CN102373276B - 一种检测猪痢疾的实时荧光pcr试剂盒及寡核苷酸序列 - Google Patents
一种检测猪痢疾的实时荧光pcr试剂盒及寡核苷酸序列 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测猪痢疾的实时荧光PCR试剂盒及核苷酸序列。所述一组检测猪痢疾的寡核苷酸序列，为序列表SEQIDNo：1至序列表SEQIDNo：3所示的寡核苷酸序列。本发明还提供了一种含有上述寡核苷酸序列的检测试剂盒。本发明的优点是：实时荧光PCR技术被应用到猪痢疾的检测中，进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测。通过反应条件的优化，该实时荧光PCR最低可检测至102拷贝/反应的病原量。该方法还对来自七个猪场的318份临床样品进行了检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在进出境样品检疫和临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种实时荧光PCR检测猪痢疾的试剂盒及其引物与探针，属于检验检疫领域。
背景技术
猪痢疾（Swine dysentery；SD）的病原体是一种革兰氏阴性的厌氧性螺旋体，先后命名为是由猪痢疾密螺旋体（Treponema hyodysenteriae;T.h）、猪痢疾蛇形螺旋体（Serpulinahyodysenteriae；S.h）。现在统一命名为猪痢疾短螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae；B.h），目前猪痢疾密螺旋体这一名称由于历史的原因还被广泛使用。该病是猪的一种肠道传染病，以黏液性或黏液出血性腹泻为特征。在猪群中的发病率相当高，病猪生长发育受阻，耗料增加，给各地养猪业造成很大的经济损失。据统计病猪的饲料消耗率为正常猪的2倍，而增重率仅为正常猪的1/2。根据1983年Lyson的统计，为控制猪痢疾在饲料中添加的药物，每头猪花费2.5-2.8美元。根据Wood等（1988年）的计算，猪痢疾猪群的饲料消耗，每头上市猪要多花12.6美元，同时每头猪还要多花费2.4美元。在美国估计每年由于猪痢疾而损失6400万美元。
该病遍布五大洲50多个国家和地区。在我国，许多省、市都有该病的存在，并且一旦传入猪群，若不采取严格的处理措施很难根除。
1978年10月，上海口岸在从美国进口的451头商品猪的检疫中确诊猪痢疾后，1979年初又在我国猪只中确诊猪痢疾，并从国内猪只分离得到猪痢疾短螺旋体纯培养，引起我国兽医界的重视，并被列入《中华人民共和国进境一、二类传染病》。
在进出口的双边协议中美国、英国、澳大利亚、新西兰、荷兰、丹麦、爱尔兰、及日本等国的进口猪要求进行猪痢疾短螺旋体的检测。现有检测条件要求高（严格的厌氧培养），一般实验室很难满足检测的要求。
到目前为止，该病还没有满意的简单可行的检测方法。在入境检测中采用行业标准SN/T 1207-2003《猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程》，检验周期要两周时间，并且要求严格的厌氧培养监控，因此急需一种快速、敏感、特异性强的检测方法以替代或者补充该规程。
Taqman荧光实时定量检测病原的技术具有灵敏度高、特异性强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安全性高等突出优点，灵敏度比普通PCR灵敏度高100倍以上，最大限度的避免了交叉污染，是国际上公认的快速准确技术之一，可检测到很微量的病毒核酸。我们已经将其应用到了禽流感病毒、新城疫病毒、猪链球菌以及口蹄疫病毒亚洲1型的检测领域，取得了很好的技术效果。
TaqMan技术的要点是在普通PCR原有一对特异性引物基础上增加特异性的荧光双标记探针。该探针结合部位位于引物结合区域的中间。探针的5’端和3’端分别标记不同的荧光素，如5’端标记的荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用R表示），3’端标记的荧光素，在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团（用Q表示）。当PCR反应在退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，此时的Taq酶发挥它的5’→3’外切核酸酶的功能，将探针切成单核苷酸，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收。
PCR进行一个循环，合成了N条新链的同时，就水解了N条探针，亦释放了相应数量的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与PCR反应产物的量呈对应关系。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。如果以每一个PCR循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以PCR循环数为横坐标作图，即可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线—称为扩增曲线。当检测标本中含有所要检测病原体的核酸序列时，所得到的曲线呈“S”型；而当标本中不含病原体，则PCR过程不发生，探针不被水解，不产生荧光信号，其扩增曲线为一水平线。
PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近，称为阈值线（Threshold）；而扩增曲线与阈值线交叉点的循环数称为Ct值。样本中病原体的浓度越高，Ct值就越小。以此方法测定未知标本中的病原体核酸，不仅能快速定性，还因为荧光PCR本身先进的荧光信号检测系统和强大的信息处理能力，可以实现对病原体核酸的定量。
实时荧光PCR技术具有高灵敏度和高特异性的优点，还可做到实时定量，具有快速、特异、敏感和较强防止交叉污染的特点，可检测到很微量的细菌。
本发明的优点在于，与病原分离培养相比，1、实时荧光PCR更快、更便捷，细菌分离培养方法至少需要10天且培养条件苛刻，需要严格的厌氧培养，而荧光PCR仅需4小时；2、由于病原为厌氧菌，如果采样及运输时间过长则对于少量感染的样品容易出现培养失败的现象，而荧光PCR检测的是核酸，在特异性相当的情况下可以有效地提高检测的敏感性。
本发明在我国首次将实时荧光PCR技术应用于猪痢疾检测，提供了针对猪痢疾短/密螺旋体特异性引物序列、探针序列、试剂盒和检测方法。与传统的病原分离方法相比具有快速高效的特点。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一组作为引物或探针使用的、检测猪痢疾的寡核苷酸序列。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测猪痢疾的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一组检测猪痢疾的寡核苷酸序列，为序列表SEQ ID No：1至序列表SEQ ID No：3所示的寡核苷酸序列；其中SEQ ID No：1和SEQ ID No：2为检验猪痢疾的引物对， SEQ ID No：3为猪痢疾的探针序列。详见表1。
表1. 引物和探针序列
| 名称 | 序列（5’-3’） | 序列表编号 |
| 引物I | ATGGTGCTATTGTAGTWGATACT | SEQ ID No：1 |
| 引物II | ACCCATTCTTACAGCATTWGT | SEQ ID No：2 |
| 探针 | [FAM]-CTAAAGATC+CTGA+TG+TATTTGC-[TAMRA] | SEQ ID No：3 |
注：胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）；W代表A/T；
其中，引物I和引物II分别为检测猪痢疾的正义引物和反义引物，探针为猪痢疾检测荧光探针，加号“+”后面的碱基需用LNA进行修饰，即第10、14、16位的碱基用LNA进行修饰，探针的5’端标记报告荧光基团FAM（6－羧基荧光素），3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。
一种检测猪痢疾的实时荧光PCR试剂盒，保存于-20℃，由以下试剂组成：
1）DNA提取液I：5mL/管×5管；其配制方法为PEG 8000 20.74g，加NaCl 17.53g，用三蒸水定容至100mL，分装5.0mL/管；
2）DNA提取液II：500μL /管×1管；其配制方法为1.0 mol/L Tris-Cl 2.0mL，2.0 mol/L KCl 5.0mL，0.5 mol/L EDTA 0.5mL，NP-40 1.0 mL, 用三蒸水定容至100mL，分装500μL/管；
3）PCR反应液， 750μL×1管，包括：1×PCR缓冲液 、3.0mM MgCl2 、 0.2mM dNTP、0.2μM引物I 、0.2 μM引物II和0.1 μM探针；其中，引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；第10、14、16位的碱基用LNA进行修饰；
4）Taq DNA聚合酶 5 U/μL，15μL×1管；
5）无DNA酶的灭菌纯化水，1mL×1管；
6）阴性对照：1mL×1管：DEPC水；
7）阳性对照：1mL×1管；为猪痢疾短/密螺旋体nox基因片段，Ct值为20.0～28.0，所述nox基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒检测猪痢疾的方法，包括如下步骤：
1）提取样品DNA；
2）对提取的样品DNA进行PCR扩增：
引物I：5’-ATGGTGCTATTGTAGTWGATACT-3’ （SEQ ID NO：1）
引物II：5’-ACCCATTCTTACAGCATTWGT-3’ （SEQ ID NO：2）
荧光探针为5’-[FAM] CTAAAGATC+CTGA+TG+TATTTGC[TAMRA]-3’；（SEQ ID NO：3）
第一步 94℃： 3 min， 1个循环；
第二步 94℃： 10 sec， 55℃： 5 sec，60℃： 30 sec（收集荧光信号），40个循环。
3）结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无猪痢疾短/密螺旋体；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪痢疾短/密螺旋体。
