CN105018628A - 鉴别布鲁氏菌a19疫苗株与野毒株的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的试剂盒，其中包括用于鉴别布鲁氏菌疫苗株A19的特异性引物对SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2；使用该试剂盒在通过PCR扩增-电泳检测区分布鲁氏菌和其他常规细菌菌株后，对于PCR扩增产物进一步测序分析，通过测序结果能够快速有效的鉴别诊断临床样本中布鲁氏菌A19疫苗株。

Description

鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的试剂盒。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属细菌引起的一种广泛分布于世界各地的人畜(兽)共患传染病，其不仅影响畜牧业的健康发展而且危害人类公共卫生健康。根据国家卫计委公布的全国法定传染病疫情数据，2014年我国人感染布鲁氏菌病人数为57222，发病率比2013年增长了31.48％。人感染布鲁氏菌病的传染源主要来源于感染的动物及被污染的畜产品，因此，控制和消灭动物布鲁氏菌病，是防止人类感染布鲁氏病的根本保障。
目前疫苗免疫仍是控制动物布鲁氏菌病的主要措施之一。当前国外主要使用的布鲁氏菌疫苗株是牛种S19株和RB51株以及羊种Rev.1株，这些疫苗株我国目前尚未引进和使用。我国使用的疫苗株主要是牛种布鲁氏菌A19疫苗株和猪种布鲁氏菌S2疫苗株，以前还曾使用过羊种M5-90疫苗株，由于毒力问题现在暂时不再使用。A19疫苗株的使用为我国动物群布鲁氏菌病的防控提供了重要保障，该菌株是光滑型，其LPS含有O-侧链，能持续刺激机体产生抗体，对牛有一定的保护力，但是也存在着无法鉴别A19疫苗株与野毒感染株的关键技术瓶颈问题。虽然竞争ELISA(cELISA)和荧光偏振实验(FPT)以其高通量以及操作方面的优势，在布鲁氏菌弱毒疫苗与野生菌株感染的血清学鉴别有一定的应用，但是对未知背景的血清样本来说，单次检测仍不能确切分辨疫苗免疫或野毒感染。从病原学方面鉴别诊断布鲁氏菌野毒株核酸，可以准确判断动物体是否带菌，为布鲁氏菌病阳性动物的检疫淘汰提供技术支撑。因此，利用分子生物学方法，依据A19疫苗株与其他布鲁氏菌毒株基因组差异碱基序列，通过PCR扩增及PCR产物序列测定，可有效实现A19疫苗株与野毒株的分子鉴别，将其应用于临床鉴别，可以为我国A19疫苗株的鉴别提供技术保障。
发明内容
发明人通过基因组序列比对，发现与其他布鲁氏菌属细菌基因组DNA序列不同的是，A19疫苗株在基因组22840位点处，即SEQ ID No.3的344位点处，缺失7个核苷酸序列，该位点后序列为AGATTTCAGA，其他布鲁氏菌序列为AGATTTCAGATTTCAGA，因为此处为AGATTTC的重复序列，所以在序列比对时会出现两种序列缺失现象(AGATTTC或TTTCAGA)。在该缺失位点上下游处设计引物，通过PCR扩增后序列测定，序列比对以及测序峰图的不同就可以特异性鉴别牛种布鲁氏菌A19疫苗株，以上是提出本发明的技术依据。
本发明的目的是提供一种鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的试剂盒及其使用方法，该试剂盒能够特异地鉴别临床样本中布鲁氏菌A19疫苗株。
为实现本发明目的，采用如下技术方案：
鉴别布鲁氏菌疫苗株A19与野毒株的试剂盒，该PCR试剂盒由PCR反应液、DNA聚合酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成；
所述PCR反应液包括鉴定并测序A19疫苗株特异性核苷酸序列的引物对，其中鉴别A19疫苗株的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQID No.2所示，分别如下：
SEQ ID No.1：5'-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3'
SEQ ID No.2：5'-GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3'
所述阳性质控标准品为牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品；
所述牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品由含有562个碱基的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成。
所述含有562个碱基的核苷酸片段的序列如SEQIDNo.3所示：
SEQIDNo.3：
5'-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCACCCTTTACCGTCGCATCATTGCAGACGATCATGCATTCGCGGCCCGATACGCGCCCGATGCCGGTGATGAAGCCAGCGGCGGGCGCTGCCCCGCCATACATGCCATGCGCTGCCGTCAGCCCCAGTTCCAGAAAGGGGGAACCCGGATCGAGCAATTGCGCCACGCGCTCACGGGGCAGAAGTTTTCCGCGCGAAACATGGCGGTCGCGCGCTTTCTCGCCGCCGCCGTCAATGGCAATGCGCGAGGCTTCCGCCACCACGTCGATTGCCGCCAGCATGGCCTTGCGGTTGGCCTCGAAGCTTGCGCTGCGCGTCGAGATTTCAGAACCGGCATCAACGGGTCTCCTGAAAGAGTTCCCGTCCGATCAGCATACGCCGGATTTCCGACGTGCCCGCGCCGATTTCATAAAGCTTGGCATCGCGCAAAAGGCGGCCCGTCGGATAATCGTTGATATAGCCGTTGCCGCCGAGAGACTGGATCGCCTGCAAGGCCATCTGCGTGGCATTTTCCGCAGAGTAAAGAATGCAGCCCGCC-3'
