CN110607399A - 用于lamp扩增以检测hpv和分型的引物组合、试剂盒和方法 - Google Patents

用于lamp扩增以检测hpv和分型的引物组合、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的引物组合，包括用于检测HPV感染的第一通用引物组和/或第二通用引物组，以及任意一组或者几组用于检测HPV亚型的特异性引物组HPV16E6、特异性引物组HPV18E6、特异性引物组HPV31E6、特异性引物组HPV33E7、特异性引物组HPV35E6、特异性引物组HPV39E6、特异性引物组HPV45E7、特异性引物组HPV51E6E7、特异性引物组HPV52E6E7、特异性引物组HPV56E6、特异性引物组HPV58E6、特异性引物组HPV59E6、特异性引物组HPV66E6、特异性引物组HPV68E6、特异性引物组HPV73E6E7，采用上述引物组合检测HPV的亚型，检测结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中HPV的亚型进行快速检测，效率高。

Description

用于LAMP扩增以检测HPV和分型的引物组合、试剂盒和方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的引物组合、试剂盒和方法。
背景技术
据世界范围的统计，宫颈癌是导致女性死亡的第二大癌症，每年死于宫颈癌的妇女约有27万，其中绝大部分宫颈癌的产生都与人乳头瘤病毒感染(Human papillomavirus；HPV)有关，同时长期持续性的感染高危亚型HPV病毒是引起宫颈癌的主要原因，而HPV16和HPV18是最致癌的HPV病毒亚型，分别约占全球宫颈癌病例的50％和20％，HPV高危亚型的检测对于女性宫颈癌的早期筛查和治疗非常重要。传统的女性宫颈癌的早期筛查主要是依靠细胞学检查，在宫颈细胞取样过程中容易使得病变细胞脱离，制片过程也极易使得细胞形态发生变化或者被其它炎症细胞和血细胞覆盖，同时结果判定太依靠于个人主观判定，因此很容易发生疾病漏诊。
为此，研发人员更多地关注于HPV基因组的分子检测技术以提高检测准确性，例如，中国专利文献CN10102485912A中公开了一种多重PCR技术用于人乳头瘤病毒HPV检测和分型的研究，通过对常见的HPV6、HPV33、HPV31、HPV52、HPV11五种高危亚型，分别设计特异引物，利用多重PCR技术扩增，最终鉴别是何种分型的HPV感染，然而，因HPV基因检测技术不仅需要提取人离体样品的基因组，还需要体外PCR扩增以及检测，其检测过程复杂，周期较长，对环境和仪器设备依靠性高。此外，该专利文献中涉及或优化的引物也存在特异性差的问题，造成检测的灵敏度和准确性低下。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种用于环等温扩增(LAMP扩增)以检测HPV和分型的引物组合，采用所述引物组检测HPV的亚型，检测结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中HPV的亚型进行快速检测，效率高。
本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的引物组合的试剂盒，采用所述试剂盒检测HPV的亚型，检测结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中HPV的亚型进行快速检测，效率高。
本发明要解决的第三个技术问题在于提供一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的引物组合的方法，采用所述方法检测HPV的亚型，检测结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中HPV的亚型进行快速检测，效率高。
本发明提供了一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的引物组合，包括用于检测HPV感染的第一通用引物组和/或第二通用引物组，以及任意一组或者几组用于检测HPV亚型的特异性引物组HPV16E6、特异性引物组HPV18E6、特异性引物组HPV31E6、特异性引物组HPV33E7、特异性引物组HPV35E6、特异性引物组HPV39E6、特异性引物组HPV45E7、特异性引物组HPV51E6E7、特异性引物组HPV52E6E7、特异性引物组HPV56E6、特异性引物组HPV58E6、特异性引物组HPV59E6、特异性引物组HPV66E6、特异性引物组HPV68E6、特异性引物组HPV73E6E7；
所述第一通用引物组的正向外引物序列如SEQ ID No：1所示；反向外引物序列如SEQ ID No：2所示；正向内引物序列如SEQ ID No：3所示；反向内引物序列如SEQ ID No：4所示；
所述第二通用引物组的正向外引物序列如SEQ ID No：5所示；反向外引物序列如SEQ ID No：6所示；正向内引物序列如SEQ ID No：7所示；反向内引物序列如SEQ ID No：8所示；
所述特异性引物组HPV16E6的正向外引物序列如SEQ ID No：9所示；反向外引物序列如SEQ ID No：10所示；正向内引物序列如SEQ ID No：11所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：12所示；
所述特异性引物组HPV18E6的正向外引物序列如SEQ ID No：13所示；反向外引物序列如SEQ ID No：14所示；正向内引物序列如SEQ ID No：15所示；反向内引物序列如SEQID No：16所示；
所述特异性引物组HPV31E6的正向外引物序列如SEQ ID No：17所示；反向外引物序列如SEQ ID No：18所示；正向内引物序列如SEQ ID No：19所示；反向内引物序列如SEQID No：20所示；
所述特异性引物组HPV33E7的正向外引物序列如SEQ ID No：21所示；反向外引物序列如SEQ ID No：22所示；正向内引物序列如SEQ ID No：23所示；反向内引物序列如SEQID No：24所示；
所述特异性引物组HPV35E6的正向外引物序列如SEQ ID No：25所示；反向外引物序列如SEQ ID No：26所示；正向内引物序列如SEQ ID No：27所示；反向内引物序列如SEQID No：28所示；
所述特异性引物组HPV39E6的正向外引物序列如SEQ ID No：29所示；反向外引物序列如SEQ ID No：30所示；正向内引物序列如SEQ ID No：31所示；反向内引物序列如SEQID No：32所示；
所述特异性引物组HPV45E7的正向外引物序列如SEQ ID No：33所示；反向外引物序列如SEQ ID No：34所示；正向内引物序列如SEQ ID No：35所示；反向内引物序列如SEQID No：36所示；
所述特异性引物组HPV51E6E7的正向外引物序列如SEQ ID No：37所示；反向外引物序列如SEQ ID No：38所示；正向内引物序列如SEQ ID No：39所示；反向内引物序列如SEQID No：40所示；
所述特异性引物组HPV52E6E7的正向外引物序列如SEQ ID No：41所示；反向外引物序列如SEQ ID No：42所示；正向内引物序列如SEQ ID No：43所示；反向内引物序列如SEQID No：44所示；
所述特异性引物组HPV56E6的正向外引物序列如SEQ ID No：45所示；反向外引物序列如SEQ ID No：46所示；正向内引物序列如SEQ ID No：47所示；反向内引物序列如SEQID No：48所示；
所述特异性引物组HPV58E6的正向外引物序列如SEQ ID No：49所示；反向外引物序列如SEQ ID No：50所示；正向内引物序列如SEQ ID No：51所示；反向内引物序列如SEQID No：52所示；
所述特异性引物组HPV59E7的正向外引物序列如SEQ ID No：53所示；反向外引物序列如SEQ ID No：54所示；正向内引物序列如SEQ ID No：55所示；反向内引物序列如SEQID No：56所示；
所述特异性引物组HPV66E6的正向外引物序列如SEQ ID No：57所示；反向外引物序列如SEQ ID No：58所示；正向内引物序列如SEQ ID No：59所示；反向内引物序列如SEQID No：60所示；
所述特异性引物组HPV68E6的正向外引物序列如SEQ ID No：61所示；反向外引物序列如SEQ ID No：62所示；正向内引物序列如SEQ ID No：63所示；反向内引物序列如SEQID No：64所示；
所述特异性引物组HPV73E6E7的正向外引物序列如SEQ ID No：65所示；反向外引物序列如SEQ ID No：66所示；正向内引物序列如SEQ ID No：67所示；反向内引物序列如SEQID No：68所示。
进一步地，所述HPV亚型为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68和HPV73中的一种或者几种。
本发明提供了一种上述所述的引物组合的设计方法，包括如下步骤：
(1)通过NCBI网站查找全部的HPV病毒亚型的基因序列和全部HPV高危亚型变异株病毒的基因序列；HPV病毒亚型包括HPV高危病毒亚型和HPV低危病毒亚型；
(2)采用DNAMAN软件分别将上述每个HPV高危病毒亚型的基因序列与全部的HPV病毒亚型的基因序列一一进行对比，同时也将上述每个HPV高危病毒亚型的基因序列和其对应亚型的HPV高危亚型变异株病毒的基因序列一一进行对比，找出每个HPV高危病毒亚型的保守序列；
(3)采用Vector NTI 10软件将上述全部的HPV病毒亚型的基因序列进行相互对比，找出所有HPV病毒亚型的通用序列；
(4)综合每个HPV高危病毒亚型的保守序列和所有HPV病毒亚型的通用序列依靠SnapGene软件分析设计出针对全部的HPV病毒亚型的通用引物组和针对每个HPV高危病毒亚型的特异性引物组。
本发明提供了一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组合。
进一步地，各条引物单独包装。
进一步地，所述试剂盒包括如下检测组分：
试剂 用量/μL 浓度
MgSO<sub>4</sub> 1.5 50mM/L
dNTP混合液 3.5 10mM/L
正向外引物(FIP) 1 40μM/L
反向外引物(BIP) 1 40μM/L
正向内引物 0.5 10μM/L
反向内引物 0.5 10μM/L
Bst 2.0DNA聚合酶 1 8000U/ml
dH<sub>2</sub>O 12.5
