CN114058719A

CN114058719A - 一种用于鉴定布鲁氏菌的引物对、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114058719A
Application number: CN202110858702.3A
Authority: CN
Inventors: 王文龙; 刘春霞; 秦云; 陆静; 毛晓伟; 呼和巴特尔; 闫旭
Original assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Current assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Priority date: 2021-07-28
Filing date: 2021-07-28
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2041-07-28
Also published as: CN114058719B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于鉴定布鲁氏菌的引物对及其应用。本发明提供一种用于鉴定布鲁氏菌的引物组合，其中包括的引物对分别可鉴定牛种、羊种、猪种、犬种、牛种A19疫苗株、牛种S19疫苗株布鲁氏菌。本发明提供的引物对和试剂可以鉴别牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌以及S19和S19疫苗株，解决免疫畜群中疫苗与自然强毒株难以区分和畜群净化的难题。不仅可带来社会经济效益，还可为净化畜群中的布鲁氏菌病做出贡献。

Description

一种用于鉴定布鲁氏菌的引物对、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于鉴定布鲁氏菌的引物对、试剂盒及其应用。

背景技术

布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏杆菌(brucella spp.)引起的世界范围内广泛流行的人兽共患病，OIE归为乙类传染病。布鲁氏菌分六个经典种，牛种(B.abortus)、羊种(B.melitensis)、猪种(B.suis)、犬种(B.cains)、绵羊种(B.ovis)和森林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)，近年来又陆续发现了鲸种布鲁氏菌(B.ceti)和鳍种布鲁氏菌(B.pinnipedialis)，在人和啮齿类、蝙蝠等动物体内也发现了布鲁氏菌。其中，羊种、牛种、猪种为家畜和人主要流行病原种类。布鲁氏菌病传染方式为接触患病动物、未消毒的肉制品、乳制品，也可经呼吸道、消化道及皮肤黏膜等组织器官侵入体内引起感染。

布鲁氏菌一旦进入宿主体内，细菌侵入血液和淋巴，繁殖并被巨噬细胞吞噬。家畜感染布鲁氏菌病常见的症状有母畜流产和公畜睾丸肿大等，严重者肝脏和脾脏等内脏肿大。家畜感染布鲁氏菌多以淘汰为主，为此，严重影响了畜牧业的健康发展，而且威胁到了人类的健康。

目前，布鲁氏菌的检测以血清学方法为主，但没有统一标准，血清学方法检测只能达到布鲁氏菌属的水平，不能区别是哪种布鲁氏菌种型引起的布鲁氏菌病，存在交叉反应，这就给布鲁氏菌病的防治带来了很多的阻碍，严重影响了布鲁氏菌病的诊断、流行病学调查和疫病预防。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种用于鉴定布鲁氏菌的引物对、试剂盒及其应用。

第一方面，本发明提供一种引物组合，包括：

引物对一：

上游：CGCGGATCCATGACCGTTTCCGTGCTC，

下游：CCCTCGAGTACCATGTGCCGCTCCGG；

引物对二：

上游：GAGAATTCATTGCCGAATGCATGAAGCT，

下游：GCCTCGAGCTATATCTTCAAGTCCTTAG；

引物对三：

上游：GGGCGTGACCTTGCAGGAAT，

下游：TGCCGACCCTCACCAGAT

本发明针对牛种布鲁氏菌特异缺失基因NC_017250、布鲁氏菌A19和S19疫苗株WP_002965788.1基因的缺失片段以及布鲁氏菌S19疫苗株eryC基因的缺失片段开发出三对引物；其中，针对牛种的缺失基因NC_017250的引物对在检测时，除了牛种没有显示条带，其它种均有条带；WP_002965788.1基因是S19和A19都缺失的，再配合只有S19缺失，而A19有的eryC基因，就能区分S19疫苗和A19疫苗。该引物组合可以用于辅助鉴定不同种型的布鲁氏菌。

进一步地，还包括：

引物对四：

上游：GCCGGGAATTCTTGTACGGTTTACTGAACAC，

下游：TGTCTCGAGTCAAGGCTGTTGGATTCGCA；

引物对五:

上游：TCTATTATTACGGACGGCTGGCTGAG，

下游：GTGGTGGCCCATGTGGCGCTT；

引物对六:

