CN108220462A - 一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒，该方法包括如下步骤：以待测样品为模板，采用试剂盒进行PCR扩增，得到反应产物；读取反应产物的荧光信号，然后判断待测样品中是否含有瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌。试剂盒包括引物对组合，组成引物对组合的4条引物的核苷酸序列依次如序列表中序列3至序列6所示。实验证明，在LGC分子检测平台上，采用本发明提供的试剂盒可以高通量快速检测瓜类种子上是否携带瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌，可作为防控感染种子流转的预防技术，也可作为田间种植阶段的病害监测预警技术，为农业生产及口岸检疫提供了一种快速、准确的检测方法。

Description

一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专 用试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒。
背景技术
瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch，简称BFB)，又称细菌性果腐病，是西瓜和甜瓜生产中一种毁灭性病害，也是世界性检疫病害。BFB是典型的由种子带菌引起的传染性病害，由西瓜嗜酸菌(Acidovorax.citrulli)引起，具有发病快、传播速度快、爆发力强、危害重等特点，可侵染西瓜、甜瓜、南瓜、西葫芦、黄瓜等多种瓜类作物，给农业安全生产造成严重威胁。西瓜嗜酸菌不仅危害果实，也在幼苗期引起子叶和真叶腐烂枯死的症状；其主要存活于种皮下的胚乳表层，具有存活时间长、抗逆、抗干旱、抗衰老能力和致病力强的特点。
瓜类细菌性角斑病是一种重要的细菌性种传病害，其散布快、传播范围广。瓜类细菌性角斑病最初在黄瓜上发现，如果黄瓜遭遇此病害，严重时可导致绝产，造成严重经济损失。瓜类细菌性角斑病的病原菌为丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病变种(Pseudomonassyringae pv.lachrymans)，其寄主非常广泛，除侵染黄瓜外，还可以侵染西瓜、葫芦、西葫芦和丝瓜等葫芦科植物，造成严重经济损失。
植物病原细菌检测中常用手段包括出苗检测、生化培养检测、免疫学检测及以PCR为基础的分子检测方法，这些检测手段因识别对象的不同而各具优缺点。LGC分子检测平台是基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术的SNP基因分型检测方案(英国政府化学家实验室开发)。截止目前，还没有高通量快速检测瓜类种子上是否携带西瓜嗜酸菌和丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病变种的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测待测瓜类种子上是否携带瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了引物对组合，可包括引物对AC-3和引物对PSL-7；
所述引物对AC-3可由引物AC-F和引物AC-R组成；所述引物对AC-3的靶序列可含有特异DNA片段甲；所述特异DNA片段甲可为如下y1)或y2)：
y1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
y2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物对PSL-7可由引物PSL-F和引物PSL-R组成；所述引物对PSL-7的靶序列可含有特异DNA片段乙；所述特异DNA片段可乙为如下z1)或z2)：
z1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
z2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
上述引物对组合中，所述引物对AC-3中一条引物的5’末端可含有接头序列甲；所述引物对PSL-7中一条引物的5’末端可含有接头序列乙；接头序列甲和接头序列乙可结合不同的信号基团。
上述引物对组合中，所述接头序列甲的核苷酸序列可如序列表中序列3自5’末端起第1至21位所示。所述接头序列甲可结合FAM信号基团。所述接头序列乙的核苷酸序列可如序列表中序列5自5’末端起第1至22位所示。所述接头序列乙可结合HEX信号基团。
所述引物AC-F可为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物AC-R可为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
b2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物PSL-F可为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列5所示的单链DNA分子；
c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物PSL-R可为如下d1)或d2)：
d1)序列表中序列6所示的单链DNA分子；
d2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物对组合具体可由所述引物对AC-3和所述引物对PSL-7组成。
上述任一所述引物对组合中的引物对AC-3也属于本发明的保护范围。
上述任一所述引物对组合中的引物对PSL-7也属于本发明的保护范围。
本发明还保护试剂盒甲或试剂盒乙或试剂盒丙。所述试剂盒甲含有上述任一所述引物对组合。所述试剂盒乙含有上述任一所述引物对AC-3。所述试剂盒丙含有上述任一所述引物对PSL-7。
所述试剂盒甲的制备方法也属于本发明的保护范围；该制备方法可包括将上述任一所述引物对组合中的各条引物单独包装的步骤。
