CN110093454A - 用于多种hpv分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法 - Google Patents
用于多种hpv分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法，首先进行DNA打断，打断后的DNA进行磁珠筛选纯化，保留主峰在350bp左右的片段；然后正常的末端修复和连接加接头，磁珠纯化一次；最后进行PCR扩增富集，使用上一步的建库产物做模板，29条引物混合液和P7末端引物进行扩增，磁珠纯化一次后得到测序文库，配合illumina测序平台进行测序。本发明能够一次测序可以同时拿到HPV分型和人基因组整合位点两个结果；并且测序产生reads数可以作为定量分析的依据，进一步判断病情发展情况；通过测序得到的HPV分型结果信息要比qPCR更准确和全面。
Description
技术领域
本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法。
背景技术
宫颈癌指的是发生在宫颈部与子宫颈阴道的一种恶性肿瘤，属常见妇科肿瘤，发生率仅次于乳腺癌。在近30年，宫颈癌发病率每年上升0.6％，全世界每年有20万人因宫颈癌死亡，国内每年将近5万人因为宫颈癌而死。根据病理学描述性的诊断方法把宫颈癌前病变划分成高度鳞状上皮内病变(HSIL)与宫颈癌前病变分为低度鳞状上皮内病变(LSIL)，也就是浸润性宫颈癌(ICC)、宫颈上皮内瘤变(CIN)与宫颈原位癌等。
HPV病毒感染为宫颈癌发生以及发展的重要因素，大约有99.75％的宫颈癌患者存在HPV感染。迄今为止，临床上已经证实次存在170余种分型，结合病变位置和致病能力情况，可分为皮肤低危型、皮肤高危型、黏膜低危型和黏膜高危型几个类型。HPV基因组大小在8k左右，是双链环状DNA分子，以环状结构或线性分子存在于宿主细胞中。
现有的HPV分型技术主要以qPCR平台taqman探针法检测试剂盒为主，品牌和种类比较多，但由于方法学的限制最多只能够检测20种的HPV分型。然而qPCR探针法对于其他种类的HPV分型检测则无能为力。二代测序的方法也被开发利用对HPV进行分型，但是由于灵敏度和qPCR探针法相比要低，所以经常会发生漏检，不能作为分型的金标准。现需要开发一种可以即准确检测HPV种类有多的方法。
HPV病毒会低概率的将自己的基因组插入整合到宿主细胞的基因组上，通常HPV病毒整合的位置经常会随机产生，病毒基因的整合会致使宿主染色体出现变化，主要包含非染色质损害、染色体易位与缺失，一直到染色体发生重排，最后进展成癌症。而且这种整合会影响宿主细胞基因表达发生变化，同样会引发细胞癌变。常规的整合位点检测方法是通过热点区域设计引物进行扩增，但是这种方法的问题是首先热点整合区域较大，单次或者几次扩增不能完整覆盖整个区域，其次是虽然定义为热点整合区域但频率概率并没有想象那么高，还有一个问题是在热点整合区域以外，还有很多整合发生，位置存在很大的随机性，单纯扩增加一代测序根本无法检测到。目前另外一种检测整合位点的方法是通过二代测序的捕获方法，设计已知整合位点捕获探针，这种方法的主要优点是探针可以覆盖很多已知的整合位点，通量和信息量要比单纯扩增大很多，但缺点是只限于HPV整合到基因组位置信息的捕捉，不能同时得到感染的游离HPV的分型结果。
发明内容
(1)选取临床宫颈脱落细胞样本进行DNA提取，得到纯化后的DNA进行超声破碎，使用磁珠筛选去除大片段和小片段，保留主峰在350bp左右的片段化DNA；
(2)将步骤(1)得到的片段化DNA依次进行末端修复、3’加A、接头连接、纯化，完成建库并得到文库产物；
(3)将步骤(2)得到的文库产物、29条长引物、P7末端引物、Multiplex PCR mastermix和水组成PCR反应体系并进行PCR扩增；
(4)将PCR扩增后的产物进行纯化，得测序文库，对测序文库进行测序。
根据权利要求1所述的用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法，其特征在于，步骤(1)中，超声破碎过程选用的超声破碎仪的型号为Covaris M220。
根据权利要求1所述的用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法，其特征在于，步骤(2)中，文库构建通过PerkinElmer公司的NEXTflex TM PCR-Free建库试剂盒完成。
优选的是，步骤(2)中，末端修复体系为：片段化DNA 500ng-3ug，NEXTflexTM PCR-Free End Repair Buffer Mix 7ul，NEXTflexTM PCR-Free End Repair Enzyme Mix 3ul无核酸水补足50ul，修复条件为：22℃处理30分钟，然后Beckman AMPure XP磁珠纯化一次。
在上述任一方案中优选的是，3’加A体系为：末端修复后的产物16μl、NEXTflexTMPCR-Free Adenylation Mix 4.5μl，反应条件为：37℃处理30分钟，处理后的体系直接进行接头连接。
在上述任一方案中优选的是，接头连接体系为：3’加A过程的产物20.5μl，NEXTflexTM PCR-Free Ligation Mix 31.5ul，NEXTflexTM PCR-Free DNA Adapter 2.5ul，反应条件为：22℃处理15分钟。
在上述任一方案中优选的是，步骤(3)中，PCR反应体系为：Multiplex PCR mastermix 12.5ul，29条长引物混合液1ul，P7末端引物1ul，文库产物10ng，水补足23ul，反应条件为：95℃，2min；95℃，30s，60℃，60s，72℃，60s，10个循环；72℃，10min。