上游：GCCCTACCCGAAAGAAA，

下游：ATCCGCTAGACCGCATCCC。

本发明通过研究牛种布鲁氏菌特异缺失基因NC_017250、猪种布鲁氏菌GL_0002189特异基因、犬种布鲁氏菌在在wbkF-wbkD区域缺失351个碱基以及鉴别S19和A19的WP_002965788.1基因和eryC基因，区分布鲁氏菌和其它病菌的BP26基因来设计引物，通过PCR扩增片段大小的差异最终鉴别牛种、羊种、猪种、犬种、S19和A19布鲁氏菌。

其中，根据犬种的缺失基因设计的引物能同时在猪S2和犬种上显示相同的272bp的条带；牛种的缺失基因NC_017250条带大小是879bp，除了牛种没有显示条带，其它种均有条带；猪种S2特有2189基因条带大小为660bp，只有猪种的显示条带，其它种型的都没有；WP_002965788.1基因是S19和A19都缺失的，再配合只有S19缺失，而A19有的eryC基因，这样就能区分S19疫苗和A19疫苗，条带大小分别是1.4kbp和440bp；此外，BP26基因是布鲁氏菌特有的，这样可以区分布鲁氏菌和其他病菌，大小为1.2kbp，全部种型有此条带。

综上，根据PCR扩增片段长度判定布鲁氏菌属于牛种、羊种、猪种、犬种、疫苗S19和A19布鲁氏菌中的哪一种型，其中扩增片段长度分别为：牛S19 1个条带为1.2kbp；牛A19 2个条带为1.2bp和420bp；猪种6个条带为1.4kbp，1.2kbp，879bp，660bp，420bp，272bp；羊种4个条带为1.4kbp，1.2kbp，879bp，420bp。

本发明进一步提供包括所述引物组合的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒还包括：

PCR反应液、DNA聚合酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品。

进一步地，所述PCR反应液包括：dNTPs、Mg²⁺、双蒸水的PCR缓冲液。

进一步地，所述的阳性质控标准品为布鲁氏菌s2疫苗株，所述阴性质控标准品为无菌双蒸水。

本发明进一步提供所述引物组合或所述试剂盒在鉴别布鲁氏菌种型中的应用。

第二方面，本发明提供一种鉴定布鲁氏菌种型的方法，包括：

提取待测样本的DNA；

采用所述引物组合中任意一对或多对引物或所述试剂盒对所述待测样本的DNA进行PCR检测；

通过检测结果判断待测样本所含有的布鲁氏菌种型。

进一步地，所述PCR检测的反应条件为：

95℃5min，94℃1min、59℃50sec、72℃50sec，30个循环，72℃10min。

进一步地，所述通过检测结果判断待测样本所含有的布鲁氏菌种型为：

取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过观察在272bp，420bp，660bp，879bp，1200bp，1400bp处是否显现条带判断所含有的布鲁氏菌种型。

本发明进一步提供一种牛种布鲁氏菌缺失基因片段，其脱氧核糖核酸序列如SEQIDNO.1所示，该基因存在于除牛种布鲁氏菌(包括疫苗株)以外的其他种布鲁氏菌中。

本发明进一步提供一种布鲁氏菌A19和S19疫苗株基因缺失片段，其脱氧核糖核酸序列如SEQIDNO.2所示该基因片段存在于除牛种布鲁氏菌A19和S19疫苗株以外的其他种布鲁氏菌中。

本发明进一步提供一种布鲁氏菌S19疫苗株基因缺失片段，其脱氧核糖核酸序列如SEQIDNO.3所示，该基因片段存在于除牛种布鲁氏菌S19疫苗株以外的其他种布鲁氏菌中。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种于鉴定布鲁氏菌的引物对以及配套的试剂盒，该试剂盒实用性强，可以同时检测牛种、羊种、猪种、犬种以及疫苗S19和A19布鲁氏菌，检测能达到布鲁氏菌种的水平，并且能区别是由哪种布鲁氏菌种型引起的布鲁氏菌病或体内存在疫苗株，且不存在交叉反应，可直接检测样品中污染的布鲁氏菌的种型。

本发明提供的检测试剂盒检测速度快，灵敏度高，灵敏度达到1.9921ng/μL，特异性强，可重复性好，使用安全可靠、快速简便，可以对样品中的布鲁氏菌的种型进行定性检测，可以替代传统的病原学和血清学方法，在一般的实验室中即可操作，适合批量检测，可以推广应用，对于布鲁氏菌病的诊断、流行病学调查和疫病预防有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的自制marker的PCR检测结果，其中，M为DNA MarkerDL2000。