本发明中发明人以实时荧光PCR对模板进行检测，验证了该方法的特异性。实时荧光PCR与传统的分离培养法的比较实验的结果也表明，两种方法在检测上并没有明显差异。
本发明以通过对稀释的模板检测，开展了敏感性实验。实验结果显示，最低可以检测到102拷贝/反应的DNA模板量，具有较高的灵敏度。
用该方法对7个猪场采集的318份猪粪拭子进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。由此我们也可以得出结论，在大批量样本检测中，完全可以用实时荧光PCR方法，以达到减少工作量，提高工作效率，减少检测成本的目的。
本发明的优点是：实时荧光PCR技术被应用到猪痢疾检测中，进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测。通过反应条件的优化，该实时荧光PCR最低可检测至102拷贝/反应的细菌量。该方法还对7个猪场采集的318份猪粪拭子进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在进出境样品检疫和临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为实时荧光PCR反应体系优化后，得到的特异性扩增曲线；其中， 1：阳性对照；2：阴性对照；
图2A为检测猪痢疾的实时荧光PCR检测试剂盒B.h七个标准菌株的特异性试验试验结果；其中， 1：阳性对照；2：阴性对照；3-9：B.h（ATCC编号依次为49526、27164、31287、49527、49886、31212、49887）；
图2B为检测猪痢疾的实时荧光PCR检测试剂盒肠道致病菌特异性试验结果；其中， 1：阳性对照；5：阴性对照；2：沙门氏菌；3：B.i （ATCC编号：29796）；4：猪链球菌（已灭活）； 6：大肠杆菌；
图3为检测猪痢疾的实时荧光PCR检测试剂盒的灵敏性检测结果；其中， 1-7：106-1.0拷贝/微升（依次作10倍梯度稀释）；8：阴性对照。
具体实施方式
本发明所用Brachyspira hyodysenteriae（B.h）、Brachyspira innocens（B.i）、大肠杆菌和沙门氏菌，均为北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心保存，灭活的猪链球菌由中国兽医药品监察所提供。
实施例1：Taqman 探针和引物的设计与合成
根据Genbank中登录的猪痢疾密螺旋体的相关基因序列，用DNAMAN 软件进行比对分析，分别选择nox基因高度保守的区域，用Primer Express V2.0软件，设计出针对猪痢疾密螺旋体的探针和引物。同表1。
引物和探针由上海旭冠生物技术有限公司合成。
实施例2：猪痢疾短/密螺旋体DNA的提取
用DNA提取试剂提取猪痢疾短/密螺旋体DNA。
具体操作如下：
①取n个1.5 mL灭菌离心管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
②每管加入200μL DNA提取液I，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各200 μL，一份样本换用一个吸头；混匀器上震荡混匀5 s。于4 ℃~25℃条件下，13000 r/min离心10 min。
③尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入10μL DNA提取液II，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃~25℃条件下，2000 r/min离心10 s。
④100 ℃干浴或沸水浴10min；5000 r/min离心5s,充分振荡一下，5000 r/min再次离心5s，加入90μL无DNA酶的灭菌纯化水，充分振荡后，5000 r/min离心5 min，上清即为提取的DNA，冰上保存备用。
⑤提取的DNA须在2 h内进行PCR扩增或放置于-80℃冰箱。
实施例3：实时荧光PCR的建立
一、 对探针和引物浓度、镁离子浓度和酶浓度分别进行了优化，建立了实时荧光PCR的反应体系。
按照实施例2方法获得猪痢疾短/密螺旋体DNA，模板浓度约为104-106 拷贝/微升，进行实时荧光PCR，优化反应体系。
（1）探针和引物浓度的优化
对探针和引物分别进行优化。从0.1 μM至0.8 μM以0.1 μM间距递增的引物浓度和从0.1 μM至0.5 μM以0.1 μM间距递增的探针浓度交叉配比，进行实时荧光PCR，以选择最适的引物和探针浓度。反应体系件见表2，所用引物和探针序列见表1：
表2引物探针优化PCR反应体系
| 组 分 | 加入量/终浓度 |
| 10×PCR buffer | 2.5μl |
| 2.5 mM dNTP | 2μl |
| 25 mM MgCl2 | 3.0mM |
| 引物I (10 μM) | xμM |
| 引物II(10 μM) | yμM |
| 探针(10 μM) | zμM |
| 模板DNA | 10μl |
| 5 U/μl Taq DNA 聚合酶 | 0.25μl |
| 补灭菌去离子水 | 至25μl |
（2）镁离子浓度的优化
