile Ala Lys Ile Ile Phe Ile Leu Gln Thr Ile Leu Ile Leu

1 5 10 15

Ser Ser Ser Asn Val Phe Ala Val Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ser Thr

20 25 30

Lys Lys Gly Phe Tyr Asp Asn Gly Leu Tyr Asn Gly Ile Met Leu Thr

35 40 45

Glu Gln Gly Ser Leu Ser Leu Ala Pro Leu Ile Glu Lys Glu Ser Ser

50 55 60

Ile Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Lys Ile Tyr Pro Ala Lys Asp Gly Ser 65 70 75 80

Met Tyr Ala Ala Ile Ser Gly Asn Gly Ala Glu Leu Tyr Lys Lys Ser

85 90 95

Ala Asn Glu Thr Asn Phe Ser Leu Phe Val Lys Ser Asp Asn Asp Asn

100 105 110

Ala Phe Thr Ala Val Ile Thr Asp Asp Ala-Gly Asn Val Tyr Ala Ala

115 120 125

Val Gly Pro Tyr Ala Lys Ile Met Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Lys Glu

130 135 140

Ile Trp Ser Lys Asp Val Asp Asp Thr Tyr Ile Trp Asp Met Lys Phe 145 150 155 160

Asp Ala Asn Gly Asn Leu Tyr Leu Ala Ala Gly Gly Asn Asn Ala Arg

165 170 175

Val Leu Lys Val Ser Val Ala Asp Gly Lys Ile Thr Glu Ile Leu Lys

180 185 190

Thr Glu Tyr Ala Gln Ala Glu Thr Ile Tyr Asn Glu Ala Asn Ala Met

195 200 205

Tyr Thr Ala Glu Thr Lys Asp Tyr Arg Val Leu Val Asp Lys Leu Tyr 210 215 220

Thr Ala Lys Glu Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Asn Lys Thr Lys Glu Gln

225 230 235 240

Phe Asp Lys Ser Asp Glu Ala Leu Thr Lys Val Lys Glu Arg Leu Ala

245 250 255

Glu Leu Glu Ala Met Val Lys Glu Leu Glu Thr Leu Glu Gln Glu Gln

260 265 270

Gln Ser

<210> 3 <211> 2193 <212> DNA

<213> Brachyspira pilosicoli <400> 3

atgcgtgtgg gagaccctta tatacctcag aagttgaatg atgctgttaa tgctataatt 60

acaaactatc aagacaaagg atatttaaag gcttatgttg agcctaaggt tacagaagat 120

aaagaggctt ctgatgttgt gatagaaatg aatattgtag agggtaatga ggttaaggta 180

tcaagcattc gttttcatgg taatacccac ttctctccta atgaattaaa aagacaaatg 240

tctacaaaag aaaatggttt cttatctttg ggtaagttta atgagtttaa gtttgaagaa 300

gataagtcta aaatagtaaa gtattatgct gatagaggtt attataaggc taaggttaat 360

aatgttcaat atacttatca gtggagagac cctcaagtaa aaaatgagca ggacttgatt 420 atagatattt atataacaga gggtgataaa tattattttg gagatattgg ctttaagggt 480

aattttgtta taccttcaga tgttatacag gctgatataa aatcaaaaaa aggtgcttta 540

tataattata cttatcatat gtctgattat cagggcatac aaaataaata ttctgaaaag 600 ggttatatat tcagacaagt tattcctgtt atatcagtta atgaagaaaa taaaatagtt 660

aatataatgt atgatatagt tgaaaacgat aaagcacata tagaaaatat tacaatagca 720

ggaaacacta aaactaaaga ctttgttata cagagatata ttgatataaa acctggtgaa 780

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gacaatatta atattaacgt aaaacctggt tctgctgaag gacttatgga gcttggactt 900