所述试剂盒乙的制备方法也属于本发明的保护范围；该制备方法可包括将所述引物对AC-3中的各条引物单独包装的步骤。
所述试剂盒丙的制备方法也属于本发明的保护范围；该制备方法可包括将所述引物对PSL-7中的各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护e1)至e12)中的至少一种：
e1)上述任一所述引物对组合在制备检测瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌的试剂盒中的应用；
e2)上述任一所述引物对AC-3在制备检测瓜类细菌性果斑病菌的试剂盒中的应用；
e3)上述任一所述引物对PSL-7在制备检测瓜类细菌性角斑病菌的试剂盒中的应用；
e4)上述任一所述引物对组合或上述任一所述试剂盒甲在检测瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌中的应用；
e5)上述任一所述引物对AC-3或上述任一所述试剂盒乙在检测瓜类细菌性果斑病菌中的应用；
e6)上述任一所述引物对PSL-7或上述任一所述试剂盒丙在检测瓜类细菌性角斑病菌中的应用；
e7)上述任一所述引物对组合或上述任一所述试剂盒甲在检测待测样品中是否含有或疑似含有瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌中的应用；
e8)上述任一所述引物对AC-3或上述任一所述试剂盒乙在检测待测样品中是否含有或疑似含有瓜类细菌性果斑病菌中的应用；
e9)上述任一所述引物对PSL-7或上述任一所述试剂盒丙在检测待测样品中是否含有或疑似含有瓜类细菌性角斑病菌中的应用；
e10)上述任一所述引物对组合或上述任一所述试剂盒甲在检测待测菌是否为候选的瓜类细菌性果斑病菌或角斑病菌中的应用；
e11)上述任一所述引物对AC-3或上述任一所述试剂盒乙在检测待测菌是否为候选的瓜类细菌性果斑病菌中的应用；
e12)上述任一所述引物对PSL-7或上述任一所述试剂盒丙在检测待测菌是否为候选的瓜类细菌性角斑病菌中的应用。
本发明还保护f1)或f2)或f3)。
f1)检测待测菌是否为瓜类细菌性果斑病菌或角斑病菌的方法一，可包括如下步骤：
(1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用上述任一所述引物对组合进行PCR扩增，得到反应产物；
(2)读取反应产物的荧光信号，然后进行如下判断：
①如果仅读取到接头序列甲结合的信号基团的荧光信号，待测菌为或候选为瓜类细菌性果斑病菌；
②如果仅读取到接头序列乙结合的信号基团的荧光信号，待测菌为或候选为瓜类细菌性角斑病菌。
f2)检测待测菌是否为瓜类细菌性果斑病菌或角斑病菌的方法二，可包括如下步骤：
(1)以瓜类细菌性果斑病菌的基因组DNA、瓜类细菌性角斑病菌的基因组DNA或待测菌的基因组DNA为模板，采用上述任一所述引物对组合进行PCR扩增，得到反应产物；
(2)读取反应产物的荧光信号，进行聚类分析，然后进行如下判断：
①如果待测菌的基因组DNA的反应产物仅和瓜类细菌性果斑病菌的基因组DNA的反应产物聚群，待测菌为或候选为瓜类细菌性果斑病菌；
②如果待测菌的基因组DNA的反应产物仅和瓜类细菌性角斑病菌的基因组DNA的反应产物聚群，待测菌为或候选为瓜类细菌性角斑病菌。
f3)检测待测菌是否为瓜类细菌性果斑病菌或角斑病菌的方法三，可包括如下步骤：检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列1或序列2所示的DNA区段，然后进行如下判断：
①如果含有序列表中序列1所示的DNA区段，待测菌为或候选为瓜类细菌性果斑病菌；
②如果含有序列表中序列2所示的DNA区段，待测菌为或候选为瓜类细菌性角斑病菌。
本发明还保护g1)或g2)。
g1)检测待测瓜类种子上是否携带瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌的方法一，可包括如下步骤：
(1)以待测瓜类种子的浸提液为模板，采用上述任一所述引物对组合进行PCR扩增，得到反应产物；
(2)读取反应产物的荧光信号，然后进行如下判断：
①如果仅读取到接头序列甲结合的信号基团的荧光信号，则待测瓜类种子上携带瓜类细菌性果斑病菌；
②如果仅读取到接头序列乙结合的信号基团的荧光信号，则待测瓜类种子上携带瓜类细菌性角斑病菌；
③如果读取到接头序列甲结合的信号基团的荧光信号和接头序列乙结合的信号基团的荧光信号，则待测瓜类种子上携带瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌；
④如果读取不到荧光信号，则待测瓜类种子上不携带瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌。
g2)检测瓜类种子上是否携带瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌的方法二，可包括如下步骤：
(1)以瓜类细菌性果斑病菌的基因组DNA、瓜类细菌性角斑病菌的基因组DNA、水或待测瓜类种子的浸提液为模板，采用上述任一所述引物对组合进行PCR扩增，得到反应产物；
(2)读取反应产物的荧光信号，进行聚类分析，然后进行如下判断：
①如果待测样品的反应产物仅和瓜类细菌性果斑病菌的基因组DNA的反应产物聚群，则待测瓜类种子上携带瓜类细菌性果斑病菌；
②如果待测样品的反应产物仅和瓜类细菌性角斑病菌的基因组DNA的反应产物聚群，则待测瓜类种子上携带瓜类细菌性角斑病菌；
③如果待测样品的反应产物不与瓜类细菌性果斑病菌的基因组DNA、瓜类细菌性角斑病菌的基因组DNA和水的反应产物聚群(即单独聚群)，则待测瓜类种子上携带瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌；
④如果待测样品的反应产物仅和水的反应产物聚群，则待测瓜类种子上不携带瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌。
上述任一所述方法中，获得待测瓜类种子的浸提液的步骤可如下：
①向待测瓜类种子中加入磷酸钾缓冲液，震荡培养；
②完成步骤①后，将液相移至离心管，离心，收集沉淀。