模板DNA 1 ≥100拷贝数/μL
含酚红的Tric-HCL反应缓冲液 2.5 10X
总共 25
本发明还提供了一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的方法，所述方法包含通过LAMP方法利用所述的引物组合，或者上述任一所述的试剂盒进行核酸扩增反应。
进一步地，所述的方法包括如下步骤：
(1)提取待检样品中的DNA，得DNA模板；
(2)取步骤(1)提取的DNA模板，分别采用所述通用引物组合和特异性引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增；
(3)检测扩增产物，如果采用所述通用引物组合中的任一引物组可以实现所述DNA模板的特异性扩增，则待检样品有HPV病毒；
如果采用特异性引物组合中的一组或者多组引物组可以实现所述DNA模板的特异性扩增，则待检样品有相应的特异性引物组对应的一种或者多种HPV病毒亚型。
本发明还提供了一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的微流控芯片，所述微流控芯片为恒温扩增微流控芯片。
进一步地，所述微流控芯片包括质控反应区和若干特异性反应区，所述质控反应区和若干特异性反应区沿流体流动方向均各自包括LAMP反应液进样孔、混合室和LAMP扩增反应室，各个所述特异性反应区的混合室和LAMP扩增反应室单独设置且多个特异性反应区共用一个LAMP反应液进样孔；所述LAMP反应液进样孔和混合室之间以及混合室与LAMP扩增反应室之间通过微流控通道相互连通，各个所述特异性反应区位于所述混合室与LAMP反应液进样孔之间的微流控通道上均设置有门阀；所述混合室位于LAMP反应液进样孔的一侧还设置有引物进样孔。
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明提供了一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的引物组合，基于从NCBI上查找的全部的HPV病毒亚型的基因序列和全部HPV高危亚型变异株病毒的基因序列进行对比，找出每个HPV亚型的保守序列和通用序列，设计得到15组分别针对每个高危病毒亚型的特异性引物组和2组针对全部的HPV病毒亚型的通用引物组，其中通用引物组可以将所有的HPV病毒亚型扩增出来，具有良好的通用性和简并性，特异性引物组不仅能够对所有的HPV高危病毒亚型进行鉴别，而且能够区分不同高危亚型的HPV病毒，具有良好的特异性、灵敏度高，检测结果准确、稳定、可靠，此外因所有引物的LAMP扩增产物仅为200～320bp，分子量小，保证了其在短时间内进行大量的样品鉴定。
(2)本发明提供了一种引物组合的设计方法，现有技术中通常采用PrimerExplor5软件设计基因引物，不仅需要先获取准确的HPV基因序列，而且PrimerExplor软件仅能够对一组HPV基因序列设计一组引物，而无法在众多HPV亚型的基因序列、HPV变异株的基因序列以及其他类似株序列之间进行比较以区分出HPV基因序列的保守区和通用区，致使所设计的引物组特异性较差，准确率低，容易导致一组引物可以扩增出多个亚型的HPV病毒，无法准确确定HPV病毒的型号，同时，在设计通用引物组时，由于不能区分所有的HPV病毒的保守区和通用区，需要设计多对引物，然后进行实验摸索以得到合适的通用引物，耗时耗力。
而本发明先通过数据库例如NCBI网站下载全部的HPV病毒亚型的基因序列和全部HPV高危亚型变异株病毒的基因序列，然后采用DNAMAN软件分别将上述每个HPV高危病毒亚型的基因序列与全部的HPV病毒亚型的基因序列一一进行对比，同时也将上述每个HPV高危病毒亚型的基因序列和其对应亚型的HPV高危亚型变异株病毒的基因序列一一进行对比，找出每个HPV高危病毒亚型的保守序列；采用Vector NTI 10软件将上述全部的HPV病毒亚型的基因序列进行相互对比，找出所有HPV病毒亚型的通用序列；综合每个HPV高危病毒亚型的保守序列和所有HPV病毒亚型的通用序列依靠SnapGene软件分析设计出针对全部的HPV病毒亚型的通用引物组和针对每个HPV高危病毒亚型的特异性引物组，避免了分型引物交叉验证中出现一组引物扩增出多个HPV病毒亚型的情况，能够极大程度上提高检测的准确性和引物特异性，且提高了通用引物的通用性和简并性，不需要设计多对引物进行最合适引物摸索，节约了时间和人力成本。
(3)本发明提供了一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的方法，通过采用LAMP技术，依靠6个区设计4条引物，相比于现有的PCR技术，具有更高的特异性，更适合于对具有众多亚型结构的HPV基因进行检测和分型，而且LAMP扩增反应不仅温控简便，只需要在65℃左右60分钟扩增反应就可以将目的基因信号放大，以达到检测目的，大大缩短了检测的时间和减少对设备依赖性，而且检测结果不要再次验证，只需要一步反应就可以通过颜色变化来判定结果，不需要过多的对样品进行操作而引进污染，因此，本发明提供的HPV检测和分型的方法具有操作简单，便捷，不易污染的优点。
(4)本发明提供了一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的微流控芯片，在LAMP检测基础上，加入了含有高精度检测型传感器的微流控芯片，使得检测更为简单直观一体化，同时依靠高精微型传感器对反应结果进行判定，大大减少了个人主观性，增大了检测的准确性；同时芯片设计结构紧凑且独立，各门阀密闭，大大减少反应过程中扩增产物或者试管反应气溶胶的污染，检测结果准确、稳定、可靠、灵敏度高。
(5)本发明提供了一种LAMP扩增以检测基因分型的微流控芯片，通过若干特异性反应区和质控反应区，所述特异性反应区和质控反应区沿流体流动方向均各自包括LAMP反应液进样孔、混合室和LAMP扩增反应室，所述LAMP反应液进样孔和混合室之间以及混合室与LAMP扩增反应室之间均通过微流控通道相互连通，使得所述特异性反应区和质控反应区彼此之间不会干扰，检测结果准确，而且通过多个所述特异性反应区共用一个LAMP反应液进样孔不仅使得微流控芯片结构紧凑，体积小，而且能够简化操作，提高效率，缩短检测时间，而且结合多个所述特异性反应区的引物进样孔、混合室和LAMP扩增反应室均各自设置使得反应检测的准确性几乎不会受到影响，此外，也尽可能减少了微流道的设置，降低样品在微流道中残留引起反应过程中扩增产物或气溶胶的污染，提高了检测的准确性，同时因各个所述特异性反应区位于所述混合室与LAMP反应液进样孔之间的微流控通道上均设置有门阀，使得各特异性反应区的混合室和反应液进样孔通过门阀相互隔离，避免了从引物进样孔进入混合室的特异性引物污染反应液进样孔从而干扰其他混合室的情况发生，使得各组特异性引物的扩增反应相对独立进行，大大降低了样品污染和65℃下气溶胶污染的发生，从而提高了检测的准确性和特异性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4中提供的一个具体实施方式的微流控芯片的结构示意图；
图2为本发明实施例4中提供的一个具体实施方式的混合室和LAMP扩增反应室的结构示意图；
图3为本发明实施例4中提供的一个具体实施方式的LAMP扩增反应室的结构示意图；
附图标记说明：
1、光感元件；2、微型恒温加热器；3、LAMP反应液进样孔；4、分流道；5、门阀；6、微流控通道；7、引物进样孔；8、混合室；9、LAMP扩增反应室；10、排液阀；11、排液口；12、反应槽；13、指示器；S、特异性反应区；T、通用反应区；N、阳性对照反应区；P、阴性对照反应区。
具体实施方式
本发明所使用的主要样品和试剂如下：
待测样品，某三级甲等医院提供的HPV病毒组织液，批号分别为如下，
HPV16单独感染的HPV病毒组织液：6929957、HPV18单独感染的HPV病毒组织液：6968975、HPV31单独感染的HPV病毒组织液：6933726、HPV33单独感染的HPV病毒组织液：6636293、HPV35单独感染的HPV病毒组织液：6933251、HPV39单独感染的HPV病毒组织液：6962770、HPV45单独感染的HPV病毒组织液：1100599681、HPV51单独感染的HPV病毒组织液：6953118、HPV52单独感染的HPV病毒组织液：6932668、HPV56单独感染的HPV病毒组织液：6930113、HPV单独感染的HPV病毒组织液：6928750、HPV59单独感染的HPV病毒组织液：6932252、HPV66单独感染的HPV病毒组织液：6896880、HPV68单独感染的HPV病毒组织液：6851610、HPV73单独感染的HPV病毒组织液：6962890；HPV18和HPV56双重感染的HPV病毒组织液：6968975、HPV16和HPV52双重感染的HPV病毒组织液：6962528、HPV39和HPV42双重感染的HPV病毒组织液：1007109845、HPV11和HPV52双重感染的HPV病毒组织液：6932668、HPV52和HPV44双重感染的HPV病毒组织液：6938690、HPV51和HPV58双重感染的HPV病毒组织液：6928750、HPV39和HPV52双重感染的HPV病毒组织液：6929365、HPV31和HPV42双重感染的HPV病毒组织液：6967906、HPV59和HPV66双重感染的HPV病毒组织液：6953333、HPV18和HPV39双重感染的HPV病毒组织液：6610528；HPV31 and HPV53和HPV42多重感染的HPV病毒组织液：6750127；HPV18 and HPV51和HPV59多重感染的HPV病毒组织液：6933786；HPV52and HPV56和HPV43 and HPV81多重感染的HPV病毒组织液：1007093830；
阴性引物对照品和阳性引物对照品为：HPV高危病毒亚型标准品为人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品，由中国食品药品检定研究院提供；
空白引物对照品为：无菌纯水。
实施例1用于LAMP扩增以检测HPV和分型的引物组合的设计和制备
(1)人乳头瘤病毒亚型和人乳头瘤病毒变异株的L1区、E6区、E7区基因序列的获得：从NCBI网站下载全部的HPV病毒亚型和全部HPV高危亚型变异株病毒的L1区、E6区、E7区的基因序列。HPV病毒包括HPV高危病毒亚型和HPV低危病毒亚型，HPV高危病毒亚型包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68和HPV73；HPV低危病毒亚型包括HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV81和HPV71。HPV高危病毒亚型变异株包括但不局限于HPV16E；HPV16As；HPV16AA；HPV16Af1；HPV16Af2；HPV16NA1；HPV18E；HPV18A；HPV18AA。