aatgttactg atggtaagtc tgctatggtg tctggaggag gcggtttttc tactggttcc 960

ggatttaagg tatttgcttc cattagagaa aataacttct taggaagagg cttacaatta 1020

ggtttaagcg gtgaatttgg tcaaactcaa aagagaatag cagttaactt tgcagagcct 1080 tatttgctta atttgcctat atatttggga tttgatttat cttactttaa tgaaagtgtt 1140 aatacaggcg accagatagg tacagatcaa tttggtcttc ctaaatattc ttattataca 1200 agacatggtt ttgaaggtat tgctagagtt ggttattatt tctttgacta ctattcaact 1260 ttcttaacat ttgacaccat tgtacagcag tatcagcagt ggtatgacca aggtgcaagt 1320 gcagcaggtc cagaccacgt attgaatgat attagaaaat atttagttca tagaataaat 1380 aaaaaagacg gaagcttcca aagatggcag agtgattggt ttactacttt tatagtgtca 1440 tactcacttc ttagagacag cagaaacgát tatcttaacc ctacaaaggg aagtttctta 1500 agaggtacag tggacttcta ctttaaccac actcaattaa tgagattaaa tgctacagga 1560 ttcttagcta tacctgctac aaaatggtta tcatttgcat tctatggaga gattggtcag 1620 attgttgcta ttcctggtct tcctattcaa aacgatgccg atgtacttta ttatcttaac 1680 ccatttgaag atgttagagg ttgggatact tctaaatata ctatatttaa acataataga 1740 ggcttgagta cttatgactt gccaaatgaa aatggtcaaa aagattcttg gagttatggt 1800 agagctaaag taagattctt tgcagagctt cgtataccta ttatacctaa aactttggga 1860 tttgttggtt ttcttgatgc tggtcaatta tggcttcctc attctactgg tcttaatttt 1920 gacggagatg cttataatta tccttcacag tttatggata ttaaagatat atttgatcct 1980 tcacaatata tgtattctgt aggttttggt ttgagactta ctatacctat atttaatatt 2040 agattttatt ttgctaaaag atttgtttat aataaagagg atattggatt tggtaagggc 2100 ttccaagact ttgagggtga tacttattct cctcttggta agtggcttgg aagaggttgg 2160 ggaattgcct ttacaatgaa ccacccattc tat 2193

<210> 4 <211> 731 <212> PRT

<213> Brachyspira pilosicoli <400> 4

Met Arg Val Gly Asp Pro Tyr Ile Pro Gln Lys Leu Asn Asp Ala Val

1 5 10 15

Asn Ala Ile Ile Thr Asn Tyr Gln Asp Lys Gly Tyr Leu Lys Ala Tyr

20 25 30

Val Glu Pro Lys Val Thr Glu Asp Lys Glu Ala Ser Asp Val Val Ile

35 40 45

Glu Met Asn Ile Val Glu Gly Asn Glu Val Lys Val Ser Ser Ile Arg 50 55 60 Phe His Gly Asn Thr His Phe Ser Pro Asn Glu Leu Lys Arg Gln Met 65 70 75 80

Ser Thr Lys Glu Asn Gly Phe Leu Ser Leu Gly Lys Phe Asn Glu Phe

85 90 95

Lys Phe Glu Glu Asp Lys Ser Lys Ile Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Arg

100 105 110

Gly Tyr Tyr Lys Ala Lys Val Asn Asn Val Gln Tyr Thr Tyr Gln Trp

115 120 125

Arg Asp Pro Gln Val Lys Asn Glu Gln Asp Leu Ile Ile Asp Ile Tyr

130 135 140

Ile Thr Glu Gly Asp Lys Tyr Tyr Phe Gly Asp Ile Gly Phe Lys Gly 145 150 155 160

Asn Phe Val Ile Pro Ser Asp Val Ile Gln Ala Asp Ile Lys Ser Lys

165 170 175

Lys Gly Ala Leu Tyr Asn Tyr Thr Tyr His Met Ser Asp Tyr Gln Gly

180 185 190

Ile Gln Asn Lys Tyr Ser Glu Lys Gly Tyr Ile Phe Arg Gln Val Ile

195 200 205

Pro Val Ile Ser Val Asn Glu Glu Asn Lys Ile Val Asn Ile Met Tyr

210 215 220

Asp Ile Val Glu Asn Asp Lys Ala His Ile Glu Asn Ile Thr Ile Ala 225 230 235 240

Gly Asn Thr Lys Thr Lys Asp Phe Val Ile Gln Arg Tyr Ile Asp Ile

245 250 255

Lys Pro Gly Glu Val Phe Asn Ser Ala Lys Ile Gln Arg Val Gln Glu

260 265 270

Arg Leu Tyr Asn Thr Gln Phe Phe Asp Asn Ile Asn Ile Asn Val Lys

275 280 285

Pro Gly Ser Ala Glu Gly Leu Met Glu Leu Gly Leu Asn Val Thr Asp

290 295 300

Gly Lys Ser Ala Met Val Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Thr Gly Ser 305 310 315 320 Gly Phe Lys Val Phe Ala Ser Ile Arg Glu Asn Asn Phe Leu Gly Arg