通过加入MgCl2溶液（25mM）进行镁离子浓度的优化，分别以1.0 mM-5.0 mM的镁离子浓度（以0.5 mM递增）进行实时荧光RT-PCR，以确定反应体系中镁离子的最适浓度。反应体系中其它条件见表3，所用引物探针序列见表1。
表3 镁离子优化PCR反应体系
| 组 分 | 加入量/终浓度 |
| 10×PCR buffer | 2.5μl |
| 2.5 mM dNTP | 2μl |
| 25 mM MgCl2 | xμl |
| 引物I (10 μM) | 1μl |
| 引物II(10 μM) | 1μl |
| 探针(10 μM) | 0.5μl |
| 模板DNA | 10μl |
| 5 U/μl Taq DNA 聚合酶 | 0.25μl |
| 补灭菌去离子水 | 至25μl |
二、结果：
经过多次试验最终引物浓度确定为0.2μM，探针浓度确定为0.1μM；镁离子浓度确定为3.0 mM。图1为以优化的反应体系进行实时荧光PCR，得到的猪痢疾短/密螺旋体特异性扩增曲线。
实施例4：一种检测猪痢疾的实时荧光PCR试剂盒及其使用
一、试剂盒的组成（48 tests/盒，保存于-20℃）
（1）DNA提取液I：5ml/管×6管，配制方法为PEG 8000 20.74g，加NaCl 17.53 g，用三蒸水定容至100mL，分装5.0mL/管；
（2）DNA提取液II：500μL /管×1管，配制方法为1.0 mol/L Tris-Cl（pH 8.9）2.0mL，2.0 mol/L KCl 5.0mL，0.5 mol/L EDTA(乙二胺四乙酸)0.5mL，NP-40（乙基苯基聚乙二醇）1.0 mL, 用三蒸水定容至100mL，分装500μL/管；
（3）PCR反应液， 750μL×1管，包括：1×PCR缓冲液、3.0mM MgCl2、 0.2mM dNTP、0.2μM引物I、0.2 μM引物II和0.1 μM探针；其中，引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；第10、14、16位的碱基用LNA进行修饰；
10×PCR缓冲液的组成为：500mmol/L KCl 、100mmol/L Tris-HCl(pH9.0，25℃)、1.0%Triton X-100，使用时可以根据所需浓度进行稀释；
（4）Taq DNA聚合酶 5 U/μL，15μL×1管；（上海Promega，货号M1665S）；
（5）无DNA酶的灭菌纯化水，1mL×1管；
（6）阴性对照：1mL×1管：DEPC水；
（7）阳性对照：1mL×1管；为含有猪痢疾短/密螺旋体nox基因片段的DNA溶液，所述猪痢疾短/密螺旋体nox基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，由上海旭冠生物技术发展有限公司合成，Ct值为20.0～28.0。
二、 试剂盒的使用
（1）提取样品的DNA，即模板DNA，具体操作如下：
①取n个1.5 mL灭菌离心管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
②每管加入200μL DNA提取液I，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各200 μL，一份样本换用一个吸头；混匀器上震荡混匀5 s。于4 ℃~25℃条件下，13000 r/min离心10 min。
③尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入10μL DNA提取液II，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃~25℃条件下，2000 r/min离心10 s。
④100 ℃干浴或沸水浴10min；5000 r/min离心5s,充分振荡一下，5000 r/min再次离心5s，加入90μL无DNA酶的灭菌纯化水，充分振荡后，5000 r/min离心5 min，上清即为提取的DNA，冰上保存备用。
⑤提取的DNA须在2 h内进行PCR扩增或放置于-80℃冰箱。
（2）进行实时荧光PCR反应，最适反应体系如下：
表4 实时荧光PCR反应体系组成
| 组分 | 体积 |
| PCR反应液 | 15 μl |
| Taq DNA 聚合酶（5 U/μl） | 0.25 μl |
| 模板DNA | 10 μl |
（3）最适反应条件：
94℃： 3 min， 1个循环；
94℃： 10 sec， 55℃： 5 sec，60℃： 30 sec（收集荧光信号），40个循环。
（4）结果的判定标准：
阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无猪痢疾短/密螺旋体；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪痢疾短/密螺旋体。
实施例5：一种检测猪痢疾的实时荧光PCR试剂盒的特异性试验
一．方法
提取Brachyspira hyodysenteriae（7株）和Brachyspira innocens、沙门氏菌、大肠杆菌和猪链球菌（详见表5）的DNA做为模板，用实施例4所建立的试剂盒和方法对提取的DNA进行实时荧光PCR检测，以确定检测试剂盒的特异性。
表5 方法研究过程中应用到的菌株
| 菌株 | 来源 |
| B. h （ATCC编号：27164） | 引自ATCC，本实验室保存 |