③完成步骤②后，用水溶解沉淀，得到待测瓜类种子的浸提液。
所述步骤①中，所述“向待测瓜类种子中加入磷酸钾缓冲液”具体可为向30g待测瓜类种子中加入100mL磷酸钾缓冲液。所述磷酸钾缓冲液具体可为含80.2mM K2HPO4和19.2mM KH2PO4的水溶液，pH值为7.4。
所述步骤①中，所述“震荡培养”可为使用脉冲震荡样品前处理器(HKMshockmixer-1)以93次/s速度震荡15s，然后置于摇床，28℃、120rpm振荡培养4h。
所述步骤②中，所述离心为8000rpm离心10min。
所述步骤③中，所述水为灭菌水。
所述步骤①中，所述瓜类种子为西瓜种子或甜瓜种子。
上文中，所述“读取反应产物的荧光信号”可采用荧光读取仪器读取。
上文中，所述聚类分析可采用Cluster analysis软件进行。
上文中，所述检测可在LGC平台进行。在LGC平台检测的具体步骤可如下：
(1)取多孔板，加入待测菌的基因组DNA或待测样品，烘干；然后加入混合液(上述任一所述引物对组合和1×LGC KASP Master Mix组成)，封膜；最后将多孔板进行PCR扩增反应，得到反应产物；
(2)使用荧光读取仪器读取反应产物的荧光信号，然后使用Cluster analysis软件进行聚类分析。如果聚类分析分组结果不明显，可将反应产物进行PCR加循环，直至聚类分析时聚群明显；每次加循环程序可如下：94℃20s，55℃1min，3个循环)。
上文中，所述烘干具体可为65℃烘干40min。
上文中，所述PCR扩增反应的反应程序具体可为：94℃15min；94℃20s，62℃-55℃30s(第1个循环62℃，之后每个循环降0.7℃)，10个循环；94℃20s，55℃1min，26个循环；4℃保存。
上文中，所述混合液具体可由1体积份引物混合物和72体积份1×LGC KASPMaster Mix(LGC公司的产品)混合而成。所述引物混合物具体可由12μL引物AC-F(浓度为10mM)、15μL引物AC-R(浓度为10mM)、12μL引物PSL-F(浓度为10mM)和15μL引物PSL-R(浓度为10mM)组成。
上述任一所述瓜类细菌性果斑病菌具体可为西瓜嗜酸菌(Acidovorax.citrulli)Xu3-14。
上述任一所述瓜类细菌性角斑病菌具体可为丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)NCPPB No.541。
上文中，Cluster analysis软件可为LGC平台自带的软件。LGC平台具体可为LGC公司的产品。
瓜类细菌性果腐病和细菌性角斑病是瓜类种子最重要的种传病害，可导致苗期烂苗延误生产，或成株期叶片与果实的感染发病，使得果实丧失商品性、严重减产。目前的种子检测方法存在耗时长、占地广(出苗检测)，检测通量不高，检测精度不够等问题。实验证明，在LGC分子检测平台上，采用本发明提供的特异引物对可以高通量快速检测瓜类种子上是否携带瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌，可作为防控感染种子流转的预防技术，也可作为田间种植阶段的病害监测预警技术，为农业生产及口岸检疫提供了一种快速、准确的检测方法。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
西瓜嗜酸菌(Acidovorax.citrulli)Xu3-14记载与如下文献中：徐秀兰，芦钰，赵子婧，吴萍，宋顺华，宫国义，张海军.不同发酵条件对瓜类细菌性果斑病菌感染西瓜种子的影响.植物保护.(详见网址：
http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1982.S.20180131.1752.003.html？uid＝WEEvR EcwSlJHSldRa1FhcTdWajFuVjdjT01qV1VhOTljcHpJS0NYbm44OD0＝$9A4hF_YAuvQ5obgVAq NKPCYcEjKensW4IQMovwHtwkF4VYPoHbKxJw)，公众可从申请人(北京市农林科学院)处获得该菌株。西瓜嗜酸菌(Acidovorax.citrulli)Xu3-14在下文中简称AC菌。
丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)NCPPB No.541于1958年保藏于美国国家植物病原细菌库(National Collection of PlantPathogenic Bacteria，NCPPB)，公众可从申请人(北京市农林科学院)处获得该菌株。丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)NCPPB No.541在下文中简称PSL菌。
1×LGC KASP Master Mix为LGC公司的产品。
下述实施例中，KrakenTM软件和Cluster analysis软件为LGC平台自带的软件。LGC平台为LGC公司的产品。
实施例1、引物的合成
根据AC菌中par基因的核苷酸序列(序列表中序列1所示)，人工设计引物并合成引物对AC-2和引物对AC-3。根据PSL菌中gap1基因的核苷酸序列(序列表中序列2所示)，人工设计并合成引物对PSL-1、引物对PSL-2、引物对PSL-3、引物对PSL-4、引物对PSL-5、引物对PSL-6和引物对PSL-7。引物设计原则：每条引物长度为20-26bp，扩增片段大小为100bp左右，在KrakenTM软件里调节Tm值为55-62℃；依据AC菌设计的引物对(即引物对AC-2和引物对AC-3)的上游引物中均含有接头序列1(接头序列1可结合FAM信号基团，从而被KrakenTM软件识别)；依据PSL菌设计的引物对(即引物对PSL-1、引物对PSL-2、引物对PSL-3、引物对PSL-4、引物对PSL-5、引物对PSL-6和引物对PSL-7)的上游引物中均含有接头序列2(接头序列2可结合HEX信号基团，从而被KrakenTM软件识别)。
各个引物对的核苷酸序列如表1所示。
表1
注：单下划线为接头序列1，双下划线为接头序列2。
实施例2、检测AC菌和PSL菌的引物组的筛选
一、用于检测AC菌的引物对AC的筛选
1、模板的获得
