CN114214320A - 一种用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物、试剂盒及其应用，涉及生物检测技术领域，本发明可以检测到0.25copy/μl(即1copy/4μl)的检出限，与现有技术相比，灵敏度有显著的提高，且检测的特异性高，稳定性好，适用于种猪场蓝耳病净化的检测监测工作，显著提高养殖效益，解决在蓝耳病在非病毒血症期检出率低以及毒株多变、隐蔽的问题。

Description

一种用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物、试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物、试剂盒及其应用。
背景技术
猪繁殖和呼吸障碍综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，简称PRRS)，俗称蓝耳病(Blue Ear Disease)。PRRS可导致母猪出现繁殖障碍及仔猪出现严重呼吸道疾病，是一种严重影响经济效益的猪传染病。猪繁殖和呼吸障碍综合症于1987年在美国首次发现，患病猪出现长期繁殖障碍，新生仔猪有严重肺炎症状。1991年在国际上提出用“猪繁殖和呼吸障碍综合症”(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)来统一命名这一疾病。猪繁殖和呼吸障碍综合症主要由猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)所引起。PRRSV为单股正链RNA，不分节段病毒，该病毒属动脉炎病毒科动脉炎病毒属。猪被病毒感染后，先在局部易感巨噬细胞中复制，然后迅速向全身淋巴线组织和在肺部扩散。大约一周左右，猪出现高烧不退、腹泻等，怀孕母猪染病后易流产、早产，产死胎。因为有时病猪耳朵会发绀变蓝，又称为“猪蓝耳病”。蓝耳病毒变异快、隐蔽性强，非发病期难检测到病毒，现有技术在病毒血症期检测到蓝耳病毒的效率较好，但在非病毒血症期检出率相当低，急需开发更灵敏的检测试剂盒应对目前蓝耳病毒株多变、隐蔽的现状。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物、试剂盒及其应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物，其包括：用于检测猪蓝耳病毒的引物对1，所述引物对1的上下游引物的序列依次如SEQ IDNo.1～2所示。
第二方面，本发明实施例提供了一种用于检测猪蓝耳病毒的试剂盒，其包括如前述实施例所述的用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物。
第三方面，本发明实施例提供了一种猪蓝耳病毒的扩增方法，其包括：采用前述实施例所述的探针引物组合物或前述实施例所述的试剂盒对待测样本中的核酸进行PCR扩增；所述扩增方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
第四方面，本发明实施例提供了一种猪蓝耳病毒试剂盒在核酸检测中的应用，所述核酸检测包括采用如前述实施例所述的扩增方法对待测样本中的核酸进行PCR扩增，并对扩增产物进行检测；所述检测方法不以疾病的治疗或诊断为直接目的。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种用于检测猪蓝耳病的探针引物组合物、试剂盒及其应用，本发明可以检测到0.25copy/μl(即1copy/4μl)的检出限，与现有技术相比，灵敏度有显著的提高，且检测的特异性高，稳定性好，适用于种猪场蓝耳病净化的检测监测工作，显著提高养殖效益，解决在蓝耳病在非病毒血症期检出率低以及毒株多变、隐蔽的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中不同浓度质粒对应的qPCR扩增曲线图；
图2为实施例2中未添加经典猪瘟病毒、II-型猪圆环病毒、猪丹毒杆菌的引物探针时的扩增曲线图；
图3为实施例2中添加有经典猪瘟病毒、II-型猪圆环病毒、猪丹毒杆菌的引物探针时的扩增曲线图；
图4为对比例1提供引物对的特异性检测结果；
图5为对比例2提供引物对的的特异性检测结果；
图6为实施例3中的灵敏度测试结果；
图7为灵敏度对比试验结果；
图8为实施例4中实施例1提供引物对的重复性测试结果；
图9为实施例4中对比例1提供引物对的重复性测试结果；
图10为实施例4中对比例2提供引物对的重复性测试结果；
图11为实施例5中的稳定性测试结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，本发明提供了一种用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物，其包括：用于检测猪蓝耳病毒的引物对1，所述引物对1的上下游引物的序列依次如SEQ ID No.1～2所示。