325 330 335

Gly Leu Gln Leu Gly Leu Ser Gly Glu Phe Gly Gln Thr Gln Lys Arg

340 345 350

Ile Ala Val Asn Phe Ala Glu Pro Tyr Leu Leu Asn Leu Pro Ile Tyr

355 360 365

Leu Gly Phe Asp Leu Ser Tyr Phe Asn Glu Ser Val Asn Thr Gly Asp

370 375 380

Gln Ile Gly Thr Asp Gln Phe Gly Leu Pro Lys Tyr Ser Tyr Tyr Thr 385 390 395 400

Arg His Gly Phe Glu Gly Ile Ala Arg Val Gly Tyr Tyr Phe Phe Asp

405 410 415

Tyr Tyr Ser Thr Phe Leu Thr Phe Asp Thr Ile Val Gln Gln Tyr Gln

420 425 430

Gln Trp Tyr Asp Gln Gly Ala Ser Ala Ala Gly Pro Asp His Val Leu

435 440 445

Asn Asp Ile Arg Lys Tyr Leu Val His Arg Ile Asn Lys Lys Asp Gly

450 455 460

Ser Phe Gln Arg Trp Gln Ser Asp Trp Phe Thr Thr Phe Ile Val Ser 465 470 475 480

Tyr Ser Leu Leu Arg Asp Ser Arg Asn Asp Tyr Leu Asn Pro Thr Lys

485 490 495

Gly Ser Phe Leu Arg Gly Thr Val Asp Phe Tyr Phe Asn His Thr Gln

500 505 510

Leu Met Arg Leu Asn Ala Thr Gly Phe Leu Ala Ile Pro Ala Thr Lys

515 520 525

Trp Leu Ser Phe Ala Phe Tyr Gly Glu Ile Gly Gln Ile Val Ala Ile

530 535 540

Pro Gly Leu Pro Ile Gln Asn Asp Ala Asp Val Leu Tyr Tyr Leu Asn 545 550 555 560

Pro Phe Glu Asp Val Arg Gly Trp Asp Thr Ser Lys Tyr Thr Ile Phe 565 570 575 Lys His Asn Arg Gly Leu Ser Thr Tyr Asp Leu Pro Asn Glu Asn Gly

580 585 590

Gln Lys Asp Ser Trp Ser Tyr Gly Arg Ala Lys Val Arg Phe Phe Ala

595 600 605

Glu Leu Arg Ile Pro Ile Ile Pro Lys Thr Leu Gly Phe Val Gly Phe

610 615 620

Leu Asp Ala Gly Gln Leu Trp Leu Pro His Ser Thr Gly Leu Asn Phe 625 630 635 640

Asp Gly Asp Ala Tyr Asn Tyr Pro Ser Gln Phe Met Asp Ile Lys Asp

645 650 655

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660 665 670

Leu Thr Ile Pro Ile Phe Asn Ile Arg Phe Tyr Phe Ala Lys Arg Phe

675 680 685

Val Tyr Asn Lys Glu Asp Ile Gly Phe Gly Lys Gly Phe Gln Asp Phe

690 695 700

Glu Gly Asp Thr Tyr Ser Pro Leu Gly Lys Trp Leu Gly Arg Gly Trp 705 710 715 720

Gly Ile Ala Phe Thr Met Asn His Pro Phe Tyr 725 730

<210> 5 <211> 807 <212> DNA

<213> Brachyspira pilosicoli <400> 5

atgaaaaagg ttttattatt attatgtttt tcattgtttt tagcttcttg cggcggaaat 60 aatgataata aaaaagattt aatcacagta aagatagggc atgttggtga atctgacaga 120 actatatgga agcctgtaca agagaaatta ttaaacgaag gcattaaagt agaattagtt 180 tcttttgctg attatactat accaaatcag gcattaaatg acggcgatat agatttagat 240 gcttttcagc accatgcata ctacagcaat gaagttaata ctaaaggtta tgatttagct 300 atattgggtg ttacttatat atctgctatg aatatttatt ctcataatat tacaaatgtt 360 aatgaggtta aaaatggaga taaagttgct atacctaatg accctgctaa tggcggaagg 420 gctttaaaag tattagaggc tgctggttta ataaagttaa aagataatgc tccagacaat 480 cctacagtta atgatataga aaatccttta aatttagaga ttatagaggt tgatgcgggc 540 agtttatata gtttgcttcc tgatgttgct tgtgcggtta ttaattgtaa ttatgcttta 600 gattttggtc ttaatccggg tgctgattat atatttagag atgaccctaa aaattatgac 660 aataatatgt atataaactt aatagcttca agggcttctg ataaggataa tgagatttat 720 aagagggtag tagaggctta tcaatctgct gaagtagaaa aagtttatgc tgaagatttt 780 aagggagctt atatacctgc ttggaaa 807

