CN103740864A

CN103740864A - 一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN103740864A
Application number: CN201410026250.2A
Authority: CN
Inventors: 高珊珊; 孙晓明; 王新杰
Original assignee: BEIJING YISEN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING YISEN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-01-21
Filing date: 2014-01-21
Publication date: 2014-04-23

Abstract

本发明提供一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法及检测试剂盒。所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：上游引物：5’-TAAACTGGAGGGTGAGCATTGG-3’，下游引物：5’-GCCCTTATGCTCGCAACAA-3’，Taqman探针:5’-TGGGATGTCCCCTACTT-3’。本发明提供的高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测试剂盒，能够快速、有效地检测高致病性猪蓝耳病毒，所述检测方法准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，可实现对待测样品如食品、血液及组织样品的快速诊断和有效检测。

Description

一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒的分子生物学检测领域，特别是涉及一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法及检测试剂盒。

背景技术

猪蓝耳病俗称猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)。猪蓝耳病毒，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)猪繁殖与呼吸综合征，主要感染猪，尤其是母猪，该病严重影响其生殖功能，临床主要特征为流产，产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难，在发病过程中会出现短暂性的两耳皮肤紫绀，故又称为蓝耳病。

目前对猪蓝耳病毒的检测所采用的方法主要还是传统常规的分离鉴定法、Elisa方法及普通PCR检测。传统常规的分离鉴定法，操作烦琐，耗时长，漏诊率高；ELISA方法相对简便，快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可能造成漏诊或误诊。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性高，能在短时间内得到大量的目的片段，使之成为当今发明研究的重要手段之一。但常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使之在诊断上受到一些限制。

定量检测技术-实时荧光定量PCR（Real-timePCR，qPCR），该方法与传统方法不同，它的优点：一是单管封闭操作，有效解决了PCR污染问题；二是自动化程度高；三是特异性更强；四是PCR反应的实时监控。有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果；五是绝对定量，由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行绝对定量测定。SYBRGreen染料法已是较完善的检测体系，且反应体系中SYBRGreen染料的使用浓度亦不用进行调整优化，整个检测体系简单易行，但用SYBRGreen染料法进行Real-timePCR也存在着一定的弊端，如结果需要进行熔解曲线分析，特别是进行多重基因检测或引物质量不好时，其扩增的原始图则不能直观反映真实的扩增效率，必需经熔解曲线分析来确定最终的发明结果。实时荧光定量PCR技术自产生以来，不断发展完善，到目前为止已经非常成熟了。标记方法由最初单一的染料法，发展到了特异性更高的探针法，如Taqman、MolecularBeacon等。

近些年，已有应用于检测高致病性猪蓝耳病毒的相关报道和专利。例如，申请号为200810032140.1公开了一种猪蓝耳病毒RT-PCR检测试剂盒；申请号为201310075372.6公开了一种高致病性猪蓝耳与经典猪蓝耳病毒的RT-PCR引物及检测试剂盒；申请号为201310189880.7公开了一种猪蓝耳病毒与HP-PRRS病毒天津株的RT-PCR引物及检测试剂盒；申请号为200710076592.5公开了一种用于检测高致病性猪蓝耳病毒的引物和探针序列。基于Taqman-MGB探针的荧光定量qRT-PCR技术通过Taqman-MGB探针与模板的特异性杂交来鉴定，具有较高的准确性、特异性和敏感性。目前尚未见用Taqman-MGB探针快速检测高致病性猪蓝耳病毒的专利。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种快速灵敏的高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测试剂盒，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，使其能够对待测样品如血液及组织样品进行快速诊断和有效检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：

上游引物：5’-TAAACTGGAGGGTGAGCATTGG-3’，

下游引物：5’-GCCCTTATGCTCGCAACAA-3’，

Taqman探针:5’-TGGGATGTCCCCTACTT-3’。

进一步地，所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。

进一步地，所述PCR反应液还包括2×One Step RT-PCR Buffer。

进一步地，所述试剂盒还包括酶混合物PrimeScript RT Enzyme Mix。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照，所述阳性对照为高致病性猪蓝耳病毒阳性质粒。

本发明的另一个目的是提供一种快速灵敏的高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法，可快速检测高致病性猪蓝耳病毒，且准确性、特异性和敏感性高。采用如下技术方案：

一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法，采用具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针进行荧光定量qRT-PCR：

上游引物：5’-TAAACTGGAGGGTGAGCATTGG-3’，

下游引物：5’-GCCCTTATGCTCGCAACAA-3’，

Taqman探针:5’-TGGGATGTCCCCTACTT-3’。

进一步地，所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM报告荧光基团，3’端标记MGB淬灭荧光基团。