本发明针对GenBank中猪蓝耳病毒的保守基因M基因设计了多组引物，经一系列创造性劳动后，筛选获得了特异性和灵敏度俱佳的引物对1，将该引物对应用于猪蓝耳病毒的检测，可显著提高猪蓝耳病毒的检测有效性。
优选地，用于检测内参基因的引物对2，所述引物对2的上下游引物的序列如SEQID No.4～5所示。所述内参基因为β-actin。靶基因(猪蓝耳病毒的M基因)与内参基因的引物之间互相无干扰，检测特异性强、敏感性高。
优选地，所述探针引物组合物还包括用于检测猪蓝耳病毒的探针1和/或用于检测内参基因的探针2。
优选地，当包括探针1时，所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；探针1和引物对1的检出限可达到0.25copy/μl(即1copy/4μl)，与现有检测技术(灵敏度1copy/μl)相比，灵敏度提高4倍，使用方法简便。
优选地，当包括探针2时，所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
优选地，所述探针1和所述探针2的5’端均连接有荧光报告基团，3’端均连接有荧光淬灭基团。
优选地，所述荧光报告基团选自Alexa350、CF350、FAM、Alexa488、CF488、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、Texas Red、Alexa594、CF594、CY5、Quasar670、Alexa647、CF647、Quasar705、Alexa680和CF680中的至少一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB中的至少一种。
上述探针引物组合物能够实现同时在单管反应中检测靶基因和内参基因，有助于监控采样质量与提取过程质控。
本发明实施例提供了一种用于检测猪蓝耳病毒的试剂盒，其包括如前述任意实施例所述的用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应试剂。
优选地，所述试剂盒还包括阳性标准品和阴性标准品中的至少一种。
本发明实施例还提供了一种猪蓝耳病毒的扩增方法，其包括：采用如前述任意实施例所述的探针引物组合物或前述任意实施例所述的试剂盒对待测样本中的核酸进行PCR扩增；所述扩增方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
优选地，在所述PCR扩增的反应体系中，所述探针引物组合物中的引物对1的上游引物和下游引物的作用浓度均为5～15μM，具体可以为5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM或15μM。
当包括探针1和/或探针2时，为qPCR扩增。具体地，当包括所述探针1时，为qPCR扩增，所述探针1和/或探针2的作用浓度为5～15μM，具体可以为5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM或15μM。优选地，所述PCR扩增的反应条件为：94～96℃变性29～31s，94～96℃9～11s，58～60℃29～31s，45个循环。
优选地，所述PCR扩增的反应条件在变形前还包括预变性的步骤：54～56℃14～16min。
本发明的检测试剂在PCR过程中使用45个循环反应，无非特异性扩增，增加循环数对病毒拷贝低的样品检测率更高。
此外，本发明还提供了一种猪蓝耳病毒试剂盒在核酸检测中的应用，所述核酸检测包括采用如前述任意实施例所述的扩增方法对待测样本中的核酸进行PCR扩增，并对扩增产物进行检测；所述应用不以疾病的治疗或诊断为直接目的，例如当待测样本为环境样本时，所述方法的直接目的是检测样本中是否存在猪蓝耳病毒。
具体地，对于扩增产物的检测包括a和b两种方式。
a.将扩增产物进行电泳实验，获得扩增产物的片段大小，当含有对应大小的扩增片段时，则判定待查样本中含有猪蓝耳病毒，反之则没有；
b.基于探针产生的信号值，对样本中的猪蓝耳病毒进行定量。定量的方式可为相对定量或绝对定量。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种猪蓝耳病毒的检测方法，其包括以下步骤。
1.引物合成
本实施例采用的探针引物组合物包括：用于检测猪蓝耳病毒的M基因的引物对1和探针1，以及用于检测内参基因β-actin基因的引物对2和探针2，具体序列如表1所示。
表1引物序列
Figure BDA0003450729170000061
备注：F为上游引物，R为下游引物，P为探针。
1.2DNA提取
分离血清，取200μl血清置干净的1.5ml离心管中，严格按提取试剂盒说明书进行操作，提取核酸，核酸提取试剂盒使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的DNA核酸提取试剂盒，货号为7E590G1。
1.3重组质粒构建