所述PCR反应液还包括含有dNTPs、Mg2+、双蒸水的PCR缓冲液。
所述含有562个碱基的核苷酸片段是从牛种布鲁氏菌A19疫苗株中克隆得到。
所述阴性质控标准品为无菌双蒸水(ddH2O)。
本发明进一步提供了鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的PCR试剂盒的使用方法，该方法的条件和步骤如下：
(1)提取待测样本的基因组DNA；
所述待检测的样本为血液、奶样、组织样本、气溶胶样本等。
(2)以提取的样本基因组DNA为模板，将样本DNA、阳性质控标准品和阴性质控标准品分别加入到含有PCR反应液和DNA聚合酶的50μL体系的PCR反应管中，按照经过优化后的PCR反应条件进行扩增，具体的反应条件为：94℃3min，94℃ 30sec、60℃ 30sec、72℃ 30sec，35个循环，72℃ 10min；
所述PCR反应液由鉴定布鲁氏菌A19疫苗株的引物对以及含有dNTPs、Mg2+、双蒸水的PCR缓冲液组成；
所述引物对分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，分别命名为A19-F和A19-R序列如下：
正向引物A19-F：5'-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3'
反向引物A19-R：5'-GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3'
所述的PCR反应体系为50μL，具体包括以下组份：
(3)取50μL PCR产物，以1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察鉴别牛种布鲁氏菌A19株引物对扩增出562bp及与之大小对应的条带；本领域技术人员应知晓，在琼脂糖凝胶电泳检测时，显示与目的条带大小对应的条带，意指PCR扩增产物大小相近，因样品来源或目标种属不同，PCR产物大小会有较小差异，但显示条带对应，例如相差30bp/20bp范围内的条带均显示大小对应。
(4)如果上述PCR检测结果与目的条带不符，则说明模板为布鲁氏菌阴性，如果PCR检测条带大小正确，则对阳性条带进行切胶回收纯化，然后再进行序列测定。
(5)鉴别布鲁氏菌A19疫苗株的结果判定：使用A19-F引物对纯化的562bp或与之大小对应的产物进行测序，如果测序结果峰图为单一峰，与SEQIDNo.3比对后完全匹配，则该样本为A19疫苗株；如果测序结果峰图为单一峰，与SEQIDNo.3比对后在第344位点处多出7个核苷酸序列(AGATTTC或TTTCAGA)，则该样本为除A19疫苗株以外的其他布鲁氏菌野毒株或疫苗株；如果测序结果与SEQIDNo.3比对，在峰图的序列第354位，即AGATTTCAGA后出现套峰，则该样本为A19疫苗株和其他布鲁氏菌株混合。
本领域技术人员应当明了，上述鉴别方法，其直接目的是鉴别菌株种类，而非获取疾病诊断结果。
本发明取得了以下效果：
(1)为我国A19疫苗株的鉴别提供新的技术手段；
(2)本发明所述引物对具有较高的特异性，通过扩增-电泳检测，可有效的区分布鲁氏菌和其他常规细菌菌株；
(3)本发明所述鉴别方法，有效地将布鲁氏菌A19疫苗株与其他布鲁氏菌野毒株或疫苗株区分开来，具有极高的准确率。
附图说明
图1 A19疫苗株缺失位点处上下游序列PCR扩增，+：模板为A19疫苗株阳性质控标准品的PCR扩增产物562bp，–：模板为阴性质控标准品，1-5：模板分别为牛种布鲁氏菌疫苗株A19株、猪种布鲁氏菌疫苗株S2株、羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90株、绵羊种布鲁氏菌63/290株、犬布鲁氏菌RM6/66株基因组DNA的PCR扩增产物562bp；6-10：模板分别为大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、牛分支杆菌基因组DNA。
图2 A19疫苗株缺失位点处序列测定峰图，A：测序峰图为单一峰，与SEQID No.3比对后完全匹配，检测模板为A19疫苗株。B：测序峰图为单一峰，与SEQ ID No.3比对后在344位点处多出7个核苷酸序列(AGATTTC或TTTCAGA)，检测模板为除A19疫苗株以外的其他布鲁氏菌野毒株或疫苗株。C：测序结果与SEQ ID No.3比对，峰图在序列第354位点后，即AGATTTCAGA序列后出现套峰，检测模板为A19疫苗株与其他布鲁氏菌株的混合。
具体实施方式
下述实施例用于进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例均按照常规试验条件与方法进行，或者按照制造厂商所建议的试验条件。
1.试验材料
