CN102459631A - 人乳头瘤病毒(hpv)型检测方法 - Google Patents

人乳头瘤病毒(hpv)型检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了检测人乳头瘤病毒(HPV)型的方法以及检测所述HPV型的试剂盒。

Description

人乳头瘤病毒(HPV)型检测方法
技术领域
本发明涉及临床样品中人乳头瘤病毒(HPV)的检测、分型及定量。更具体地说，它涉及能够用于扩增反应并用于多个HPV基因组的同步检测、分型和定量的寡核苷酸序列及其诊断试剂盒。
背景技术
20世纪80年代人乳头瘤病毒(HPV)感染就被报道为宫颈癌的成因。癌症恶性肿瘤与HPV基因型之间的关系被认为是有意义的。自此已鉴定出多于120种的HPV型。在粘膜上皮中已识别出13种HPV型具有致瘤性。这些型包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66。
人乳头瘤病毒感染局限于上皮，限制了其与免疫器官的接触并且其具有不良的免疫原性。因此，对于HPV来说血清学并不是有效的测试手段。同样地，培养也不是有效的诊断技术。虽然在体外复制病毒生命周期是可能的，但这是需要体外分化上皮细胞培养的高度精细的组织培养技术。此外，重度的宫颈肿瘤和癌症不产生病毒。因此，HPV测试依赖于病毒核酸的检测。
已显示对于重度宫颈增生(cervical dysplasia)来说HPV测试比PAP测试(帕帕尼科拉乌测试，Papanicolaou test)具有更高的灵敏度，虽然由于良性的、短暂的HPV感染的高患病率其特异性较低。
许多国家已采用HPV测试作为轻度和可疑增生的二级筛选(分类)测试并且也已建议其用于初步筛选中。
目前主要的HPV测试是Digene HCII测试，它的效用得到大部分科技文献的支持。在该测试中样品中的HPV DNA与互补的RNA杂交，并且所生成的DNA-RNA杂交体被固体表面上的抗体捕获，随后在固体表面与抗体-酶轭合物结合，由酶催化的化学发光检测。LCII测试不区分不同的致瘤的HPV型。
也可以利用原位杂交用标记有荧光部分的探针(荧光原位杂交，FISH)或标记有可以与酶轭合物结合在原位产生不溶性有色沉淀的半抗原的探针检测固定细胞中的HPV。原位杂交能够提供有关HPV定位和物理状态的有价值的信息，但是不能做到同一样品中多重HPV型的型特异性检测。
很多筛选权威机构表达了对二级筛选中基因分型测试的偏爱，因为该测试允许将呈良性的系列短暂感染与呈非良性的型特异性持续感染区分开。此外，一些HPV型，特别是HPV16，呈更显著的病毒致癌性。
最后，基因分型测试的使用提供了有效的流行病学信息，该信息在监测针对HPV16和HPV18的疫苗接种的群体效应方面具有特别的价值。
可用的HPV基因分型测试主要基于PCR及随后某些形式的反向杂交。PCR步骤靶向L1或E1基因。PCR扩增子在扩增过程中被标记并与微阵列上、膜条带上或微量滴定板孔中的固定探针杂交。结合的标记扩增子随后被检测，如果扩增子被荧光部分标记则直接通过荧光检测法检测，或使用与标记物结合的酶轭合物并且使用比色或发光检测技术检测。此类测试包括在需要严格卫生措施的开放的实验室中处理PCR扩增子。这一点，结合这种测试的高价格，使可用的测试超出了大多数大规模筛选程序能力所及。
使用SDA(序列依赖性扩增)检测来自病毒肿瘤基因E6和E7的mRNA的基因分型测试也是可行的。然而，该方法只检测13种致瘤型中的5种且仅在存在活性肿瘤基因表达时检测。
WO 2007115582A1描述了用于通过实时PCR检测多重HPV型的PCR引物和探针的集合。这些集合包括引物的复杂的组合。在根据本发明的方法中，只需要一种正向引物和四种反向引物。这简化了质量控制和生产并节约了成本。而且，WO 2007115582A1中靶向的基因经受型内序列变异(intratypic sequence variation)。这种变异不在考虑范围之内。因此在含有HPV序列变异而非原型序列的临床样品中可能出现假阴性结果。根据本发明，在引物和探针设计之前已将L1基因靶区域内的已知的序列变异纳入考虑范围，并避免或通过引物序列的修饰负责所有变异位置。