在上述任一方案中优选的是，步骤(4)中，测序选用的仪器为illumina测序仪。
在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，所述29条长引物和P7末端引物的序列信息为：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA
HPV1 CACGACGCTCTTCCGATCTAGTATGTATCCGAAAKCGCCAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA
HPV2 CACGACGCTCTTCCGATCTGCGAACTCCCGTATTTGACTGCTTAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA
HPV3 CACGACGCTCTTCCGATCTTGAGGTCTGCTGAAACGCATTAAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA
HPV4 CACGACGCTCTTCCGATCTATGACTCGATGCCGMAGTAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA
HPV5 CACGACGCTCTTCCGATCTAGTGTGTGCAGACGCAAAGTAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA
HPV6 CACGACGCTCTTCCGATCTGGTATTTTAGTWCTGCATGGAAAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTAC
HPV7 ACGACGCTCTTCCGATCTACGGCATTAATACCTATAGTTCA
HPV8 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGTGGGATTTAGTGACCGGATAAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACAC
HPV9 GACGCTCTTCCGATCTGCATAAACAGGAATTTCATTGGAAAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTAC
HPV10 ACGACGCTCTTCCGATCTGCGCCTGCATAAATTATGAGGAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTAC
HPV11 ACGACGCTCTTCCGATCTGCCCAATTTAATTATGCTTTGAAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACAC
HPV12 GACGCTCTTCCGATCTTGCTTTAAATTAAGCGAGACRGTAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA
HPV13 CACGACGCTCTTCCGATCTAACCAGACCCAGTGCAGTGAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACAC
HPV14 GACGCTCTTCCGATCTCTATACGCCTAGYTTAATACAAAGGAAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA
HPV15 CACGACGCTCTTCCGATCTCCACATGGCATTGGGTGTCATAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTAC
HPV16 ACGACGCTCTTCCGATCTCGTATTTCTGGGTTTTGGKGGAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTAC
HPV17 ACGACGCTCTTCCGATCTATCTGTGGGATGTCCCTAGCGGAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACA
HPV18 CGACGCTCTTCCGATCTGAACACGATGGAWTATGTGGTTGTCAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACAC
HPV19 GACGCTCTTCCGATCTCCTGATCCTAGGTCAATACCAATTTGGAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACA
HPV20 CGACGCTCTTCCGATCTGGGCCGCAWTTAGGGGTCGTAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACA
HPV21 CGACGCTCTTCCGATCTGAATTGGGAATAAGAACWGAAATGACAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG
HPV22 ACGCTCTTCCGATCTGGATTATATCCGTGAGCARATCCCAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACA
HPV23 CGACGCTCTTCCGATCTGCAGCGTTATGATGCATGTTATAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACA
HPV24 CGACGCTCTTCCGATCTGTCGTGCCTCTGCAATGCATATCCTAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACA
HPV25 CGACGCTCTTCCGATCTGTTGGTTACTGTAGCTACCYAGGGAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACAC
HPV26 GACGCTCTTCCGATCTGGGTACTGAATATGATTTACATGCTAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTAC
HPV27 ACGACGCTCTTCCGATCTGGTTTAGGAGGTTGTATATTGCAGAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACA
HPV28 CGACGCTCTTCCGATCTGGTATCCATCATGGACATCAGCAARC
HPV29 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTTGCCAACGGAAAGGCRCCCG
p7末端引物CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
本发明的有益效果为：
(1)一次测序可以同时拿到HPV分型和人基因组整合位点两个结果；
(2)测序产生reads数可以作为定量分析的依据，进一步判断病情发展情况；
(3)通过测序得到的HPV分型结果信息要比qPCR更准确和全面。
附图说明
图1为HPV基因组；
图2为测序文库构建的流程图。
具体实施方式
为了更进一步了解本发明的发明内容，下面将结合具体实施例详细阐述本发明。
如图1和图2所示，本发明设计的长引物一共有29条，长引物分为三个部分：P5，接头序列和HPV引物，HPV引物全部为正向引物，根据多种HPV型的保守序列设计，非平均的分布于整个8k的HPV基因组上，两条引物之间间隔距离最长不超过1k，本发明第一步是进行DNA打断，打断后的DNA进行磁珠筛选纯化，保留主峰在350bp左右的片段，然后正常的末端修复和连接加接头，磁珠纯化一次，最后进行PCR扩增富集，使用上一步的建库产物做模板，29条引物混合液和P7末端引物进行扩增，磁珠纯化一次后得到测序文库，配合illumina测序平台进行测序，具体方案如下：
(1)选取三个临床宫颈脱落细胞样本进行DNA提取，得到纯化后的DNA进行超声打断，使用Covaris M220将DNA进行破碎，Beckman AMPure XP磁珠筛选一次去除大片段和小片段，保留主峰在350bp左右的片段；
(2)纯化后的DNA进行文库构建，采用PerkinElmer公司的NEXTflexTM PCR-Free建库试剂盒，PCR-free的好处是操作方便步骤少，末端修复和加接头完成建库，利于后续操作。
末端修复体系(50ul)：
| 成分组成 | 体积/DNA量 |
| 片段化DNA | 500ng-3ug |
| NEXTflex<sup>TM</sup> PCR-Free End Repair Buffer Mix | 7ul |
| NEXTflex<sup>TM</sup> PCR-Free End Repair Enzyme Mix | 3ul |
| 无核酸水 | 补足50ul |
22℃处理30分钟，然后Beckman AMPure XP磁珠纯化一次；
3’加A体系(20.5ul)：
| 成分组成 | 体积 |
| 末端修复过片段化DNA | 16ul |
| NEXTflex<sup>TM</sup> PCR-Free Adenylation Mix | 4.5ul |
37℃处理30分钟，处理后的体系直接进行接头连接；
连接体系(54.5ul)：
| 成分组成 | 体积 |
| 上一步加A体系 | 20.5ul |
| NEXTflex<sup>TM</sup> PCR-Free Ligation Mix | 31.5ul |
| NEXTflex<sup>TM</sup> PCR-Free DNA Adapter | 2.5ul |
22℃处理15分钟，然后Beckman AMPure XP磁珠纯化一次。
(3)文库HPV长引物扩增，将上一步建好的文库按照下面的体系混合；
PCR反应体系(25ul)：
| 成分组成 | 体积/DNA量 |
| Multiplex PCR master mix | 12.5ul |
| 29条长引物混合液(10uM) | 1ul |
| P7末端引物(10uM) | 1ul |
| 文库产物 | 10ng |
| 水 | 补足23ul |
反应程序：
PCR反应后用Beckman AMPure XP磁珠纯化一次，纯化后产物为测序文库，可以进行pooling上illumina测序仪测序。
(4)测序数据下机数据经过过滤比对等步骤分析得到如下结果：
从测序结果可以看出，本发明覆盖了到临床qPCR所有HPV分型的结果，而且还检测到qPCR没有检出的分型，比如样本GZR110070，临床qPCR漏检了HPV56分型。从整合结果来看，本发明可以很好地得到整合HPV的种类以及整合在人染色体的具体位置(表1)。不仅如此，我们还可以通过reads数的高低和整合位点以及整合reads多少来判断感染程度以及病程进展。所以可以看出GZR110070情况比较严重，感染的HPV reads数非常多，而且整合也很多。