牛种布鲁氏菌疫苗株A19株(B.abortus A19)，猪种布鲁氏菌疫苗株S2株(B.suis S2)，羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90株(B.melitensis M5-90)，绵羊种布鲁氏菌63/290株(B.ovis 63/290)，犬布鲁氏菌RM6/66株(B.canis RM6/66)，大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌(CMCC25623)、牛分支杆菌(M.bovis ATCC 19210)、临床上确诊为布鲁氏菌阳性的血液、奶样、流产胎儿组织和气溶胶等DNA样本均由山东省农业科学院奶牛研究中心疾病研究室保存。
DNA聚合酶(TaKaRa LA Taq)购自宝生物工程(大连)有限公司，琼脂糖购自北京全式金生物技术有限公司，快速DNA提取试剂盒、细菌DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒等均购自天根生化科技(北京)有限公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA序列测定由山东省农业科学院测序中心完成。
2.实验仪器
梯度PCR仪(TaKaRa TP-600)，电泳仪(北京市六一仪器厂DYY-6C型)，Alpha个人型凝胶成像系统red(美国ProteinSimple公司)，DNA测序仪(ABI3730XL DNA Analyzer)。
实施例一、鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的PCR试剂盒的使用方法
(1)提取待测样本的基因组DNA：使用快速DNA提取试剂盒对待检测的血液、奶样、组织样本、气溶胶等样本进行基因组DNA的提取。
(2)以提取的样本基因组DNA为模板，使用A19-F和A19-R引物对进行PCR扩增，同时以阳性质控标准品和阴性质控标准品分别作为阳性和阴性对照，依次将50μL反应体系的各组份加到PCR反应管中，分别为10×PCR Buffer：5.0μL，dNTP Mixture(2.5mM)：8.0μL，10μM的正向引物：2.0μL，10μM的反向引物：2.0μL，待测样本DNA：5.0μL，DNA聚合酶：0.5μL，最后加27.5μL双蒸水(ddH2O)补足到50μL。PCR的扩增效果直接影响到检测结果的特异性和灵敏性，因此需要对PCR反应条件中的相关参数进行优化，包括引物的浓度、Mg2+浓度、退火温度、退火时间、循环次数以及延伸时间等。PCR反应条件的优化采用现有技术，最终优化后的PCR反应条件为：引物浓度为0.4μmoL/L，Mg2+浓度为0.2mmoL/L，PCR反应条件为：94℃ 3min，94℃ 30sec、60℃ 30sec、72℃ 30sec，35个循环，72℃ 10min。以上述优化好的反应条件进行PCR扩增。
(3)反应结束后，取50μL PCR产物，以1.5％琼脂糖凝胶进行电泳(120V25min)检测，观察鉴别牛种布鲁氏菌A19株引物对扩增出562bp的条带。
(4)如果上述PCR检测结果与目的条带不符，则说明模板为布鲁氏菌阴性，如果PCR检测条带大小正确，则对阳性条带进行切胶回收纯化，然后用DNA测序仪进行序列测定。
(5)布鲁氏菌A19疫苗株鉴别的结果判定：使用A19-F引物对纯化的562bp产物进行测序，如果测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No.3比对后完全匹配，则该样本为A19疫苗株；如果测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No.3比对后在第344位点处多出7个核苷酸序列(AGATTTC或TTTCAGA)，则该样本为除A19疫苗株以外的其他布鲁氏菌野毒株或疫苗株；如果测序结果与SEQ IDNo.3比对，在峰图的序列第354位，即AGATTTCAGA后出现套峰，则该样本为A19疫苗株和其他布鲁氏菌株混合。
实施例二、PCR试剂盒的组装
(1)配制PCR反应液：
①设计1对鉴定牛布鲁氏菌A19疫苗株的引物：为SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2，命名为A19-F和A19-R，序列如下：
A19-F：5'-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3'
A19-R：5'-GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3'
②PCR反应液的配制：PCR反应液由牛种布鲁氏菌A19疫苗株的引物和含有dNTPs、Mg2+、双蒸水(ddH2O)的PCR缓冲液组成，PCR反应液的总体积为44.5μL，每条引物的量为2μL(引物浓度为10μmoL/L)，含有dNTPs、Mg2+、双蒸水(ddH2O)的PCR缓冲剂的总量为40.5μL，其中双蒸水(ddH2O)为27.5μL。
(2)阳性质控标准品的制备：
①模板DNA的提取：对牛种布鲁氏菌疫苗株A19的菌液应用细菌DNA提取试剂盒提取DNA。
②PCR扩增：以提取的DNA为模板，按照PCR反应体系：DNA模板5μL、DNA聚合酶0.5μL、PCR反应液44.5μL，PCR反应条件为：94℃ 3min，94℃30sec、60℃ 30sec、72℃ 30sec，35个循环，72℃ 10min，在PCR仪上扩增目的片段，以1.5％的琼脂糖凝胶电泳(120V 25min)鉴定PCR目的产物。
③重组质粒的构建及阳性质控标准品的建立：将PCR产物进行凝胶纯化回收，然后连接pEASY-T3载体，转化，提取质粒后双酶切鉴定，将阳性重组质粒进行测序，并进行序列比对。序列正确的重组质粒即为获得的阳性质控标准品。
所说的阳性质控标准品为牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品。
