CN104561372A - 人类乳头瘤病毒基因的扩增和分型的组合引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人类乳头瘤病毒基因的扩增和分型的组合引物,所述组合引物分为组合上游引物和组合下游引物,所述组合上游引物由3部分组成,依次由接头部分P2序列、标签序列和正向引物序列组成,所述组合下游引物依次由反向引物序列和接头部分P1序列组成。本发明还公开了一种人类乳头瘤病毒基因的扩增和分型的试剂盒。本发明还公开了上述组合引物和试剂盒的应用。本发明具备有效通量、低成本、可对HPV进行精确分型。通过使用多条引物(6条正向引物和5条反向引物)进行扩增,并将扩增产物的序列信息与HPV数据库进行比对,可以精确地确定HPV的类型,从而为临床诊断和治疗方案选择提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,具体涉及人类乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)基因的扩增和分型的组合引物及其应用,特别是基于高通量测序和多重PCR技术的HPV分型检测新方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papilloma Virus,HPV)是一种小型的、无包膜的双链环状DNA病毒,主要通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。HPV具有宿主特异性和组织特异性,只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞,引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣以及粘膜生殖道上皮增生性损伤。目前,世界卫生组织及国际癌症研究中心均确认HPV持续感染是导致宫颈癌发生的主要病因。
癌症报告显示,宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一,是目前唯一病因明确,可早发现、早预防的癌症。研究统计表明,99.7%的宫颈癌患者都能发现高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染,潜伏期有十几年,初期没有任何症状,后期可出现异常阴道流血。目前,治疗方案以手术和放射治疗为主,但中晚期患者治愈率很低。全球每年约有20多万女性死于宫颈癌。在发展中国家,宫颈癌属于常见多发的妇科肿瘤,我国宫颈癌已成为女性的主要杀手,发病率逐年上升,已位居世界第二;仅2000年~2010年,我国宫颈癌患病率就由9.6/10万升至15.1/10万。我国每年新发现的病例为13.15万,每年约有3万名妇女死于宫颈癌。传统宫颈癌筛查方法有细胞学检查,阴道镜检查和宫颈组织学检查,都是从发现细胞或组织病变入手,并不能进行HPV早期感染检测。但随着大规模宫颈癌筛查工作的开展,HPV检测作为初筛手段成为一种趋势。定期进行HPV检查,长期跟踪HPV感染情况,在细胞未发生病变时进行合理的干预,能及时有效地预防宫颈癌的发生。有报道指出,HPV检测阴性的妇女筛查间隔可以安全延至6年。因此,对HPV感染的及早发现和正确分型对宫颈癌防治显得至关重要。
HPV的检测方法主要有以下几种:①细胞学检查,其利用宫颈刮片细胞学检查或液基薄层细胞学检查,藉由细胞外观形态的转变来加以诊断。对于HPV感染,镜下可见挖空细胞、角化不良以及湿疣外底层细胞。其局限性在于,HPV感染的诊断的灵敏性和特异性较低。②免疫组化方法,其通过检测HPV的衣壳抗原来进一步明确HPV感染,其所得的阳性反应定位明确,判断可靠。但是,衣壳抗原仅在HPV-DNA复制成熟后才产生,因此,诊断为阴性的受试者并不能被确定为不被HPV感染,该方法灵敏性较低。③实时荧光定量PCR法(FQ-PCR),其主要是应用荧光检测PCR仪,在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累对PCR过程中每一个循环产生的扩增产物进行实时监测,从而对模板的初始浓度进行定量。此方法通量较低。④杂交捕获法(主要为HC-II系统),其是目前唯一获得美国FDA认证的可用于临床的HPV DNA检测方法,并且其已获得欧洲CE及中国SDA认证。该方法使用专用的标本采集保存器;已获得专利保护的全长8000bp的RNA探针以及已获得专利保护的特异性第一抗体。其原理是将核酸探针杂交到受测检体的HPV DNA上,再通过化学荧光或酶反应借助增幅的信号进行检测。该方法所使用的核酸探针主要分为两种:针对低危险型HPV的核酸探针和针对高危险型HPV的核酸探针。该方法可用于HPV的初步筛检,但是不能确定HPV的特定类型,也不能确定多重感染的情况。
