CN107119147A - 人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒及其应用。所述试剂盒包括由MF11上游引物、MF12上游引物、MR11下游引物、MR12下游引物、MF21上游引物、MF22上游引物、MF23上游引物、MF24上游引物、F24上游引物、MR21下游引物、MR22下游引物、MR23‑1下游引物、MR23‑2下游引物、MR25下游引物、18F上游引物、18R下游引物、73F上游引物、73R下游引物、MP11探针、MP13探针、MP16探针、MP21检测探针、M18P探针、M73P探针等组成的混合液。本发明提供的试剂盒具有操作简单、准确性高、敏感度高、特异性好及生产成本低的优点，能有效满足临床使用推广。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，特别的，涉及一种人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒、该试剂盒在检测18种人乳头瘤病毒核酸的存在及对HPV16和HPV18进行分型的应用。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一类双链环状DNA病毒，具有宿主特异性和组织特异性。根据定义，如果L1开放阅读框中特定的291bp有10％不同就属于不同的HPV型，迄今为止，已鉴定的HPV型别有100多种。根据临床上感染后与宫颈癌的相关性，可将HPV型别分为低危型和高危型。低危型HPV感染可导致生殖器尖锐湿疣或低度鳞状上皮内瘤，影响生活质量，其中以HPV6、HPV11、HPV54、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44等较常见。高危型HPV除引起生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度宫颈上皮内瘤，依据WHO国际癌症研究机构(IARC)及其他国际组织的研究成果，确定将HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68型等13种基因型别列为高危型别，HPV26、HPV53、HPV66、HPV73、HPV82等5种基因型列为中等风险型别。
据统计，女性有70-80％在其一生中会有至少一次的HPV感染，但大多数感染具有自限性，在没有任何长期的健康干预时，在6-24个月之间可以通过有效的免疫应答清除感染。仅少部分人会发生癌前病变。持续反复的高危型HPV病毒感染被认为是几乎所有宫颈癌的必要条件。在全球范围内的调查研究结果显示，宫颈癌患者中有99.7％的人感染了HPV高危型病毒，其中最为常见的高危型别为HPV16型和HPV18型。美国国立综合癌症网络《宫颈癌筛查实践指南》等明确指出，在宫颈细胞学无异常而HPV阳性的30岁以上女性，如果为HPV16、HPV18型感染者，应立即进行阴道镜检查。宫颈病变的早期治疗效果远比宫颈癌的治疗效果要好得多，且快速、准确的检测出高危型的感染并同时分型鉴别HPV16型、HPV18型对于早期治疗和降低宫颈癌的发病率和死亡率等具有重要的意义。
宫颈癌是全球妇女常见恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌，据统计，每年全球约有50万的新发病例。宫颈癌发病初期症状并不明显，癌症发展过程长，且存在可逆转的病变期。临床研究表明，从HPV感染到一般的癌前病变到最终发展成宫颈癌要约需8-10年的时间。如能在癌前病变阶段开始医学干预，治愈率可达98％，因此，HPV筛查是目前预防和早期诊断宫颈癌的主要手段。
目前在临床检测高危HPV DNA的方法中，主要有杂交捕获法、PCR反向点杂交法、实时荧光定量PCR法(即聚合酶链式反应)。其中杂交捕获法不可添加内标，对样本及管内抑制不能很好的监控，且耗时长(一般需要5-6小时)，灵敏度低，操作复杂且假阳性率高。PCR反向杂交检测型别虽多，但其检测时间长，耗时成本大，且目前的人乳头瘤病毒的指南中对于16、18型以外的型别不建议分型，分型实用性不大。实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点即值以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果，并得知样本浓度的定值结果。实时荧光PCR法因灵敏度和特异性好，耗时时间短应用较为广泛。
目前利用荧光PCR技术针对13种高危(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)及5种中危型别(HPV26、53、66、73、82)定性检测，且对常见的HPV 16和HPV18型进行分型的试剂较少，且绝大部分沿用以前通用型检测的习惯在L1区设计引物探针，基本上每个型别相对应一套引物探针，试剂生产的成本极大的增加，对试剂的临床推广造成阻碍。有些产品虽然在一些型别的相似区域进行合并引物或探针设计，但没能找到最佳的合并位点，引物探针的数量相对较多，增加引物二聚体的风险。此外，有些产品没有对扩增过程中气溶胶污染进行有效的防护措施，增加临床应用的风险性；在核酸提取过程中，大部分的荧光PCR试剂采取煮沸法或者裂解法进行样本处理，高温煮沸容易对环境造成污染，裂解法操作过程较复杂，操作时间较长，临床接受程度不高。
发明内容