进一步地，所述荧光定量PCR反应体系为20μl，包括：上游引物0.4μl；下游引物0.4μl；Taqman探针0.8μl；检测样品RNA1μl；2×OneStep RT-PCR Buffer，10μl；PrimeScript RT EnzymeMix，1μl；余量为灭菌去离子水。

进一步地，所述20μl的荧光定量PCR反应体系还包括：50×ROXReference DyeⅠ/Ⅱ0.4μl。

进一步地，所述荧光定量PCR反应条件为：42℃5min，95℃10s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：

（1）本发明根据高致病性猪蓝耳病毒的美洲型标准毒株（ATCCVR-2332）的保守序列设计并合成特异性引物及Taqman探针，采用荧光定量PCR方法快速灵敏地检测高致病性猪蓝耳病毒，且准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，可实现对待测样品如食品、血液及组织样品的快速诊断和有效检测。

（2）本发明一方面采用了高拷贝的靶基因，一方面采用Taqman-MGB探针荧光定量qRT-PCR检测法，使得利用Taqman-MGB探针法荧光定量PCR检测的灵敏度约是普通PCR的100倍。

（3）由于采用定量检测技术-Taqman-MGB荧光定量PCR（Real-timePCR），该方法（Real-time PCR）具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。

（4）由于探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间上的位置更接近，实验灵敏度更高，特异性更强。

（5）Taqman-MGB探针法荧光定量PCR方法简便、快速，整个过程（包括加样）可在一个小时内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了污染。

附图说明

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

图1是检测高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR扩增曲线。

图2是高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR特异性检测结果；图中，1：高致病性猪蓝耳病毒；2：灭菌的去离子水；3：猪伪狂犬病毒；4：猪瘟病毒；5：猪圆环2型病毒。

图3是高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR的敏感性检测结果；图中，1：1×10⁸拷贝/μl；2：1×10⁷拷贝/μl；3：1×10⁶拷贝/μl；4：1×10⁵拷贝/μl；5：1×10⁴拷贝/μl；6：1×10³拷贝/μl；7：1×10²拷贝/μl；8：1×10¹拷贝/μl；9：1×10⁰拷贝/μl；10：阴性样品（灭菌的去离子水）。

具体实施方式

除非特别指明，以下实施例中所用毒株由北京亿森宝生物科技有限公司分离保存。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

实施例1建立Taqman-MGB荧光定量qRT-PCR检测高致病性猪蓝耳病毒方法及特异性和敏感性验证

1、设计引物和Taqman-MGB探针

根据高致病性猪蓝耳病毒（Hp-PRRSV）美洲型标准毒株（ATCCVR-2332）的部分序列，通过DNAstar软件进行序列比对，找出高致病性猪蓝耳病毒基因序列的特异性保守序列。运用Primer Primer5.0软件进行引物和探针的设计。得到多对特异性引物和探针，经过比对筛选，最终确定一组最佳引物和一条MGB探针，目的片段为100bp，其核苷酸序列为序列表中序列4。

上游引物(Hp-PRRSV-F)：5’-TAAACTGGAGGGTGAGCATTGG-3’；

下游引物(Hp-PRRSV-R)：5’-GCCCTTATGCTCGCAACAA-3’；

探针(Hp-PRRSV-Taqman-MGB)：5’-FAM-TGGGATGTCCCCTACTT-MGB-3’。

由于TaqMan-MGB探针与传统的TaqMan-TAMRA探针比较具有以下优势：（1）提高TM值--平均15bases可提高18℃，这样可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列设计有很大的帮助，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异。（2）提高信噪比--由于在探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近。所以荧光定量的实验结果更精确，分辨率更高。

2、高致病性猪蓝耳病毒RNA提取

1)提前取出需要提取的Hp-PRRSV病毒毒株。

2)在超净台中取出2n个1.5ml的EP管。

3)在通风橱中每管加入600μlRNA裂解液，和200μl三氯甲烷后，分别加入200μl毒株。颠倒5-10次，震荡混匀5-10s，4℃，12000，15min。

4)取新1.5ml的EP管，每管加入400μl异丙醇（-20℃预冷）。

5)吸取步骤3中的上清550μl，避免吸出中间层。颠倒混匀4℃，12000,15min，弃上清。

6)加入600μl75%乙醇。4℃，12000,10min，弃上清。

7)吸水纸上去水凉干，15-30min。

8)加入10μlRNAasefreewater，瞬离5s，-80℃保存。

3、荧光定量qRT-PCR扩增：

按如下反应体系进行Taqman-MGB探针法荧光定量qRT-PCR：

将加好检测样品的PCR管放置荧光定量PCR仪中进行扩增，同时分别设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为高致病性猪蓝耳病毒RNA，阴性对照为灭菌的去离子水。荧光定量qRT-PCR反应条件如下：42℃5min，95℃10s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环。第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