(2)采用DNAMAN软件分别将上述从NCBI网站下载得到HPV亚型中的每一个HPV病毒亚型的基因序列与其他的HPV病毒亚型的基因序列一一进行对比，同时也将上述每一个HPV病毒亚型的基因序列和上述HPV病毒变异株的基因序列一一进行对比，找出每个HPV病毒亚型的保守序列；并采用Vector NTI 10软件将上述从NCBI网站下载得到HPV亚型的基因序列中的每一个HPV病毒亚型的基因序列与其对应的HPV病毒变异株的基因序列一一进行对比，找出每个HPV病毒亚型的通用序列；将上述保守序列和通用序列导入引物设计软件SnapGene软件中，将导入序列人为划分成F3、F2、F1、B1、B2、B3六个区设计四条引物，得到特异性引物组和通用引物组。
在针对全部的HPV病毒亚型的通用区中设计通用引物时，选择尽可能兼容所有HPV病毒亚型的基因序列同时要求相对于其它每个亚型的HPV病毒序列错配数3个或3个以下的序列作为通用引物。
在针对高危HPV病毒亚型的保守序列中选择特异性引物时，选择能避开其它HPV病毒通用序列同时包含其所有变异株的通用序列且不存在1个错配序列作为特异性引物组，见表1所示。
(3)将下表1的通用引物和特异性引物序列委托生物工程(上海)股份有限公司合成，备用。
表1引物序列表
其中，第一通用引物和第二通用引物的引物序列选择HPV基因的L1区域核酸序列；
特异性引物组HPV16E6、特异性引物组HPV18E6、特异性引物组HPV31E6、特异性引物组HPV35E6、特异性引物组HPV39E6、特异性引物组HPV56E6、特异性引物组HPV58E6、特异性引物组HPV59E6、特异性引物组HPV66E6、特异性引物组HPV68E6分别选择相应的HPV基因亚型的E6区域核酸序列；
特异性引物组HPV33E7、特异性引物组HPV45E7分别选择相应的HPV基因亚型的E7区域核酸序列；
特异性引物组HPV51E6E7、特异性引物组HPV52E6E7、特异性引物组HPV73E6E7分别选择相应的HPV基因亚型的E6和E7区域核酸序列。
实施例2用于LAMP扩增以检测HPV和分型的试剂盒的制备和使用
本实施例提供了一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的引物组合的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和LAMP反应液；所述引物液为包含实施例1中一组通用引物组或者一组特异性引物组的Tris HCl溶液(含1mmol/L EDTA，PH8)，每条引物均单独包装、四条引物构成一组通用引物组或者特异性引物组；所述LAMP反应液含有用于进行LAMP扩增的扩增缓冲液、dNTPs、Bas 2.0 DNA聚合酶以及无菌超纯水，每支所述试剂盒的配方为：
其中，含酚红的Tric-HCL反应缓冲液的母液为10倍体系(10X)，反应液为1倍体系(1X)，含酚红的Tric-HCL反应缓冲液的母液中包含200mMTric-HCL，100mM、(NH4)2SO4、20mMMgSO4、1％Tween 20、1％酚红。
实施例3用于LAMP扩增以检测HPV和分型的方法
本实施例提供了一种利用实施例1的引物组合或实施例2的试剂盒用于LAMP扩增以检测HPV和分型的方法，包括如下步骤：
(1)DNA提取
将人离体HPV病毒组织液100μL加入到含有300μL裂解液的试管中，65℃水浴2h。其中，裂解液的组分含有10mM Tis-Cl(PH 8.0)，15mM NaCl，10mM EDTA(PH 8.0)，0.4％SDS，200μg/ml蛋白酶K(使用前加入)。在上述溶液中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，冰上静置15min后，1200rmp离心5min，弃去上清液，加入1ml 75vt％的乙醇水溶液，室温下放置2min，然后离心3min，弃去上清液，通风台吹干，然后加入30μL去RNA酶水，得DNA模板。
(2)LAMP扩增
以步骤(1)中提取的DNA为模板，分别采用实施例1中的各组引物组进行LAMP扩增。
其中，所述LAMP反应体系包括：
所述LAMP扩增程序如下：
65℃恒温反应1h。
(3)由于在LAMP扩增反应液体中加入了酚红，Bst2.0 DNA聚合酶参与LAMP扩增反应产生更多的H+，使得反应液PH值下降，酚红由粉红色变成橙色，因此可以依靠反应液体颜色的明显变化作为结果判定，具体地，若采用第一通用引物组和/或第二通用引物组扩增过程中，反应液颜色由粉红色变成橙色，则为阳性反应，说明待检样品感染HPV；反之则为阴性反应，无感染；若采用特异性引物组合中的一条或者多条引物组可以实现所述DNA模板的特异性扩增，反应液颜色由粉红色变成橙色，则发生颜色变化的待检样品为阳性反应，其余未变化的为阴性反应，该样品感染相应的一种或者多种HPV亚型，例如若采用引物组HPV18E6和引物组HPV45E7分别进行扩增的过程中，反应液颜色均由粉红色变成橙色，则说明待检样品同时感染HPV18和HPV45。
其中，分别采用特异性引物组HPV16E6、特异性引物组HPV18E6、特异性引物组HPV31E6、特异性引物组HPV33E7、特异性引物组HPV35E6、特异性引物组HPV39E6、特异性引物组HPV45E7、特异性引物组HPV51E6E7、特异性引物组HPV52E6E7、特异性引物组HPV56E6、特异性引物组HPV58E6、特异性引物组HPV59E6、特异性引物组HPV66E6、特异性引物组HPV68E6、特异性引物组HPV73E6E7、第一通用引物组、第二通用引物组扩增的核苷酸序列如SEQ ID NO：69-85所示。
实施例4用于LAMP扩增以检测HPV和分型的微流控芯片
本实施例提供了一种用于HPV检测和分型的微流控芯片，如图1所示，包括质控反应区和特异性反应区S，本实施例中质控反应区包括阳性对照反应区N、阴性对照反应区P和通用反应区T，分别用来供阳性对照引物、阴性引物对照品、通用引物分别与待测样品的DNA模板进行LAMP扩增反应。特异性反应区S设置有多个，如图1所示，本实施例中设置有5个特异性反应区S，分别用于引入5种特异性引物发生LAMP扩增反应，例如引入的5种特异性引物可以是特异性引物组HPV16E6、特异性引物组HPV18E6、特异性引物组HPV31E6、特异性引物组HPV35E6和特异性引物组HPV39E6，可以同时检测待测样品是否感染HPV16、HPV18、HPV31、HPV35和HPV39，共5种HPV高危亚型病毒。
多个所述特异性反应区S的微流控通道6沿LAMP反应液进样孔3的直径呈轴对称分布，使得流体的流动更加稳定，降低反应的系统误差。
特异性反应区S、阳性对照反应区N、阴性对照反应区P和通用反应区T沿流体流动方向均包括各自的LAMP反应液进样孔3、混合室8和LAMP扩增反应室9，使得所述特异性反应区S和质控反应区彼此之间不会干扰，检测结果准确。具体地，通过LAMP反应液进样孔3可以将LAMP反应液加入微控流芯片，所述混合室8位于LAMP反应液进样孔3的一侧还设置有引物进样孔7，通过引物进样孔7可以将特异性引物或者其他引物加入微控流芯片，混合室8的设置使得特异性引物或其他引物(液体或者固体粉末)分别与LAMP反应液混合均匀。所述LAMP反应液进样孔3和混合室8之间以及混合室8与LAMP扩增反应室9之间均通过微流控通道6相互连通，多个所述特异性反应区S的混合室8和LAMP扩增反应室9单独设置且多个所述特异性反应区S共用一个LAMP反应液进样孔3，不仅使得微流控芯片结构紧凑，体积小，而且能够简化操作，提高效率，缩短检测时间，而且结合多个所述特异性反应区S的引物进样孔7、混合室8和LAMP扩增反应室9均各自设置使得反应检测的准确性几乎不会受到影响，此外，也尽可能减少了微流道的设置，降低样品在微流道中残留引起反应过程中扩增产物或气溶胶的污染，提高了检测的准确性。各个所述特异性反应区S位于所述混合室8与LAMP反应液进样孔3之间的微流控通道6上均设置有门阀5，使得每个反应区的混合室8和引物进样孔7可以通过门阀5相互分割，各个特异性引物进行LAMP扩增反应相互独立，不易干扰，从而有效改善了样品污染的情况发生，也有效地抑制了高温下气溶胶污染，提高反应的特异性和准确性。
为了便于向LAMP反应液进样孔3内注入LAMP反应液，其他实施方式的微流控芯片还可以包括反应液注入泵，所述反应液注入泵的样品出口与LAMP反应液进样孔3相连通，通过反应液注入泵提供流体向前输送的压力，首先开启反应液注入泵，将LAMP反应液从LAMP反应液进样孔3泵入微流控芯片并沿着微流控通道6流入混合室8，然后关闭反应液注入泵，通过引物进样孔7向混合室8内注入引物，引物扩散到LAMP反应液中并和LAMP反应液在混合室8内混合均匀后得到混合液体，然后打开反应液注入泵，在反应液注入泵的压力下，混合液体继续向前输送至LAMP扩增反应室9。
当使用本发明的微流控芯片进行检测时，按照实施例3的方法提取待检测样品中的DNA，得DNA模板，按照实施例3的组成和用量配制LAMP反应液，将DNA模板和LAMP反应液混合均匀，得LAMP反应液，分别将LAMP反应液从特异性反应区S、阳性对照反应区N、阴性对照反应区P和通用反应区T的LAMP进样孔加入微流控芯片，当LAMP反应液进入混合室8后，停止注压，取实施例1制备的特异性引物和通用引物组以及购买的阳性引物对照品、阴性引物对照品，分别加入Tri-HCL溶液中配制成引物组溶液，然后分别从相应的特异性反应区S、阳性对照反应区N、阴性对照反应区P和通用反应区T的引物进样孔7加入，引物组溶液和LAMP反应液在混合室8混合均匀后进入LAMP扩增反应室9进行扩增反应。
将LAMP反应液分别从特异性反应区S、阳性对照反应区N、阴性对照反应区P和通用反应区T的LAMP反应液进样孔3加入微流控芯片，当LAMP反应液进入混合室8后，停止注压，取特异性引物组和通用引物组以及阳性引物对照品、阴性引物对照品，分别加入Tri-HCL溶液中配制成引物组溶液，然后分别从相应的特异性反应区S、通用反应区T、阳性对照反应区N和阴性对照反应区P的引物进样孔7加入，引物组溶液和LAMP反应液在混合室8混合均匀后进入LAMP扩增反应室9进行扩增反应。
作为一种改进的实施方式，微流控芯片上位于LAMP扩增反应室9周围还设置有微型恒温加热器2，所述微型恒温加热器2可以采用镍铬薄膜型微型加热器，微型恒温加热器2电连接有温度传感器，提供并监控65±2℃的恒温扩增反应条件。LAMP扩增反应的温度为65±2℃，当温度传感器检测到LAMP扩增反应室9内液体的温度小于65±2℃时，通过启动微型恒温加热器2对LAMP扩增反应室9进行加热，当LAMP扩增反应室9的温度达到65±2℃时，关闭微型恒温加热器2，使得LAMP扩增反应室9的温度维持在65±2℃，以保证LAMP扩增反应的顺利进行。
