CN107739761A - 一种用于hpv分型及整合的高通量测序检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HPV分型及整合的高通量测序检测方法,本方法选取目前HPV亚型的基因,结合第二代高通量测序测序技术,更全面的检测患者感染HPV的类型,克服了传统检测方法准确率低、假阳性高、重复性差、漏诊率高等困难。在分子诊断领域,最直接而明确的技术是基因测序,第二代高通量测序测序技术比目前多采用经典的Sanger测序方法有检通量更大、测序速度更快、精确度更高、成本更低和信息量更丰富等优点。本方法在第二代高通量测序测序技术帮助下,可以对高危型HPV及低危型HPV进行精确分型并检测其是否发生人类基因组的整合,对检测者进行精确地个体化评估,预防病变发生的风险,从而预防肿瘤的发生。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于HPV分型及整合的高通量测序检测方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)是一种小型DNA病毒,是一种嗜黏膜和皮肤上皮性病毒,具有高度特异性。HPV病毒,主要由DNA核心和蛋白衣壳组成。其基因组为双链环状DNA,长约7.5~8.0 kb,含8个开放阅读框(open reading frames, ORFs),依功能不同分3个区:(1)早期区(early region, E区):分别编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等六个早期蛋白,参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和转化等功能;(2)晚期区(late region, L区):编码主要外壳蛋白L1和次要外壳蛋白L2;(3)非编码区(uncoding region, UCR)又称长控区(LCR)或上游调控区(URR):含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV表达所必需的调控元件。HPV的分类主要依据HPV病毒基因组中L1区的DNA同源性。目前已经发现了170多种HPV型,有40多种可感生殖腔。HPV可以引起人全身各部位的皮肤或者粘膜感染,导致多种上皮组织疾病。例如皮肤寻常疣,扁平疣,外生殖器的尖锐湿疣等。宫颈上皮组织长期感染的某些型别的HPV可能引起基因突变,导致宫颈上皮内增生和宫颈癌。宫颈癌发病率居全球女性恶性肿瘤的第2位,发病率仅次于乳腺癌,每年约有50万宫颈癌新发病例,其中约1/3为死亡病例。据统计中国每年宫颈癌新发病例约13.5万,发病率为14.6/10万。根据其导致宫颈癌风险的高低将这些HPV分为高危型和低危型。高危型HPV可能引发妇女发生宫颈癌.主要包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73、82等型别;低危型HPV主要引起尖锐湿疣,包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、81等型别。CP8304等亚型,与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CINⅡ/Ⅲ)的发生相关,尤其是HPV16和18型。HPV感染是宫颈癌发生的主要病因,持续高危型HPV的感染是癌前病变和浸润性宫颈癌发展的必要因素。由于不同亚型HPV的致病机制、致癌危险性及感染后的预后各不相同,因此对HPV各亚型进行分型以及是否整合到人类基因组上的检测有重要的临床意义。因此,临床上有必要建立一种简便、快速、灵敏、特异的分型及整合的检测方法。
对HPV病毒感染进行准确的检测可提高宫颈癌前病变筛查的敏感性,同时改善妇女宫颈癌的防治。宫颈癌早期症状不明显,筛查预警对早期发现宫颈癌,降低死亡率极为重要。传统上,宫颈涂片检测是群体筛查的常规手段,属于细胞学检测方法。实验室的技术人员会于显微镜下观察不正常的细胞以诊断病人的病情,但由于这方法只以观察作为诊断基础,受取材、涂片制作质量、阅片技术影响,其准确率低,假阴性高,重复性差,得到的结果及分析漏诊率可达30%。在检查和筛选HPV的基因型方法中,实时荧光PCR法及杂交捕获法是最为常用的,但是对于不同种基因型HPV的诊断操作繁琐,检测通量低,难以满足临床上同时检测多个亚型的需要,不适合于对子宫颈癌的大规模筛查。商业化的杂交捕获法试剂盒无须PCR扩增即可检测出临床样品中的HPV DNA,并且可区别高危型和低危型两类,但是此类试剂盒无法鉴定出感染HPV的具体基因型及是否整合,其假阴性和假阳性较多,灵敏性和特异性有待提高。但在分子诊断领域,最直接而明确的技术是基因测序,传统的基因测序方法是通过Sanger终止法进行的,该方法一次只能读取单个基因的序列,而对于有众多基因亚型感染的疾病,很难获得理想的测序结果。现有的这些检测方法只能进行少量的HPV分型,而对于HPV是否整合到人类基因组上无法检测,而HPV是否整合到人类基因组上是发生HPV导致癌症的前提。第二代高通量测序测序技术实现了同时对几百万甚至数亿条DNA序列进行测序,具有费用低、通量高、速度快、灵敏度高及准确度高等优点,更重要的是可以在检测分型的同时,检测HPV是否整合到人类基因组上,以及整合的位点是否会导致癌症的发生。本专利在第二代高通量测序测序技术的帮助下,可以对高危型HPV及低危型HPV进行精确分型,并对HPV是否整合到人类基因组上,以及整合的位点是否会导致癌症的发生进行精确地个体化评估,预防病变发生的风险,从而预防肿瘤的发生。