<210> 6 <211> 269 <212> PRT

<213> Brachyspira pilosicoli <400> 6

Met Lys Lys Val Leu Leu Leu Leu Cys Phe Ser Leu Phe Leu Ala Ser 1 5 10 15

Cys Gly Gly Asn Asn Asp Asn Lys Lys Asp Leu Ile Thr Val Lys Ile 20 25 30

Gly His Val Gly Glu Ser Asp Arg Thr Ile Trp Lys Pro Val Gln Glu

35 40 / 45

Lys Leu Leu Asn Glu Gly Ile Lys Val Glu Leu Val Ser Phe Ala Asp 50 55 60

Tyr Thr Ile Pro Asn Gln Ala Leu Asn Asp Gly Asp Ile Asp Leu Asp 65 70 75 80

Ala Phe Gln His His Ala Tyr Tyr Ser Asn Glu Val Asn Thr Lys Gly 85 90 95

Tyr Asp Leu Ala Ile Leu Gly Val Thr Tyr Ile Ser Ala Met Asn Ile 100 105 110

Tyr Ser His Asn Ile Thr Asn Val Asn Glu Val Lys Asn Gly Asp Lys

115 120 125

Val Ala Ile Pro Asn Asp Pro Ala Asn Gly Gly Arg Ala Leu Lys Val 130 135 140

Leu Glu Ala Ala Gly Leu Ile Lys Leu Lys Asp Asn Ala Pro Asp Asn 145 150 155 160 Pro Thr Val Asn Asp Ile Glu Asn Pro Leu Asn Leu Glu Ile Ile Glu

165 170 175

Val Asp Ala Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Leu Pro Asp Val Ala Cys Ala

180 185 190

Val Ile Asn Cys Asn Tyr Ala Leu Asp Phe Gly Leu Asn Pro Gly Ala

195 200 205

Asp Tyr Ile Phe Arg Asp Asp Pro Lys Asn Tyr Asp Asn Asn Met Tyr

210 215 220

Ile Asn Leu Ile Ala Ser Arg Ala Ser Asp Lys Asp Asn Glu Ile Tyr 225 230 235 240

Lys Arg Val Val Glu Ala Tyr Gln Ser Ala Glu Val Glu Lys Val Tyr

245 250 255

Ala Glu Asp Phe Lys Gly Ala Tyr Ile Pro Ala Trp Lys 260 265

<210> 7 <211> 852 <212> DNA

<213> Brachyspira pilosicoli <400> 7

atgaaaaatg ttttttattt attactaata ttactttctt taatctcttg taacaataat 60 aataatcaaa acacaactga caaacttcaa gtatatgcaa gtatatatcc tatttatgat 120 ttcgctaaaa aaattggcgg agagaaaata gatatttata atataacttc agcaggttca 180 gagcctcatg actttgagct tacatcaaaa gatatggcta atttaagcaa ggctaatcta 240 tttatatata atggtgcttc aatggagcat tgggcagaca ctgttaaaga tacaataaaa 300 gatttaaaat atttagaggc ttcttcaaat atcaataacg aagaattaga ccctcatttt 360 tggctttcac ctaaaaaagc aaaagttcaa atggaaaata taaaaaatgt acttgcagaa 420 ttagacagta aaaacgctga ttattataat tctaattaca atttatatgc tgctaaatta 480 gatgagcttg ataaaagctt tagagataat ttacaaaaca taaaaaacac taatttggtt 540 gttactcacc ctgcattcgg acatttctgc aaagaatata atcttaatca agttgcaata 600 gcaagagatg aagctgatgc taaagccatg gctcaaacaa ttaatttcat aaaaaacaat 660 aatattaaaa ctatatttta tgaagacttc tcaagttcta agcttgtaga ttctattgca 720 aaagaaacag gagtaaaagt aagtgcatta aaccctatag agtctttaag tgaagaatat 780 attaaatctg gagaggacta tttctctata atgcagaaga atctagaagc tataacaaat 840 ggtcttaata at 852