为了解决上述试剂盒存在引物探针数量多且需要设计多个PCR反应液分别进行检测导致的成本高、临床推广难度大的技术问题，本发明提供一种操作简单、准确性高、敏感度高、特异性好及生产成本低的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒。
本发明提供一种人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括由引物与探针组成的混合液，组成所述混合液的引物和探针如下:
MF11上游引物：
5'-TTTTCTCAAGGACGTGGTSCA-3'；
MR11下游引物：
5'-TTT WTC CTG RCA CAC ATT TAA ACG-3'；
MF12上游引物：
5'-TTT TCC ACY ACC TGG TCC AGA-3'；
MR12下游引物：
5'-GTC CTG CAC TGC AYT TAA ACG-3'；
MF21上游引物：
5'-CTA TTTACAGCAAGGGAACATGG-3'；
MR21下游引物：
5'-TTATGTGCCTTGCTTTTTGAAATGTT-3'；
MF22上游引物：
5'-TTATGCAGCACGAGAACGTGG-3'；
MR22下游引物：
5'-GCAGTTCAATAGCTTG ATATGCTTT A-3'；
MF23上游引物：
5'-GAA AGCTGT GCGACATGA AWATG-3'；
MR23-1下游引物：
5'-CAGTTCAATAGC TTCACATGC CT-3'；
MR23-2下游引物：
5'-CATGCTTTTGCTTTACAYACT TGTAA-3'；
MF24上游引物：
5'-TGCAGCA AGA GAG AACAATATACA-3'；
F24上游引物：
5'-TCGTGA AGG AAA CATGCAATGTATA-3'；
MR25下游引物：
5'-GCTATATGTATT TCA ATTGCCTGC-3'；
18F上游引物：
5'-TTCAGGTAACTACAAATGGCGAAC-3'；
18R下游引物：
5'-CCGTTGTCTATAGCCTCCG-3'；
73F上游引物：
5'-CGTGAAATG GGA CTGCAA ACT-3'；
73R下游引物：
5'-CATTATACCCTT TGGATCGTGATA-3'；
MP11检测探针：
5'FAM-TTCTTTGTCCTCTTCCTC-MGB-3'；
MP13检测探针：
5'FAM-TTCCTTGTCCTCTTCCTC-MGB-3'；
MP16检测探针：
5'VIC-TCGTTTTCCTTGTCCTCGTCCTCGTG-BQ1-3'；
MP21检测探针：
5'FAM-CCACCAGGTGGTGCC-MGB-3'；
M18P检测探针：
5'CY5-GCCGCCACTACATACATTGCCGCC-BQ1-3'；
M73P检测探针：
5'FAM-GCCGCCACTACATACATTGCCGCC-BQ1-3'；
上述引物与探针的碱基序列中的Y代表C或T，S代表C或G，W代表C或A，R代表A或G。
在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述混合液还包括内标、用于检测内标的内标引物及内标探针，所述内标为人上皮细胞管家基因β-globin，所述内标引物组及内标探针分别为ICF上游引物、ICR下游引物及ICP检测探针，其中，
ICF上游引物：
5’-AAGTGCTCG GTG CCTTTA GT-3’；
ICR下游引物：
5’-ACGTGCAGCTTGTCACAGTG-3’；
ICP检测探针：
5’ROX-CT GGCTCA CCT GGA CAA CCTCAA G-BQ2-3’。
在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述混合液中各引物和探针的浓度100pmol/uL。
在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述PCR反应液还包括PCR缓冲液、dNTPs、酶混合物及无菌蒸馏水。
在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述PCR缓冲液包括100mM/L pH8的Tris-HCl、500mM的氯化钾、30mM的氯化镁及体积分数为50％的甘油溶液。
在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述酶混合物为UDG酶与Taq酶的混合液。
在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、阳性对照品和阴性对照品。
在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述核酸提取试剂包括体积分数为0.1％～1％的十二烷基硫酸钠、100～300mM的氯化镁、10～100mM的硫酸铵、0.5～1mM的二硫苏糖醇、0.1～5mM pH8.0的EDTA及30～80mM pH8.5的Tris-HCl。
在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述阳性对照品为包括HPV16型、HPV18型和HPV73型质粒混合液，所述质粒稀释液为含1-10ng/uL人基因组TE溶液，所述阴性对照品为宫颈细胞保存液。
