CN106834545A - 高危人乳头瘤病毒试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高危人乳头瘤病毒检测试剂盒，包括HPV扩增引物，在多重PCR体系中引入了通用的荧光标记引物，设计三种荧光标记引物，就能够扩增出十几种不同长度或不同荧光的扩增子，特异性扩增引物的5’端引入20bp的特异性接头，并且在PCR体系中引入荧光标记的通用引物，通过多重PCR扩增，得到荧光标记的扩增子长度比目的扩增区域多两个接头的长度，然后多重PCR产物应用于毛细管电泳分析，得到基因型；本发明进一步降低荧光标记多重PCR的费用，并且解决HPV亚型的增多与检测成本线性增加的问题，本方法以检测14种高危HPV亚型为例，可以使多重PCR成本降低50％，并且随着检测HPV亚型的种类增多，成本降低幅度更大。
Description
技术领域
本发明属于生命科学和技术领域，特别涉及人类乳头瘤病毒HPV的检测。
背景技术
人乳头瘤病毒即HPV，高危HPV持续感染(HR-HPV)是宫颈癌发生的最主要原因，其中HR-HPV E6和E7基因是促进宫颈癌发生发展的最主要的癌基因。目前的研究表明：不同的高危HPV亚型引起宫颈癌的致癌能力不同，其中HPV16和18亚型是公认的致癌能力最强的亚型。因此，通过检测妇女宫颈上皮组织感染的高危HPV亚型对预测宫颈癌的发生具有重要的作用。最新的宫颈癌筛查指南也建议高危HPV分型检测方法作为一线的宫颈癌筛查方法。目前，报道的HPV检测方法超过125种，按技术原理主要分为杂交法，实时定量PCR法，高分辨溶解曲线法，第二代杂交捕获法，焦磷酸测序法，PCR-飞行质谱技术和荧光标记PCR法。其中，仅实时定量PCR法，高分辨溶解曲线法和荧光标记多重PCR法操作简单，时间短，仅需一步就可得到可用于检测的扩增子。然而，实时定量PCR法通量较低，成本高；高分辨溶解曲线法准确性低限制了在亚型多样的HPV检测中的应用。荧光标记多重PCR结合毛细管电泳具有成本低，通量高，准确性高的优点，弥补了实时定量PCR和高分辨溶解曲线法的不足之处。
荧光标记多重PCR的原理是针对不同的基因区域设计不同的荧光标记引物，即每一对引物中的一条引物标记上荧光基团，通过多重PCR扩增得到不同荧光和不同长度的扩增子。扩增子进行毛细管电泳来区分，已达到分型的目的。
浦艳等建立了基于荧光标记PCR方法检测人乳头瘤病毒核酸检测方法可同时对24种HPV亚型进行分型检测，操作简单，通量高，灵敏度较高。但是，浦艳等的发明有以下几个不足之处：(1)由于HPV整合进入人基因组的过程容易导致HPV L1基因缺失，导致对宫颈癌及癌前病变的筛查灵敏度下降。(2)由于L1基因是HPV亚型间最保守的基因，可能导致对HPV分型的特异性降低。(3)简并引物的引入，降低了本方法对HPV分型的特异性。(4)PCR扩增过程中需要两种酶Taq HS DNA聚合酶和UNG酶，增加了检测试剂成本。(5)其方法在PCR完成后，为了获得单链的荧光标记产物进行了变性，然后进行毛细管电泳，增加了检测成本。
戴建荣等建立了基于荧光标记PCR方法检测人乳头瘤病毒E6/E7基因区域的方法，可同时对22种HPV亚型进行分型。与浦艳等的方法相比，在灵敏度和特异性方面有所提高，降低了成本；并且本方法针对HPV E6/E7基因区域进行分型，可能提高对宫颈癌及癌前病变的筛查灵敏度。但是，以上两种发明方法都需要对检测的每一种HPV亚型设计特异性的荧光标记引物，成本随着检测HPV亚型的增多成线性增加。
发明内容
为了进一步降低荧光标记多重PCR的费用，并且解决HPV亚型的增多与检测成本线性增加的问题，我们在多重PCR体系中引入了通用的荧光标记引物，只需设计三种荧光标记引物，就能够扩增出十几种不同长度或不同荧光的扩增子。
根据本发明的一方面提供了一种高危人乳头瘤病毒检测试剂盒，包括HPV扩增引物，所述HPV扩增引物为HPV16上游引物及HPV16下游引物、HPV18上游引物及HPV18下游引物、HPV31上游引物及HPV31下游引物、HPV33上游引物及HPV33下游引物、HPV35上游引物及HPV35下游引物、HPV39上游引物及HPV39下游引物、HPV45上游引物及HPV45下游引物、HPV51上游引物及HPV51下游引物、HPV52上游引物及HPV52下游引物、HPV56上游引物及HPV56下游引物、HPV58上游引物及HPV58下游引物、HPV59上游引物及HPV59下游引物、HPV66上游引物及HPV66下游引物和HPV68上游引物及HPV68下游引物，
