CN111394489A - 用于鉴别布鲁氏菌a19/s19株和其它株的dna片段、引物及其检测方法 - Google Patents

用于鉴别布鲁氏菌a19/s19株和其它株的dna片段、引物及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它株的DNA片段、引物及其检测方法，包括以下操作步骤：(1)提取待测样本的基因组；(2)以提取的样本基因组为模板，进行PCR扩增；(3)取扩增后的产物电泳检测，如果出现217bp大小的条带，说明检测样品含有布鲁氏菌A19或S19菌株；如果出现285bp大小的条带，说明检测样品含有除A19和S19之外的其它布鲁氏菌；如果没有出现条带或出现的条带不是217bp或285bp，说明检测样品中不含有布鲁氏菌，无布鲁氏菌感染。本发明提供的方法可特异性地鉴别检测布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株，有利于使用布鲁氏菌A19或S19疫苗免疫的养殖场进行布鲁氏菌野毒的检测，更有效地进行布鲁氏病的净化和防控。

Description

用于鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它株的DNA片段、引物及其 检测方法
技术领域
本发明涉及病原检测技术领域，具体涉及用于鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它株的DNA片段、引物及其检测方法。
背景技术
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜兽共患传染病，广泛分布于世界各地，不仅影响畜牧业的健康发展，而且危害人类健康。近年来发病率呈现逐年上升趋势。
目前动物布鲁氏菌病防控的主要策略是检疫与净化，常使用的疫苗株主要是A19/S19疫苗株和S2疫苗株，以前还曾使用过M5疫苗株，由于毒力问题现在很少使用。A19和S19疫苗株的毒力较弱，免疫确实，目前在牛的免疫中广泛使用。但它会在抗体的诊断中对布鲁氏菌野毒感染造成干扰，不能对自然感染和疫苗免疫动物进行抗体的鉴别诊断，这样在免疫养殖场就不能采用抗体检测的方法进行野毒感染动物的鉴定。
要实行布鲁氏菌病检疫、扑杀、净化的防控规程，就必须从病原学方面对它们进行鉴别。现已有多种检测布鲁氏菌的检测方法，但这些方法普遍存在着操作复杂、费时、费用高的问题，不便于快速检验以指导临床。同时这些检测方法往往不能将布鲁氏菌A19/S19疫苗株和其它菌株进行区分，因此，会出现将携带A19或S19疫苗的动物作为野毒感染动物进行淘汰的错误结果，造成比较严重的经济损失。
发明内容
利用分子生物学方法，依据A19/S19疫苗株与其它布鲁氏菌菌株基因组之间的差异碱基序列，设计特异性的引物，通过PCR等方法实现布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的鉴别检测，为更好地进行布鲁氏病免疫、检测、淘汰的防控措施提供技术保障。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段，所述特异性DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.1：CCGGTGTGGTCGCGGGCTTCCTGATGCAGGGCGTGACCTTGCAGGAATTCGGCATCATCCTTTATTTC。
本发明还提供一种用于鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段的应用，所述特异性DNA片段用于检测和区分布鲁氏菌A19/S19和其它布鲁氏菌菌株。
一种鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的PCR引物，包括上游引物SEQID No.2和下游引物SEQ ID No.3，分别命名为A19/S19F和A19/S19R，
正向引物A19/S19F：5'-GGCTGGCCGGTSTGG-3'；
反向引物A19/S19R：5'-AGTCAAAGCCCGTATTGCCA-3'。
本发明还提供一种鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的检测方法，包括以下操作步骤：
(1)提取待测样本的基因组；
(2)以提取的样本基因组为模板，加入到含有反应液和聚合酶的反应体系的反应管中，进行PCR扩增；
(3)取5ul扩增后的产物，加入至2％琼脂糖凝胶的加样孔内进行电泳检测，再在紫外灯下观察，如果出现217bp大小的条带，说明检测样品含有布鲁氏菌A19或S19菌株；如果出现285bp大小的条带，说明检测样品含有除A19和S19之外的其它布鲁氏菌；如果没有出现条带或出现的条带不是217bp或285bp，说明检测样品中不含有布鲁氏菌，无布鲁氏菌感染。
具体地，上述步骤(1)中，待测样本包括血液、奶样、组织样本、气溶胶样本中的任意一种。
具体地，上述步骤(2)中，反应体系具体包括以下组份：
Figure BDA0002490697460000021
具体地，上述步骤(2)中，PCR扩增反应的具体条件为：
94℃进行预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，运行30个循环后反应结束。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
1)本发明所述引物对具有较高的特异性，通过扩增-电泳检测，可有效的区分布鲁氏菌A19/S19株、其它布鲁氏菌菌株及其它细菌，具有极高的准确率；
2)在使用布鲁氏菌A19或S19疫苗免疫的养殖场，进行布鲁氏菌野毒感染的检测及净化时，可以利用本发明对临床样品进行检测，排除感染布鲁氏菌A19或S19疫苗株的样品，避免误以为是野毒感染从而淘汰导致的经济损失；
3)在使用布鲁氏菌A19或S19疫苗免疫的养殖场，配合本方法，免疫后仍可进行其它布鲁氏菌的检测和淘汰，有利于更好地进行布鲁氏的防控。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种用于鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段，所述特异性DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.1：CCGGTGTGGTCGCGGGCTTCCTGATGCAGGGCGTGACCTTGCAGGAATTCGGCATCATCCTTTATTTC，见序列表，所述特异性DNA片段通过在线BLAST获得，在线BLAST所选片段时，在布鲁氏菌A19和S19菌株中，该序列缺失，在其它的布鲁氏菌菌株中，该序列普遍存在。
本实施例提供一种用于鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段的应用，所述特异性DNA片段用于检测和区分布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株。
一种鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的PCR引物，包括上游引物SEQID No.2和下游引物SEQ ID No.3，分别命名为A19/S19F和A19/S19R，
正向引物A19/S19F：5'-GGCTGGCCGGTSTGG-3'；
反向引物A19/S19R：5'-AGTCAAAGCCCGTATTGCCA-3'；
所述引物对具有较高的特异性，通过扩增-电泳检测，可有效的区分布鲁氏菌A19/S19株、其它布鲁氏菌菌株及其它细菌，具有极高的准确率。
实施例2
一种鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的检测方法，包括以下操作步骤：
(1)棉签蘸取免疫过布鲁氏菌A19或S19疫苗动物的流产分泌物，放入TRIzol中提取流产分泌物的基因组；
(2)取1ul提取的流产分泌物的基因组作为模板，配制20ul反应体系，其中2×AceTaq Master Mix(Dye Plus)10μl、20μM的正向引物A19/S19F 1μl、20μM的反向引物A19/S19R 1μl、ddH2O 7μl，将含上述反应体系的薄壁PCR管放入PCR仪，94℃进行预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，运行30个循环后反应结束；
(3)取5ulPCR扩增反应的产物，加入至2％琼脂糖凝胶加样孔内进行电泳检测，同时用DL2000 DNA Marker做为分子量标准，电泳后进行紫外灯下观察，出现217bp大小的条带，说明流产分泌物中含有布鲁氏菌A19或S19菌株，检测动物被布鲁氏菌疫苗感染。
实施例3
一种鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的检测方法，包括以下操作步骤：
(1)棉签蘸取免疫过布鲁氏菌A19或S19疫苗的牛的血液，提取血液中的基因组；
(2)取1ul提取的血液的基因组作为模板，配制20ul反应体系，其中2×Ace TaqMaster Mix(Dye Plus)10μl、20μM的正向引物A19/S19F 1μl、20μM的反向引物A19/S19R 1μl、ddH2O 7μl，将含上述反应体系的薄壁PCR管放入PCR仪，94℃进行预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，运行30个循环后反应结束；
(3)取5ul PCR扩增反应的产物，加入至2％琼脂糖凝胶加样孔内进行电泳检测，同时用DL2000 DNA Marker做为分子量标准，电泳后进行紫外灯下观察，出现285bp大小的条带，说明检测的血液样品中含有除A19和S19株之外的布鲁氏菌，检测动物被布鲁氏菌野毒感染。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
序列表
<110>沈阳农业大学
<120>用于鉴别布鲁氏菌A19/S19 株和其它株的DNA 片段、引物及其检测方法
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>68
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
CCGGTGTGGTCGCGGGCTTCCTGATGCAGGGCGTGACCTTGCAGGAATTCGGCATCATCC 60
TTTATTTC 68