本发明还提供一种上文所述的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒在检测人乳头瘤病毒及对人乳头瘤病毒进行分型的应用，所述人乳头瘤病毒包括13种高危型人乳头瘤病毒及5种中危型人乳头瘤病毒，所述高危型人乳头瘤病毒包括：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，所述中危型人乳头瘤病毒包括：HPV26、53、66、73、82，所述人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒对HPV16和HPV18进行分型。
相较于现有技术，本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒及应用的有益效果在于：
一、本发明引物探针设计结合ARMS特异性引物及Taqman探针设计原理，对检测型别的全基因组序列及其他常见的型别及交叉病原体进行比对后，合并一些检测型别的上/下游引物或探针，提高了引物探针的特异性和灵敏度，减少引物探针的数量，节省了生产成本，同时降低了背景荧光信号，可提高试剂盒的准确性。
二、实现了一管就可以定性检测13种高危型人乳头瘤病毒及5种中危型人乳头瘤病毒并对对HPV16和HPV18进行分型的目的，操作简单、快速，且具有灵敏度和特异性好的优点，更适合临床推广应用。
三、本发明中核酸提取试剂为一步法提取，在较短的时间内，提取样本的核酸DNA用于检测，能有效地去除复杂样本中PCR抑制物，提高了核酸DNA的提取率和质量，极大程度上提高临床的接受度。
四、所述混合液还包括针对内标而设计的用于检测内标的上下游引物及用于检测内标的探针，在反应体系中，该内标可以监控反应过程，监控反应体系是否有效，进而防止样本中可能存在的抑制物干扰检测，并使检测结果呈假阴性的情况。
附图说明
图1为本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒中阳性对照品的PCR扩增曲线图；
图2为本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒中阴性对照品的PCR扩增曲线图；
图3为为本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒检测HPV6、11、40、42、43、44、61、67、69、70、71、72、81、83、单纯疱疹病毒Ⅱ型、梅毒螺旋体、解脲支原体、淋病奈瑟菌、白色念珠菌、阴道毛滴虫、沙眼衣原体扩增曲线图；
图4a为本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒中精密度实验FAM通道73型扩增曲线图；
图4b为本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒精密度实验VIC通道16型扩增曲线图；
图4c为本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒精密度实验CY5通道18型扩增曲线图；
图5a为本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒扩增18个型别临床宫颈脱落细胞样本扩增曲线图(FAM通道检测结果)；
图5b为本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒扩增18个型别临床宫颈脱落细胞样本扩增曲线图(VIC通道检测结果)；
图5c为本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒扩增18个型别临床宫颈脱落细胞样本扩增曲线图(CY5通道检测结果)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：引物和探针的设计与合成
本发明针对人乳头瘤病毒中18种的HPV型别包括13种高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)及5种中危型别(HPV26、53、66、73、82)进行引物设计与合成。具体如下：
分析序列比对后的进化树及各基因组的序列，本发明成功地选择一些同源性比较高的基因组区域作为靶序列设计共用引物和探针，HPV16、31、33、35、51、52、58、82在E1区域具有比较高的同源区域，一定程度上共用上/下游引物或探针。其中，HPV16、31、33、35、52、58共用上游引物MF11，HPV51、82共用上游引物MF12，HPV16、31、35、51、82共用下游引物MR11，HPV33、52、58共用下游引物MR12，HPV31、35、51、82共用探针MP11，HPV33、52、58共用一条探针MP13。HPV26、39、45、53、56、59、66在E1区共用一条探针MP21，且HPV39、HPV68共用上游和下游引物MF22/MR22，HPV53、56、66共用上/下游引物MF23/MR23-2。在分析序列时，发现HPV67型在HPV16、31、33、35、51、52、58、82引物探针的设计区域与其HPV33型有较高的同源性，通过ARMS特异性引物设计的原理，规避了扩增HPV67的风险。这就显著降低了引物探针的数量，HPV16型、HPV18型为宫颈癌患者高危型HPV感染率最高的两种病毒型别，通过在5’端引入不同于其他型别的两种发光基团，对HPV16型及HPV18型进行分型。达到一管可以检测18种型别且对HPV16型，HPV18型进行分型的目的。
本发明设计的引物和探针具体如表1所示：
表1、引物及探针序列表
上述引物与探针的碱基序列中的Y代表C或T，S代表C或G，W代表C或A，R代表A或G。
实施例2：试剂盒的制备