发明内容
本发明提供一种准确度高、临床意义明确的HPV分型及整合检测方法。
1.一种用于HPV分型及整合的检测方法,包括HPV分型及整合高通量测序测序检测方法。
HPV分型及整合检测试剂盒的方法包括如下步骤:
(1)根据HPV基因组,调取HPV基因组序列。常见HPV分型列表如下:
HPV6 | HPV11 | HPV16 | HPV18 | HPV26 |
HPV31 | HPV33 | HPV35 | HPV39 | HPV45 |
HPV51 | HPV52 | HPV53 | HPV56 | HPV58 |
HPV59 | HPV66 | HPV68 | HPV73 | HPV82 |
HPV40 | HPV42 | HPV43 | HPV44 | HPV54 |
HPV61 | HPV70 | HPV72 | HPV81 |
调取包含列表不同亚型HPV基因组序列;
(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列,每个序列沿着基因位置挪动设计,探针之间的挪动大小60bp;
(3)采用原位合成技术,在芯片上大量合成设计的探针,并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针,并制作HPV基因扫描试剂盒;
所述试剂盒筛查方法包括如下步骤:
从患者获取宫颈细胞样本并提取DNA,然后利用HPV基因探针将目的基因序列捕获出来,再用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序测序,进而分析,找出与HPV基因信息,从而得到患者HPV的基因型,以达到区分是否高危HPV及整合。
根据权利要求1所述的一种用于HPV分型及整合的检测方法,采用测序仪进行高通量测序测序分析流程包括如下步骤:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到相应的HPV基因组数据(例如Alphapapillomavirus 7, Human papillomavirus 18 (HPV18), completegenome gi|60975|lcl|HPV18REF.1|HPV18REF)相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4) 使用PicardTools及自写脚本,针对不同样本不同类型的HPV基因进行归一化处理,统计相应的覆盖度及短序列数量,得到分型结果。
所述基因整合分析流程包括如下步:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到HPV基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用factera检测多个基因的全部或一部分的编码区首尾相连。包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果,得到基因整合结果。
本发明一种HPV分型及整合的高通量测序检测方法的有益效果如下:
本发明一种HPV分型及整合的高通量测序检测方法,是以DNA文库的方式进行捕获测序,然后利用HPV基因探针将目的基因序列捕获出来,再用测序仪(Illumina Nextseq500)进行高通量测序测序,进而分析,找出与HPV基因信息,从而得到患者HPV的基因型,以达到区分是否高危HPV及整合。本方法采取高深度测序的方法(500X)检测HPV分型及整合。相比于临床上传统的病理学诊断而言,本方法有以下优势:
1、相比于传统宫颈涂片检测等常规细胞学检测手段。采用二代高通量测序等直接测序鉴定HPV分型及整合,其准确率更高,且重复性更好;采取高深度测序,平均要达到500X,保证足够的检测深度,使假阴性更低。
2、相比于传统的基因测序方法,一次只能读取单个基因的序列,本专利所用方法能高通量测序区分HPV分型及整合,一次检测即可区分下列HPV6,HPV11,HPV16,HPV18,HPV26,HPV31,HPV33,HPV35,HPV39,HPV45,HPV51,HPV52,HPV53,HPV56,HPV58,HPV59,HPV66,HPV68,HPV73,HPV82,HPV40,HPV42,HPV43,HPV44,HPV54,HPV61,HPV70,HPV72,HPV81。
具体实施方式
本发明的一种HPV分型及整合的高通量测序检测方法,包括如下步骤:
1.样本文库制备:
(1)、超声片段化:起始量为3ug,加无核酶的水到100ul稀释到30ng/ul。采用SCIENTZ08-Ⅲ杯式超声波细胞粉碎机进行超声片段化,设定参数为:功率70%,打断3s,停止1s,循环30-60min。