进一步地，WO 2007115582A1中声明获得所有靶向HPV型的低达100个拷贝的灵敏度。然而，所描述的实验并不包括载体DNA的使用。这给出对灵敏度的不切实际的乐观估计，因为临床样品中存在的人类DNA抑制PCR灵敏度。根据本发明的方法的灵敏度在500ng人类DNA存在下测量，500ng人类DNA相当于7.5×104个人类细胞，从而准确模拟了富含细胞的临床样品中的条件。因此本发明提供了现实条件下增强的灵敏度。
此外，WO 2007115582A1描述了单管13-重(13-plex)多重PCR测试的使用。然而，根据现有技术似乎并不存在能够进行这样的测试的仪器。根据本发明的方法可以在现有可获得的仪器上以所提议的规格或其变型或类似条件操作。
WO 2009011472A1中用于PCR测试的靶基因是E1。然而，在癌症发展过程中该基因是缺失和插入的热点。因此假阴性结果的可能性随疾病的严重程度而增加。根据本发明的方法以L1基因为靶标，其具有低得多的缺失倾向。
此外，在WO 2009011472A1中HPV的检测和分型方法包括在开放的实验室中处理PCR产物。这包括携带污染(carry-over contamination)的风险。根据本发明的方法在封闭系统中操作，消除了这一风险，从而保证更可靠的结果并消除开放实验室PCR后续工作之后净化装备和设施所需的额外的劳动。
根据上述内容，本领域因此需要用于HPV检测和分型的新的方法、引物、探针和试剂盒，其高度灵敏、可再现且比现有测试方法更便宜，并且因此适于大规模筛选程序。
发明概述
本发明表述实时定量PCR(quantitative realtime PCR)方法的开发，所述方法使用通用引物(consensus primer)和多重的型特异的TaqMan探针，允许13种致瘤的HPV型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66的灵敏的且特异性的检测和分型。而且，根据本发明的方法检测HPV型HPV6、11、26、40、42、43、44、53、54、61、68、70、72、73、82。
更具体地，本发明涉及在生物样品中检测和/或分型和/或定量人乳头瘤病毒(HPV)型的存在的方法，所述测试包括以下步骤：
(i)HPV的核酸片段在以下的存在下的扩增：DNA聚合酶，具有SEQ ID NO：1或其类似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，具有选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6或其类似物组成的组的寡核苷酸序列的反向PCR引物，具有选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：80或其类似物组成的组的寡核苷酸序列、标记有荧光染料和猝灭分子的探针，和内部对照(internal control)；
(ii)检测荧光变化并确定HPV型。
进一步地，根据本发明的方法涉及在生物样品中同时检测和/或分型/和/或定量HPV 18、52、59、39、51、56、66、16、45、58、31、33和35的存在，所述方法包括以下4个平行反应：
反应1-a)HPV18、52和59的核酸片段在以下的存在下的扩增：
(i)核酸聚合酶
(ii)具有SEQ ID NO：1或其类似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，
(iii)具有SEQ ID NO：2或其类似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，
(iv)具有SEQ ID NO：7、8和9或其类似物的寡核苷酸序列、标记有荧光团和猝灭分子的探针，和
b)检测荧光变化，荧光的波长确定HPV型18、52和59；
反应2-a)HPV39、51、56和66的核酸片段在以下的存在下的扩增：
(i)核酸聚合酶
(ii)具有SEQ ID NO：1或其类似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，
(iii)具有SEQ ID NO：3或其类似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，
(iv)具有SEQ ID NO：10、11、12、和13或其类似物的寡核苷酸序列、标记有荧光团和猝灭分子的探针，和
b)检测荧光变化，荧光的波长确定HPV型39、51、56和66；反应3-a)HPV16、45和58的核酸片段在以下的存在下的扩增：