所述试剂盒包括PCR反应液、核酸提取试剂、阳性对照品和阴性对照品。
所述PCR反应液包括由实施例1设计与合成的引物和探针组成的混合液、PCR缓冲液、dNTPs、酶混合物及无菌蒸馏水。
所述混合液包括MF11上游引物、MF12上游引物、MR11下游引物、MR12下游引物、MF21上游引物、MF22上游引物、MF23上游引物、MF24上游引物、F24上游引物、MR21下游引物、MR22下游引物、MR23-1下游引物、MR23-2下游引物、MR25下游引物、18F上游引物、18R下游引物、73F上游引物、73R下游引物、MP11检测探针、MP13检测探针、MP16检测探针、MP21检测探针、M18P检测探针、M73P检测探针、ICF上游引物、ICR下游引物及ICP检测探针，其中，所述混合液中各引物和探针的浓度100pmol/uL。
所述混合液中包括了针对内标而设计的用于检测内标的ICF上游引物、ICR下游引物及ICP检测探针，在反应体系中，该内标可以监控反应过程，监控反应体系是否有效，进而防止样本中可能存在的抑制物干扰检测，并使检测结果呈假阴性的情况。
所述PCR缓冲液包括pH为9.2的100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L的氯化钾、30mmol/L的氯化镁及体积分数为50％的甘油溶液。
所述dNTPs包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP，其组成的比例为dATP：dUTP：dGTP：dCTPP＝1:2:1:1。
所述酶混合液包括浓度为1U/反应的Taq酶和0.3U/反应的UNG酶。所述Taq酶为热启动酶，该酶在室温或37℃，酶活性被抑制，从而抑制低温条件下引起的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，而高温(68℃以上)酶活性被激活。所述UDG酶使含有dUTP的DNA分子(简称U-DNA)中的尿嘧啶碱基与糖基之间的糖苷键断裂，使U-DNA分子降解，而对含dTTP的DNA(简称T-DNA)不起作用，在体系中添加了UDG酶和dUTP，能够起到预防前次PCR产物污染的作用，进而防止样本检测假阳性。
所述核酸提取试剂包括体积分数为0.1％～1％的十二烷基硫酸钠、100～300mM的氯化镁、10～100mM的硫酸铵、0.5～1mM的二硫苏糖醇、0.1～5mM pH8.0的EDTA及30～80mMpH8.5的Tris-HCl。其中，十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)快速破坏病原体结果，释放病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；Tris-HCl提供裂解的碱性环境，氯化镁与硫酸铵用于沉淀蛋白；EDTA抑制核酸酶降解核酸；DTT为还原剂。
所述核酸提取试剂为一步法提取，在较短的时间内，提取样本的核酸DNA用于检测，能有效地去除复杂样本中PCR抑制物，提高了DNA的得率和质量，且检测灵敏度高、重复性好，极大程度上提高临床的接受度。
所述阳性对照品为包括HPV16型、HPV18型和HPV73型质粒混合液，所述质粒稀释液为含1-10ng/uL人基因组TE溶液，用于监控样本测试过程的准确性。
所述阴性对照品为宫颈细胞保存液，用于监控样本测试过程的准确性。
本试剂盒采用荧光PCR法对13种高危型别(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)及5种中危型别(HPV26、53、66、73、82)进行定性检测，且能对常见的HPV 16和HPV18型进行分型检测。
实施例3：性能指标测试
1、PCR反应溶液的配制
每人份的35μL PCR反应液配方如表2所示。
表2反应液的配制
2、样本和阴性对照的处理
取宫颈脱落细胞样本震荡混匀后，取3-5μL加入到5-10μL的核酸提取试剂中，深吸浅打后，形成混合液，静置10分钟后，得核酸DNA样本一，备用；
阴性对照品取3-5μL加入到5-10μL的核酸释放剂中，深吸浅打后，形成混合液，静置10分钟后，得核酸DNA样本二，备用。
3、加样建立反应体系
反应体系总体积为40μL，其中PCR反应液体积为35μL，样本核酸DNA体积5μL。
计算需准备的样品数n份(n＝样本数+1份阳性对照+1份阴性对照)，将35μL配制好的PCR反应液加到不同的反应管中，分别往不同的反应管中加入5μL核酸DNA样本一、阴性对照处理得到的核酸DNA样本二及阳性对照。
4、PCR扩增
将各反应管按一定顺序放入荧光PCR仪上，并按照以下程序进行PCR扩增，扩增程序如所表3所示：
表3PCR扩增反应条件
5、荧光通道的选择：
选择FAM通道检测HPV26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82型DNA；
选择VIC通道检测HPV16型；
选择ROX通道检测内标；
选择CY5通道检测HPV18型。
6、结果分析及检测结果解释
反应结束后，保存结果。根据PCR仪说明书及荧光曲线自动或手动调整基线和阈值。阈值设定原则以阈值刚好超过阴性对照检测荧光的最高点。设定好后，点击分析“分析(Analyze)”按键，可以从报告(Reports)窗口得到各样本的Ct值。
在满足质量控制的条件下，待测样本检验结果可能出现以下几种情况：
1)如果ROX通道没有出现S型曲线，检测结果无效，可能出现了管内抑制，应重新提取样本检测。