使用北京全式金生物技术公司的pEASY-Blunt Cloning Kit和Trans1-T1试剂盒，全程按说明书进行操作。将合成M基因克隆到MBP载体，得到带靶序列的阳性质粒，转入大肠杆菌培养，扩增质粒；提取质粒，计算出拷贝数，以10倍做梯度稀释，制备标准曲线，反应过程：37℃5分钟，95℃1分钟，95℃15秒，60℃30秒(采集荧光)，45个循环；定量，得到阳性标准品。
1.4荧光定量PCR(qPCR)
进行质粒浓度的测定，对已知浓度的标准品质粒进行10倍浓度梯度稀释：107、106、105、104、103、102和101copies/μl，分别进行荧光定量PCR。
反应体系如表2所示。
表2反应体系
体积μl
2×预混液 10
上游引物(10μM) 0.6
下游引物(10μM) 0.6
探针(10μM) 0.8
标准品 2
ddH<sub>2</sub>O 6
反应条件：95℃变性30s，95℃10s，59℃30s，45个循环。在59℃进行荧光采集。实施例1提供的引物对的检测结果如图1所示。
实施例2
蓝耳病病毒阳性标准品、阴性样品作为对照，在同一份样本中加入含有临床症状与蓝耳病相似的经典猪瘟病毒、II-型猪圆环病毒和猪丹毒杆菌，均为阳性的猪源性样品，混匀器充分混匀后取200μl提取核酸，采用实施例1的引物对进行检测，反应体系：20μl(预混液15μl，模板5μl)；反应条件：55℃15min，95℃变性30s，95℃10s，59℃30s，45个循环，在59℃进行荧光采集，结果如图2～3所示。
结果显示只有蓝耳病病毒阳性标准品能扩增出靶序列的特征性曲线，其他均未扩增出靶序列曲线，只扩增出内参序列曲线，如图2。
而用同样的核酸做模板，加入对应的经典猪瘟病毒、II-型猪圆环病毒、猪丹毒杆菌的引物探针时均能扩增出对应的靶序列曲线，如图3，可知本发明提供的引物对具有很好的特异性。
对照设置2组对比例，对比例1和2采用的引物如表3所示。
表3引物序列
Figure BDA0003450729170000081
验证对比例1和2的特异性，对比例1的检测结果如图4所示，对比例2的检测结果如图5所示。
实施例3
灵敏度试验。
对已知浓度的标准品质粒进行倍比浓度梯度稀释：102、101、100、0.5、0.25和0.125copies/μL，分别进行荧光定量PCR，反应体系和反应程序同实施例2，结果显示0.125copies/μL这个浓度未扩增出，其他浓度均能扩增出对应的S形曲线，表明实施例1的荧光定量PCR的检测灵敏度最低为0.25copies/μL，如图6。
将阳性对照、实施例1、对比例1～2进行灵敏度对比试验，结果见图7。对比例1的灵敏度为1copies/μl，对比例2的灵敏度为2copies/μl。
实施例4
重复性试验。
做重复性验证，反应体系与反应程序与实施例2相同，三次重复中，同一浓度标准品的扩增曲线基本重叠，靶序列与内参序列重复性均良好，说明本发明试剂重复性好，如图8。
对比例1和对比例2的重复性结果依次参照图9～10。
实施例5
稳定性试验。
将实施例1的探针引物组合物置于37℃进行加速稳定性试验，分别于0d、4d、7d进行留样，其中0d、4d取出的试剂先放-20℃保存，待7d的样品一起进行PCR检测，反应体系与反应程序与实施例2相同，结果显示：未出现显著变化，如图11。
实施例6
一种用于种猪场的蓝耳病净化，样品采集及检测方法，其包括以下步骤：
1、环境样品：用自制的采样包，将水料槽(一栋猪舍用2个采样包)、产房(一个单元用2个采样包)、早产母猪乳头、第一次出现流产的母猪单元进风口的风机水帘。采集后放回自制包中充分揉挤，用无菌注射器吸取1ml，立即放入预先装有0.5ml核酸保护液的2ml或5ml EP管中。盖紧管盖，做好标记，放入预先装有冰冻冰袋的泡沫箱中保存，尽快送到实验室检测。
2、种猪口鼻拭子采集：用一根长棉签，先放猪只嘴巴待其咀嚼几秒钟后，再次放入猪鼻子中刮拭几下。立即放入预先装有0.5ml核酸保护液的EP管中。盖紧管盖，做好标记。
3、保育与育成猪：根据栏内猪数量，8-10头一根棉绳，固定于栏舍内易咬的地方，30-45分钟后，取下，尽量挤出1ml液体，立即放入预先装有0.5ml核酸保护液的EP管中。盖紧管盖，做好标记。
4、大栏猪只：与保育猪类似。
5、公猪：都尽可能采集口鼻拭子，如果实在没有条件，采用其精液。如再无方法，采取棉绳方法。公猪站的公猪，每头都要采集。立即放入预先装有0.5ml核酸保护液的EP管中。盖紧管盖，做好标记。
6、未断奶小猪：每单元采集刚出生的脐带血2头(不需要加核酸保护剂)，快断奶的小猪口鼻拭子2头，立即放入预先装有0.5ml核酸保护液的EP管中。盖紧管盖，做好标记。
7、重复筛选，间隔7天，再进行全群口鼻拭子和环境采样复检(第二次视情况增加一次全群常规疫苗免疫，应激后第五天采样)，连续筛查3轮。
8、无新增病例后，每天使用本发明只监测异常猪，每半个月全场猪进行监测一次蓝耳病原，连续监测24个月。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 泰和县傲牧育种有限公司
吉安市傲农现代农业科技有限公司
吉安市傲宝生物科技有限公司
福建傲农生物科技集团股份有限公司