在其他实施例中，也可以将微流控芯片放置于恒温装置上，为核酸扩增反应提供反应温度。
作为一种改进的实施方式，微型恒温加热器2设置于LAMP扩增反应室9远离混合室8的一侧，使得通过微型恒温加热器2只加热LAMP扩增反应室9的温度，而不影响混合室8、LAMP反应液进样孔3、引物进样孔7以及周围微流控通道6的温度，从而大大减少混合室8、LAMP反应液进样孔3、引物进样孔7以及周围微流控通道6中残留的液体蒸发引起的污染。
作为一种改进的实施方式，如图2所示，所述LAMP扩增反应区，包括：若干分流道4，均匀设置，所述分流道4分别连通于所述微流控通道6远离所述混合室8的端部，用于对核酸溶液进行分流；反应槽12，连通于所述分流道4远离微流控通道6的端部，用于供所述核酸进行LAMP扩增反应和显色反应。通过分流道4对微流控通道6进行分流，液体经分流道4进入各个分流道4连通的反应槽12中进行LAMP扩增反应，使得通过一次进样即可实现多次检测，提高检测效率和准确性，而且通过分流道4的设置，避免了各个反应槽12中的样本相互干扰，进一步提高检测的准确性。
进一步，所述反应槽12为圆柱形，所述反应槽12的深宽比为5:1，通过控制反应槽12的深宽比为5:1，不仅能够从俯视角度看到更加明显的颜色变化情况，提高检测的准确度，同时也有利于提高LAMP反应的受热均匀性，使数据更加可靠。
作为一种改进的实施方式，如图3所示，所述LAMP扩增反应室9还通过微流控通道6连通有排液阀10，所述排液阀10上设置有排液口11，所述排液阀10设置于所述微流控芯片的底部，且所述排液阀10和排液口11与所述LAMP扩增室处于非同一水平面上，用于将反应结束后的反应液体从排液口11全部排出，排出反应液残留污染，极大降低样品在微流道中残留引起反应过程中扩增产物或气溶胶的污染，提高了检测的准确性。
此外，传统的LAMP显色反应依靠裸眼或浊度仪判定，极容易引起偏差，导致病情误诊和漏诊，本发明微流控芯片上还设置有光感元件1和指示器13，光感元件1与指示器13电连接，光感元件1和指示器13分别对应于各个LAMP扩增反应室9一一设置，用于检测每个LAMP扩增反应室9中反应液的颜色变化，具体地，指示器13为双色指示灯或者显示屏，所述光感元件1用于接受和识别LAMP扩增反应室9中反应液不同颜色的光，并将所述不同颜色的光变化转化为电信号传递给指示器13，所述指示器13接受光感元件1传来的电信号后转化为光信号或者图像信号，在LAMP扩增反应过程中，实验者可以依靠光信号或者图像信号判定LAMP扩增结果。具体地，本实施例中，所述光感元件1可以选用非晶态色敏元件，指示器13为红绿双色指示灯，当酚红作为显色剂时，Bst2.0 DNA聚合酶参与LAMP扩增反应产生更多的H+，使得反应液PH值下降，LAMP反应液由粉红色变成橙色，LAMP反应结束后，当LAMP反应液颜色为粉红色，结果为阴性，指示器13显示绿色；当LAMP反应液为橙色，结果为阳性，指示器13显示为红色。通过引入光感元件1和指示器13使得使用本发明微流控芯片反应结果判定简单、准确，不需要肉眼观察细胞形态，很大程度避免了过多依赖多年病理临床经验的医师，大大降低了结果判定的人为主观性，提高检测的准确性，而且本发明的微流控芯片检测更为一体化，同时微流控芯片的体积较小，反应进行数量较多。
作为一种光感元件1可替换的实施方式，所述光感元件1可以用微型pH值测量器和微型浊度器代替，优选使用光感元件1。
在其他实施例中，也可以直接通过肉眼观察反应液的颜色变化来判读结果。
本发明的微流控芯片采用硅基片加工而成，加工方便，其中微流控芯片还包括顶部的盖片，盖片与硅基片键合在一起，盖片为透明玻璃或者透明塑料，有助于观察液体的流动位置和反应现象等，在其他实施方式中，微流控芯片LAMP反应液进样孔3、混合室8和LAMP扩增反应室9的高度也可以逐渐降低，以形成高度差促进流体向前流动。
实施例5引物特异性验证
(1)取中国药品生物制品鉴定所建立的HPV基因分型质控品盘中的15种人乳头瘤病毒DNA质粒(型号分别为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73)进行等比例稀释，制得若干组标准样品作为DNA模板，浓度均为105Copies/μL，使用本发明实施例2制备的试剂盒分别进行检测(共17个试剂盒，其中2个试剂盒分别含有第一通用引物组和第二通用引物组，15个试剂盒分别含有15组特异性引物组)，按照实施例3的检测方法进行检测，结果表明，可以分别检测相应的HPV病毒信号，特异性符合率达到100％。
(2)取某医院单独感染HPV16病毒亚型样品为待测样品，按照实施例3的检测方法进行检测，其结果显示，阳性引物对照品、通用引物和HPV16特异性引物均为阳性反应，而阴性引物对照品，空白引物对照品以及其他型号的特异性引物均为阴性反应，说明该样品单独感染HPV16病毒亚型，与医院检测结果相一致，且上述实验均进行三个独立实验且结果一致。
(3)取某医院同时感染HPV45和HPV59病毒亚型样品为待测样品，按照实施例3的检测方法进行检测，其结果显示，阳性引物对照品、通用引物、HPV45特异性引物和HPV59特异性引物均为阳性反应，而阴性引物对照品，空白引物对照品以及其他型号的特异性引物均为阴性反应，说明该样品同时感染HPV16和HPV59病毒亚型，与医院检测结果相一致，且上述实验均进行三个独立实验且结果一致。
实施例6引物灵敏度验证
将中国药品生物制品鉴定所建立的HPV基因分型质控品盘中的15种人乳头瘤病毒DNA质粒(型号分别为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73)分别进行稀释，制得若干样品，浓度分别为105Copies/μL、104Copies/μL、103Copies/μL、102Copies/μL、101Copies/μL，为DNA模板，使用本发明实施例2制备的试剂盒分别进行检测(共17个试剂盒，其中2个试剂盒分别含有第一通用引物组和第二通用引物组，15个试剂盒分别含有15组特异性引物组)，按照实施例3的检测方法进行检测。结果表明，各组引物组中，105Copies/μL、104Copies/μL、103Copies/μL、102Copies/μL浓度中均可以检测出HPV病毒信号，所以LAMP特异分型检测引物和通用检测引物扩增引物灵敏度为102Copies/μL。
对比例1通用引物的设计与制备
(1)人乳头瘤病毒各亚型的L1通用区序列的获得：从NCBI网站下载各HPV亚型的L1区的基因序列。
(2)通用引物的设计：将上述从NCBI网站下载得到HPV各亚型的L1通用序列导入引物设计软件Primerexplore 5软件中，把序列分成F3、F2、F1、B1、B2、B3六个区设计四条引物，作为通用引物。
(3)引物的合成，将下表2的通用引物序列委托生物工程(上海)股份有限公司合成，备用。
表2引物序列表
取某医院单独感染HPV16病毒亚型样品为待测样品，使用对比例1中的4组通用引物组分别代替实施例3中的通用引物组，并按照实施例3的检测方法进行检测，其结果显示，第一通用引物和第四通用引物均显示阴性反应，说明该引物无法扩增HPV16病毒亚型。
取某医院单独感染HPV45病毒亚型样品为待测样品，使用对比例1中的4组通用引物组分别代替实施例3中的通用引物组，并按照实施例3的检测方法进行检测，其结果显示，第三通用引物显示阴性反应，说明该引物无法扩增HPV45病毒亚型。
取某医院单独感染HPV59病毒亚型样品为待测样品，使用对比例1中的4组通用引物组分别代替实施例3中的通用引物组，并按照实施例3的检测方法进行检测，其结果显示，第二通用引物显示阴性反应，说明该引物无法扩增HPV59病毒亚型。
对比例2特异性引物的设计与合成
(1)人乳头瘤病毒各亚型的E6、E7区保守区序列的获得：从NCBI网站下载各HPV亚型的E6、E7区保守区的基因序列，下述为以HPV33、HPV52、HPV66和HPV68为例进行设计。
(2)特异性引物的设计：将上述从NCBI网站下载得到HPV各亚型的E6、E7保守区基因序列导入引物设计软件Primerexplore 5软件中，把序列分成F3、F2、F1、B1、B2、B3六个区设计四条引物，选择相应的TM值(F1c、B1c﹥F2；B2﹥F3、B3且B2和F2的TM值在60-65℃)、GC含量(GC含量在45％-60％)、引物长度(18bp-23bp)就可以输出得到引物，作为特异性引物。
(3)引物的合成，将下表3的特异性引物序列委托生物工程(上海)股份有限公司合成，备用。
表3引物序列表
(4)检测：取某医院单独感染HPV68病毒亚型样品为待测样品，分别按照实施例3中的检测方法以及使用对比例2中的特异性引物组HPV68E6代替实施例3中的特异性引物组HPV68E6，并按照实施例3的检测方法进行检测，其结果显示，采用对比例2中的特异性引物组HPV68E6显示阴性反应，而采用实施例3中的特异性引物组HPV68E6显示阳性反应，与医院检测结果相一致，说明对比例2中的特异性引物组HPV68E6无法扩增HPV68病毒亚型，本发明实施例3采用的特异性引物组HPV68E6具有更高的特异性和准确性。
取某医院单独感染HPV33病毒亚型样品、单独感染HPV35病毒亚型样品和单独感染HPV59病毒亚型样品为待测样品，分别按照实施例3中的检测方法以及使用对比例2中的特异性引物组HPV33E7代替实施例3中的特异性引物组HPV33E7，并按照实施例3的检测方法进行检测，其结果显示，采用对比例2中的特异性引物组HPV33E7对上述三组样品均显阳性反应，而采用实施例3中的特异性引物组HPV33E7只感染HPV33病毒亚型样品显示阳性反应，而对其余两个样品均显示阴性与医院检测结果相一致，说明对比例2中的特异性引物组HPV33E7不仅能够扩增HPV33病毒亚型，还可以扩增HPV35病毒亚型和HPV59病毒亚型，本发明实施例3采用的特异性引物组HPV33E7具有更高的特异性和准确性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 西人马（厦门）科技有限公司
<120> 用于LAMP扩增以检测HPV和分型的引物组合、试剂盒和方法
<130> HA201902822
<160> 117
<170> PatentIn version 3.3
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cagaggtatt agattttgct ccgtgtggtg tgtcgtccct a 41
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
cgccatgaga ggacacaagc ca 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