2)如果ROX通道出现S型曲线，同时FAM通道、VIC通道、CY5通道检测无S型曲线，则检测试剂盒检测范围内HPV型别DNA核酸阴性或低于试剂盒检测限。
3)如果ROX通道出现S型曲线，FAM通道、VIC通道、CY5通道检测有S型曲线，则出现的相关情况如表4所示：
表4
通过对已确定的阳性参考品与阴性参考品进行检测，检测所得到的PCR扩增曲线请参考附图1和附图2，图1为本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒中阳性对照品的PCR扩增曲线图，图2为本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒中阴性对照品的PCR扩增曲线图。
阳性参考品为试剂盒检测范围内的18种HPV型别的质粒溶液，质粒的稀释液为含1ng/μL人基因组核酸TE溶液。阴性参考品为临床上确认为沙眼衣原体、单纯疱疹病毒、解脲原体、巨细胞病毒、HPV6型、HPV11型、正常人宫颈脱落细胞提取核酸。从图1和图2可以看出，检测HPV18个型别的阳性参考品时，均出现典型的阳性扩增曲线，内标呈阳性扩增。检测阴性参考品时，除内标通道外，其他通道均没有PCR扩增曲线出现，试剂阴阳性参考品符合率100％。
7、特异性实验
请参考附图3，附图3为本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光PCR检测试剂盒检测HPV6、11、40、42、43、44、61、67、69、70、71、72、81、83、单纯疱疹病毒Ⅱ型、梅毒螺旋体、解脲支原体、淋病奈瑟菌、白色念珠菌、阴道毛滴虫、沙眼衣原体扩增曲线图。从附图3中可以看到，内标曲线均呈正常扩增，反应的检测结果均为阴性，说明本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒与上述病原体均无交叉反应，具有很好的特异性。
8、精密度实验
本发明实施例提供的试剂盒对试剂盒精密度参考品进行重复性荧光PCR反应的检测，检测结果详见附图4a、4b和4c。附图4a为FAM通道73型10次扩增曲线图，附图4b为VIC通道16型10次扩增曲线图,附图4c为CY5通道18型10次扩增曲线图。
9、临床样本检测
对80例临床样本进行核酸提取，并对提取的80例HPV宫颈拭子样品中的核酸DNA进行荧光PCR扩增。与此同时，为了便于比较，利用广州安必平医药科技有限公司生产的“人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)”同时对这80例样本进行检测。检测结果如表5所示。
表5检测结果对比
表5结果显示，80例样本中，样本阴阳性符合率为87.5％，其中有10例样本不符，将这10例样本扩增后进行Sanger测序法分析，发现结果均为阳性。两种试剂的检测结果差异主要影响因素为检测方法的差异，荧光PCR检测平台的灵敏度相对PCR点杂交法的灵敏度要高。本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒各个型别的检测限均不高于50copies/反应，而广州安必平医药科技有限公司生产的“人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)的检测限为1*104copies/mL。相对于安必平试剂，本发明更适用于宫颈癌的筛查，本发明试剂盒可以检测13种高危型别及5种中危型别的HPV，且对最常见的HPV16、HPV18型进行分型，据报道，99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型别，低危型HPV极少能引起浸润癌。本发明是单个反应管中对临床样本中可能存在的18种HPV型别进行四通道荧光PCR检测，其中图5a为FAM通道检测结果，图5b为VIC通道检测结果，图5c为CY5通道检测结果。
本发明提供的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒及应用的有益效果在于：
一、本发明引物探针设计结合ARMS特异性引物及Taqman探针设计原理，对检测型别的全基因组序列及其他常见的型别及交叉病原体进行比对后，合并一些检测型别的上/下游引物或探针，提高了引物探针的特异性和灵敏度，减少引物探针的数量，节省了生产成本，同时降低了背景荧光信号，可提高试剂盒的准确性。
二、实现了一管就可以定性检测13种高危型人乳头瘤病毒及5种中危型人乳头瘤病毒并对对HPV16和HPV18进行分型的目的，操作简单、快速，且具有灵敏度和特异性好的优点，更适合临床推广应用。
三、本发明中核酸提取试剂为一步法提取，在较短的时间内，提取样本的核酸DNA用于检测，能有效地去除复杂样本中PCR抑制物，提高了核酸DNA的提取率和质量，极大程度上提高临床的接受度。
四、所述混合液还包括针对内标而设计的用于检测内标的上下游引物及用于检测内标的探针，在反应体系中，该内标可以监控反应过程,监控反应体系是否有效，进而防止样本中可能存在的抑制物干扰检测，并使检测结果呈假阴性的情况。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 韩林志
<120> 人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒及其应用
<130> 2017
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