(i)核酸聚合酶
(ii)具有SEQ ID NO：1或其类似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，
(iii)具有SEQ ID NO：4或其类似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，
(iv)具有SEQ ID NO：14、15和16或其类似物的寡核苷酸序列、标记荧光团和猝灭分子的探针，和
b)检测荧光变化，荧光的波长确定HPV型16、45和58；
反应4-a)HPV31、33、35和内部对照的核酸片段在以下的存在下的扩增：
(i)核酸聚合酶
(ii)具有SEQ ID NO：1或其类似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，
(iii)具有SEQ ID NO：5或其类似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，
(iv)具有SEQ ID NO：17、18、19和20或其类似物的寡核苷酸序列、标记有荧光团和猝灭分子的探针，和
(v)内部对照，和
b)检测荧光变化，荧光的波长确定HPV型31、33、35和内部对照。
本发明还涉及用于HPV扩增的引物，所述引物选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6组成的组。
进一步地，本发明还涉及用于HPV检测和/或分型和/或定量的探针，所述探针选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ IDNO：78、SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：80或其类似物组成的组。
本发明还涉及用于在生物样品中检测和/或分型和/或定量HPV的诊断试剂盒，所述试剂盒包括正向引物和反向引物，HPV11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、59、59、61、66、68、70、72、73和82的探针，内部阳性对照和DNA聚合酶。
附图和表格简述
图1-13：表示特异性检测HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66的通用多重实时PCR类型的样品分析和扩增曲线，其中：
图1：表示多重组1中HPV18的扩增。
图2：表示多重组1中HPV52的扩增。
图3：表示多重组1中HPV59的扩增。
图4：表示多重组2中HPV39的扩增。
图5：表示多重组2中HPV51的扩增。
图6：表示多重组2中HPV56的扩增。
图7：表示多重组2中HPV66的扩增。
图8：表示多重组3中HPV16的扩增。
图9：表示多重组3中HPV45的扩增。
图10：表示多重组3中HPV58的扩增。
图11：表示多重组4中HPV31的扩增。
图12：表示多重组4中HPV33的扩增。
图13：表示多重组4中HPV35的扩增。
图14：表示内部对照的扩增曲线。
图15-20：表示用引物PTf和PTr2对HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35和HPV56的稀释系列的扩增。
表1：指所设计的引物的列表。
表2：指所设计的探针的列表。
表3：指多重组1、多重组2、多重组3和多重组4的多重PCR的组成。
表4：指在临床样品上对通用实时方法的评估。
表5：指HPV组1，mastermix配方。
表6：指HPV组2，mastermix配方。
表7：指HPV组3，mastermix配方。
表8：指HPV组4，mastermix配方。
表9：指靶HPV型的分析灵敏度。
发明详述
根据本发明的实时定量PCR方法检测所有已识别的致瘤性粘膜HPV型低至每个样品400GU或更少的水平。所述方法本质上为半定量，因为结果以与靶DNA的起始浓度成比例的CT值读出。也可以通过包括用以建立标准曲线的靶类型的稀释系列在完全定量模式(fully-quantitative mode)运行反应。