cccataagta gttgctgtat gg 22
<210> 23
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
cggtccaagc cttcatcctc atctgcctga accaactgac ctatactgc 49
<210> 24
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
ctacattgta acctgttgtc acggtcactt gctgtactgt tgacac 46
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
ccgctgtgtc cagttgaaaa gc 22
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
tggaggtgtc tggttttgct t 21
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
cgtgttggtt tccaacaggc gattccataa catcggtgga c 41
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
gatttggaac ccgaggcaac ctcctcctct gagctgtcac ac 42
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
gggagtaacc gaaaacggtc a 21
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
catgcagcta gtggttccc 19
<210> 31
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
ggcaatttgt atggccgttc gtcacagttt ctgtccatac cgatg 45
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
acaacgctgg acaccacctt gcatttgctg tagtggtcgt ctgc 44
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
cactgcaaga aattgtattg c 21
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
gacacacaaa ggacaaggtg ctc 23
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
gcatgactaa ctccatctgc gacctgttgt gttacgagca 40
<210> 36
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
gtgtgtatgt tgtaagtgtg acgagtgttc taaggtcctc tgccg 45
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 37
caaagaccac ttgggcctga ag 22
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 38
ctttctggta gctggtcacg c 21
<210> 39
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 39
gttgtcgtgt acgttgccag cggttccatg aaatagcggg acgt 44
<210> 40
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 40
gccatgcgtg gtaatgtacc acgcaagtca atttcagtct gtgg 44
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 41
cggaccctgc acgaattgtg tg 22
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 42
caggacataa tggcgtttga c 21
<210> 43
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 43
cgtaaatctg taaatagaaa cttggcagtg tgtgcagtgc aaa 43
<210> 44
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 44
cgtgtgtatt atgtgcctac gctccctctc ttctaatgtt ttccc 45
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 45
gcagtgtgca gagtatgttt attg 24
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 46
cttgcagcgt tggtacttta cc 22
<210> 47
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 47
ggactttgac atctgtagca cctgactatt cagtgtatgg agctac 46
<210> 48
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 48
ctaatagcac atggttggac cggttctcta gatgtttgtc tcc 43
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 49
ctgtgcagtg tgttggagac cc 22
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 50
ccgtggtgcc acaagtgtaa ca 22
<210> 51
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 51
ctcttagcgt tgggttgttt ccgtagacaa acacaagtgt aac 43
<210> 52
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 52
gcaattatgt gacagctcag acgtgtggcc ggttgtgctt gtccat 46
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 53
gactccgact ccgagaatga a 21
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 54
caggttactg gtttgctgca ca 22
<210> 55
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 55
acaatgttgt gacgctgtgg ttcccagatg gagttaatca tcct 44
<210> 56
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 56
tcagctagta gtagaaacct cgcggatagt gggtccataa acagc 45
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 57
cagcaataca caggaacgtc ca 22
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 58
gttgccccat acactgaata t 21
<210> 59
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 59
gctctaaact tgtaagttcc ttctgcacca tctgagcgag gtat 44
<210> 60
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 60
gcatgtattg agttaaaact agacaataaa cataccctac atactgc 47
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 61
cctgaggaac ggccatacaa at 22
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 62
ggtttcaggc aacacatgca cct 23
<210> 63
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 63
ctgtccgttg tagttgcctt ctgcctgtgc aggacattgg acacta 46
<210> 64
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 64
accattagct gcatgccaat cgttgtggca tacaccgatt ctgag 45
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 65
cggtttcatc aaatagcaga ac 22
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 66
gttgctttca atggcaaggc atac 24
<210> 67
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 67
caggtctaaa gtaatgtcct gcgtacacgg tgctggagac catct 45
<210> 68
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 68
ggacaactca gaggatgagg atgctgtaac actctcgttc agcttg 46