HPV16上游引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
HPV16下游引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
HPV18上游引物如序列表中SEQ ID NO.3所示；
HPV18下游引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；
HPV31上游引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；
HPV31下游引物如序列表中SEQ ID NO.6所示；
HPV33上游引物如序列表中SEQ ID NO.7所示；
HPV33下游引物如序列表中SEQ ID NO.8所示；
HPV35上游引物如序列表中SEQ ID NO.9所示；
HPV35下游引物如序列表中SEQ ID NO.10所示；
HPV39上游引物如序列表中SEQ ID NO.11所示；
HPV39下游引物如序列表中SEQ ID NO.12所示；
HPV45上游引物如序列表中SEQ ID NO.13所示；
HPV45下游引物如序列表中SEQ ID NO.14所示；
HPV51上游引物如序列表中SEQ ID NO.15所示；
HPV51下游引物如序列表中SEQ ID NO.16所示；
HPV52上游引物如序列表中SEQ ID NO.17所示；
HPV52下游引物如序列表中SEQ ID NO.18所示；
HPV56上游引物如序列表中SEQ ID NO.19所示；
HPV56下游引物如序列表中SEQ ID NO.20所示；
HPV58上游引物如序列表中SEQ ID NO.21所示；
HPV58下游引物如序列表中SEQ ID NO.22所示；
HPV59上游引物如序列表中SEQ ID NO.23所示；
HPV59下游引物如序列表中SEQ ID NO.24所示；
HPV66上游引物如序列表中SEQ ID NO.25所示；
HPV66下游引物如序列表中SEQ ID NO.26所示；
HPV68上游引物如序列表中SEQ ID NO.27所示；
HPV68下游引物如序列表中SEQ ID NO.28所示；
HPV扩增引物的5’端为20bp的特异性接头，高危人乳头瘤病毒检测试剂盒还包括带有荧光基团的特异性接头引物。
根据本发明的一方面提供了一种高危人乳头瘤病毒检测试剂盒，带有荧光基团的特异性接头引物为三种，分别为Tip-Blue、Tip-Yellow和Tip-Green，
Tip-Blue序列如序列表中SEQ ID NO.29，所述Tip-Blue5’的荧光基团为FAM；
Tip-Yellow序列如序列表中SEQ ID NO.30,所述Tip-Yellow5’的荧光基团为NED；
Tip-Green序列如序列表中SEQ ID NO.31，所述Tip-Green5’的荧光基团为VIC。
根据本发明的一方面提供了一种高危人乳头瘤病毒检测试剂盒，高危人乳头瘤病毒检测试剂盒还包括Tip-reverse引物，所述Tip-reverse引物如序列表中SEQ ID NO.32。
根据本发明的一方面提供了一种高危人乳头瘤病毒检测试剂盒，高危人乳头瘤病毒检测试剂盒还包括内参基因(HBB)的上游引物和下游引物，内参基因的上游引物如序列如序列表中SEQ ID NO.33，内参基因的下游引物如序列如序列表中SEQ ID NO.34。
根据本发明的一方面提供了一种高危人乳头瘤病毒检测方法，使用权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒检测试剂盒进行PCR反应，反应体系10uL：DDH2O 2.35uL，10*PCRBuffer 1uL，25nM Mg2+1uL,2nM DNTP 1.5uL，5U/uL FastTaq酶0.15uL，样本DNA 2uL和所述的高危人乳头瘤病毒检测试剂盒；
PCR循环程序：95℃ 4min；11cycles x(94℃ 30s,68℃-0.5℃/cycle 120s)；36cycles x(94℃ 30s,58℃ 60s)；72℃ 10min；4℃ for ever；