<120> 一种用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物、试剂盒及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttaacgtcag agctcgttac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taaagtcagc gaagtacgca 20
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actgatcgtg tgcgcgatat cgcatcac 28
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttctatcggc gctgtcgagg atcgc 25
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<211> 25
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<213> 人工序列
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tactcatggg caggcaatca gtcgc 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agcagcaccg gctgcttagg cttgtc 26

Claims (10)

1.一种用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物，其特征在于，其包括：用于检测猪蓝耳病毒的引物对1，所述引物对1的上下游引物的序列依次如SEQ ID No.1～2所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物，其特征在于，用于检测内参基因的引物对2，所述引物对2的上下游引物的序列依次序列如SEQ ID No.4～5所示。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物，其特征在于，所述探针引物组合物还包括用于检测猪蓝耳病毒的探针1和/或用于检测内参基因的探针2；
优选地，当包括探针1时，所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
优选地，当包括探针2时，所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
4.根据权利要求3所述的用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物，其特征在于，所述探针1和所述探针2的5’端均连接有荧光报告基团，3’端均连接有荧光淬灭基团。
5.根据权利要求4所述的用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自Alexa350、CF350、FAM、Alexa488、CF488、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、Texas Red、Alexa594、CF594、CY5、Quasar670、Alexa647、CF647、Quasar705、Alexa680和CF680中的至少一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB中的至少一种。
6.一种用于检测猪蓝耳病毒的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1～5任一项所述的用于检测猪蓝耳病毒的探针引物组合物。
7.根据权利要求6所述的用于检测猪蓝耳病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂；
优选地，所述试剂盒还包括阳性标准品和阴性标准品中的至少一种。
8.一种猪蓝耳病毒的扩增方法，其特征在于，其包括：采用权利要求1～5任一项所述的探针引物组合物或权利要求6或7所述的用于检测猪蓝耳病毒的试剂盒对待测样本中的核酸进行PCR扩增；
所述扩增方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
9.根据权利要求8所述的猪蓝耳病毒的扩增方法，其特征在于，在所述PCR扩增的反应体系中，所述探针引物组合物中的引物对1的上游引物和下游引物的作用浓度均为5～15μM；
当所述探针引物组合物包括探针时，所述探针的作用浓度为5～15μM；
优选地，所述PCR扩增的反应条件为：94～96℃变性29～31s，94～96℃9～11s，58～60℃29～31s，45个循环。
10.一种猪蓝耳病毒试剂盒在核酸检测中的应用，其特征在于，所述核酸检测包括采用如权利要求8或9所述的扩增方法对待测样本中的核酸进行PCR扩增，并对扩增产物进行检测；
所述应用方法不以疾病的治疗或诊断为直接目的。
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