取AC菌的菌悬液，加入无菌水，得到浓度为108CFU/mL的AC菌悬液6(OD600nm为0.15)。
取AC菌悬液6，用无菌水进行梯度稀释，得到浓度为103CFU/mL的AC菌悬液1、浓度为104CFU/mL的AC菌悬液2、浓度为105CFU/mL的AC菌悬液3、浓度为106CFU/mL的AC菌悬液4和浓度为107CFU/mL的AC菌悬液5。
2、反应混合液的获得
将12μL引物对AC-2的上游引物(浓度为10mM)和15μL引物对AC-2的下游引物(浓度为10mM)混合，得到引物混合物2。
将12μL引物对AC-3的上游引物(浓度为10mM)和15μL引物对AC-3的下游引物(浓度为10mM)混合，得到引物混合物3。
将1体积份引物混合物(引物混合物2或引物混合物3)和72体积份1×LGC KASPMaster Mix混合，得到反应混合液。
3、LGC平台检测
样品为AC菌悬液1、AC菌悬液2、AC菌悬液3、AC菌悬液4、AC菌悬液5、AC菌悬液6、AC菌的基因组DNA(阳性对照)或水(阴性对照)。
采用LGC平台进行检测，具体步骤如下：
(1)取384孔板，每孔加入1.5μL样品，65℃烘干40min；然后加入3μL步骤2得到的反应混合液，封膜；最后将所述384孔板进行PCR扩增反应，得到反应产物。
反应程序：94℃15min；94℃20s，62℃-55℃30s(第1个循环62℃，之后每个循环降0.7℃)，10个循环；94℃20s，55℃1min，26个循环；4℃保存。
(2)使用荧光读取仪器读取反应产物的荧光信号，然后使用Cluster analysis软件进行聚类分析(如果聚类分析分组结果不明显，可将反应产物进行PCR加循环，直至聚类分析时聚群明显；每次加循环程序如下：94℃20s，55℃1min，3个循环)并进行如下判断：如果步骤(1)中反应产物与阳性对照聚群(即读取到FAM荧光信号)，则相应的AC菌悬液中含有AC菌；如果步骤(1)中反应产物与阴性对照聚群(即无荧光信号)，则相应的AC菌悬液中不含有AC菌。
实验结果见表2。结果表明，引物对AC-2和引物对AC-3的检测结果均比较好。
表2
引物对AC-2 引物对AC-3
AC菌悬液1 FAM FAM
AC菌悬液2 FAM FAM
AC菌悬液3 FAM FAM
AC菌悬液4 FAM FAM
AC菌悬液5 FAM FAM
AC菌悬液6 FAM FAM
水 N N
AC菌的基因组DNA FAM FAM
注：N表示无荧光信号，FAM表示FAM荧光信号。
二、检测AC菌和PSL菌的引物组的筛选
1、模板的获得
取PSL菌的菌悬液，加入无菌水，得到浓度为108CFU/mL的PSL菌悬液(OD600nm为0.15)。
将AC菌悬液6和PSL菌悬液混合(体积比为1:1)，得到混合菌悬液，即模板。
2、反应混合液的获得
引物对PSL为引物对PSL-1、引物对PSL-2、引物对PSL-3、引物对PSL-4、引物对PSL-5、引物对PSL-6或引物对PSL-7。
将12μL引物对AC-2的上游引物(浓度为10mM)、15μL引物对AC-2的下游引物(浓度为10mM)、12μL引物对PSL的上游引物(浓度为10mM)和15μL引物对PSL的下游引物(浓度为10mM)混合，得到引物混合物甲。
将12μL引物对AC-3的上游引物(浓度为10mM)、15μL引物对AC-3的下游引物(浓度为10mM)、12μL引物对PSL的上游引物(浓度为10mM)和15μL引物对PSL的下游引物(浓度为10mM)混合，得到引物混合物乙。
将1体积份引物混合物(引物混合物甲或引物混合物乙)和72体积份1×LGC KASPMaster Mix混合，得到反应混合液。
3、LGC平台检测
样品为AC菌悬液6、PSL菌悬液、混合菌悬液、AC菌的基因组DNA(阳性对照1)、PSL菌的基因组DNA(阳性对照2)或水(阴性对照)。
采用LGC平台进行检测，具体步骤如下：
(1)取384孔板，每孔加入1.5μL样品，65℃烘干40min；然后加入3μL步骤2得到的反应混合液，封膜；最后将所述384孔板进行PCR扩增反应，得到反应产物。
反应程序：94℃15min；94℃20s，62℃-55℃30s(第1个循环62℃，之后每个循环降0.7℃)，10个循环；94℃20s，55℃1min，26个循环；4℃保存。
(2)使用荧光读取仪器读取反应产物的荧光信号，然后使用Cluster analysis软件进行聚类分析(如果聚类分析分组结果不明显，可将反应产物进行PCR加循环，直至聚类分析时聚群明显；每次加循环程序如下：94℃20s，55℃1min，3个循环)并进行如下判断：如果步骤(1)中反应产物只读取到FAM荧光信号(即只与阳性对照1聚群)，则相应的菌悬液中含有AC菌且不含有PSL菌；如果步骤(1)中反应产物只读取到HEX荧光信号(即只与阳性对照2聚群)，则相应的菌悬液中含有PSL菌且不含有AC菌；如果步骤(1)中反应产物同时读取到FAM和HEX荧光信号(即单独聚群，而不与阳性对照1、阳性对照2和阴性对照聚群)，则相应的菌悬液中含有PSL菌和AC菌；如果步骤(1)中反应产物无荧光信号(即与阴性对照聚群)，则相应的菌悬液中不含有AC菌和PSL菌。
实验结果见表3。结果表明，引物组1(由引物对AC-2和引物对PSL-7组成)和引物组2(由引物对AC-3和引物对PSL-7组成)的效果最好，用于下一步实验。
表3
注：N表示无荧光信号，ND表示无法判断，FAM表示FAM荧光信号，HEX表示HEX荧光信号，FAM&HEX表示FAM和HEX荧光信号。
实施例3、实施例2筛选的引物组1和引物组2的测试
一、AC菌和PSL菌以不同比例混合
1、模板的获得
将AC菌悬液6和PSL菌悬液混合(体积比见表4第1列)，得到混合菌悬液，即模板。
2、反应混合液的获得
将12μL引物对AC-2的上游引物(浓度为10mM)、15μL引物对AC-2的下游引物(浓度为10mM)、12μL引物对PSL-7的上游引物(浓度为10mM)和15μL引物对PSL-7的下游引物(浓度为10mM)混合，得到引物混合物a。
将12μL引物对AC-3的上游引物(浓度为10mM)、15μL引物对AC-3的下游引物(浓度为10mM)、12μL引物对PSL-7的上游引物(浓度为10mM)和15μL引物对PSL-7的下游引物(浓度为10mM)混合，得到引物混合物b。