PCR反应产物上遗传分析仪，根据毛细管电泳图上特定颜色和位置的峰来判断HPV亚型。
其原理如图1和图2所示是：特异性扩增引物的5’端引入20bp的特异性接头，并且在PCR体系中引入荧光标记的通用引物，通过多重PCR扩增，得到荧光标记的扩增子长度比目的扩增区域多两个接头的长度，然后多重PCR产物应用于毛细管电泳分析，得到基因型。
图1为特异性扩增引物示意图，其中A：20bp的特异接头序列；B：特异性扩增引物与DNA模板结合的序列；C：基因组DNA；D：荧光标记通用引物，分别标记三种不同荧光基团。
图2为高危HPV检测方法流程图，途中NED、FAM和VIC颗粒分别代表相应颜色的荧光基团，用以在毛细管电泳峰图中区分不同PCR产物；单条粗实线为引物，箭头表示延伸方向，细实线表示模板DNA，带有荧光基团的双实线表示PCR产物。本发明的流程图表示通过一步PCR反应，生成标记有荧光基团的双链DNA产物，在遗传分析仪上毛细管电泳将不同大小的DNA片段区分开，并根据峰的颜色和位置判断HPV亚型。
本方法以检测14种高危HPV亚型为例，可以使多重PCR成本降低50％，并且随着检测HPV亚型的种类增多，成本降低幅度更大。
本发明针对HPV E6/E7基因设计带有接头的特异性PCR引物(见表1)，通过Touchdown多重PCR扩增HPV E6/E7特定区域的DNA片段，其特点是由与模板结合区域和5’端的特异性接头序列组成，实现检测HPV亚型的特异性。
本发明引入了三种5’端标记荧光基团引物(见表2)，荧光基团分别为FAM(蓝色)，VIC(绿色)和NED(黑色)，实现将扩增的不同HPV亚型的片段标记上荧光。通用荧光标记引物以通过特异性扩增引物扩增出来的扩增子为模板进行扩增，从而将荧光基团添加到扩增子上，便于检测。
本发明引入三种荧光标记基团的引物，克服了PCR扩增过程中不同引物扩增效率的不均一性。
本发明的毛细管电泳在遗传分析仪上进行，毛细管电泳后运用Genemapper软件进行分析，根据不同颜色和不同位置的峰来判读感染的高危HPV亚型。
本发明设计的引物扩增片段为80～200bp,并且22种HPV亚型的扩增片段都不相同，每一种颜色的峰在不同的位置都代表一种HPV亚型，避免了由于目的峰过高带起的背景峰造成的误判。
本发明在PCR扩增过程中，采用Touchdown多重PCR技术，首先采用较高的退火温度，并延长退火时间，利于特异性扩增引物与模板的结合和延伸；在若干循环后，采用较低的退火温度，使特异性扩增引物形成二聚体结构，不利于与模板结合，而有利于荧光标记引物与扩增子的结合和延伸，使得到的荧光标记扩增子长度一样，便于判读。
附图说明
图1是本发明特异性扩增引物示意图；
图2是本发明鉴定高危HPV检测方法流程图；
图3是本发明一实施例鉴定HPV 16阳性样本结果图；
图4是本发明一实施例鉴定HPV16阴性样本结果图；
图5是本发明一实施例鉴定HPV52阳性样本结果图；
图6是本发明一实施例鉴定HPV52阴性样本结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
本发明的试剂盒包含如下表1和表2的多重PCR引物和荧光标记引物
表1
表2
表1包含了多重PCR引物序列信息及浓度等信息，表2为荧光标记引物信息表。
实施例2
1.多重PCR反应
反应体系10uL：DDH2O 2.35uL，10*PCR Buffer 1uL，25nM Mg2+1uL,2nM DNTP1.5uL，带接头引物混合液(引物信息见表1)1uL，荧光标记引物混合液(引物信息见表2)1uL，5U/uL Faststart Taq酶0.15uL，HPV16阳性样本DNA 2uL。PCR循环程序：95℃ 4min；11cycles x(94℃ 30s,68℃-0.5℃/cycle 120s)；36cycles x(94℃ 30s,58℃ 60s)；72℃10min；4℃ for ever。
2.PCR产物上遗传分析仪
取1uL PCR产物稀释50倍；取1uL稀释液与0.06μl Liz120SIZE STANDARD和8.9μlHi-Di混匀，上遗传分析仪ABI3130进行毛细管电泳及基因型分析。根据毛细管电泳图上特定颜色和位置的峰来判断HPV亚型。
3.结果分析
检测结果如图3显示为HPV16阳性。
使用相同方法鉴定HPV16阴性的样本时结果如图4。
实施例3
1.多重PCR反应