所述方法的定量性质具有若干优势。在流行病学研究中可以建立所有型的常数临界值，从而消除由分析灵敏度上的型特异性差异造成的偏差的患病率估计。已经表明只有较高的每样品50 000GU的高水平HPV感染才是临床显著的，尽管这还留有争议。所述通用多重方法中可以将临界值校准到所需的任何定量值。最后，定量方法的使用可以在跟踪感染进程和治疗效果中起作用。
在500ng人类DNA的存在下所述方法的分析灵敏度对所有型为4-400GU，500ng人类DNA相当于0.75×105细胞。因此0.5％的细胞中单病毒拷贝的存在会给出阳性结果。在较低人类DNA浓度(50ng)，相当于0.75×104细胞，灵敏度增加10倍。这说明低细胞(cell-poor)样品造成的假阳性结果并不会成为问题。然而，也说明在完全定量模式下进行所述测试需要细胞DNA浓度的标准化。
正如所预期的，考虑到根据本发明的通用多重方法的检测灵敏度至少高出一个数量级，与杂交捕获(HCII)测试相比，HPV在更多的临床样品中被检测。
根据本发明的方法因而在一次测试中覆盖所有已证实的致瘤性HPV型。所述方法已被特别设计给出四管规格。这给出了最优使用8×12(96孔)和16×24(384孔)规格的方法，所述规格在多数实时PCR仪器中是标准的。然而，很明确根据本发明的方法可以用于不同规格而不背离本发明的范围。
进一步地，根据本发明的方法中，只需要1种正向引物和4种反向引物。这简化了质量控制和生产并节约了成本。
根据本发明，在引物和探针设计之前，已将L1基因靶区域内的已知的序列变异纳入考虑范围并避免或通过引物序列的修饰负责所有变异位置。
根据本发明的方法的灵敏度在500ng人类DNA存在下测量，500ng人类DNA相当于7,5×104人类细胞，从而准确模拟了富含细胞的临床样品中的条件。这对于所有靶向HPV型提供了增强的灵敏度。
根据本发明的方法靶向L1基因，其具有低得多的缺失倾向。
根据本发明的引物能够进一步修饰而用于相关HPV型比如尤其是HPV11、26、40、42、43、44、53、54、61、68、70、72、73、82的检测。
在根据本发明的方法使用的实时PCR仪器中具有两个空置的颜色通道，这允许在测试中添加另外的致瘤性HPV型的可能。
本申请描述的多重分组(multiplex grouping)是许多可能分组之一。例如组3使用的引物已知能够扩增HPV型18、31、33、39、51、58、59和66及内部对照HPV6，从而这些型中的任何型都可以被分配到该组。
本发明中使用的实时PCR仪器具有4个颜色通道。然而对于具有5、6、7个或更多个颜色通道的实时PCR仪器来说，测试的替代性变型是可以的。于是，为检测同样的HPV型，所述引物和探针可以以3或2个平行反应组合。
本测试规格能在一个工作日内分析20个样品，使得该测试非常适于低通量到中等通量实验室。更大批次的样品可以采用384孔规格的实时PCR仪器分析，尽管在现阶段可用的自动DNA提取仪的容量是比PCR分析时间更重要的对通量的限制。
实时PCR是封闭系统测试。因此不需要在开放实验室中处理扩增样品。从而极大地减少了PCR携带污染的问题，并继而减少了必须另外投入到有关开放实验室PCR后分析的严格污染控制的资源。
根据本发明的方法在优选HPV基因分型的筛选程序中尤其有价值。
已描述本发明优选的实施方案。然而应理解本发明并不局限于那些精确的实施方案，并理解可由本领域技术人员在其中做出各种变化和修改而不背离如所附的权利要求所限定的本发明的范围或精神。以下实施例阐明但并未限制本发明。
实施例
实施例1-质粒
将包含HPV6、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66的L1基因的靶区域的质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5-α中，并通过氯化铯密度梯度离心(Fritsch等人)或Qiagen HiSpeed Midi试剂盒(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)分离。DNA浓度采用紫外分光光度法测定。
实施例2-临床样品