| B. h （ATCC编号：31212） | 引自ATCC，本实验室保存 |
| B. h （ATCC编号：31287） | 引自ATCC，本实验室保存 |
| B. h （ATCC编号：49526） | 引自ATCC，本实验室保存 |
| B. h （ATCC编号：49527） | 引自ATCC，本实验室保存 |
| B. h （ATCC编号：49886） | 引自ATCC，本实验室保存 |
| B. h （ATCC编号：49887） | 引自ATCC，本实验室保存 |
| B. i （ATCC编号：29796） | 引自ATCC，本实验室保存 |
| 沙门氏菌 | 本实验室保存 |
| 大肠杆菌 | 本实验室保存 |
| 猪链球菌（已灭活） | 中国兽医药品监察所 |
二．结果
结果见图2（2A、2B）。图2A结果显示7株从ATCC引进的B.h均出现了特征性的扩增，图2B结果显示除阳性外，其他结果均为阴性。由此证明该方法有较强特异性。
实施例6：一种检测猪痢疾的实时荧光PCR试剂盒的敏感性试验
一．方法：
用实施例4所建立的试剂盒和方法对实施例4所述的阳性标准品进行实时荧光PCR检测，以确定反应的灵敏度。稀释后，得到DNA浓度分别为106，105，104，103，102，10，1.0拷贝/微升的溶液。
二．结果
对稀释的阳性标准品（106-1.0拷贝/微升）进行实时荧光PCR检测，结果如图3所示。结果表明，实时荧光PCR对系列梯度稀释的阳性标准品（从左至右分别为106-1.0拷贝/反应对应的结果）进行检测，在模板浓度为102拷贝/反应时，成弱阳性反应，10拷贝/反应的模板浓度结果接近阴性。故实时荧光PCR对DNA模板最低可检测至102拷贝/反应。
实施例7：临床样品的检测
一．方法
参照行业标准SN/T 1207-2003《猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程》对采集样品进行病原分离。采集的样品同时参照实例4的方法进行实时荧光PCR检测。
二．结果
表6 实时荧光PCR检测结果与病原分离法结果汇总
结果见表6，用该方法对7个猪场采集的318份猪粪拭子进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在进出境样品检疫和临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景。
序列表
<110> 中华人民共和国北京出入境检验检疫局
中国兽医药品监察所
北京农学院
<120> 一种检测猪痢疾的实时荧光PCR试剂盒及寡核苷酸序列
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成引物I
<400> 1
atggtgctat tgtagtwgat act 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成引物II
<400> 2
acccattctt acagcattwg t 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成探针
<220>
<221> modified_base
<222> (10，14，16)
<223> LAN修饰
<400> 3
ctaaagatcc tgatgtattt gc 22
<210> 4
<211> 1705
<212> DNA
<213> 猪痢疾短/密螺旋体nox基因片段
<400> 4
aatgccaata ttttataata taaacatttt ttgtaaaatt tatatacatt taatgctttt 60
aattatcata attcatgata attagtgaaa tcattatata aaaaacatac taaaactatt 120
aaaatttact aagttacata taatataact tgactaagta ttttttttgt actataataa 180
acaccaattt tatattagat tatttttaat aaggggttaa attattatga aagttattgt 240
aataggttgt aaccatgctg gtacatgggc agcaaaaact ttgaaagcta cagatcctaa 300
ttgtcaagta gttacttacg atagaaatga taatatatct ttcttagcct gcggtatcgc 360
actttgggtt ggtggcgtag ttaaagatcc taaaggatta ttctatgcta gtcctgaaag 420
tttgagaggt gaaggcatcg atgtttatat gggacatgat gttactaaaa tagactgggc 480
taacaaaaaa ttatgtgtaa aagaactaaa aacaggaaaa gagtttgaag acacttacga 540
taaacttatt cttgctactg gttcttggcc tgtaactcct cctatcgaag gcttaaaaca 600
agaaggaact acttacggac ttaaaaaagg tattttcttc tctaagcttt atcagcaagg 660
acaagaaatt attgatgaaa tagctaaacc agatgttaaa aaagttatgg tagttggtgc 720