Claims (7)

1.一种用于鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段，其特征在于，所述特异性DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.1：CCGGTGTGGTCGCGGGCTTCCTGATGCAGGGCGTGACCTTGCAGGAATTCGGCATCATCCTTTATTTC。
2.一种用于鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段的应用，其特征在于，所述特异性DNA片段用于检测和区分布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株。
3.一种用于鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的PCR引物，包括上游引物SEQ ID No.2和下游引物SEQ ID No.3，分别命名为A19/S19F和A19/S19R，
正向引物A19/S19F：5'-GGCTGGCCGGTSTGG-3'；
反向引物A19/S19R：5'-AGTCAAAGCCCGTATTGCCA-3'。
4.一种鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)提取待测样本的基因组；
(2)以提取的样本基因组为模板，加入到含有反应液和聚合酶的反应体系的反应管中，进行PCR扩增；
(3)取5ul扩增后的产物，加入至2％琼脂糖凝胶的加样孔内进行电泳检测，再在紫外灯下观察，如果出现217bp大小的条带，说明检测样品含有布鲁氏菌A19或S19菌株；如果出现285bp大小的条带，说明检测样品含有除A19和S19之外的其它布鲁氏菌；如果没有出现条带或出现的条带不是217bp或285bp，说明检测样品中不含有布鲁氏菌，无布鲁氏菌感染。
5.根据权利要求4所述的一种鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的检测方法，其特征在于，上述步骤(1)中，待测样本包括血液、奶样、组织样本、气溶胶样本中的任意一种。
6.根据权利要求4所述的一种鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的检测方法，其特征在于，上述步骤(2)中，反应体系具体包括以下组份：
Figure FDA0002490697450000011
Figure FDA0002490697450000021
7.根据权利要求1所述的一种鉴别布鲁氏菌A19/S19株和其它布鲁氏菌菌株的PCR引物及检测方法，其特征在于，上述步骤(2)中，PCR扩增反应的具体条件为：94℃进行预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，运行30个循环后反应结束。
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