上述检测方法各有优势,结合使用可以精确的检测HPV的分型,并有效的降低检测的假阴性率。但是,这些方法的组合不仅成本高昂,并且耗时耗力,单次检测数量有限,不适用于大范围的宫颈癌的筛查,一般只适用于经济发达地区的HPV检测和宫颈癌筛查。因此,开发一种简便,准确率较高、成本合适的检测方法,成为了亟待解决的问题。
发明内容
发明目的:针对现有技术存在的不足,本发明基于多重PCR和新型的高通量测序法,开发了一种人类乳头瘤病毒基因的扩增和分型的组合引物;本发明还开开发了一种人类乳头瘤病毒基因的扩增和分型的试剂盒;本发明还公开了一种人类乳头瘤病毒基因的测序方法;根据本发明的方法不仅可以实现HPV的高通量、低成本检测,而且可以实现HPV的精确分型。
技术方案:为实现上述发明的目的,本发明采用的技术方案是:一种人类乳头瘤病毒基因的扩增和分型的组合引物,所述组合引物分为组合上游引物和组合下游引物,所述组合上游引物由3部分组成,依次由接头部分P2序列、标签序列和正向引物序列组成,所述组合下游引物依次由反向引物序列和接头部分P1序列组成,所述标签序列为SEQ ID NO:1-16中的任意一个,所述接头部分P2序列为SEQ ID NO:18,所述接头部分P1序列为SEQ ID NO:17,所述正向引物序列为SEQ ID NO:19-24中的任意一个,所述反向引物序列为SEQ ID NO:25-29中的任意一个。Barcode(标签)序列是指经设计的一小段碱基序列,通常为8bp,标签的个数决定了一次上机待测样本的数量,本发明中仅使用16个标签进行验证。组合引物的连接顺序为:P2+barcode+正向PCR引物,反向引物+P1;以barcode1为例,具体“组合引物”序列分别为SEQ ID NO:30-40。该正反向引物通过PCR扩增,直接扩增出带有测序接头和barcode序列的产物,直接作为乳液PCR的文库,免去了文库构建的步骤,更加省时省力,节省成本。
一种人类乳头瘤病毒基因的扩增和分型的试剂盒,包括权利要求1所述的组合引物、测序引物、一组四色荧光标记的核酸探针,所述测序引物的序列如SEQ ID NO:41-56所示,所述核酸探针的序列如SEQ ID NO:58-62所示。
一种人类乳头瘤病毒基因的测序方法,包括以下步骤:
1)PCR扩增引物的设计:所述扩增引物设计为权利要求1所述的组合引物;引物长度在50bp左右,所以在合成引物时,要选用较高纯化标准;
2)PCR扩增:将步骤1)中的上游组合引物按照等比例混合得到组合引物F,将下游组合引物按照等比例混合得到组合引物R,后分别作为标签的引物池,用得到的组合引物F和组合引物R引物按照多重PCR的方法进行扩增,扩增出的片段即为此标签的扩增文库;该文库在200bp左右,其对应于HPV基因组中最为保守的基因区(L1区)中的一段高度保守的DNA序列,因此,通过对该扩增产物进行精确测序,可以实现HPV的精确分型;该方法省去了DNA连接酶连接接头的步骤,直接在PCR步骤中构建获得文库,获得方法简便,省时省力,节省成本。将每条引物混合至终浓度为2μM,按照如下Takara反应体系和扩增程序进行扩增反应;
PCR反应条件为:94℃变性30秒;94℃变性30秒,58℃退火15s,72℃延伸1分钟,共扩增35个循环;最终72℃充分延伸10分钟;
3)目的基因的回收:扩增得到的文库采用琼脂糖凝胶电泳后采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因;配制2%琼脂糖凝胶,放入电泳槽中,加TAE工作液,淹没胶块;将10μL PCR产物与2μL 6×Loading buffer混匀后加入上样孔中。电压调至90V,电泳至染料前沿至胶板3/4处停止。在紫外光下快速切下目标条带。按照天根琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209-03)的操作说明回收目标片段,用30μLddH2O溶解目的基因,回收产物即为文库。