图2为本发明实施例1提供的PCR试剂盒的重复性试验扩增电泳图；其中，M为DNAMarker DL2000。

图3为本发明实施案例2提供的PCR试剂盒特异性电泳图；其中，1-9依次为牛s19、牛a19、猪S2、羊REV.1、羊M28、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、猪链球菌和阴性对照。

图4为本发明实施案例2提供的PCR试剂盒灵敏度电泳图；其中各泳道1-7依次为：1.9921×10¹ng/μL、1.9921ng/μL、1.9921×10^-1ng/μL、1.9921×10^-2ng/μL、1.9921×10-3ng/μL、1.9921×10^-4ng/μL、1.9921×10^-5ng/μL；M为DL2000 marker。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明所用实验菌株：牛种布鲁菌A19疫苗株购自齐鲁动物保健品有限公司；猪种布鲁菌S2疫苗株，羊种布鲁菌Rev.1疫苗株，牛种布鲁菌S19疫苗株，均购自金宇保灵生物药品有限公司；链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸链球菌、贝雷斯芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌基因组DNA、羊种布鲁菌M28株基因组DNA均为内蒙古农业大学兽医学院预防兽医实验室保存提供。

PCR引物由生工有限公司合成；

实验仪器：

NanoDrop核酸浓度测定仪 ND2000 Thermo，美国；

普通离心机 2-16KL Sigma，美国；

BDA凝胶成像仪 BDA digital BioDocAnalyze，美国；

超净台 BG-verMINI北京百晶生物技术公司；

水平凝胶电泳仪 BG-subMINI北京百晶生物技术公司；

梯度PCR仪 PowerCycler384北京百晶生物技术公司。

实施例1本发明鉴定布鲁氏菌种型和疫苗株PCR试剂盒的使用

本发明提供的试剂盒使用方法如下：

1、对待检测样本提取样本DNA；

2、以提取的样本DNA为模板，将样本DNA、阳性质控标准品和阴性质控标准品分别加入到含有PCR反应液和DNA聚合酶的管中，按照经过优化后的PCR反应条件进行扩增：95℃5min，94℃1min、59℃50sec、72℃50sec，30个循环，72℃10min；

3、PCR扩增效果直接影响检测的敏感度和特异性，为此需要对PCR反应体系和反应条件中的引物浓度、退火温度、退火时间、循环次数、延伸时间等参数进行优化，PCR反应条件的优化采用现有技术，最终优化后的PCR反应条件为：引物浓度为0.1μmol/L，退火温度为59℃、退火时间50sec、循环次数30次、延伸时间60sec。

4、取5μL PCR产物，以1.5％琼脂糖凝胶电泳(100V 30min)进行检测，观察是否是牛S19 1个条带为1.2kbp；牛A19 2个条带为1.2bp和420bp；猪S2 6个条带为1.4kbp，1.2kbp，879bp，660bp，420bp，272bp；羊REV.1和羊M28 4个条带为1.4kbp，1.2kbp，879bp，420bp。

实施例2 PCR试剂的组装

1、实验方法

1.1配置PCR反应液

所述PCR反应液由鉴定牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌以及牛种S19和A19疫苗株的六对引物和含有dNTPs、Mg²⁺、双蒸水的PCR缓冲液组成，所述的六对引物分别根据NC_017250，GL_0002189，EryC，wbkF-wbkD，WP_002965788.1，BP26基因设计，具体如下：

NC_01725(SEQ ID NO.4-5)：

上游：CGCGGATCCATGACCGTTTCCGTGCTC，

下游：CCCTCGAGTACCATGTGCCGCTCCGG；

GL_0002189(SEQ ID NO.6-7)：

上游：GCCGGGAATTCTTGTACGGTTTACTGAACAC，

下游：TGTCTCGAGTCAAGGCTGTTGGATTCGCA；

EryC(SEQ ID NO.8-9)：

上游：GAGAATTCATTGCCGAATGCATGAAGCT，

下游：GCCTCGAGCTATATCTTCAAGTCCTTAG；

wbkF-wbkD(SEQ ID NO.10-11):

上游：TCTATTATTACGGACGGCTGGCTGAG，

下游：GTGGTGGCCCATGTGGCGCTT；

WP_002965788.1(SEQ ID NO12-13):

上游：GGGCGTGACCTTGCAGGAAT，

下游：TGCCGACCCTCACCAGAT；

BP26(SEQ ID NO.14-15):