反应体系10uL：DDH2O 2.35uL，10*PCR Buffer 1uL，25nM Mg2+1uL,2nM DNTP1.5uL，带接头引物混合液(引物信息见表1)1uL，荧光标记引物混合液(引物信息见表2)1uL，5U/uL Faststart Taq酶0.15uL，HPV52阳性样本DNA 2uL。PCR循环程序：95℃ 4min；11cycles x(94℃ 30s,68℃-0.5℃/cycle 120s)；36cycles x(94℃ 30s,58℃ 60s)；72℃10min；4℃ for ever。
2.PCR产物上遗传分析仪
取1uL PCR产物稀释50倍；取1uL稀释液与0.06μl Liz120SIZE STANDARD和8.9μlHi-Di混匀，上遗传分析仪ABI3130进行毛细管电泳及基因型分析。根据毛细管电泳图上特定颜色和位置的峰来判断HPV亚型。
3.结果分析
检测结果如图5显示为HPV16阳性。
使用相同方法鉴定HPV52阴性的样本时结果如图6。
由于本发明设计了以上引物、荧光标记引物并确定了上述各高危HPV实际峰位置和目的峰的颜色，通过检测的实际峰位置和目的峰的颜色来判断HPV亚型。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
<110>王本敬
<120>高危人乳头瘤病毒试剂盒及检测方法
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<212>DNA
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ACCGTTGATGAGGACCAGTACCACAGGAGCGACCCAGAA
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TAGACCGACACGCTTACGATGCAACGAGGTAGAAGAAAGCA
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<211>20
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TGTAAGCGAATCCAGCCAGT
<210>32
<211>20
<212>DNA
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<400>32
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<211>41
<212>DNA
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<400>33
TAGACCGACACGCTTACGATCTCTTGGGTTTCTGATAGGCA
<210>34
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
GGCGGCTTGAGACATACATACATCACTAAAGGCACCGAGCA
Claims (5)
1.高危人乳头瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，包括HPV扩增引物，所述HPV扩增引物为HPV16上游引物及HPV16下游引物、HPV18上游引物及HPV18下游引物、HPV31上游引物及HPV31下游引物、HPV33上游引物及HPV33下游引物、HPV35上游引物及HPV35下游引物、HPV39上游引物及HPV39下游引物、HPV45上游引物及HPV45下游引物、HPV51上游引物及HPV51下游引物、HPV52上游引物及HPV52下游引物、HPV56上游引物及HPV56下游引物、HPV58上游引物及HPV58下游引物、HPV59上游引物及HPV59下游引物、HPV66上游引物及HPV66下游引物和HPV68上游引物及HPV68下游引物，
所述HPV16上游引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
所述HPV16下游引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
所述HPV18上游引物如序列表中SEQ ID NO.3所示；