<210> 69
<211> 236
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 69
cacacacgta gacattcgta ctttggaaga cctgttaatg ggcacactag gaattgtgtg 60
ccccatctgt tctcagaaac cataatctac catggctgat cctgcaggta ccaatgggga 120
agagggtacg ggatgtaatg gatggtttta tgtagaggct gtagtggaaa aaaaaacagg 180
ggatgctata tcagatgacg agaacgaaaa tgacagtgat acaggtgaag atttgg 236
<210> 70
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 70
gactctgtgt atggagacac attggaaaaa ctaactaaca ctgggttata caatttatta 60
ataaggtgcc tgcggtgcca gaaaccgttg aatccagcag aaaaacttag acaccttaat 120
gaaaaacgac gatttcacaa catagctggg cactatagag gccagtgcca ttcgtgctgc 180
aaccgagcac gacaggaacg actccaacga cgcagagaaa cacaa 225
<210> 71
<211> 251
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 71
cctacagacg ccatgttcaa aaatcctgca gaaagacctc ggaaattgca tgaactaagc 60
tcggcattgg aaatacccta cgatgaacta agattgaatt gtgtctactg caaaggtcag 120
ttaacagaaa cagaggtatt agattttgca tttacagatt taacaatagt atatagggac 180
gacacaccac acggagtgtg tacaaaatgt ttaagatttt attcaaaagt aagtgaattt 240
agatggtata g 251
<210> 72
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 72
cgccatgaga ggacacaagc caacgttaaa ggaatatgtt ttagatttat atcctgaacc 60
aactgaccta tactgctatg agcaattaag tgacagctca gatgaggatg aaggcttgga 120
ccggccagat ggacaagcac aaccagccac agctgattac tacattgtaa cctgttgtca 180
cacttgtaac accacagttc gtttatgtgt caacagtaca gcaagtgacc tacgaaccat 240
acagcaacta cttatggg 258
<210> 73
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 73
ccgctgtgtc cagttgaaaa gcaaagacat ttagaagaaa aaaaacgatt ccataacatc 60
ggtggacggt ggacaggtcg gtgtatgtcc tgttggaaac caacacgtag agaaaccgag 120
gtgtaatcat gcatggagaa ataactacat tgcaagacta tgttttagat ttggaacccg 180
aggcaactga cctatactgt tatgagcaat tgtgtgacag ctcagaggag gaggaagata 240
ctattgacgg tccagctgga caagcaaaac cagacacctc ca 282
<210> 74
<211> 265
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 74
gggagtaacc gaaaacggtc aggaccgaaa tcggtggata taaaacgcag tcacagtttc 60
tgtccatacc gatggcgcga tttcacaatc ctgcagaacg gccatacaaa ttgccagacc 120
tgtgcacaac gctggacacc accttgcagg acattacaat agcctgtgtc tattgcagac 180
gaccactaca gcaaaccgag gtatatgaat ttgcatttag tgatttatat gtagtatata 240
gggacgggga accactagct gcatg 265
<210> 75
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 75
cactgcaaga aattgtattg catttggaac ctcagaatga attagatcct gttgacctgt 60
tgtgttacga gcaattaagc gagtcagagg aggaaaacga tgaagcagat ggagttagtc 120
atgcacaact accagcccga cgagccgaac cacagcgtca caaaattttg tgtgtatgtt 180
gtaagtgtga cggcagaatt gagcttacag tagagagctc ggcagaggac cttagaacac 240
tacagcagct gtttttgagc accttgtcct ttgtgtgtc 279
<210> 76
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 76
caaagaccac ttgggcctga agaaaagcaa aaattggtgg acgaaaaaaa aaggttccat 60
gaaatagcgg gacgttggac ggggcaatgc gctaattgct ggcaacgtac acgacaacgt 120
aacgaaaccc aagtgtaata aagccatgcg tggtaatgta ccacaagtac aagatgtagt 180
attgcattta acaccacaga ctgaaattga cttgcaatgc tacgagcaat ttgacagctc 240
agaggaggag gatgaagtag ataatatgcg tgaccagcta ccagaaag 288
<210> 77
<211> 310
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 77
cggaccctgc acgaattgtg tgaggtgctg gaagaatcgg tgcatgaaat aaggctgcag 60
tgtgtgcagt gcaaaaaaga gctacaacga agagaggtat acaagtttct atttacagat 120
ttacgaatag tatatagaga caataatcca tatggcgtgt gtattatgtg cctacgcttt 180
ttatctaaga taagtgaata taggcattat caatattcac tgtatgggaa aacattagaa 240
gagagggtaa aaaaaccatt aagtgaaata actattagat gtataatttg tcaaacgcca 300
ttatgtcctg 310
<210> 78
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 78
gcagtgtgca gagtatgttt attgttttat agtaaagtta gaaaatatag gtattatgac 60
tattcagtgt atggagctac actagaaagt ataactaaaa aacagttatg tgatttatta 120
ataaggtgct acagatgtca aagtccgtta actccggagg aaaagcaatt gcattgtgac 180
agaaaaagac gatttcatct aatagcacat ggttggaccg ggtcatgttt ggggtgctgg 240
agacaaacat ctagagaacc tagagaatct acagtataat catgcatggt aaagtaccaa 300
cgctgcaag 309
<210> 79
<211> 256
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 79
ctgtgcagtg tgttggagac cccgacgtag acaaacacaa gtgtaacctg taacaacgcc 60
atgagaggaa acaacccaac gctaagagaa tatattttag atttacatcc tgaaccaact 120
gacctattct gctatgagca attatgtgac agctcagacg aggatgaaat aggcttggac 180
gggccagatg gacaagcaca accggccaca gctaattact acattgtaac ttgttgttac 240
acttgtggca ccacgg 256
<210> 80
<211> 232
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 80
gactccgact ccgagaatga aaaagatgaa ccagatggag ttaatcatcc tttgctacta 60
gctagacgag ctgaaccaca gcgtcacaac attgtgtgtg tgtgttgtaa gtgtaataat 120
caacttcagc tagtagtaga aacctcgcaa gacggattgc gagccttaca gcagctgttt 180
atggacacac tatcctttgt gtgtcctttg tgtgcagcaa accagtaacc tg 232
<210> 81
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 81