<210> 8 <211> 284 <212> PRT

<213> Brachyspira pilosicoli <400> 8

Met Lys Asn Val Phe Tyr Leu Leu Leu Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ser 1 5 10 15

Cys Asn Asn Asn Asn Asn Gln Asn Thr Thr Asp Lys Leu Gln Val Tyr 20 25 30

Ala Ser Ile Tyr Pro Ile Tyr Asp Phe Ala Lys Lys Ile Gly Gly Glu

35 40 45

Lys Ile Asp Ile Tyr Asn Ile Thr Ser Ala Gly Ser Glu Pro His Asp

50 55 60

Phe Glu Leu Thr Ser Lys Asp Met Ala Asn Leu Ser Lys Ala Asn Leu 65 70 75 80

Phe Ile Tyr Asn Gly Ala Ser Met Glu His Trp Ala Asp Thr Val Lys 85 90 95

Asp Thr Ile Lys Asp Leu Lys Tyr Leu Glu Ala Ser Ser Asn Ile Asn 100 105 110

Asn Glu Glu Leu Asp Pro His Phe Trp Leu Ser Pro Lys Lys Ala Lys

115 120 125

Val Gln Met Glu Asn Ile Lys Asn Val Leu Ala Glu Leu Asp Ser Lys 130 135 140

Asn Ala Asp Tyr Tyr Asn Ser Asn Tyr Asn Leu Tyr Ala Ala Lys Leu 145 150 155 160

Asp Glu Leu Asp Lys Ser Phe Arg Asp Asn Leu Gln Asn Ile Lys Asn 165 170 175

Thr Asn Leu Val Val Thr His Pro Ala Phe Gly His Phe Cys Lys Glu 180 185 190

Tyr Asn Leu Asn Gln Val Ala Ile Ala Arg Asp Glu Ala Asp Ala Lys 195 200 205

Ala Met Ala Gln Thr Ile Asn Phe Ile Lys Asn Asn Asn Ile Lys Thr

210 215 220

Ile Phe Tyr Glu Asp Phe Ser Ser Ser Lys Leu Val Asp Ser Ile Ala 225 230 235 240

Lys Glu Thr Gly Val Lys Val Ser Ala Leu Asn Pro Ile Glu Ser Leu

245 250 255

Ser Glu Glu Tyr Ile Lys Ser Gly Glu Asp Tyr Phe Ser Ile Met Gln

260 265 270

Lys Asn Leu Glu Ala Ile Thr Asn Gly Leu Asn Asn 275 280

<210> 9 <211> 1197 <212> DNA

<213> Brachyspira pilosicoli <400> 9

atggaaaaaa aatttaaact tggattagtg cctaggctga ttatcggaat tttgcttggt 60 atattttttg gacagcaatt tataccagaa gtaatatcta gagtcatagt aacggcatct 120 ggtatattta gttcttattt aaaatttgta atacctttga tgatagtttc ttatgtatcc 180 atgggtatag ctgatttgaa agaaggttca gggttcttat tgcttgtaac atgtatattg 240 gcttatggct ctacattaat tgctggctct gcatcattct tggtggctta caatttattt 300 cctagcttta tgagtgctga tgatattcag agaattgctg atgctgctgg taattctgtt 360 actccttatt tatctataac cgtaacacct ttattagata ctttagctgc tgttttattt 420 gcatttataa taggacttgg aatatctact atgagaggaa aagaaatagg agaatattta 480 tacaatgtat ttaaagaatt atctactatt attgataaag ttttgcgtgt atctataatt 540 cctttacttc ctctttatat ttgtggtact tttgttgata tgactagatc tggaaaaact 600 tttgtaatat taggaatatt atggaaagta ttcttagtag ttattattat gcatttaata 660 tatcttctaa tagctttctt agtatctggt actataggaa agaaaaatcc ttttatgctt 720 atgaagaacc aaattgcagg atatgcaact gctttaggta cacagtcatc tgctgctact 780 atacctgtta atttacaatg tgcagaaaaa gatggtatat ctgaacaaat aagaaatttc 840 gtagtacctc tttgtgctaa tattcacatg gcaggctcta tgattacaat tacagcatgt 900 gccacagcag tatgtttgat gaatcagatt cctatttctt ataatactat acttccattt 960 attgctatgc ttggtattgc tatgatagct tctcctggtg ctcctggcgg ttctataatg 1020

acagctttac cattccttta tatggttggt cttggcggtc ctgacagtcc tttaagtgct 1080 ataatggttg ctctatacat cactcaagac tcattcggta ctgcttgtaa tgtatctggt 1140

