CN105385786B - 一种人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。本发明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒具有很好的特异性，且操作快速、方法简便、灵敏度高，同时在反应体系中增加的内标能够有效防止检测呈假阴性。本发明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒在提取DNA时使用核酸快速释放法，该法简便快速，无需加热。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，更为具体地说，涉及一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一类分子量较小的无包膜的双链环状DNA病毒，专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞。在临床上，根据HPV不同亚型致病力大小或致癌危险性大小不同可将HPV分为高危型和低危型两大类。低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道下段的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变，其病毒亚型主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。
HPV在人群中极易传播扩散，可通过直接或间接接触交叉传染，其感染部位隐蔽，发病隐匿，不易早期发现，可致多种增生性病变，在女性生殖系统所引起的最常见的恶性肿瘤为宫颈癌。对宫颈癌的病因学研究可知，高危HPV持续感染是子宫颈癌的主要致病因素，99.7％宫颈癌患者存在HPV感染。临床研究显示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要8-10年，因此筛查是目前预防和早期诊断宫颈癌的主要手段。美国国立综合癌症网络(NCCN)宫颈癌筛查实践指南等明确指出，即使宫颈细胞学无异常而HPV阳性的30岁以上女性，如其为HPV16、HPV18感染者，应立即进行阴道镜检查。早期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果要好得多，且快速、准确的检测出HPV高危型的感染并同时分型鉴别HPV16、HPV18型对于早期治疗和降低宫颈癌的发病率和死亡率等具有重要的意义。
而目前在临床检测高危HPV-DNA的方法中，主要是采用基于实时荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction，即聚合酶链式反应)的技术及其改进。实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果，并得知样本浓度的定值结果。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。但是，仅有极少量荧光PCR诊断试剂盒在HPV诊断中使用，且缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，灵敏度不高，检测范围小，因此，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确快速诊断的需要。
国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测高危HPV-DNA的方法，这些试剂盒所提供的HPV-DNA提取方法主要是煮沸法，然而煮沸法存在很多不足之处：1)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。2)检测灵敏度不高，约在10000copies/ml左右；3)没有设置阳性内对照(即内标)，无法监控假阴性；4)一般没有预防PCR产物污染的措施。
发明内容
本发明的目的是提供一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法，以解决背景技术所述的现有HPV检测方法灵敏度低的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针；所述用于检测靶多核苷酸的探针具有HPYG1-P1、HPYG1-P2、HPYG1-P3、HPYG2-P、HPYG2-P1、HPYG3-P1、HPYG3-P2、HPYG4-CY5和HPYG5-ROX的序列。
优选地，所述用于扩增靶多核苷酸的上下游引物具有HPYG1-F、HPYG1-R1、HPYG1-R2、HPYG2-F、HPYG2-R1、HPYG2-R2、HPYG3-F1、HPYG3-F2、HPYG3-R1、HPYG3-R2、HPYG4-F、HPYG4-R、HPYG5-F、HPYG5-R的序列。
优选地，所述检测试剂盒还包括内标，所述内标为β-球蛋白。
优选地，所述PCR反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针具有GB-P的序列。
优选地，所述PCR反应液还包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物；所述上下游引物具有GB-F、GB-R序列。
优选地，所述PCR缓冲液包括pH为7.5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L的氯化镁溶液、500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2％的曲拉通溶液和体积比为10％的甲酰胺溶液。
优选地，所述脱氧核糖核苷三磷酸包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP。
优选地，所述检测试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液为1U/μl～5U/μl Taq酶和0.05U/μl～0.2U/μl UNG酶。
优选地，所述检测试剂盒还包括核酸释放剂，所述核酸释放剂包括质量浓度为0.01～0.5mM/L的莎梵婷，质量浓度为50～200mM/L的氯化钾，质量浓度为0.01％～2％十二烷基磺酸钠，体积分数为0.05％～1％的乙醇。
优选地，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照是浓度为1.00～5.00E+05copies/ml的HPV16型/18型混合强阳性样本。
优选地，所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为灭菌生理盐水。
优选地，所述检测试剂盒还包括定量参考品，所述定量参考品是浓度梯度为1.00～5.00E+07copies/ml、1.00～5.00E+06copies/ml、1.00～5.00E+05copies/ml和1.00～5.00E+04copies/ml的HPV16/18型强阳性质粒。