(2)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温,震荡混匀,取180ul磁珠加入超声打断后的PCR产物中,抽打混匀,温室孵育5min。
(3)、将PCR单管放于磁力架上,静置5min,去上清,保持PCR管在磁力架上,加入80%乙醇(新配)200ul漂洗,静置30s后去上清,80%乙醇漂洗两遍,室温干燥10min(还有2min时用小抢头吸残液),直至无乙醇残留。
(4)将PCR管从磁力架上取出,加入65ul超纯灭菌水,轻弹混匀,静置5min,短暂离心,将PCR单管置于磁力架上,静置5min后小心吸取上清60ul于新的PCR管中。
(5)将40ul Endprep mix加入(4)中60ul上清的PCR管中,吹打混匀,短暂离心,进行末端修复,反应条件为30℃、30min。
(4)、将PCR管从磁力架中取出,加入20ul超纯灭菌水洗脱,轻弹混匀,静置5min,短暂离心,置于磁力架上,待溶液澄清后吸上清17.5ul于新的PCR管中,再在PCR管中加入12.5uldA-Tailing(解冻后放4℃,离心后再使用),吹打混匀。进行末端加尾,反应条件为37℃30min, 70℃ 5min,4℃ 5min。
(5)、在上步加尾后的产物中加入Ligation mix 和adapter各2.5ul,吹打混匀,短暂离心,放入PCR仪中,反应条件为30℃ 10min ,20℃ 20min。
(6)、在上步连接产物中加入15ul的超纯灭菌水,再加入50ul磁珠,震荡混匀,室温孵育5min,短暂离心,放入磁力架上,静置5min,澄清后去上清,保持PCR管在磁力架上,用200ul的80%乙醇(新配)漂洗两次,室温干燥10min,直至无乙醇残留。
(7)、将PCR管从磁力架上取出,加入25ul超纯灭菌水,轻弹混匀,静置5min,短暂离心,将PCR单管置于磁力架上,静置5min后小心吸取上清22ul于新的PCR管中。
(8)、将PCR primer mix和Amplification mix 2解冻后颠倒混匀,在上步连接产物中加入3ul的primer mix和25ul的Amplification mix 2,吹打混匀,短暂离心,进行PCR扩增,反应条件为
第一步95℃ 3min
第二步98℃ 20s
第三步60℃ 15s
第四步72℃ 30s
第五步72℃ 5min
第六步Hold at 4℃
第二----四步扩增15cycle。
(9)、用上步扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,观察条带亮度。
(10)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温,震荡混匀,取50ul加入PCR扩增产物中,震荡混匀,室温孵育5min,短暂离心,置于磁力悬架上,静置5min,待溶液澄清后去上清,用200ul的80%乙醇(新配)漂洗两次,室温干燥10min,直至无乙醇残留。
(11)、将PCR管从磁力架中取出,加入40ul超纯灭菌水洗脱,轻弹混匀,静置5min,短暂离心,置于磁力架上,待溶液澄清后吸上清38ul于新的EP管中,用Qubit测溶液浓度并记录,-20℃保存。
2.样本富集液相杂交
(1)、用于杂交的建库后DNA总量为500ng,根据检测的溶液浓度计算杂交时加入EP管的溶液体积。
(2)、在上步的EP管中加入2.5ul的cot-1 DNA,2.5ul的SS DNA,2ul的P5(500um),2ul的P7-x(500um),短暂离心。
(3)、将上步混合好的溶液在60℃真空干燥30 min,直至无液体残留。
(4)、在上步干燥后的EP管中加入10ul超纯灭菌水,轻弹混匀,水化10 min,短暂离心,取10ul加入PCR八连排中。
(5)、将上步PCR八连排放入PCR仪中进行PCR反应,反应条件为
第一步95℃ 5min
第二步65℃ 5min
第三步65℃ 无限
在95℃结束后,将1ul RNAsin和5ul RNAbait混合(每个样品所取量),在65℃2.5min时将RNAsin和RNAbait混合液以及杂交液放入65℃PCR仪中,在65℃ 5min结束后先在八连排每个孔中加入6ul的混合液,加入时吹打混匀,2.5min后加入10ul(每个样品所取量)杂交液,加入后吹打混匀,65℃过夜。
3.捕获
(1)、洗磁珠,取Dnabeads磁珠震荡混匀,根据样品数取磁珠(每个样品取30ul磁珠),用200ul beads洗液洗3次。
(2)、悬浮磁珠于binding buffer中,每个样品取165ul的binding buffer。
(3)、吸取binding buffer和磁珠的结合液165ul于杂交样品中,震荡45min(每隔5min上下颠倒混匀),45min后置于磁力架上,待澄清后吸弃上清。
(4)、加165ul的洗液1于上步磁珠中,洗15min,每5min颠倒混匀一次,15min后置于磁力架上,待澄清后吸弃上清。
(5)、将洗液2提前放入70℃PCR仪预热,加165ul的洗液2于上步磁珠中,颠倒混匀,在70℃洗10min,10min后置于磁力架上,待澄清后吸弃上清,洗液2洗3次。
(6)、在上步八连排的每个孔中加入22 ul的超纯灭菌水,3ul的primer和25ul的Amplification mix2,颠倒混匀,进行PCR扩增,扩增程序为