gataatgctt taggtgttat agtggataca atatataaaa agaaagttgt aaaagct 1197

<210> 10

<211> 399 <212> PRT

<213> Brachyspira pilosicoli <400> 10

Met Glu Lys Lys Phe Lys Leu Gly Leu Val Pro Arg Leu Ile Ile Gly 1 5 10 15

Ile Leu Leu Gly Ile Phe Phe Gly Gln Gln Phe Ile Pro Glu Val Ile

20 25 30

Ser Arg Val Ile Val Thr Ala Ser Gly Ile Phe Ser Ser Tyr Leu Lys 35 40 45

Phe Val Ile Pro Leu Met Ile Val Ser Tyr Val Ser Met Gly Ile Ala

50 55 60

Asp Leu Lys Glu Gly Ser Gly Phe Leu Leu Leu. Val Thr Cys Ile Leu 65 70 75 80

Ala Tyr Gly Ser Thr Leu Ile Ala Gly Ser Ala Ser Phe Leu Val Ala

85 90 95

Tyr Asn Leu Phe Pro Ser Phe Met Ser Ala Asp Asp Ile Gln Arg Ile

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Gly Asn Ser Val Thr Pro Tyr Leu Ser Ile Thr Val .

115 120 125

Thr Pro Leu Leu Asp Thr Leu Ala Ala Val Leu Phe Ala Phe Ile Ile

130 135 140

Gly Leu Gly Ile Ser Thr Met Arg Gly Lys Glu Ile Gly Glu Tyr Leu 145 150 155 160

Tyr Asn Val Phe Lys Glu Leu Ser Thr Ile Ile Asp Lys Val Leu Arg

165 170 175

Val Ser Ile Ile Pro Leu Leu Pro Leu Tyr Ile Cys Gly Thr Phe Val Asp Met Thr 195

Lys Val Phe 210 Ala Phe Leu 225

Met Lys Asn

Ser Ala Ala

Ile Ser Glu 275

His Met Ala

290 Cys Leu Met 305

Ile Ala Met

Gly Ser Ile

Gly Pro Asp 355

Gln Asp Ser

370 Gly Val Ile 385 <210> 11 <211> 24 <212> DNA

180 185 190

Arg Ser Gly Lys Thr Phe Val Ile Leu Gly Ile Leu Trp

200 205

Leu Val Val Ile Ile Met His Leu Ile Tyr Leu Leu Ile

215 220

Val Ser Gly Thr Ile Gly Lys Lys Asn Pro Phe Met Leu 230 235 240

Gln Ile Ala Gly Tyr Ala Thr Ala Leu Gly Thr Gln Ser

245 250 255

Thr Ile Pro Val Asn Leu Gln Cys Ala Glu Lys Asp Gly 260 265 270

Gln Ile Arg Asn Phe Val Val Pro Leu Cys Ala Asn Ile

280 285

Gly Ser Met Ile Thr Ile Thr Ala Cys Ala Thr Ala Val

295 300

Asn Gln Ile Pro Ile Ser Tyr Asn Thr Ile Leu Pro Phe 310 315 320

Leu Gly Ile Ala Met Ile Ala Ser Pro Gly Ala Pro Gly

325 330 335

Met Thr Ala Leu Pro Phe Leu Tyr Met Val Gly Leu Gly 340 345 350

Ser Pro Leu Ser Ala Ile Met Val Ala Leu Tyr Ile Thr

360 365

Phe Gly Thr Ala Cys Asn Val Ser Gly Asp Asn Ala Leu

375 380

Val Asp Thr Ile Tyr Lys Lys Lys Val Val Lys Ala 390 395

<213> Seqüência <220>

Artificial <223> Forward Primer for ACl <400> 11

atcgctaaga taatttttat actg <210> 12 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Reverse primer AC1-R822 <400> 12

gctttgttgc tcttgctcta aag <210> 13 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Forward primer AC1-F226 <400> 13

ccatttccgc ttatagcagc atac <210> 14 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Reverse primer AC1-R542 <400> 14

gatactttta atactcttgc attg <210> 15 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Forward primer P4-F4 <400> 15

cgtgtgggag acccttatat acc <210> 16 <211> 27 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Reverse primer P4-R1113 <400> 16

aaatcccaaa tatataggca aattaag <210> 17 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Forward primer P4-F1072 <400> 17

gcagagcctt atttgcttaa tttg <210> 18 <211> 25 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Reverse primer P4-R2193 <400> 18

atagaatggg tggttcattg taaag <210> 19 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Forward primer P4-F458