将1体积份引物混合物(引物混合物a或引物混合物b)和72体积份1×LGC KASPMaster Mix混合，得到反应混合液。
3、LGC平台检测
样品为混合菌悬液、AC菌的基因组DNA(阳性对照1)、PSL菌的基因组DNA(阳性对照2)或水(阴性对照)。
采用LGC平台进行检测，具体步骤如下：
(1)取384孔板，每孔加入1.5μL样品，65℃烘干40min；然后加入3μL步骤2得到的反应混合液，封膜；最后将所述384孔板进行PCR扩增反应，得到反应产物。
反应程序：94℃15min；94℃20s，62℃-55℃30s(第1个循环62℃，之后每个循环降0.7℃)，10个循环；94℃20s，55℃1min，26个循环；4℃保存。
(2)使用荧光读取仪器读取反应产物的荧光信号，然后使用Cluster analysis软件进行聚类分析(如果聚类分析分组结果不明显，可将反应产物进行PCR加循环，直至聚类分析时聚群明显；每次加循环程序如下：94℃20s，55℃1min，3个循环)并进行如下判断：如果步骤(1)中反应产物只读取到FAM荧光信号(即只与阳性对照1聚群)，则相应的混合菌悬液中含有AC菌且不含有PSL菌；如果步骤(1)中反应产物只读取到HEX荧光信号(即只与阳性对照2聚群)，则相应的混合菌悬液中含有PSL菌且不含有AC菌；如果步骤(1)中反应产物同时读取到FAM和HEX荧光信号(即单独聚群，而不与阳性对照1、阳性对照2和阴性对照聚群)，则相应的混合菌悬液中含有PSL菌和AC菌；如果步骤(1)中反应产物无荧光信号(即与阴性对照聚群)，则相应的混合菌悬液中不含有AC菌和PSL菌。
部分实验结果见表4。
表4
AC菌悬液6和PSL菌悬液的体积比 引物组1 引物组2
1:1 FAM&HEX FAM&HEX
1:2 ND FAM&HEX
1:5 ND HEX
1:10 HEX HEX
2:1 ND FAM&HEX
5:1 ND FAM
10:1 FAM FAM
注：ND表示无法判断，FAM表示FAM荧光信号，HEX表示HEX荧光信号，FAM&HEX表示FAM和HEX荧光信号。
二、AC菌的基因组DNA和PSL菌的基因组DNA以不同比例混合
1、模板的获得
将AC菌的基因组DNA(浓度为10ng/μL)和PSL菌的基因组DNA(浓度为10ng/μL)混合(体积比见表5第1列)，得到混合溶液，即模板。
2、反应混合液的获得
将12μL引物对AC-3的上游引物(浓度为10mM)、15μL引物对AC-3的下游引物(浓度为10mM)、12μL引物对PSL-7的上游引物(浓度为10mM)和15μL引物对PSL-7的下游引物(浓度为10mM)混合，得到引物混合物b。将1体积份引物混合物b和72体积份1×LGC KASP MasterMix混合，得到反应混合液。
3、LGC平台检测
样品为混合溶液、AC菌的基因组DNA(阳性对照1)、PSL菌的基因组DNA(阳性对照2)或水(阴性对照)。
采用LGC平台进行检测，具体步骤如下：
(1)取384孔板，每孔加入1.5μL样品，65℃烘干40min；然后加入3μL步骤2得到的反应混合液，封膜；最后将所述384孔板进行PCR扩增反应，得到反应产物。
反应程序：94℃15min；94℃20s，62℃-55℃30s(第1个循环62℃，之后每个循环降0.7℃)，10个循环；94℃20s，55℃1min，26个循环；4℃保存。
(2)使用荧光读取仪器读取反应产物的荧光信号，然后使用Cluster analysis软件进行聚类分析(如果聚类分析分组结果不明显，可将反应产物进行PCR加循环，直至聚类分析时聚群明显；每次加循环程序如下：94℃20s，55℃1min，3个循环)并进行如下判断：如果步骤(1)中反应产物只读取到FAM荧光信号(即只与阳性对照1聚群)，则相应的混合溶液中含有AC菌的基因组DNA且不含有PSL菌的基因组DNA；如果步骤(1)中反应产物只读取到HEX荧光信号(即只与阳性对照2聚群)，则相应的混合溶液中含有PSL菌的基因组DNA且不含有AC菌的基因组DNA；如果步骤(1)中反应产物同时读取到FAM和HEX荧光信号(即单独聚群，而不与阳性对照1、阳性对照2和阴性对照聚群)，则相应的混合溶液中含有PSL菌的基因组DNA和AC菌的基因组DNA；如果步骤(1)中反应产物无荧光信号(即与阴性对照聚群)，则相应的混合溶液中不含有AC菌的基因组DNA和PSL菌的基因组DNA。
部分实验结果见表5。
表5
注：FAM表示FAM荧光信号，HEX表示HEX荧光信号，FAM&HEX表示FAM和HEX荧光信号。
结果表明，测试结果和预期结果完全符合。引物组2(由引物对AC-3和引物对PSL-7组成)的效果最好。
实施例4、带菌种子的灵敏度评估
一、带菌西瓜种子制备
取AC菌的菌悬液，加入无菌水，得到浓度为108CFU/mL的AC菌悬液6(OD600nm为0.15)。取PSL菌的菌悬液，加入无菌水，得到浓度为108CFU/mL的PSL菌悬液(OD600nm为0.15)。
1、取无菌西瓜种子，加入AC菌悬液6，28℃、120rpm摇培4h，然后风干，得到携带AC菌的西瓜种子。
2、取无菌西瓜种子，加入PSL菌悬液，28℃、120rpm摇培4h，然后风干，得到携带PSL菌的西瓜种子。
3、取无菌西瓜种子，加入PSL菌悬液和AC菌悬液6，28℃、120rpm摇培4h，然后风干，得到携带AC菌和PSL菌的西瓜种子。
二、待测西瓜种子的获得
1粒携带AC菌的西瓜种子，得到待测西瓜种子1。
将1粒携带AC菌的西瓜种子和9粒无菌西瓜种子混合，得到待测西瓜种子2。
将1粒携带AC菌的西瓜种子和99粒无菌西瓜种子混合，得到待测西瓜种子3。
将1粒携带AC菌的西瓜种子和499粒无菌西瓜种子混合，得到待测西瓜种子4。
1粒携带PSL菌的西瓜种子，得到待测西瓜种子5。
将1粒携带PSL菌的西瓜种子和9粒无菌西瓜种子混合，得到待测西瓜种子6。
将1粒携带PSL菌的西瓜种子和99粒无菌西瓜种子混合，得到待测西瓜种子7。
将1粒携带PSL菌的西瓜种子和499粒无菌西瓜种子混合，得到待测西瓜种子8。
1粒携带AC菌和PSL菌的西瓜种子，得到待测西瓜种子9。
将1粒携带AC菌和PSL菌的西瓜种子和9粒无菌西瓜种子混合，得到待测西瓜种子10。
将1粒携带AC菌和PSL菌的西瓜种子和99粒无菌西瓜种子混合，得到待测西瓜种子11。