4)文库的质控:对已经扩增好的文库进行质控,质控方法如下:先用Nanodrop 2000进行文库初步定量,按摩尔量等比例混合后;使用Qubit 2.0对混合后的文库进行最终定量,作为最终乳液PCR的稀释标准;产物浓度在0.5-5ng/μL之间;
5)乳液扩增:在样本数足够的情况下,可以按照每次乳液共混合至少96个人;本次样本数较少,为16个样本;将这些预扩增好的DNA片段与其中一个连接子互补序列的磁珠进行乳液PCR反应,得到大量有目的基因组DNA片段的单克隆磁珠,并变性得到基因组测序模板,最后将这些扩增有目的基因组DNA片段的单克隆磁珠固定在微流控芯片上;
6)上机测序:
A)将单克隆磁珠上的模板链变性成单链;
B)将变性好的模板链与能和待测基因位点对应的引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物,测序引物序列分别为SEQ ID NO:41-56;
C)加入一组对应的四色荧光标记的核酸探针Probe Mix1进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断待测基因位点的信息;
D)循环步骤A)-C)15次,直到获得所有待测基因位点的碱基信息;
E)将磁珠上的模板链变性成单链;
F)将变性好的模板链与能和待测基因位点对应的引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物,如SEQ ID NO:57;
G)加入一组四色荧光标记的核酸探针Probe Mix 1进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断标签序列第1位的碱基信息;
H)循环步骤E)-G)4次,分别加入核酸探针Probe Mix 2、3、4、5进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断标签序列的第2、3、4、5位的碱基信息,SEQ ID NO:58-62。
I)通过解码标签序列来区分不同的样本,通过所加入的测序引物来区分待测基因的位点。
本发明中的测序方法采用的是连接法测序,所述连接法测序,其主要是通过:1)测序引物杂交:将5’端固定的模板与能和5’端连接子互补的引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物,由5’→3’方向进行连接测序;2)采用边连接边测序的策略,在测序引物A与待测片段杂交后,加入4种荧光标记的探针,完成待测片段1号位碱基的测序,随后编码测序探针的后3个碱基和荧光基团被切除;重复2)完成另外碱基的测序;在对barcode(标签)这样的连续序列进行测序时,不需要添加测序引物,只需要循环使用编码测序探针和剪切步骤,完成对待测片段的测序。3)在加入荧光后,观察荧光信号,根据不同的荧光解码出相应的碱基序列信息;4)序列组装:利用所有模板的碱基序列信息,组装成目标基因组序列信息。
本文中所使用的术语“多重PCR技术”,是指在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同,在本发明中,使用多对PCR引物,但只有特定的引物才能扩增出特定的产物;
基于PDX平台连接法测序的使用,可以满足基因分型,基因突变筛查,疾病分型检测等应用。本发明的方法将应用于HPV分型检测,既能快速简便的鉴定HPV分型,又能节省成本,节省通量,为HPV分型检测的一个新方法。
如本文中所说的“上机测序引物”,是指一段与目标序列互补的序列,长度在200bp左右,在上机时,通过退火与目标序列杂交,然后加入荧光探针,即可以测出上机测序引物的下一位碱基。
当对多个样本进行测序时,只需要改变barcode序列,其他接头序列和PCR引物序列不变,即可以扩展出多个样本的文库。PCR反应后,可以将来自各个样本的带有不同barcode的PCR产物等量混合组成一个文库,然后采用连接法测序对其进行测序。通过独特的延伸引物,根据其突变位点的碱基,推断其HPV分型。
如本文所说的“阳性质控品”,是感染有特定型别HPV病毒的样本,为保证实验的准确性,采用阳性质控品进行方法的验证。分别采用16种分型的阳性质控品;