上游：GCCCTACCCGAAAGAAA，

下游：ATCCGCTAGACCGCATCCC。

1.2自制MARKER

引物本发明PCR产物在猪种S2上都有条带，所以用其的PCR反应液制备本实验专用的marker，如图1，具体如下：

(1)六种引物分别按照固定比例混合：

NC_017250：GL_0002189：WP_002965788.1：犬wbkF-wbkD缺失基因,：BP26：EryC＝2：1：1：4：2：4进行混合

(2)每次用50μL的体系进行正常的PCR仪反应，产物即为自制marker。

1.3阳性质控标准品：猪s2菌株。

1.4阴性质控标准品：无菌双蒸水。

1.5 PCR试剂盒的重复性试验

(1)本发明的猪种S2能显示全部条带，故单独用猪种S2菌株进行重复性实验即可。采用细菌基因组DNA提取试剂盒猪种布鲁氏菌S2布鲁氏菌DNA，用于PCR扩增；

(2)分别取PCR反应液各47.8uL，取步骤(1)所得布鲁氏菌DNA和布鲁氏菌阳性质控标准品各2μL，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在PCR仪上平行做PCR扩增，PCR反应条件为：95℃5min，94℃1min、59℃50sec、72℃50sec，30个循环，72℃10min。

(3)取5μL PCR产物，以1.5％琼脂糖凝胶电泳(100V 30min)进行检测，观察是否是猪S2 6个条带为1.4kbp，1.2kbp，879bp，660bp，420bp，272bp。

(4)对上面的PCR产物进行重复性实验，结果如图2所示，所得检测结果均相同，这说明检测结果具有可比性和良好的重复性，PCR试剂盒的重复性较好，而且采用PCR试剂盒对样本(DNA)的检测仅需3个小时就能完成，表明本发明的PCR试剂盒可以快速检测牛种、羊种、猪种、犬种以及疫苗S19和A19。

1.6 PCR试剂盒的特异性试验

(1)采用本发明的PCR试剂盒对牛种布鲁氏菌S19和A19、羊种布鲁氏菌M28和REV.1、猪种布鲁氏菌S2、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌的基因组DNA进行扩增，并设阴性对照，验证多重PCR反应的特异性，PCR反应条件为：95℃5min，94℃1min、59℃50sec、72℃50sec，30个循环，72℃10min。

(2)结果如图3所示，牛s19显示1.2kbp条带，牛a19显示1.2kbp和420bp的条带，猪S2显示1.4kbp，1.2kbp，879bp，660bp，420bp，272bp 6个条带，羊REV.1和羊M28显示1.4kbp，1.2kbp，879bp，420bp4个条带，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、猪链球菌和阴性对照没有显示条带，说明PCR试剂盒具有较好的特异性，且无交叉反应。

1.7 PCR试剂盒的敏感性试验

本发明的猪种S2能显示全部条带，故单独用猪种S2菌株进行重复性实验即可。分别取牛种布鲁氏菌S19、牛种布鲁氏菌A19、猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M28、羊种布鲁氏菌REV.1的DNA模板，利用NanoDrop核酸浓度测定仪测浓度，分别以10倍倍比稀释菌液，取1μL基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃5min，94℃1min、59℃50sec、72℃50sec，30个循环，72℃10min。

结果如图4所示，通过实验结果确定PCR试剂盒检测灵敏度为2.0×10^-1ng/μL。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明基本原理的基础上所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 内蒙古农业大学

<120> 一种用于鉴定布鲁氏菌的引物对、试剂盒及其应用

<130> KHP211118393.9

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaccgttt ccgtgctcat catgacgctc aacgaggaag ccaacctgcc ggcatgtctg 60