将1粒携带AC菌和PSL菌的西瓜种子和499粒无菌西瓜种子混合，得到待测西瓜种子12。
取500粒无菌西瓜种子，得到待测西瓜种子13。
三、待测西瓜种子的浸提液的制备
待测西瓜种子为待测西瓜种子1、待测西瓜种子2、待测西瓜种子3、待测西瓜种子4、待测西瓜种子5、待测西瓜种子6、待测西瓜种子7、待测西瓜种子8、待测西瓜种子9、待测西瓜种子10、待测西瓜种子11、待测西瓜种子12或待测西瓜种子13。
磷酸钾缓冲液为含80.2mM K2HPO4和19.2mM KH2PO4的水溶液，pH值为7.4。
1、取锥形瓶，加入30g待测西瓜种子和100mL磷酸钾缓冲液，使用脉冲震荡样品前处理器(HKM shockmixer-1)以93次/s速度震荡15s，然后置于摇床，28℃、120rpm振荡培养4h。
2、完成步骤1后，取所述锥形瓶，剧烈震荡15s，将液相转移至离心管(规格为50mL)中，8000rpm离心10min，收集沉淀。
3、完成步骤2后，取沉淀，加入1mL灭菌水，充分溶解悬浮后，得到待测西瓜种子的浸提液。
四、反应混合液的获得
将12μL引物对AC-3的上游引物(浓度为10mM)、15μL引物对AC-3的下游引物(浓度为10mM)、12μL引物对PSL-7的上游引物(浓度为10mM)和15μL引物对PSL-7的下游引物(浓度为10mM)混合，得到引物混合物b。将1体积份引物混合物b和72体积份1×LGC KASP MasterMix混合，得到反应混合液。
五、LGC平台检测
样品为待测西瓜种子的浸提液、AC菌的基因组DNA(阳性对照1)、PSL菌的基因组DNA(阳性对照2)或水(阴性对照)。
采用LGC平台进行检测，具体步骤如下：
(1)取384孔板，每孔加入1.5μL样品，65℃烘干40min；然后加入3μL步骤2得到的反应混合液，封膜；最后将所述384孔板进行PCR扩增反应，得到反应产物。
反应程序：94℃15min；94℃20s，62℃-55℃30s(第1个循环62℃，之后每个循环降0.7℃)，10个循环；94℃20s，55℃1min，26个循环；4℃保存。
(2)使用荧光读取仪器读取反应产物的荧光信号，然后使用Cluster analysis软件进行聚类分析(如果聚类分析分组结果不明显，可将反应产物进行PCR加循环，直至聚类分析时聚群明显；每次加循环程序如下：94℃20s，55℃1min，3个循环)并进行如下判断：如果步骤(1)中反应产物只读取到FAM荧光信号(即只与阳性对照1聚群)，则相应的待测西瓜种子中携带AC菌且不携带PSL菌；如果步骤(1)中反应产物只读取到HEX荧光信号(即只与阳性对照2聚群)，则相应的待测西瓜种子中携带PSL菌且不携带AC菌；如果步骤(1)中反应产物同时读取到FAM和HEX荧光信号(即单独聚群，而不与阳性对照1、阳性对照2和阴性对照聚群)，则相应的待测西瓜种子中既携带PSL菌又携带AC菌；如果步骤(1)中反应产物无荧光信号(即与阴性对照聚群)，则相应的待测西瓜种子中既不携带PSL菌又不携带AC菌。
实验结果见表6中第2列。
按照上述步骤，将西瓜种子替换为甜瓜瓜子，其它步骤均不变。实验结果见表6中第4列。
结果表明，采用实施例2筛选的引物组2可以检测西瓜种子是否携带AC菌和/或PSL菌，且具有极高的灵敏度。
表6
待测西瓜种子1 FAM 待测甜瓜种子1 FAM
待测西瓜种子2 FAM 待测甜瓜种子2 FAM
待测西瓜种子3 FAM 待测甜瓜种子3 FAM
待测西瓜种子4 FAM 待测甜瓜种子4 FAM
待测西瓜种子5 HEX 待测甜瓜种子5 HEX
待测西瓜种子6 HEX 待测甜瓜种子6 HEX
待测西瓜种子7 HEX 待测甜瓜种子7 HEX
待测西瓜种子8 HEX 待测甜瓜种子8 HEX
待测西瓜种子9 FAM&HEX 待测甜瓜种子9 FAM&HEX
待测西瓜种子10 FAM&HEX 待测甜瓜种子10 FAM&HEX
待测西瓜种子11 FAM&HEX 待测甜瓜种子11 FAM&HEX
待测西瓜种子12 FAM&HEX 待测甜瓜种子12 FAM&HEX
待测西瓜种子13 N 待测甜瓜种子13 N
注：N表示无荧光信号，FAM表示FAM荧光信号，HEX表示HEX荧光信号，FAM&HEX表示FAM和HEX荧光信号。
<110> 北京市农林科学院
<120> 一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 898
<212> DNA
<213> 西瓜嗜酸菌（Acidovorax. citrulli）
<400> 1
tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagc gggttctgcc agaagtaggt agcctaaccg 60
taaggagggc gcttaccacg gcagggttcg tgactggggt gaagtcgtaa caaggtagcc 120
gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctggaaaa cagcattcaa tattgaacgc 180
ccacacttat cggttgttgg aagaagtcgg tgctaaccga catgggtctg tagctcagct 240
ggttagagca ccgtcttgat aaggcggggg tcgttggttc gagcccaact agacccacca 300
aatcttccga acataagatg cgaggatcag tgggggatta gctcagctgg gagagcacct 360
gctttgcaag cagggggtcg tcggttcgat cccgtcatcc tccaccaacc aatacgctct 420
gcggtagggc gaagaaacca acaccaaagc ggcttcgcga gaggcctctt tgttgttggt 480
ccggtataga ccggatcaat cggctgttct ttaaaaattc atagagtcga atcagcgttg 540
ccggcggaaa gcaggaaact gcaccgtgcc gccggtgaca aaaatttgat tgcgtcaaaa 600