为了增加测序的样本数,Barcode序列的设计我们采用8碱基设计,“组合引物”应当注意以下几个方面:1)应当避免3个或3个以上的单碱基重复序列;2)同一位点中碱基A和碱基C的总含量应在所有碱基含量的30%-70%之间;3)本身的GC含量应在40%-60%之间;4)引物组之间的序列差异应大于4个碱基;5)引物组序列中应避免出现与用于测序的引物其相似度高的序列;6)当因无阻序列添加到PCR扩增产物上后,应避免PCR扩增引物形成发卡结构和二聚体等二级结构。
本发明的“组合引物”可扩增出至少16种200bp左右的产物,其对应于HPV基因组中最为保守的基因区(L1区)中的一段高度保守的DNA序列。因此,本发明的“组合引物”可用于HPV的精确分型。
在一个优选实施方案中,本发明的“组合引物”可用于HPV测序、检测或分型,从而其可用于医疗用途,例如诊断HPV的存在和确定HPV的类型等,以及非医疗用途,例如构建HPV数据库,研究HPV类型分布的地域性特点,流行病学研究和疫苗研制等。
本发明的另一个方面提供了用于对一个或多个样本进行HPV测序、检测或分型的方法。所述方法包括使用上文描述的“组合引物”对多个样本的DNA进行扩增,然后进行测序以获得样本的序列的步骤。
根据“组合引物”中的barcode序列,将测序结果与质控品类型一一对应,检查其准确性。
在又一个优选方案中,采用Takara公司的扩增试剂盒(R010Q),扩增反应条件和体系根据实验过程中最佳条件进行。
在又一个优选方案中,采用天根的琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209-03),具体操作步骤按照其说明书进行。该试剂盒操作方便,性价比较高。
在一个优选方案中,本发明的方法使用的是本公司自主研发的测序仪,PDX2000,按照连接法测序的方法进行的测序,只获得需要的结果,不浪费通量。
上述的组合引物、试剂盒、测序方法中,所述组合引物为11条不同的引物,所述上游组合引物与下游组合引物之间的退火温度在3度内,且引物对与引物对之间形成的引物二聚体的△G的绝对值小于5。
上述的组合引物、试剂盒在制备用于检测和乳头瘤病毒分型试剂方面的应用。
有益效果:本发明的新型HPV检测方法相对于现有技术具有以下有利方面:
1)有效通量。通过测序获得的结果只是单个碱基的结果,不含整个L1区的测序结果,结果简单明了,不获得多余的通量,避免了数据结果的浪费。
2)低成本。采用自主研发的测序仪以及自主研发的试剂,其价格要远远低于进口仪器和试剂,使得测序成本大大降低,从而HPV检测成本也大大降低。
3)可对HPV进行精确分型。通过使用多条引物(6条正向引物和5条反向引物)进行扩增,并将扩增产物的序列信息与HPV数据库进行比对,可以精确地确定HPV的类型,从而为临床诊断和治疗方案选择提供依据。
附图说明
图1扩增后产物示意图;图1的简单说明:在本发明的示例性方法中,通过PCR在每个样本的PCR产物两端分别加入不同的序列,把多个不同的barcode混合在一起,用于构建测序文库。在测序文库的构建过程中,当需要时,通过设计不同的barcode可以完成多个样本的测序文库。文库构建完毕后,经具有不同特征序列的接头标记的多个测序文库可以混合在一起,并用PDX2000仪器,结合测序和连接法测序对其检测。最后,根据测序结果中的barcode序列信息,将测序结果与样本一一对应;
图2为部分PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图,marker为DL500 DNA Marker。从电泳图上可以观察到,PCR产物条带的大小在200bp左右;图2的简单说明:对其进行扩增后,每个样本对应一个HPV分型,所以,混合引物的扩增也只能有一条优势扩增条带,并且其扩增后产物大小基本一致。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例,进一步阐明本发明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
在本发明的实施中,通过使用本发明的方法,实现了对样本中的HPV进行分型检测,主要是对14种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)和2种低危型HPV(6和11)进行检测。待检测序列如下:
通过多重PCR策略构建测序文库。对于分型探针的延伸,按照延伸测序方案进行;对于Barcode检测,按照连接测序方案进行。
以HPV16种分型的阳性质控品为例,省去了样本采集和DNA提取的过程,其他的具体实施方式的描述如下:
实施例1:PCR扩增引物设计