本发明还提供了一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，所述使用步骤包括：
S01：取体积比为38-44：1-2的PCR反应液和酶混合液，混和均匀并形成PCR-mix，瞬时离心后备用；
S02：在PCR反应管中加入2～5μl的核酸释放剂，深吸浅打后加入3～5μl待测样本、阴性对照或阳性对照，形成混合液；
S03：在上述混合液中加入40～45μl的PCR-mix，盖好管盖，形成待测样品；
S04：将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。
本发明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。本发明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒能够对人或动物生殖道分泌物中的HPV进行定量分析，且仅能检测出HPV的DNA，而不能检测出其它病原体的DNA，进而说明本发明所提供的检测试剂盒具有很好的特异性。本发明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒在提取DNA时使用核酸快速释放法，该法能够有效地去除复杂样本中的PCR抑制物，从而获得高纯度和高得率的DNA，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性。同时，本发明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒还具有操作快速、方法简便、灵敏度高的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法流程示意图；
图2是本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒检测阳性参考品的扩增曲线图；
图3是本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒检测阴性参考品的扩增曲线图；
图4是本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒精密度试验的扩增曲线图；
图5是本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒对正常人生殖道分泌物样本、或者HBV、HCV、HEV、HIV-1、EBV、HCMV感染样本进行荧光PCR反应测试的扩增曲线图；
图6是本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒对临床样本检测的扩增曲线图。
具体实施方式
本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法，解决了现有HPV检测方法准确度差的问题。
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明实施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明实施例中的技术方案作进一步详细的说明。
本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒包括一种PCR反应液，且该PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。
其中，本发明通过应用DNAStar软件包中的SeqMan和MegAlign软件对Genbank中检索到的HPV高危型(15型)基因组序列进行同源性比较，找出保守的区段，设计了多对通用引物及探针，经优化，筛选出了各组扩增效果相对较好的用于扩增靶多核苷酸的探针和上下游引物。同时在反应体系中还加入了HPV16型及HPV18型的特异性引物探针，以实现一次检测同时实现筛查和分流。其中，用于扩增靶多核苷酸的探针和上下游引物的序列如表1所示。
表1：用于扩增靶多核苷酸的探针和上下游引物的序列表
PCR缓冲液包括pH为7.5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，即Tris-HCl)、30mmol/L的氯化镁溶液、500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2％的曲拉通溶液和体积比为10％的甲酰胺溶液。
脱氧核糖核苷三磷酸包括dATP(三磷酸脱氧腺苷)、dCTP(三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸)、dGTP(三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸)和dUTP(脱氧尿苷三磷酸)。
本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒由于采用了上述探针和上下游引物，仅能检测出HPV的DNA，而不能检测出他病原体的DNA，从而说明本发明试剂盒具有很好的特异性。同时，本发明提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒能够通过一次检测实现HPV的筛查和分流，节省了大量的工作时间。应用本发明提供的检测试剂盒不仅能够对人或动物生殖道分泌物标本中的HPV进行定量分析，而且操作快速、方法简便、特异性好。
本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒的PCR反应液进一步包括内标，即包括阳性内对照，该内标为β-球蛋白。在PCR反应体系中，该内标可以监控PCR反应过程，监控反应体系是否有效，进而防止样本中可能存在的抑制物干扰检测，并使检测结果呈假阴性的情况。
本发明实施例提供的PCR反应液还包括针对内标而设计的用于检测内标的探针及用于扩增内标的上下游引物，该用于检测探针及用于扩增内标的上下游引物的序列如表2所示。
表2：用于检测探针及用于扩增内标的上下游引物的序列表
优选地，本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒中的还包括酶混合液，所述酶混合液包括浓度为1U/μl～5U/μl的Taq酶混合液(Thermusaquaticus，耐热酶混合液)和0.05U/μl～0.2U/μl UNG酶(uracil-N-glycosylase，即尿嘧啶-N-糖基化酶)。UNG酶可以降解dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，能够起到预防前次PCR产物污染的作用，进而防止样本检测假阳性。