临床样品是送到本实验室的用于二级筛选低度增生(LSIL)或可疑细胞学(ASCUS或不适当的(inadequate)样品)的常规HPV分析的宫颈细胞刷样品。根据制造商的建议在CYTYC新柏氏(thin prep)转移剂(介质CYTYC，Crawley，UK)中收集并转移样品。10ml样品在3000rpm离心10分钟并在100μl磷酸盐缓冲盐水中重悬颗粒，之后使用MagNAPure自动DNA提取仪和MagNAPure LC DNA提取试剂盒(Roche Diagnostics，Penzberg，Germany)提取DNA。100μl洗脱DNA。使用预先用HCII测试法进行测试并使用通用PCR和反向线性杂交(reverse line blot)进行分型的临床样本评估本测试。
实施例3-杂交捕获测试
根据制造商的使用说明使用25ml样品进行Digene杂交捕获测试(Digene，Gaithersburg，MD)。
实施例4-引物设计
为鉴定通用PCR引物的适当靶标，使用CLUSTALW比对HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66以及HPV6的L1基因的序列。为生成用于CLUSTAL比对的输入序列，在BLAST搜索中使用每个HPV型的原型序列以鉴定型内变异序列。接下来通过合适的IUPAC模糊代码(IUPAC ambiguity code)的替换在变异位置对所述序列进行编辑。对应于HPV16基因组上nt 6348-6374和6579-6557的区域经鉴定为高度保守的并分别被选择用于放置正向引物和反向引物。这导致了引物PTf和PTr的构建。因为这一引物对不能令人满意地扩增所有靶型，该现象可能由与PTr形成的双链体的低稳定性造成，所以寻求PTr的较低简并性的版本。
基于CLUSTALW中(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)构建的级联的(contatenated)正向和反向引物靶序列的距离树(distancetree)将序列分组为四个同源性组。所述分组为HPV18、HPV52和HPV59(组1)，HPV39、HPV51、HPV56和HPV66(组2)，HPV16、HPV45和HPV58(组3)，以及HPV31、HPV33和HPV35加上内部对照HPV6(组4)。为每组建立新的CLUSTAL比对，并设计组特异性反向引物以减少引物简并度并提高灵敏度。使用次黄嘌呤核苷作为通配碱基，胸腺嘧啶作为通用嘧啶，鸟嘌呤作为通用嘌呤(利用非经典的G:T碱基对的稳定性)或掺入混合的核苷酸来调节可变位置。这导致了引物PTrGr1、PTrGr2和PTrGr4的设计。组3保留初始PTr序列。
为放置反向引物还对与HPV16上位置6644-6620相对应的替代性靶区域进行研究。引物PTr2被设计为靶向这一区域。PTr2适于HPV型16、18、31、33、35、45、52、56、58、58和59的扩增。
表1.引物列表
  引物   序列  SEQ ID NO
  PTf   5-TG(CT)AAA TAT CC(AT)GAT TAT(AT)TI IAA ATG-3  1
  PTrGr1b   5-TGT AGC CAG TAT GG(CT)TTA TTG AA-3  2
  PTrGr2   5-TG(GT)AGC CAA TAA GGT TTA TTA AA-3  3
  PTr957   5-TGI AIC CAA TAI GG(CT)TTA TTG AA-3  4
  PTrGr4   5-TGT AIC CAA TAT GGt TTA TTA AA-3  5
  PTr2   5-C(GT)G T(AG)G TAT CIC CAI CAA GTA ACA AA-3  6
实施例5-探针设计
TaqMan MGB探针使用Primer Express软件(Applied Biosystems，FosterCity，CA)设计，使用靶扩增子作为输入序列并指定扩增子长度≥200bp。设定该软件寻找Tm 60℃的引物和Tm高10℃(70℃)的探针。必要时，为弥补软件如不同时定位引物就无法定位探针的不足，所述序列被虚拟引物序列(dummy primer sequence)掩盖(bracket)。TaqMan MGB探针由Applied Biosystems提供并用FAM、VIC或NED标记，这些标记是用于AB Prism 7000系列实时PCR仪的三个标准颜色通道的推荐的标记。MGB探针包括提高探针Tm并允许使用较短探针的小沟结合剂，和暗猝灭剂(dark，非荧光猝灭剂)。第四通道，通常作为被动参照，在ABI 7000系列仪器上是可用的。所述通道理想地使用ROX染料。ROX标记的MGB探针不可获得。为达到所需的Tm，采用了两种方法。在第一种方法中首先将探针设计成TaqMan MGB探针，然后基于供应商(Sigma Genosys)的建议或使用网站http://lna-tm.com/将其重新设计成LNA探针。LNA探针在糖-磷酸骨架中包含稳定螺旋结构并提高Tm的修饰的脱氧核糖。可选地，使用Primer Express利用为此目的的程序模块设计常规(非MGB)TaqMan探针，并进一步评价＜22bp的探针。将所有探针设计成具有70±2℃的Tm。ROX标记的探针在5’末端被荧光团标记并在3’末端使用暗猝灭剂BHQ2猝灭。