本领域技术人员不难理解，本发明的用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分以及附图所示出的各部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京格致医学检验有限公司
<120> 用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tatgtatccg aaakcgcc 78
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gaactcccgt atttgactgc tt 82
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gtactgaata tgatttacat gct 83
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tttaggaggt tgtatattgc ag 82
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tatccatcat ggacatcagc aarc 84
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tgccaacgga aaggcrcccg 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caagcagaag acggcatacg agat 24
Claims (9)
1.一种用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法，按照先后顺序包括以下步骤：
(1)选取临床宫颈脱落细胞样本进行DNA提取，得到纯化后的DNA进行超声破碎，使用磁珠筛选去除大片段和小片段，保留主峰在350bp左右的片段化DNA；
(2)将步骤(1)得到的片段化DNA依次进行末端修复、3’加A、接头连接、纯化，完成建库并得到文库产物；
(3)将步骤(2)得到的文库产物、29条长引物、P7末端引物、Multiplex PCR master mix和水组成PCR反应体系并进行PCR扩增；
(4)将PCR扩增后的产物进行纯化，得测序文库，对测序文库进行测序。
2.根据权利要求1所述的用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法，其特征在于，步骤(1)中，超声破碎过程选用的超声破碎仪的型号为Covaris M220。
3.根据权利要求1所述的用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法，其特征在于，步骤(2)中，文库构建通过PerkinElmer公司的NEXTflexTMPCR-Free建库试剂盒完成。
4.根据权利要求3所述的用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法，其特征在于，步骤(2)中，末端修复体系为：片段化DNA 500ng-3ug，NEXTflexTMPCR-Free EndRepair Buffer Mix 7ul，NEXTflexTMPCR-Free End Repair Enzyme Mix 3ul无核酸水补足50ul，修复条件为：22℃处理30分钟，然后Beckman AMPure XP磁珠纯化一次。
5.根据权利要求3所述的用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法，其特征在于，3’加A体系为：末端修复后的产物16μl、NEXTflexTMPCR-Free Adenylation Mix4.5μl，反应条件为：37℃处理30分钟，处理后的体系直接进行接头连接。
6.根据权利要求3所述的用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法，其特征在于，接头连接体系为：3’加A过程的产物20.5μl，NEXTflex TMPCR-Free Ligation Mix31.5ul，NEXTflexTMPCR-Free DNA Adapter 2.5ul，反应条件为：22℃处理15分钟。
7.根据权利要求1所述的用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR反应体系为：Multiplex PCR master mix 12.5ul，29条长引物混合液1ul，P7末端引物1ul，文库产物10ng，水补足23ul，反应条件为：95℃，2min；95℃，30s，60℃，60s，72℃，60s，10个循环；72℃，10min。
8.根据权利要求1所述的用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法，其特征在于，步骤(4)中，测序选用的仪器为illumina测序仪。
9.根据权利要求1所述的用于多种HPV分型鉴定和基因组整合分析的扩增测序方法，其特征在于，步骤(2)中，所述29条长引物和P7末端引物的序列信息为：
。
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