优选地，本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒还包括核酸释放剂，该核酸释放剂包括质量浓度为0.01～0.5mM/L的莎梵婷，质量浓度为50～200mM/L的氯化钾，质量浓度为0.01％～2％十二烷基磺酸钠，体积分数为0.05％～1％的乙醇。
优选地，本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒还包括阳性对照，该阳性对照是浓度为1.00～5.00E+05copies/ml的HPV16型/18型混合强阳性样本。
优选地，本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒还包括阴性对照，该阴性对照为灭菌生理盐水。
本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒进一步还包括HPV定量参考品，该HPV定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的HPV16/18型强阳性质粒，其浓度分别为1.00～5.00E+07copies/m(A)、1.00～5.00E+06copies/ml(B)、1.00～5.00E+05copies/ml(C)和1.00～5.00E+04copies/ml(D)。
请参考附图1，附图1示出了本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法流程示意图。将本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒用于检测生殖道分泌物等样本中HPV-DNA的操作步骤为：
S01：根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A-D的数量，取体积比为38-44：1-2的PCR反应液和酶混合液，充分混和均匀并形成PCR-mix，瞬时离心后备用；
S02：在每个PCR反应管中加入2～5μl的核酸释放剂，深吸浅打后加入3～5μl待测样本、阴性对照或阳性对照，形成混合液；
S03：间隔10分钟后，在上述混合液中每管加入40～45μl的PCR-mix，盖好管盖，形成待测样品；
S04：将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。
本发明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒在对HPV的DNA进行提取时所选用的方法为核酸快速释放法，该核酸快速释放法采用强烈的蛋白变性剂，如SDS(sodium dodecyl sulfate，即十二烷基硫酸钠)快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取，检测灵敏度可达400copies/ml，定量线性范围为400copies/ml～4.00E+09copies/ml。
进一步，将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试包括以下步骤：
(1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度；
(2)荧光检测通道选择：
选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:None)检测HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68-DNA；
选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测内标；
选择CY5通道检测人乳头瘤病毒16-DNA；
选择ROX通道检测人乳头瘤病毒18-DNA。
(3)荧光定量PCR反应条件为：
结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。对于测定Ct值≤39的样本，报告为HPV-DNA阳性；对于测定无Ct值的样本，通过4个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定值结果。如果样本FAM通道扩增曲线呈S型，有Ct值且Ct≤39，可以判为HPV高危型(15型)-DNA阳性，并根据CY5及ROX通道是否有扩增曲线判定样本是否为HPV16或HPV18型；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示(Undet)显示，可以判为HPV高危型(15型)-DNA阴性。
(1)定量参考品的标准检测
荧光PCR扩增结束后，输入HPV定量参考品A-D的浓度，通过软件自助分析可以得知各样本的荧光扩增曲线以及各样本的定值结果(浓度值)。阳性对照和阴性对照的结果能够验证实验的有效性。通过对已确定的阳性参考品和阴性参考品进行检测，检测所得到的PCR扩增曲线请参考附图2和3，其中，附图2示出了本发明实施例提供的方法对阳性参考品进行检测的PCR扩增曲线示意图；附图3示出了本发明实施例提供的方法对阴性参考品进行检测的PCR扩增曲线示意图。
从附图2和3可以看出，在检测阳性参考品时，均出现了PCR反应体系的扩增曲线，且PCR反应体系的扩增曲线一致性较好；在检测阴性参考品时，均未出现PCR反应体系的扩增曲线，阴阳性参考品符合率为100％，这说明本发明实施例提供的检测试剂盒具有很好的检测准确性。
(2)精密度试验
本发明实施例提供的检测试剂盒对批内和批间的HPV进行重复性荧光PCR反应测试，反应的测试结果请参考附图4。从附图4中能够看出Ct值从22-45均具有很好的扩增曲线，线性范围良好，且Ct值的变异系数<5％,浓度对数值变异系数<10％，由此可以说明本检测试剂盒具有很高的精密度。
(3)特异性试验
请参考附图5，附图5示出了本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒对如CT、NG、HSV、UU等的常见性病病原体及如6、11、40、42、43、44等的低危型HPV感染样本进行荧光PCR反应测试的扩增曲线图。从附图5中能够看出，对感染样本进行荧光PCR反应测试时，反应的结果显示均为阴性，均未出现扩增曲线，且无交叉反应，由此能够说明本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒具有很好的特异性。
(4)DNA不同提取方法对HPV高危型(15型)-DNA检测的影响试验
通过同时检测梯度稀释样本发现，本发明的核酸快速释放法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本发明提供的试剂盒的方法操作更为简便快速，无需加热。同时，本发明的快速检测试剂盒中加入内标，防止所提取的DNA中有PCR抑制物存在，进而能够有效监控假阴性的存在。
(5)PCR产物污染的预防试验
在本发明实施例提供的检测试剂盒的PCR反应体系中加入适量的UNG酶，通过进行荧光PCR反应测试得知，所加入的UNG酶能够预防PCR产物引起的污染。
(6)临床样本的检测试验