ttttctcaag gacgtggtsc a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
ttttccacya cctggtccag a 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
tttwtcctgr cacacattta aacg 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
gtcctgcact gcayttaaac g 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
ttctttgtcc tcttcctc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
ttccttgtcc tcttcctc 18
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
tcgttttcct tgtcctcgtc ctcgtg 26
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
ctatttacag caagggaaca tgg 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
ttatgcagca cgagaacgtg g 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
gaaagctgtg cgacatgaaw atg 23
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
tgcagcaaga gagaacaata taca 24
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
ttatgtgcct tgctttttga aatgtt 26
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
gcagttcaat agcttgatat gcttta 26
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 14
cagttcaata gcttcacatg cct 23
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 15
catgcttttg ctttacayac ttgtaa 26
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 16
tcgtgaagga aacatgcaat gtata 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 17
gctatatgta tttcaattgc ctgc 24
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 18
ccaccaggtg gtgcc 15
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 19
ttcaggtaac tacaaatggc gaac 24
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 20
ccgttgtcta tagcctccg 19
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 21
gccgccacta catacattgc cgcc 24
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 22
cgtgaaatgg gactgcaaac t 21
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 23
cattataccc tttggatcgt gata 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 24
gccgccacta catacattgc cgcc 24
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
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<400> 25
aagtgctcgg tgcctttagt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 26
acgtgcagct tgtcacagtg 20
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 27
ctggctcacc tggacaacct caag 24
Claims (10)
1.一种人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括由引物与探针组成的混合液，组成所述混合液的引物和探针如下:
MF11上游引物：
5′-TTTTCTCAAGGACGTGGTSCA-3′；
MR11下游引物：
5′-TTT WTC CTG RCA CAC ATT TAA ACG-3′；
MF12上游引物：