gcttcgctcg actggtgcga tgatatcgtc gtgctggatt cattcagcac cgaccgcacg 120

gtcgagattg ccagagcggc tggcgcgcgc atctaccagc gggcctatga caccgaagac 180

cgccagcgca tgtatggatt aaccgaaatc gagttcagac atgcctgggt ctatacaccc 240

gatgccgacg aaatcacccc gccggatctg cgtgatgaaa tgctggcgat agccgccgac 300

cccgaccggc ctgaagtctt cttcaaggcg cgttacaaga atatgttcat ggggcgctgg 360

atacgccatg cgagccttta tcccacctgg ataacccgcc tcgtgcggcc ggaccgtgtg 420

catttcgagc gctccgtcca ttcgcgggca agcggtgggc cgggcggcga attacaggcc 480

catttcatcc attacagttc caacaagggg ctggccgcct ggtatgacaa gcacaaccgt 540

tattcctccg tcgaggcaga cctggccgcc tcaaagcgcc tggaacgcca catcgattgg 600

ggcggccttc tatccggcga accggagcgc aggcgccgca cactgaaatc gctctcctat 660

aatttgcctt tccggcccag cctgcgcttt ctctatatgt atatattgcg tggcgggttt 720

ctcgacggca agcccggcta tctctattgc cgccttctcg ccgcctatga attcatgatc 780

gtggtgaaaa cggaagagca tcgccgcaag caaagcgcca tgccgcaagc gccagcgcga 840

cgcccgcttg atgcgaaaga gccggagcgg cacatggta 879

<210> 2

<211> 1888

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtcagtcac gagcaccaac aaggaaacag cggctccgac cggcgcgaag cggaagacca 60

gcctcgtgca tctgctgctc gagggtcgcg cattctttgc gctgatcgcg atcatcgccg 120

tcttctcgtt cctttcgccc tattacttta cggtcgataa tttcctcatc atgtcgtcgc 180

atgtggccat tttcggcctt ctggcgattg gtatgctgct cgtcatcctc aatggcggca 240

tcgacctttc ggtcggctcc acgctggggc tggccggtgt ggtcgcgggc ttcctgatgc 300

agggcgtgac cttgcaggaa ttcggcatca tcctttattt cccggtctgg gccgtggtgc 360

tcatcacctg cgcgctcggc gccttcgtcg gcgcggtcaa tggtgtgttg atcgcttatc 420

tgcgcgttcc ggccttcgtg gcgacgcttg gcgttcttta ttgcgcgcgt ggcgtagcgc 480

ttttgatgac caacggtctc acctacaaca atctcggcgg tcgccccgaa cttggcaata 540

cgggctttga ctggctcggc ttcaacaagc ttttcggcgt gccgatcggt gtgctggtgc 600

tggcaattct cgccatcatc tgcgccattg ttttgaaccg cactgcattc ggccgctggc 660

tctatgcctc gggcggcaat gaacgggcgg cggaactttc cggtgttccg gtcaagcggg 720

tcaaggtgtc ggtctatgtc atttccggca tctgcgctgc cattgcgggg ctggttcttt 780

cctcgcagct cacctctgct gggccgacgg ctggcaccac ctacgaactg acggcaatcg 840

ctgccgtggt gatcggtggc gctgcgctca ctggggggcg cggtacgata cagggcacac 900

ttctcggtgc tttcgtgatc ggtttccttt ccgacggcct cgtgattatc ggcgtgtcct 960

cttactggca gaccgtcttt accggcgcgg tgatcgtgct cgcggttctg ctcaacagca 1020

ttcaatattc ccggcgatga ttggttacgg ctccgtccac cgttccgggc ggagccggtt 1080

cttcatcctg tccgggcatg tcgaaaggtt tccagaaggc cgcatcgtct taaaaacggc 1140

ccatggaaat aagtactgcc ggggaaccgg cacaacgcaa atgaaaaaca tcaagggagt 1200

gagactatgt tcaagaaggg tatgcgcgtt ctgttcgccg ctgcggcagc gttgcctctt 1260

atcgccagca cggcctgggc tgaaggactg atgacgatca tcgtcaacga tccgtccaac 1320

ccgtattggt tcaccgaagg cgaagtcgcc aagaagaccg ccgagggtct gggttataag 1380

gctgttgtcg ggggccacaa gggcgacacc aataccgaaa gcaacctgat cgacacggcg 1440

atcaccaaca agtcggttgc cattattctc gatccggcca atgccgacgg ttcggtcggc 1500

gcggtcaagc gcgcgattgc cgccaatatt ccggttttcc tcatcaatgc tgaaatcaat 1560

caggaagggc ttgccaaggc gcagctcgtt tccaacaatg cgcagggtgc ggctctcggc 1620

gcgacccagt gggttgaaag cgttggcgac aagggcaaat atgtcgaact tttcggtgcg 1680

ccttccgaca ataatgccgc cacgcgctcc aacggttatg aaaccgttct ttcgcagtat 1740

cccgatctgg tgagggtcgg caaggacgtc gccaactggg accgcacgca gggccacgac 1800

aagatgcagg cactgcttca ggcaaatccg gacattatcg gcgtcatctc cggcaatgat 1860

gaaatggcgc ttggcgcgat tgctgccc 1888

<210> 3

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggccctga cgctttcgct caacaccaat ccgctggtca accgctttgc cgagccggac 60