请参考附图6，附图6示出了本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒定量线性范围的扩增曲线图。从附图6中能够看出本发明实施例提供的检测试剂盒的定量线性范围为400copies/ml～4.00E+09copies/ml，检测下限即灵敏度为400copies/ml。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针；
所述用于检测靶多核苷酸的探针为HPYG1-P1、HPYG1-P2、HPYG1-P3、HPYG2-P、HPYG2-P1、HPYG3-P1、HPYG3-P2、HPYG4-CY5和HPYG5-ROX的序列；其中，
用于检测HPV16、31、35、33、52、58的HPYG1-P1、HPYG1-P2、HPYG1-P3的序列分别为：
HPYG1-P1：TCCTCGTGCAAACTTAATCTGCACCAC-FAM；
HPYG1-P2：TTCCTCTATTAAACCTAATTTGCACCACGT-FAM；
HPYG1-P3：CTCGTGCAAACTTAATCTGGACCACG-FAM；
用于检测HPV18、45、59、39、68的HPYG2-P、HPYG2-P1的序列分别为：
HPYG2-P：TCCCCTCCCCATCTGTACCTTC-FAM；
HPYG2-P1：ACCCATCCCCGTCTGTACCTTC-FAM；
用于检测HPV51、53、56、66的HPYG3-P1、HPYG3-P2的序列分别为：
HPYG3-P1：TCATCCTCATCCTCTGAGCTGTCCAA-FAM；
HPYG3-P2：TCATCCTCCTCCTCTGAGCTGTCAAA-FAM；
用于检测HPV16的HPYG4-CY5序列为：CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC-CY5；
用于检测HPV18的HPYG5-ROX序列为：AATCATCAACATTTACCAGCCCGACG-ROX；
所述用于扩增靶多核苷酸的上下游引物为HPYG1-F、HPYG1-R1、HPYG1-R2、HPYG2-F、HPYG2-R1、HPYG2-R2、HPYG3-F1、HPYG3-F2、HPYG3-R1、HPYG3-R2、HPYG4-F、HPYG4-R、HPYG5-F和HPYG5-R的序列；其中，
HPYG1-F的序列为AACTGGAAATCCTTTTTCTCAAGG；
HPYG1-R1的序列为CTCCATCGTTTTCCTTGTCCTC；
HPYG1-R2的序列为CTCCATCGTTTTCTTTGTCCTC；
HPYG2-F的序列为TTTGTGTGTCCGTGGTGTGC；
HPYG2-R1的序列为AACCAGCCATTACAACCCG；
HPYG2-R2的序列为AACCATCCGTTACAACCCG；
HPYG3-F1的序列为GACCTGCAATGCAATGAGCAA；
HPYG3-F2的序列为GACTTGCAATGCTACGAGCAA；
HPYG3-R1的序列为CTCCTGCAAATGGTCTACTTCATC；
HPYG3-R2的序列为GGTAGCTGGTCACGCATATTATCTAC；
HPYG4-F的序列为CACAGGAGCCACCCAGAAAG；
HPYG4-R的序列为GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC；
HPYG5-F的序列为TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG；
HPYG5-R的序列为CTGGCTTCACACTTACAACACATAC。
2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括内标，所述内标为β-球蛋白；
所述PCR反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针为GB-P的序列；
所述PCR反应液还包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物；所述上下游引物为GB-F、GB-R序列；其中，
GB-P序列为CATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAG-HEX；
GB-F序列为GTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGA；
GB-R序列为ACGTTCACCTTGCCCCACA。
3.据权利要求1所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述 PCR缓冲液包括pH为7.5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L的氯化镁溶液、500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2%的曲拉通溶液和体积比为10%的甲酰胺溶液。
4.据权利要求1所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述脱氧核糖核苷三磷酸包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP。
5.据权利要求1-4中任意一项所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液为1U/μl~5U/μl Taq酶和0.05U/μl ~0.2U/μl UNG酶。
6.据权利要求5所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括核酸释放剂，所述核酸释放剂包括质量浓度为0.01～0.5 mM/L的莎梵婷，质量浓度为50～200mM/L的氯化钾，质量浓度为0.01%～2%十二烷基磺酸钠，体积分数为0.05%～1%的乙醇。
7.据权利要求6所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照是浓度为1.00~5.00E+05 copies/ml的HPV16型/18型混合强阳性样本。
8.据权利要求6所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为灭菌生理盐水。
9.据权利要求6所述的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括定量参考品，所述定量参考品是浓度梯度为1.00~5.00E+07copies/ml、1.00~5.00E+06copies/ml、1.00~5.00E+05copies/ml和1.00~5.00E+04copies/ml的HPV16/18型强阳性质粒。
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