第一步95℃ 3min
第二步98℃ 20s
第三步60℃ 15s
第四步72℃ 30s
第五步72℃ 5min
第六步Hold at 4℃
第二----四步扩增15cycle。
(7)、将上步八连排放在磁力架上,待溶液澄清后,吸上清进行琼脂糖凝胶电泳,观察条带亮度。
(8)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温,震荡混匀,吸取上步八连排中的上清于新的PCR单管中,吸取50ul磁珠加入PCR单管中,震荡混匀,室温孵育5min,短暂离心,置于磁力悬架上,静置5min,待溶液澄清后去上清,用200ul的80%乙醇(新配)漂洗两次,室温干燥10min,直至无乙醇残留。
(9)、将PCR管从磁力架中取出,加入40ul超纯灭菌水洗脱,轻弹混匀,静置5min,短暂离心,置于磁力架上,待溶液澄清后吸上清38ul于新的EP管中,用Qubit测溶液浓度并记录,-20℃保存。
以上得到的DNA通过Illumina Nextseq 500测序,得到测序的数据。
4. HPV分型及整合的高通量测序检测方法数据分析流程
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到相应的HPV基因组数据(例如Alphapapillomavirus 7, Human papillomavirus 18 (HPV18), completegenome gi|60975|lcl|HPV18REF.1|HPV18REF)相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4) 使用PicardTools及自写脚本,针对不同样本不同类型的HPV基因进行归一化处理,统计相应的覆盖度及及短序列数量,得到分型结果。
所述基因整合分析流程包括如下步:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到HPV基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用factera检测多个基因的全部或一部分的编码区首尾相连。包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果,得到基因整合结果。
上面所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神前提下,本领域普通工程技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种用于HPV分型及整合的高通量测序检测方法,包括HPV分型及整合检测试剂盒以及检测方法。
2.HPV分型及整合检测试剂盒的方法包括如下步骤:
(1)根据HPV基因组,调取HPV基因组序列;
常见HPV分型列表如下:
调取包含列表不同亚型HPV基因组序列;
(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列,每个序列沿着基因位置挪动设计,探针之间的挪动大小60bp;
(3)采用原位合成技术,在芯片上大量合成设计的探针,并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针,并制作HPV基因扫描试剂盒;
所述试剂盒筛查方法包括如下步骤:
从患者获取宫颈细胞样本并提取DNA,然后利用HPV基因探针将目的基因序列捕获出来,再用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序测序,进而分析,找出与HPV基因信息,从而得到患者HPV的基因型,以达到区分是否高危HPV及是否整合到人类基因组上。
3.根据权利要求1所述的一种用于HPV分型及整合的检测方法,采用测序仪进行高通量测序测序分析流程包括如下步骤:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到相应的HPV基因组数据(例如Alphapapillomavirus 7, Human papillomavirus 18 (HPV18), completegenome gi|60975|lcl|HPV18REF.1|HPV18REF)相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4) 使用PicardTools及自写脚本,针对不同样本不同类型的HPV基因进行归一化处理,统计相应的覆盖度及短序列数量,得到分型结果。
4.所述基因整合分析流程包括如下步:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到HPV基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用factera检测多个基因的全部或一部分的编码区首尾相连,包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果,得到基因整合结果。
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