所述HPV18下游引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；
所述HPV31上游引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；
所述HPV31下游引物如序列表中SEQ ID NO.6所示；
所述HPV33上游引物如序列表中SEQ ID NO.7所示；
所述HPV33下游引物如序列表中SEQ ID NO.8所示；
所述HPV35上游引物如序列表中SEQ ID NO.9所示；
所述HPV35下游引物如序列表中SEQ ID NO.10所示；
所述HPV39上游引物如序列表中SEQ ID NO.11所示；
所述HPV39下游引物如序列表中SEQ ID NO.12所示；
所述HPV45上游引物如序列表中SEQ ID NO.13所示；
所述HPV45下游引物如序列表中SEQ ID NO.14所示；
所述HPV51上游引物如序列表中SEQ ID NO.15所示；
所述HPV51下游引物如序列表中SEQ ID NO.16所示；
所述HPV52上游引物如序列表中SEQ ID NO.17所示；
所述HPV52下游引物如序列表中SEQ ID NO.18所示；
所述HPV56上游引物如序列表中SEQ ID NO.19所示；
所述HPV56下游引物如序列表中SEQ ID NO.20所示；
所述HPV58上游引物如序列表中SEQ ID NO.21所示；
所述HPV58下游引物如序列表中SEQ ID NO.22所示；
所述HPV59上游引物如序列表中SEQ ID NO.23所示；
所述HPV59下游引物如序列表中SEQ ID NO.24所示；
所述HPV66上游引物如序列表中SEQ ID NO.25所示；
所述HPV66下游引物如序列表中SEQ ID NO.26所示；
所述HPV68上游引物如序列表中SEQ ID NO.27所示；
所述HPV68下游引物如序列表中SEQ ID NO.28所示；
所述HPV扩增引物的5’端为20bp的特异性接头，所述高危人乳头瘤病毒检测试剂盒还包括带有荧光基团的特异性接头引物。
2.根据权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述带有荧光基团的特异性接头引物为三种，分别为Tip-Blue、Tip-Yellow和Tip-Green，
所述Tip-Blue序列如序列表中SEQ ID NO.29，所述Tip-Blue5’的荧光基团为FAM；
所述Tip-Yellow序列如序列表中SEQ ID NO.30,所述Tip-Yellow5’的荧光基团为NED；
所述Tip-Green序列如序列表中SEQ ID NO.31，所述Tip-Green5’的荧光基团为VIC。
3.根据权利要求2所述的高危人乳头瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述高危人乳头瘤病毒检测试剂盒还包括Tip-reverse引物，所述Tip-reverse引物如序列表中SEQ IDNO.32。
4.根据权利要求2所述的高危人乳头瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述高危人乳头瘤病毒检测试剂盒还包括内参基因的上游引物和下游引物，所述内参基因的上游引物如序列如序列表中SEQ ID NO.33，所述内参基因(HBB)的下游引物如序列如序列表中SEQ IDNO.34。
5.高危人乳头瘤病毒检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒检测试剂盒进行PCR反应，反应体系10uL：DDH2O 2.35uL，10*PCR Buffer 1uL，25nM Mg2+1uL,2nM DNTP 1.5uL，5U/uL FastTaq酶0.15uL，样本DNA 2uL和所述的高危人乳头瘤病毒检测试剂盒；
PCR循环程序：95℃ 4min；11cycles x(94℃ 30s,68℃-0.5℃/cycle 120s)；36cyclesx(94℃ 30s,58℃ 60s)；72℃ 10min；4℃ forever；
PCR反应产物上遗传分析仪，根据毛细管电泳图上特定颜色和位置的峰来判断HPV亚型。
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