gacctgatcg aaacggttgc ccgcgacctg cgcctgcgtg acctccagct tacccatgag 120

tttatcaatc caagctggca ggcctcgacc atccgccgcc tcacccgcga catggacagg 180

gccttgcagc gcaccggtgt ccgcgtcacc tccggcatga ccggccccta tggccgcctc 240

aaccattttg gccatcccga ccgggacgtg cgccgctatt atgtggactg gttcaagacc 300

tttgccgata ttatcgcgga tcttggcggc aagtccgtcg gtacgcagtt tgcaatcttc 360

acctataagg atttcgatga tccggcgcgc cgcgaagaac ttatcaagat cgccatcgac 420

tgctgggccg aggtggccga acatgcggca ggtgcgggcc tcgactatgt gttctgggag 480

ccgatgagca tcgggcgcga atttggcgag acgattgccg aatgcatgaa gcttcaggat 540

cggctcaccg ccgctaacat ggcgatcccc atgtggatga tggccgatat cgaccatggt 600

gacgtgacat ccgctaaccc ggacgactac gatccttacg catgggcccg caccgtgccg 660

aaagtctcgc ccatcatcca tatcaagcaa agcctgatgg acaagggcgg gcatcgtcct 720

ttcacagccg cgttcaatgc caagggccgc atccagccgg aaccgctttt gaaagccttt 780

gccgacggcg cggtggataa tgaaatctgt cttgaacttt cgttcaagga gcgcgagccg 840

aacgaccgtg aagtcattcc acagattgca gaaagtgtgg ctttctgggc gccgcacatt 900

gacaccggcg ctaaggactt gaagatatag 930

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcggatcca tgaccgtttc cgtgctc 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccctcgagta ccatgtgccg ctccgg 26

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccgggaatt cttgtacggt ttactgaaca c 31

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtctcgagt caaggctgtt ggattcgca 29

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagaattcat tgccgaatgc atgaagct 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcctcgagct atatcttcaa gtccttag 28

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tctattatta cggacggctg gctgag 26

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtggtggccc atgtggcgct t 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gggcgtgacc ttgcaggaat 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gggcgtgacc ttgcaggaat 20

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gccctacccg aaagaaa 17

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atccgctaga ccgcatccc 19

Claims

1.一种引物组合，其特征在于，包括：

引物对一：

上游：CGCGGATCCATGACCGTTTCCGTGCTC，

下游：CCCTCGAGTACCATGTGCCGCTCCGG；

引物对二：

上游：GAGAATTCATTGCCGAATGCATGAAGCT，

下游：GCCTCGAGCTATATCTTCAAGTCCTTAG；

引物对三：

上游：GGGCGTGACCTTGCAGGAAT，

下游：TGCCGACCCTCACCAGAT。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，还包括：

引物对四：

上游：GCCGGGAATTCTTGTACGGTTTACTGAACAC，

下游：TGTCTCGAGTCAAGGCTGTTGGATTCGCA；

引物对五:

上游：TCTATTATTACGGACGGCTGGCTGAG，

下游：GTGGTGGCCCATGTGGCGCTT；

引物对六:

上游：GCCCTACCCGAAAGAAA，

下游：ATCCGCTAGACCGCATCCC。

3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括：

PCR反应液、DNA聚合酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品；

优选地，所述的阳性质控标准品为布鲁氏菌s2疫苗株，所述阴性质控标准品为无菌双蒸水。

5.权利要求1所述引物组合，或权利要求2-4任一项所述试剂盒在鉴别布鲁氏菌种型中的应用。

6.一种鉴定布鲁氏菌种型的方法，其特征在于，包括：

提取待测样本的DNA；

采用权利要求1或2所述引物组合中任意一对或多对引物，或权利要求3或4所述试剂盒对所述待测样本的DNA进行PCR检测；

通过检测结果判断待测样本所含有的布鲁氏菌种型；

优选地，所述PCR检测的反应条件为：

95℃5min，94℃1min、59℃50sec、72℃50sec，30个循环，72℃10min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述通过检测结果判断待测样本所含有的布鲁氏菌种型为：

8.一种牛种布鲁氏菌缺失基因片段，其特征在于，其脱氧核糖核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

9.一种布鲁氏菌A19和S19疫苗株基因缺失片段，其特征在于，其脱氧核糖核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

10.一种布鲁氏菌S19疫苗株基因缺失片段，其特征在于，其脱氧核糖核酸序列如SEQID NO.3所示。