5′-TTT TCC ACY ACC TGG TCC AGA-3′；
MR12下游引物：
5′-GTC CTG CAC TGC AYT TAA ACG-3′；
MF21上游引物：
5′-CTA TTTACAGCAAGGGAACATGG-3′；
MR21下游引物：
5′-TTATGTGCCTTGCTTTTTGAAATGTT-3′；
MF22上游引物：
5′-TTATGCAGCACGAGAACGTGG-3′；
MR22下游引物：
5′-GCAGTTCAATAGCTTG ATATGCTTT A-3′；
MF23上游引物：
5′-GAA AGCTGT GCGACATGA AWATG-3′；
MR23-1下游引物：
5′-CAGTTCAATAGC TTCACATGC CT-3′；
MR23-2下游引物：
5′-CATGCTTTTGCTTTACAYACT TGTAA-3′；
MF24上游引物：
5′-TGCAGCA AGA GAG AACAATATACA-3′；
F24上游引物：
5′-TCGTGA AGG AAA CATGCAATGTATA-3′；
MR25下游引物：
5′-GCTATATGTATT TCA ATTGCCTGC-3′；
18F上游引物：
5′-TTCAGGTAACTACAAATGGCGAAC-3′；
18R下游引物：
5′-CCGTTGTCTATAGCCTCCG-3′；
73F上游引物：
5′-CGTGAAATG GGA CTGCAA ACT-3′；
73R下游引物：
5′-CATTATACCCTT TGGATCGTGATA-3′；
MP11检测探针：
5′FAM-TTCTTTGTCCTCTTCCTC-MGB-3′；
MP13检测探针：
5′FAM-TTCCTTGTCCTCTTCCTC-MGB-3′；
MP16检测探针：
5′VIC-TCGTTTTCCTTGTCCTCGTCCTCGTG-BQ1-3′；
MP21检测探针：
5′FAM-CCACCAGGTGGTGCC-MGB-3′；
M18P检测探针：
5′CY5-GCCGCCACTACATACATTGCCGCC-BQ1-3′；
M73P检测探针：
5′FAM-GCCGCCACTACATACATTGCCGCC-BQ1-3′；
上述引物与探针的碱基序列中的Y代表C或T，S代表C或G，W代表C或A，R代表A或G。
2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述混合液还包括内标、用于检测内标的内标引物及内标探针，所述内标为人上皮细胞管家基因β-globin，所述内标引物及内标探针分别为ICF上游引物、ICR下游引物及ICP检测探针，其中，
ICF上游引物：
5’-AAGTGCTCG GTG CCTTTA GT-3’；
ICR下游引物：
5’-ACGTGCAGCTTGTCACAGTG-3’；
ICP检测探针：
5’ROX-CT GGCTCA CCT GGA CAA CCTCAA G-BQ2-3’。
3.根据权利要求2所述的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述混合液中各引物和探针的浓度100pmol/uL。
4.根据权利要求3所述的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括PCR缓冲液、dNTPs、酶混合物及无菌蒸馏水。
5.根据权利求4所述的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包括100mM pH9.2的Tris-HCl、500mM的氯化钾、30mM的氯化镁及体积分数为50％的甘油溶液。
6.根据权利要求4所述的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合物为UDG酶与Taq酶的混合液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、阳性对照品和阴性对照品。
8.根据权利要求7所述的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂包括体积分数为0.1％～1％的十二烷基硫酸钠、100～300mM的氯化镁、10～100mM的硫酸铵、0.5～1mM的二硫苏糖醇、0.1～5mM pH8.0的EDTA及30～80mM pH8.5的Tris-HCl。
9.根据权利要求7所述的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为包括HPV16型、HPV18型和HPV73型的质粒混合液，所述质粒稀释液为含1-10ng/uL人基因组TE溶液，所述阴性对照品为宫颈细胞保存液。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒在检测人乳头瘤病毒及对人乳头瘤病毒进行分型的应用，其特征在于，所述人乳头瘤病毒包括13种高危型人乳头瘤病毒及5种中危型人乳头瘤病毒，所述高危型人乳头瘤病毒包括：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，所述中危型人乳头瘤病毒包括：HPV26、53、66、73、82，所述人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒对HPV16和HPV18进行分型。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20170901 |