所说的牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品由含有562个碱基的核苷酸片段连接到pEASY-T3载体后的重组质粒构成。
(3)阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水，体积为5μL。
实施例三、布鲁氏菌A19疫苗株鉴别试剂盒特异性试验
采用本发明的PCR试剂盒分别对牛种布鲁氏菌A19、猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5-90、绵羊种布鲁氏菌63/290株，犬布鲁氏菌RM6/66株，大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、牛分支杆菌基因组DNA进行扩增，并设阳性与阴性对照，验证PCR反应的特异性，PCR反应条件为：94℃ 5min，94℃ 30sec、60℃ 30sec、72℃ 30sec，35个循环，72℃ 10min。反应结束后再进行PCR产物的纯化与测序。
牛种布鲁氏菌A19疫苗株鉴别特异性结果如图1所示，琼脂糖凝胶电泳结果中：+为阳性质控标准品，1-5：分别为牛种布鲁氏菌A19、猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5-90、绵羊种布鲁氏菌63/290株，犬布鲁氏菌RM6/66株均扩增出562bp的条带，而–、6-10：分别为阴性质控标准品、大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和牛分支杆菌均无条带。序列测定后序列与峰图比对结果如图2所示，只有A19疫苗株344点处存在7个核苷酸序列(AGATTTC)的缺失(图2-A)，其他布鲁氏菌株与疫苗株结果均为图2-B所示。
实施例四、布鲁氏菌阳性临床样本A19疫苗株的鉴别
分别对本实验室保存的布鲁氏菌阳性样本(已经经过PCR扩增测序验证)，包括2份血液样本、2份奶样、2份流产胎儿组织样本以及2份不同奶牛养殖场的牛舍气溶胶样本进行疫苗株的鉴别，结果如下表所示。

Claims (9)

1.一种用于鉴别牛种布鲁氏菌疫苗株A19的引物对，其特征在于，两条引物序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的引物对用于制备鉴别和/检测布鲁氏菌的试剂盒、芯片的应用。
3.权利要求1所述的引物对用于制备鉴别和/检测布鲁氏菌疫苗株A19的试剂盒、芯片的应用。
4.包括权利要求1所述的引物对的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括：PCR反应液、DNA聚合酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品。
6.一种用于鉴别布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA；
(2)以提取的样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增，所采用的引物为权利要求1所述的引物对；
(3)取PCR产物，以琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察是否出现牛种布鲁氏菌疫苗株A19引物对扩增出的562bp及与之大小对应的条带；
(4)如果上述PCR检测结果与目的条带不符，则说明模板为布鲁氏菌阴性，目的条带相符，则为布鲁氏菌。
7.一种鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与其他布鲁氏菌野毒株或疫苗株的方法，其特征在于，
(1)提取待测样本的基因组DNA；
(2)以提取的样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增，所采用的引物为权利要求1所述的引物对；
(3)取PCR产物，以琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察是否出现牛种布鲁氏菌疫苗株A19引物对扩增出的562bp及与之大小对应的条带；
(4)如果上述PCR检测结果与目的条带不符，则说明模板为布鲁氏菌阴性，如果PCR检测条带大小正确，则对阳性条带进行切胶回收纯化，然后再进行序列测定；
(5)结果判定：对使用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2引物对纯化的562bp或与之大小对应的产物进行测序，如果测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No.3比对后完全匹配，则该样本为A19疫苗株；如果测序结果峰图为单一峰，与SEQID No.3比对后在第344位点处多出7个核苷酸序列，则该样本为除A19疫苗株以外的其他布鲁氏菌野毒株或疫苗株；如果测序结果与SEQ ID No.3比对，在峰图的序列第354位后，即AGATTTCAGA后，出现套峰，则该样本为A19疫苗株和其他布鲁氏菌株混合。
8.权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述待测样本为血液、奶样、组织样本、气溶胶样本。
9.权利要求6或7所述方法，其特征在于，PCR扩增条件为：94℃3min，94℃30sec、60℃30sec、72℃30sec，35个循环，72℃10min。
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