实验结果如图1，结果显示高致病性猪蓝耳病毒RNA使用荧光定量qRT-PCR检测为阳性扩增，Ct值为20.85，有S形扩增曲线。从扩增曲线上可以看到，在扩增的前期，特别是在荧光临界值（threshold）附近，曲线重合性较好。阳性对照出现S形扩增曲线，阴性样品则无扩增曲线，表明检测样品中含有高致病性猪蓝耳病毒。

4、高致病性猪蓝耳克隆载体构建

1)高致病性猪蓝耳克隆载体连接转化：采用pMD19-T载体克隆试剂盒（pMD19-T Vector CloningKit，宝生物工程大连有限公司，货号6013）。

2)使用PCR法鉴定阳性克隆菌株。

3)抽提质粒：采用高纯度质粒小提试剂盒（TIANpureMini Plasmid Kit，宝生物工程大连有限公司，货号DP104），将所得质粒测定质粒浓度，并计算每μl质粒拷贝数。

5、特异性验证

将提取的高致病性猪蓝耳病毒和猪瘟病毒RNA作为模板，猪伪狂犬病毒和猪圆环2型病毒的DNA作为模板，灭菌去离子水作为阴性对照，进行Taqman探针法荧光定量qRT-PCR反应，记录结果。结果如图2所示，阳性模板高致病性猪蓝耳病毒RNA在23.20Ct处有扩增，扩增曲线呈S形，对猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环2型病毒的检测结果均为阴性，阴性对照样品无非特异性扩增。

6、敏感性验证

将构建成功的高致病性猪蓝耳病毒重组质粒，进行10倍梯度稀释。取10⁸-10⁰拷贝/μl浓度梯度阳性质粒作为模板，无菌水作为阴性对照，进行Taqman探针法荧光定量qRT-PCR反应，记录结果。结果如图3所示，在最佳反应条件下，最低检测下线为1×10²拷贝/μl，即最低可检测到高于1×10²拷贝/μl的高致病性猪蓝耳病毒阳性重组质粒。起始模板的Ct值大约为36.58，因此反应循环数40可大大满足最低检测要求。从不同浓度起始模板的扩增曲线可以看出，指数区明显，斜率较大，这些均说明在该条件下模板的扩增是较为理想的。

实施例2：高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测试剂盒的制备及样品检测

1、试剂盒的制备：

配制如下试剂并保存。

试剂1：高致病性猪蓝耳病毒荧光PCR反应液1mL；

2、试剂盒的稳定性分析

1)选取3个已知阳性的样品，分别进行批内重复检测和批间重复检测。批内重复检测：将3个已知阳性样品在同一批实验中进行，每个样品设置3个重复。批间重复实验：将3个已知阳性样品分批次检测，每个样品单独检测，每个样品设置3个重复。

2)每管高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR反应体系为20μl：需18μl试剂1，1μl试剂2，试剂3（阳性对照）或试剂4（阴性对照）1μl。（ROXⅠ/Ⅱ根据荧光定量PCR仪需要选择是否添加）

3)反应条件为：42℃5min，95℃10s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环的Taqman探针法荧光定量qPT-PCR扩增，并记录实验结果。从表1中的检测结果分析，可以看出批内变异系数在0.02%-2.07%之间，批间变异系数在0.83%-1.99%之间，说明本试剂盒稳定性良好。

表1试剂盒稳定性分析

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：

上游引物：5’-TAAACTGGAGGGTGAGCATTGG-3’，

下游引物：5’-GCCCTTATGCTCGCAACAA-3’，

Taqman探针:5’-TGGGATGTCCCCTACTT-3’。

2.根据权利要求1所述的高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括2×One Step RT-PCR Buffer。

4.根据权利要求1所述的高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合物PrimeScript RT Enzyme Mix。

5.根据权利要求1所述的高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照，所述阳性对照为高致病性猪蓝耳病毒阳性质粒。

6.一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法，其特征在于，采用具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针进行荧光定量qRT-PCR：

上游引物：5’-TAAACTGGAGGGTGAGCATTGG-3’，

下游引物：5’-GCCCTTATGCTCGCAACAA-3’，

Taqman探针:5’-TGGGATGTCCCCTACTT-3’。

7.根据权利要求6所述的高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法，其特征在于，所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM报告荧光基团，3’端标记MGB淬灭荧光基团。

8.根据权利要求6所述的高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系为20μl，包括：上游引物0.4μl；下游引物0.4μl；Taqman探针0.8μl；检测样品RNA1μl；2×One Step RT-PCR Buffer，10μl；PrimeScript RT Enzyme Mix，1μl；余量为灭菌去离子水。

9.根据权利要求6所述的高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法，其特征在于，所述20μl的荧光定量PCR反应体系还包括：50×ROXReference DyeⅠ/Ⅱ0.4μl。

10.根据权利要求6所述的高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应条件为：42℃5min，95℃10s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。