cgaatattca attgagcgaa agcttgttga aattcagtaa tgacgaattg ttctctaggt 660
agctataccg aagaagaatt cacattacgg cataacgcgc gaggtgaaag acctcgcaag 720
tccttgaaag aaagcggaga tgtctcgcaa gagatgtcaa agttataggg tcaagtgact 780
aagagcatgt ggtggatgcc ttggcgatga taggcgacga aagacgtgat agcctgcgat 840
aagcttcggg gagctggcaa ataagctttg atccggggat ttctgaatgg ggaaaccc 898
<210> 2
<211> 681
<212> DNA
<213>丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病变种（Pseudomonas syringae pv.lachrymans）
<400> 2
gccgacctgc cgtgggctgc ccacaagatc gacgtggtat tcgaatgcac cggtctgttc 60
accgaccgtg acaaggctgc cgcccatatt accgccggcg cgcgcaaggt gatcatttct 120
gcaccggcca aaggtgcgga cgccaccgtg gtctacggtg tgaaccatga cattctgcgc 180
caatcccacc agatcatctc caacgcctcg tgcaccacca actgcctggc gccggtcgcc 240
caggtactgc accgcgaact gggcatcgaa agcggcctga tgaccaccat ccatgcctac 300
accaatgacc agaacctgac cgacgtctac cacaccgacc cataccgtgc gcgttcggcc 360
acccagaaca tgatcccgag caagaccggc gccgccgaag cggtcggcct ggtgctgccg 420
gaactggcgg gcaagctgac tggcatggcg gtgcgcgtac cggtgatcaa cgtatcgctg 480
gtggacctca cggtgaccct gaaaaaagag gcaacagccg aagaagtcaa cgcgctgctc 540
aaggaagcca gccaacattc gaagatcctc ggctacaaca ccctgccgct ggtttccagc 600
gacttcaacc acaacccgtt gtcgtcgatc ttcgacgcca atcacaccaa ggtcagcggc 660
aaattgctca aggtactggc g 681
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gaaggtcgga gtcaacggat tcgcccgtca caccatggg 39
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gtcacgaacc ctgccgtggt 20
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc tgcgacttca accacaaccc g 41
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
ttgccgctga ccttggtgtg att 23

Claims (10)

1.引物对组合，包括引物对AC-3和引物对PSL-7；
所述引物对AC-3由引物AC-F和引物AC-R组成；所述引物对AC-3的靶序列含有特异DNA片段甲；所述特异DNA片段甲为如下y1)或y2)：
y1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
y2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物对PSL-7由引物PSL-F和引物PSL-R组成；所述引物对PSL-7的靶序列含有特异DNA片段乙；所述特异DNA片段乙为如下z1)或z2)：
z1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
z2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
2.如权利要求1所述引物对组合，其特征在于：
所述引物对AC-3中一条引物的5’末端含有接头序列甲；
所述引物对PSL-7中一条引物的5’末端含有接头序列乙；
接头序列甲和接头序列乙可结合不同的信号基团。
3.如权利要求2所述引物对组合，其特征在于：
所述接头序列甲的核苷酸序列如序列表中序列3自5’末端起第1至21位所示；所述接头序列甲结合FAM信号基团；
所述接头序列乙的核苷酸序列如序列表中序列5自5’末端起第1至22位所示；所述接头序列乙结合HEX信号基团。
4.如权利要求1至3任一所述引物对组合，其特征在于：
所述引物AC-F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物AC-R为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
b2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物PSL-F为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列5所示的单链DNA分子；
c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物PSL-R为如下d1)或d2)：
d1)序列表中序列6所示的单链DNA分子；
d2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子。
5.权利要求1至4任一所述引物对组合中的引物对AC-3。