tggatacata ggtgttgaac ttatagaagc attcaaaaac catggtaaag aagttatctt 780
aatggaagct atgcctagag ttatggctaa ctactttgat aaagaaatca ctgatgaagc 840
tgaaaaaaga atcaaagaag ctggcataga aatgcattta ggtgaaactg ttaagaaatt 900
tgaaggtgat gacagagtta aaaaagttgt tactgacaaa ggttcttatg atgtagatat 960
ggtagttatg tctgttggtt tcagacctaa taatgaactt tataaagatt atttagaaac 1020
tttacctaat ggtgctattg tagtagatac tactatgaaa actactaaag atcctgatgt 1080
atttgctata ggtgactgtg ctactgtata ttcaagagct tctgaaaaac aagaatatat 1140
tgctttagct actaatgctg taagaatggg tattgttgct gctaataatg ctttaggaaa 1200
acatgttgaa tattgcggta ctcaaggttc taatgctatt tgtgtatttg gatacaatat 1260
ggcttctact ggttggtctg aagaaactgc taagaaaaaa ggattaaaag taaaatctaa 1320
cttcttcaaa gattctgaaa gaccagaatt tatgcctact aatgaagatg ttttagtaaa 1380
aatcatttat gaagaaggca gcagacgttt attaggtgct caaatagctt ctaaacacaa 1440
tcatgctgaa gctattcatg cattctctct tgctatacaa aatggtatga ctgttgatca 1500
atttgcattg tcagatttct tcttcctacc tcactacaac aaaccattat cttggatgac 1560
tatggttgct tatactgcta aataattata gaaaatataa ttagtttaag aatatttacc 1620
ccctaataaa tttattttat tagggggttt ttataatcaa taaatatttt actcacatat 1680
ataaattaaa aaacgaaaat cataa 1705
Claims (4)
1.一组检测猪痢疾的寡核苷酸序列，其特征在于，其寡核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3，其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测猪痢疾的引物I和引物II，序列SEQ ID NO：3为检测猪痢疾的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的检测猪痢疾的寡核苷酸序列，其特征在于：所述探针序列SEQ ID NO：3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA，第10、14、16位的碱基用LNA进行修饰。
3.一种检测猪痢疾的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：
（1）DNA提取液I：其配制方法为PEG 8000 20.74g，加NaCl 17.53 g，用三蒸水定容至100mL；
（2）DNA提取液II：其配制方法为1.0 mol/L Tris-Cl 2.0mL，2.0 mol/L KCl 5.0mL，0.5 mol/L EDTA 0.5mL，NP-40 1.0 mL, 用三蒸水定容至100mL；
（3）PCR反应液，包括：PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、引物I、引物II和探针；
（4）Taq DNA聚合酶；
（5）无DNA酶的灭菌纯化水；
（6）阴性对照：DEPC水；
（7）阳性对照：为猪痢疾短/密螺旋体nox基因片段，所述nox基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示；
其中，引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，引物2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA，第10、14、16位的碱基用LNA进行修饰。
4.根据权利要求3所述的检测猪痢疾的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液为1×PCR缓冲液、3.0mM MgCl2、0.2mM dNTP、0.2μM引物I、0.2 μM引物II和0.1 μM探针。
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