本发明采用扩增子的方法对L1区进行扩增,引物设计如图1:
设计主要遵循:
组合上游引物为:5’P2接头+barcode接头+上游引物3’;组合下游引物为:5’P1接头+下游引物3’;总扩增长度约200bp。用软件进行比对,保证引物对之间的退火温度相差不大,最好在3度内。引物对与引物对之间形成的引物二聚体的△G的绝对值小于5。
引物长度在50bp左右,所以在合成引物时,要选用较高纯化标准。
表1:Barcode序列
备注:Bc=barcode
表2:P1,P2序列
表3:未添加任何序列的引物
表4:组合引物序列(以barcode1为例)
实施例2 PCR扩增
将每条引物混合至终浓度为2μM,按照如下Takara反应体系和扩增程序进行扩增反应。
PCR反应条件为:94℃变性30秒;94℃变性30秒,58℃退火15s,72℃延伸1分钟,共扩增35个循环;最终72℃充分延伸10分钟;
实施例3:目标片段的回收
回收目的基因:配制2%琼脂糖凝胶,放入电泳槽中,加TAE工作液,淹没胶块。将10μL PCR产物与2μL 6×Loading buffer混匀后加入上样孔中。电压调至90V,电泳至染料前沿至胶板3/4处停止。在紫外光下快速切下目标条带。按照天根琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209-03)的操作说明回收目标片段,用30μLddH2O溶解目的基因,回收产物即为文库。
实施例4:文库QC
对已经扩增好的文库进行质控,质控方法如下:先用Nanodrop 2000进行文库初步定量,按摩尔量等比例混合后;使用Qubit 2.0对混合后的文库进行最终定量,作为最终乳液PCR的稀释标准。产物浓度在0.5-5ng/μL之间。
实施例5:乳液扩增
在样本数足够的情况下,可以按照每次乳液共混合至少96个人;本次样本数较少,为16个样本。
将这些预扩增好的DNA片段与其中一个连接子互补序列的磁珠进行乳液PCR反应,得到大量有目的基因组DNA片段的单克隆磁珠,并变性得到基因组测序模板,最后将这些扩增有目的基因组DNA片段的单克隆磁珠固定在微流控芯片上。
实施例6:上机测序
1)用含0.005M NaOH和65%甲酰胺的缓冲液在65℃下处理10分钟,将单克隆磁珠上的模板链变性成单链;
2)将变性好的模板链与能和待测基因位点对应的引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物;
3)加入50μM四色荧光标记的核酸探针Probe Mix 1,在0.35U/μl T4 NAD连接酶的作用下15℃反应30min,然后用含0.01%wt Triton X-100、20%wt甘油的缓冲液洗涤,最后用CCD成像,通过荧光信号的种类来判断待测基因位点的信息;
4)循环步骤1)-3)15次,直到获得所有待测基因位点的碱基信息。
5)用含0.005M NaOH和65%甲酰胺的缓冲液在65℃下处理10分钟,将磁珠上的模板链变性成单链;
6)将变性好的模板链与标签(Barcode)引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物,如SEQ ID NO:57;
7)加入50μM核酸探针Probe Mix 1,在0.35U/μl T4 NAD连接酶的作用下 15℃反应30min,然后用含0.01%wt Triton X-100、20%wt甘油的缓冲液洗涤,最后用CCD成像,通过荧光信号的种类来判断标签(Barcode)序列第1位的碱基信息,
8)循环步骤5)-7)4次,分别加入核酸探针Probe Mix 2、3、4、5进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断标签(Barcode)序列的第2、3、4、5位的碱基信息,探针如表5,SEQ ID NO:58-62。
9)通过解码标签(Barcode)序列来区分不同的样本,通过所加入的测序引物来区分待测基因的位点。
表5:测序引物序列PO4-代表磷酸基团,表中41~62代表SEQ ID NO 41~62
结果分析:
根据测序结果中的标签(Barcode)序列以及测序引物,将测序结果与每一个 样品一一对应。然后进行数据分析。
结果显示,检测出的突变位点均与质控品的型别保存一致。
为了检测本发明方法的准确性,我们采用Sanger测序法进行验证,发现所有结果完全吻合,无假阴性、假阳性。
如表6,为测序所得数据统计:
参考文献
本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的专利、文献或其他材料通过引用合并入本文,并且为方便起见按下列文献目录提供。
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Claims (5)
1.一种人类乳头瘤病毒基因的扩增和分型的组合引物,其特征在于:所述组合引物分为组合上游引物和组合下游引物,所述组合上游引物由3部分组成,依次由接头部分P2序列、标签序列和正向引物序列组成,所述组合下游引物依次由反向引物序列和接头部分P1序列组成,所述标签序列为SEQ ID NO:1-16中的任意一个,所述接头部分P2序列为SEQ ID NO:18,所述接头部分P1序列为SEQ ID NO:17,所述正向引物序列为SEQ ID NO:19-24中的任意一个,所述反向引物序列为SEQ ID NO:25-29中的任意一个。
2.一种人类乳头瘤病毒基因的扩增和分型的试剂盒,其特征在于:包括权利要求1所述的组合引物、测序引物、一组四色荧光标记的核酸探针,所述测序引物的序列如SEQ ID NO:41-56所示,所述核酸探针的序列如SEQ ID NO:58-62所示。
3.一种人类乳头瘤病毒基因的测序方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)PCR扩增引物的设计:所述扩增引物设计为权利要求1所述的组合引物;
2)PCR扩增:将步骤1)中不同的引物按照等比例混合,混合后作为一个标签的引物池,用此引物按照多重PCR的方法进行扩增,扩增出的片段即为此标签的扩增文库;
3)目的基因的回收:扩增得到的文库采用琼脂糖凝胶电泳后采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因;
4)文库的质控:先用Nanodrop 2000进行文库初步定量,按摩尔量等比例混合后;使用Qubit 2.0对混合后的文库进行最终定量,作为最终乳液PCR的稀释标准;产物浓度在0.5-5ng/μL之间;
5)乳液扩增:将这些预扩增好的DNA片段与其中一个连接子互补序列的磁珠进行乳液PCR反应,得到大量有目的基因组DNA片段的单克隆磁珠,并变性得到基因组测序模板,最后将这些扩增有目的基因组DNA片段的单克隆磁珠固定在微流控芯片上;
6)上机测序:
A)将单克隆磁珠上的模板链变性成单链;
B)将变性好的模板链与能和待测基因位点对应的引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物,测序引物序列分别为SEQ ID NO:41-56;
C)加入一组对应的四色荧光标记的核酸探针Probe Mix1进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断待测基因位点的信息;
D)循环步骤A)-C)15次,直到获得所有待测基因位点的碱基信息;
E)将磁珠上的模板链变性成单链;
F)将变性好的模板链与能和待测基因位点对应的引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物,如SEQ ID NO:57;
G)加入一组四色荧光标记的核酸探针Probe Mix 1进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断标签序列第1位的碱基信息;
H)循环步骤E)-G)4次,分别加入核酸探针Probe Mix 2、3、4、5进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断标签序列的第2、3、4、5位的碱基信息,SEQ ID NO:58-62。
I)通过解码标签序列来区分不同的样本,通过所加入的测序引物来区分待测基因的位点。
4.根据权利要求1所述的组合引物、权利要求2所述的试剂盒、权利要求3所述的测序方法,其特征在于,所述组合引物为11条不同的引物,所述上游组合引物与下游组合引物之间的退火温度在3度内,且引物对与引物对之间形成的引物二聚体的△G的绝对值小于5。
5.权利要求1所述的组合引物、权利要求2所述的试剂盒在制备用于检测和乳头瘤病毒分型试剂方面的应用。
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