6.权利要求1至4任一所述引物对组合中的引物对PSL-7。
7.试剂盒甲或试剂盒乙或试剂盒丙：
所述试剂盒甲含有权利要求1至4任一所述引物对组合；
所述试剂盒乙含有权利要求5所述引物对AC-3；
所述试剂盒丙含有权利要求6所述引物对PSL-7。
8.e1)至e12)中的至少一种：
e1)权利要求1至4任一所述引物对组合在制备检测瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌的试剂盒中的应用；
e2)权利要求5所述引物对AC-3在制备检测瓜类细菌性果斑病菌的试剂盒中的应用；
e3)权利要求6所述引物对PSL-7在制备检测瓜类细菌性角斑病菌的试剂盒中的应用；
e4)权利要求1至4任一所述引物对组合或权利要求7所述试剂盒甲在检测瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌中的应用；
e5)权利要求5所述引物对AC-3或权利要求7所述试剂盒乙在检测瓜类细菌性果斑病菌中的应用；
e6)权利要求6所述引物对PSL-7或权利要求7所述试剂盒丙在检测瓜类细菌性角斑病菌中的应用；
e7)权利要求1至4任一所述引物对组合或权利要求7所述试剂盒甲在检测待测样品中是否含有或疑似含有瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌中的应用；
e8)权利要求5所述引物对AC-3或权利要求7所述试剂盒乙在检测待测样品中是否含有或疑似含有瓜类细菌性果斑病菌中的应用；
e9)权利要求6所述引物对PSL-7或权利要求7所述试剂盒丙在检测待测样品中是否含有或疑似含有瓜类细菌性角斑病菌中的应用；
e10)权利要求1至4任一所述引物对组合或权利要求7所述试剂盒甲在检测待测菌是否为候选的瓜类细菌性果斑病菌或角斑病菌中的应用；
e11)权利要求5所述引物对AC-3或权利要求7所述试剂盒乙在检测待测菌是否为候选的瓜类细菌性果斑病菌中的应用；
e12)权利要求6所述引物对PSL-7或权利要求7所述试剂盒丙在检测待测菌是否为候选的瓜类细菌性角斑病菌中的应用。
9.f1)或f2)或f3)：
f1)检测待测菌是否为瓜类细菌性果斑病菌或角斑病菌的方法一，包括如下步骤：
(1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用权利要求1至4任一所述引物对组合进行PCR扩增，得到反应产物；
(2)读取反应产物的荧光信号，然后进行如下判断：
①如果仅读取到接头序列甲结合的信号基团的荧光信号，待测菌为或候选为瓜类细菌性果斑病菌；
②如果仅读取到接头序列乙结合的信号基团的荧光信号，待测菌为或候选为瓜类细菌性角斑病菌；
f2)检测待测菌是否为瓜类细菌性果斑病菌或角斑病菌的方法二，包括如下步骤：
(1)以瓜类细菌性果斑病菌的基因组DNA、瓜类细菌性角斑病菌的基因组DNA或待测菌的基因组DNA为模板，采用权利要求1至4任一所述引物对组合进行PCR扩增，得到反应产物；
(2)读取反应产物的荧光信号，进行聚类分析，然后进行如下判断：
①如果待测菌的基因组DNA的反应产物仅和瓜类细菌性果斑病菌的基因组DNA的反应产物聚群，待测菌为或候选为瓜类细菌性果斑病菌；
②如果待测菌的基因组DNA的反应产物仅和瓜类细菌性角斑病菌的基因组DNA的反应产物聚群，待测菌为或候选为瓜类细菌性角斑病菌；
f3)检测待测菌是否为瓜类细菌性果斑病菌或角斑病菌的方法三，包括如下步骤：检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列1或序列2所示的DNA区段，然后进行如下判断：
①如果含有序列表中序列1所示的DNA区段，待测菌为或候选为瓜类细菌性果斑病菌；
②如果含有序列表中序列2所示的DNA区段，待测菌为或候选为瓜类细菌性角斑病菌。
10.g1)或g2)：
g1)检测待测瓜类种子上是否携带瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌的方法一，包括如下步骤：
(1)以待测瓜类种子的浸提液为模板，采用权利要求1至4任一所述引物对组合进行PCR扩增，得到反应产物；
(2)读取反应产物的荧光信号，然后进行如下判断：
①如果仅读取到接头序列甲结合的信号基团的荧光信号，则待测瓜类种子上携带瓜类细菌性果斑病菌；
②如果仅读取到接头序列乙结合的信号基团的荧光信号，则待测瓜类种子上携带瓜类细菌性角斑病菌；
③如果读取到接头序列甲结合的信号基团的荧光信号和接头序列乙结合的信号基团的荧光信号，则待测瓜类种子上携带瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌；
④如果读取不到荧光信号，则待测瓜类种子上不携带瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌；
g2)检测瓜类种子上是否携带瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌的方法二，包括如下步骤：
(1)以瓜类细菌性果斑病菌的基因组DNA、瓜类细菌性角斑病菌的基因组DNA、水或待测瓜类种子的浸提液为模板，采用权利要求1至4任一所述引物对组合进行PCR扩增，得到反应产物；
(2)读取反应产物的荧光信号，进行聚类分析，然后进行如下判断：
①如果待测样品的反应产物仅和瓜类细菌性果斑病菌的基因组DNA的反应产物聚群，则待测瓜类种子上携带瓜类细菌性果斑病菌；
②如果待测样品的反应产物仅和瓜类细菌性角斑病菌的基因组DNA的反应产物聚群，则待测瓜类种子上携带瓜类细菌性角斑病菌；
③如果待测样品的反应产物不与瓜类细菌性果斑病菌的基因组DNA、瓜类细菌性角斑病菌的基因组DNA和水的反应产物聚群，则待测瓜类种子上携带瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌；
④如果待测样品的反应产物仅和水的反应产物聚群，则待测瓜类种子上不携带瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌。
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