<400> 19

ttggagatat tggctttaag ggta <210> 20 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Reverse primer P4-R1659 <400> 20

ggcatcgttt tgaataggaa ga <210> 21 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Forward primer P6-F3 5 <400> 21

tgtttttagc ttcttgcggc <210> 22 <211> 25 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Reverse primer P6-R713 <400> 22

tcattatcct tatcagaagc ccttg <210> 23 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Forward primer P6-F219

<400> 23

tgacggcgat atagatttag atgc <210> 24 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Reverse primer P6-R578 <400> 24

accgcacaag caacatcagg <210> 25 <211> 26 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Forward primer P11-F33 <400> 25

actttcttta atctcttgta acaata <210> 26 <211> 26 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Reverse primer P11-R864 <400> 26

ccatttgtta tagcttctag attctt <210> 27 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Forward primer P11-F26 <400> 27

tggagcattg ggcagacact 20

<210> 28 <211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Reverse primer P11-R566

<400> 28

aaatgtccga atgcagggtg 20

<210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Forward primer P14-F41 <400> 29

ttatcggaat tttgcttggt 20

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Reverse primer P14-R1142

<400> 30

tcaccagata cattacaagc agt 23

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Forward primer P14-F332 <400> 31

gaattgctga tgctgctggt <210> 32 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Reverse primer P14-R858 <400> 32

agcacaaaga ggtactacga aa <210> 33 <211> 33 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer ACl-Fl-XhoI <400> 33

aaactcgaga tgaccctaca tattttttca cag <210> 34 <211> 32 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer ACl-R822-EcoRI <400> 34

aaagaattcg ctttgttgct cttgctctaa ag <210> 35 <211> 32 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Primer P4-F4-XhoI <400> 35

ctactcgagc gtgtgggaga cccttatata cc <210> 36 <211> 36 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer P4-R1113-ECORI <400> 36

agagaattca aatcccaaat atataggcaa attaag <210> 37 <211> 33 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer P4-F1072-Xhol <400> 37

gttctcgagg cagagcctta tttgcttaat ttg <210> 38 <211> 34 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer P4-R2193-EcoF.l <400> 38

gttgaattca tagaatgggt ggttcattgt aaag <210> 39 <211> 33 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer P6-F52-XhoI <400> 39

gctctcgagg cggaaataat gataataaaa aag <210> 40 <211> 32 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer P6-R807-EcoRl <400> 40

gttgaattct ttccaagcag gtatataagc tc <210> 41 <211> 35 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Pll-F52-XhoI <400> 41

atcctcgaga acaataataa taatcaaaac acaac <210> 42 <211> 36 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Pll-R852-EcoRI <400> 42

gttgaattca ttattaagac catttgttat agcttc <210> 43 <211> 36 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer P14-F4-XhoI <400> 43

atactcgagg aaaaaaaatt taaacttgga ttagtg <210> 44 <211> 38 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer P14-R1197-EcoRl <400> 44

gttgaattca gcttttacaa ctttcttttt atatattg <210> 45 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> pTrcHis-F primer <400> 45

caatttatca gacaatctgt gtg <210> 46 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> pTrcHis-R primer <400> 46

tgcctggcag ttccctactc tcg <210> 47 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Τ3 primer

<400> 47

taaccctcac taaagggaac <210> 48 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Τ7 primer <400> 48

gtaatacgac tcactatagg gc <210> 49 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> ACl-FO primer <400> 49

gcatcattaa tggattttga age <210> 50 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> ACl-Fl primer <400> 50

ctgtaggagg agtttgcggt tc <210> 51 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> AC1-F2 primer

<400> 51

ttactttagt taaagcttca tcac <210> 52 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> AC1-F3 primer <400> 52

agcagtaaaa gcattgtcat tatc <210> 53 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> AC1-F4 primer <400> 53

tgataatatt agtatagttt gcag <210> 54 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> AC1-F5 primer <400> 54

taaatgtata gtctctcctg caac <210> 55 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> AC1-F6 primer

<400> 55

ttaccctatg caagctggcg gaac <210> 56 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> AC1-F7 primer <400> 56

tttaatttaa gagtattaaa tgac

Claims

1. Polinucleotídeo compreendendo a seqüência selecionada entre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, e 9.