cagcaataca caggaacgtc cacgaagcct gcaccatctg agcgaggtat tacaaatacc 60
tttacttgat cttagattat catgtgtata ctgcaaaaag gaacttacaa gtttagagct 120
atataggttt gcatgtattg agttaaaact agtatataga aacaattggc catatgcagt 180
atgtagggta tgtttattgt tttatagtaa ggttagaaaa tataggtact ataaatattc 240
agtgtatggg gcaac 255
<210> 82
<211> 314
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 82
cctgaggaac ggccatacaa attgccagac ctgtgcagga cattggacac tacattgcat 60
gacgttacaa tagactgtgt ctattgcaga aggcaactac aacggacaga ggtatatgaa 120
tttgcctttg gcgacttaaa tgtagtatat agggacgggg taccattagc tgcatgccaa 180
tcatgtatta aattttatgc taaaatacgg gaactacgat attactcaga atcggtgtat 240
gccacaacat tagaaaccat aactaataca aagttatatg atttatcaat aaggtgcatg 300
tgttgcctga aacc 314
<210> 83
<211> 289
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 83
cggtttcatc aaatagcaga acagtggacc ggacgctgta cacggtgctg gagaccatct 60
gcaactgtgg tgtaagatgc atggaaaaaa aacaaccttg caggacatta ctttagacct 120
gaaaccaaca accgaaattg accttacatg ttacgagtca ttggacaact cagaggatga 180
ggatgaaaca gacagccatc tagacagaca agctgaacga gagtgttaca gaatagttac 240
tgactgcacg aagtgtcagt gcacagtatg ccttgccatt gaaagcaac 289
<210> 84
<211> 211
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 84
cctaaggttt ctgcatacca atatagagta tttagggtgc agttacctga cccaaataaa 60
tttggtttac ctgatactag tatttataat cctgaaacac aacgtttagt gtgggcctgt 120
gctggagtgg aaattggccg tggtcagcct ttaggtgttg gccttagtgg gcatccattt 180
tataataaat tagatgacac tgaaagttcc c 211
<210> 85
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 85
ggaagatggt gatatggtag atactggata tggtgccatg gactttagta cattgcaaga 60
tactaaatgt gaggtaccat tggatatttg tcagtctatt tgtaaatatc ctgattattt 120
acaaatgtct gcagatcctt atggggattc catgtttttt tgcttacggc gtgagcagct 180
ttttgctagg catttttgga atagagcagg tactatggg 219
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 86
cgaggtatta caaatacct 19
<210> 87
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 87
catgcaaacc tatatagctc gattatcatg tgtatactgc 40
<210> 88
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 88
ggccatatgc agtatgtagg ggtacctata ttttctaacc ttac 44
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 89
acggacattg acatcggtag 20
<210> 90
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 90
cgaggtatta caaatacct 19
<210> 91
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 91
catgcaaacc tatatagctc gattatcatg tgtatactgc 40
<210> 92
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 92
ggccatatgc agtatgtagg ggtacctata ttttctaacc ttac 44
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 93
acggacattg acatcggtag 20
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 94
ctcctcccag ttctgtatat g 21
<210> 95
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 95
cacgttgcaa ccaataaggt tctcctagtg ggtccatgat tacc 44
<210> 96
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 96
ggtatttgtt actgttgtgg ctgcattaat agtcatgttg g 41
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 97
ttaatgtgct tttagctgca tta 23
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 98
ccgtgaaatc aatcaatacc 20
<210> 99
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 99
caaatatgcc ataacttctg cagctacagt ttgtgtttca actttg 46
<210> 100
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 100
gacgattgga atattggctt acctatattt atcctctaag c 41
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 101
ttctgcaggg ggctgttccc tc 22
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 102
gacgttacaa tagactgtgt ct 22
<210> 103
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 103
ctacatttaa gtcgccaaag gggcaactac aacggacaga gg 42
<210> 104
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 104
accattagct gcatgccaat cctgagtaat atcgtagttc ccg 43
<210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 105
catataactt tgtattagtt atgg 24
<210> 106
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 106
cacgtagaga aactgcactg tg 22
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 107
catcctcatc tgagctgtca ctgttttaga tttatatcct gaacc 45
<210> 108
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 108
ccagccacag ctgattacta ccgaactgtg gtgttacaag tgt 43
<210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 109
catataactt tgtattagtt atgg 24
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 110
taaggctgca gtgtgtgcag tgc 23
<210> 111
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 111
attgtctcta tatactattc gcaacgaaga gaggtataca ag 42
<210> 112
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 112
ggcattatca atattcactg tctaatagtt atttcactta atgg 44
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 113
tcttcaggac ataatggcgt ttg 23