2. Plasmídeo compreendendo o polinucleotídeo da reivindicação 1.

3. Plasmídeo da reivindicação 2 em que o referido plasmídeo é um vetor de expressão.

4. Célula contendo o plasmídeo da reivindicação 2.

5. Célula contendo o plasmídeo da reivindicação 3.

6. Composição imunogênica compreendendo o plasmídeo da reivindicação 3.

7. Composição de vacina para o tratamento ou prevenção de Brachyspira pilosicoli compreendendo o vetor de expressão da reivindicação 3.

8. Composição de vacina para o tratamento ou prevenção de

9. Molécula de DNA compreendendo uma seqüência que é no mínimo 70% homóloga ao polinucleotídeo da reivindicação 1.

10. Plasmídeo compreendendo o polinucleotídeo da reivindicação 9.

11. Molécula de DNA da reivindicação 9 em que a referida mo- lécula de DNA é no mínimo 80% homóloga ao polinucleotídeo da reivindi- cação 1.

12. Plasmídeo compreendendo o polinucleotídeo da reivindica- ção 11.

13. Molécula de DNA da reivindicação 9 em que a referida mo- lécula de DNA é no mínimo 90% homóloga ao polinucleotídeo da reivindi- cação 1.

14. Plasmídeo compreendendo o polinucleotídeo da reivindica- ção 13.

15. Polipeptídeo compreendendo a seqüência selecionada en- tre o grupo consistindo de SEQ ID N-: 2, 4, 6, 8, e 10.

16. Polinucleotídeo compreendendo uma seqüência a qual codi- fica o polipeptídeo da reivindicação 15.

17. Plasmídeo compreendendo o polinucleotídeo da reivindicação 16.

18. Plasmídeo da reivindicação 17, em que o referido plasmídeo é um vetor de expressão.

19. Célula contendo o plasmídeo da reivindicação 17.

20. Composição imunogênica compreendendo a célula da rei- vindicação 19.

21. Proteína compreendendo uma seqüência que é no mínimo 70% homóloga ao polipeptídeo da reivindicação 15.

22. Proteína da reivindicação 21, em que a referida proteína é no mínimo 80% homóloga ao polipeptídeo da reivindicação 15.

23. Proteína da reivindicação 22, em que a referida proteína é no mínimo 90% homóloga ao polipeptídeo da reivindicação 15.

24. Composição imunogênica compreendendo a proteína da rei- vindicação 23.

25. Composição imunogênica compreendendo o polipeptídeo da reivindicação 15.

26. Composição de vacina para o tratamento ou prevenção de Brachyspira pilosicoli compreendendo o polipeptídeo da reivindicação 15.

27. Anticorpo monoclonal que liga ao polipeptídeo da reivindicação 15.

28. Kit para o diagnóstico da presença de Brachyspira pilosicoli em um animal, o referido kit compreendendo o anticorpo monoclonal da rei- vindicação 27.

29. Kit para o diagnóstico da presença de Brachyspira pilosicoli em um animal, o referido kit compreendendo os polipeptídeos da reivindica- ção 15.

30. Kit para o diagnóstico da presença de Brachyspira pilosicoli em um animal, o referido kit compreendendo os polinucleotídeos da reivindicação 1.

31. Método para produzir uma reação imune para Brachyspira pilosicoli em um animal compreendendo administrar ao referido animal a composição imunogênica da reivindicação 24.

32. Método para produzir uma reação imune para Brachyspira pilosicoli em um animal compreendendo administrar ao referido animal a composição imunogênica da reivindicação 25.

33. Método para produzir uma reação imune para Brachyspira pilosicoli em um animal compreendendo administrar ao referido animal a composição imunogênica da reivindicação 6.

34. Método para produzir uma reação imune para Brachyspira pilosicoli em um animal compreendendo administrar ao referido animal a composição imunogênica da reivindicação 20.

35. Método para tratar ou prevenir uma doença causada por Brachyspira pilosicoli em um animal que necessite de semelhante tratamento compreendendo administrar ao referido animal uma quantidade terapeutica- mente eficaz da composição de vacina da reivindicação 7.

36. Método para tratar ou prevenir uma doença causada por Brachyspira pilosicoli em um animal que necessite de semelhante tratamento compreendendo administrar ao referido animal uma quantidade terapeutica- mente eficaz da composição de vacina da reivindicação 8.

37. Método para tratar ou prevenir uma doença causada por Brachyspira pilosicoli em um animal que necessite de semelhante tratamento compreendendo administrar ao referido animal uma quantidade terapeutica- mente eficaz da composição de vacina da reivindicação 26.