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 114
gagctatata ggtttgcatg 20
<210> 115
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<212> DNA
<213> 人工合成
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caataaacat accctacata ctgcgtatat agaaacaatt ggcc 44
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ttcagtgtat ggggcaacac cttattgata aatcagataa ctg 43
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 117
cctccggtgt taacggacat tg 22

Claims (10)

1.用于LAMP扩增以检测HPV和分型的引物组合，其特征在于，包括用于检测HPV感染的第一通用引物组和/或第二通用引物组，以及任意一组或者几组用于检测HPV亚型的特异性引物组HPV16E6、特异性引物组HPV18E6、特异性引物组HPV31E6、特异性引物组HPV33E7、特异性引物组HPV35E6、特异性引物组HPV39E6、特异性引物组HPV45E7、特异性引物组HPV51E6E7、特异性引物组HPV52E6E7、特异性引物组HPV56E6、特异性引物组HPV58E6、特异性引物组HPV59E6、特异性引物组HPV66E6、特异性引物组HPV68E6、特异性引物组HPV73E6E7；
所述第一通用引物组的正向外引物序列如SEQ ID No：1所示；反向外引物序列如SEQID No：2所示；正向内引物序列如SEQ ID No：3所示；反向内引物序列如SEQ ID No：4所示；
所述第二通用引物组的正向外引物序列如SEQ ID No：5所示；反向外引物序列如SEQID No：6所示；正向内引物序列如SEQ ID No：7所示；反向内引物序列如SEQ ID No：8所示；
所述特异性引物组HPV16E6的正向外引物序列如SEQ ID No：9所示；反向外引物序列如SEQ ID No：10所示；正向内引物序列如SEQ ID No：11所示；反向内引物序列如SEQ ID No：12所示；
所述特异性引物组HPV18E6的正向外引物序列如SEQ ID No：13所示；反向外引物序列如SEQ ID No：14所示；正向内引物序列如SEQ ID No：15所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：16所示；
所述特异性引物组HPV31E6的正向外引物序列如SEQ ID No：17所示；反向外引物序列如SEQ ID No：18所示；正向内引物序列如SEQ ID No：19所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：20所示；
所述特异性引物组HPV33E7的正向外引物序列如SEQ ID No：21所示；反向外引物序列如SEQ ID No：22所示；正向内引物序列如SEQ ID No：23所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：24所示；
所述特异性引物组HPV35E6的正向外引物序列如SEQ ID No：25所示；反向外引物序列如SEQ ID No：26所示；正向内引物序列如SEQ ID No：27所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：28所示；
所述特异性引物组HPV39E6的正向外引物序列如SEQ ID No：29所示；反向外引物序列如SEQ ID No：30所示；正向内引物序列如SEQ ID No：31所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：32所示；
所述特异性引物组HPV45E7的正向外引物序列如SEQ ID No：33所示；反向外引物序列如SEQ ID No：34所示；正向内引物序列如SEQ ID No：35所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：36所示；
所述特异性引物组HPV51E6E7的正向外引物序列如SEQ ID No：37所示；反向外引物序列如SEQ ID No：38所示；正向内引物序列如SEQ ID No：39所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：40所示；
所述特异性引物组HPV52E6E7的正向外引物序列如SEQ ID No：41所示；反向外引物序列如SEQ ID No：42所示；正向内引物序列如SEQ ID No：43所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：44所示；
所述特异性引物组HPV56E6的正向外引物序列如SEQ ID No：45所示；反向外引物序列如SEQ ID No：46所示；正向内引物序列如SEQ ID No：47所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：48所示；
所述特异性引物组HPV58E6的正向外引物序列如SEQ ID No：49所示；反向外引物序列如SEQ ID No：50所示；正向内引物序列如SEQ ID No：51所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：52所示；
所述特异性引物组HPV59E7的正向外引物序列如SEQ ID No：53所示；反向外引物序列如SEQ ID No：54所示；正向内引物序列如SEQ ID No：55所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：56所示；
所述特异性引物组HPV66E6的正向外引物序列如SEQ ID No：57所示；反向外引物序列如SEQ ID No：58所示；正向内引物序列如SEQ ID No：59所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：60所示；
所述特异性引物组HPV68E6的正向外引物序列如SEQ ID No：61所示；反向外引物序列如SEQ ID No：62所示；正向内引物序列如SEQ ID No：63所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：64所示；
所述特异性引物组HPV73E6E7的正向外引物序列如SEQ ID No：65所示；反向外引物序列如SEQ ID No：66所示；正向内引物序列如SEQ ID No：67所示；反向内引物序列如SEQ IDNo：68所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述HPV亚型为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68和HPV73中的一种或者几种。
3.一种权利要求1或2所述的引物组合的设计方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过NCBI网站查找全部的HPV病毒亚型的基因序列和全部HPV高危亚型变异株病毒的基因序列；HPV病毒亚型包括HPV高危病毒亚型和HPV低危病毒亚型；
(2)采用DNAMAN软件分别将上述每个HPV高危病毒亚型的基因序列与全部的HPV病毒亚型的基因序列一一进行对比，同时也将上述每个HPV高危病毒亚型的基因序列和其对应亚型的HPV高危亚型变异株病毒的基因序列一一进行对比，找出每个HPV高危病毒亚型的保守序列；
(3)采用Vector NTI 10软件将上述全部的HPV病毒亚型的基因序列进行相互对比，找出所有HPV病毒亚型的通用序列；
(4)综合每个HPV高危病毒亚型的保守序列和所有HPV病毒亚型的通用序列依靠SnapGene软件分析设计出针对全部的HPV病毒亚型的通用引物组和针对每个HPV高危病毒亚型的特异性引物组。
4.一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，各条引物单独包装。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下检测组分：
7.一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的方法，其特征在于，所述方法包含通过LAMP方法利用权利要求1或2所述的引物组合，或者权利要求4-6中任一所述的试剂盒进行核酸扩增反应。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待检样品中的DNA，得DNA模板；
(2)取步骤(1)提取的DNA模板，分别采用所述通用引物组合和特异性引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增；
(3)检测扩增产物，如果采用所述通用引物组合中的任一引物组可以实现所述DNA模板的特异性扩增，则待检样品有HPV病毒；
如果采用特异性引物组合中的一组或者多组引物组可以实现所述DNA模板的特异性扩增，则待检样品有相应的特异性引物组对应的一种或者多种HPV病毒亚型。
9.一种用于LAMP扩增以检测HPV和分型的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片为恒温扩增微流控芯片。
10.根据权利要求9所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括质控反应区和若干特异性反应区，所述质控反应区和若干特异性反应区沿流体流动方向均各自包括LAMP反应液进样孔(3)、混合室(8)和LAMP扩增反应室(9)；各个所述特异性反应区的混合室(8)和LAMP扩增反应室(9)单独设置且多个所述特异性反应区共用一个LAMP反应液进样孔(3)，所述混合室(8)位于微流控通道(6)的一侧还连通有引物进样孔(7)；
所述LAMP反应液进样孔(3)和混合室(8)之间以及混合室(8)与LAMP扩增反应室(9)之间通过微流控通道(6)相互连通，各个所述特异性反应区位于所述混合室(8)与所述LAMP反应液进样孔(3)之间的微流控通道(6)上均设置有门阀(5)。
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