用标出变异位置的13个靶HPV型和HPV6的扩增子区域的CLUSTALW多重序列比对对候选探针进行比较。选择靶向型内非变异但型间(inter-type)特异性序列的探针序列进一步测试。
实施例6-PCR程序
在ABI Prism 7000或7300基因分析仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上运行所有PCR反应，关闭ROX被动参照功能以允许ROX颜色通道用于检测。所有实验的PCR程序为：95℃，12分钟，之后是如下的45个循环：95℃，15秒；45℃，30秒；60℃，60秒。对于使用SYBR绿色的实验，在程序结尾添加融解分析(dissociation analysis)。所有反应中反应体积为50μl并使用5μl样品DNA。根据制造商的使用说明使用PCRmastermix。
实施例7-引物测试
引物的使用浓度为600nM。通过扩增100ng/μl人类DNA(SigmaAldrich，St Louis，MI)中HPV质粒DNA的10倍稀释系列评价所有靶HPV型的分析灵敏度。使用SYPR绿色与Finnzymes DyNAmo SYBR绿色qPCR试剂盒F400(Finnzymes，Espoo，Finland)，使用所述的PCR程序结合融解分析检测所扩增的DNA。分析的灵敏度定义为给出明确的型特异性融解峰的最低靶浓度。对于所有靶HPV型来说在此分析阶段引物接受度的标准为4000GU或更高的分析灵敏度。
实施例8-探针的评价和滴定
探针最初使用浓度为200nM。通过TaqMan PCR测定进行探针的评估，所述TaqMan PCR测定使用Finnzymes DyNAmo探针PCR试剂盒F450(Finnzymes，Espoo，Finland)，或在之后的实验中，使用PerfeCta qPCRFastMix、UNG Quanta Mastermix(Quanta Biosciences，Gaithersburg，MD)，使用100ng/μl人类DNA中靶HPV型的10倍系列稀释和同源引物。来自400GU靶DNA的阳性扩增信号作为准许探针用于进一步测试的最低标准。
在多重反应中使用高浓度时，探针常常相互干扰。因此进行探针滴定以确定能够使用而不损失灵敏度的最低探针浓度。针对4000、400、40和4GU的靶型，测试200、150、100和50nM的探针浓度。在多重反应中使用能够使用而不损失分析灵敏度的探针最低浓度。
实施例9-多重探针测试
对于多重测试，探针在选定的浓度与同源引物组合并在所描述的PCR反应中针对3种或4种靶HPV型的稀释系列进行测试。多重组合的接受标准为400GU或更好的分析灵敏度且没有与组内其他型的交叉反应。当在多重组中检测到不可接受的分析灵敏度损失或交叉反应时，在所有组合中用更少的探针重复反应以识别干扰探针。
在测试中针对4.104GU的14种HPV型中的每种HPV型测试成功组的探针以检测交叉反应。凡观察到交叉反应，即在单重反应中针对交叉反应的HPV型测试交叉反应的探针以确定交叉反应是由探针和交叉反应的HPV型之间的直接相互作用造成，还是由多重反应(multiplexing)的次级效应造成。
若探针因为干扰或交叉反应被舍弃，则如上所述设计和测试新的探针。
表2中显示已评价的探针。
表2.探针列表
Figure BDA0000115388910000151
Figure BDA0000115388910000161
第一栏给出现已分配型的多重组。用小写字母表示正常残基并用以“+”为前缀的大写字母表示LNA残基书写锁定核酸(LNATM)序列。在下列多重混合物中使用的探针用粗体字表示。灰色文本表示探针已被替换。所用荧光团(FAM、VIC、NED和ROX)是那些在本方法中使用的。也可使用技术人员熟知的替代的荧光团和荧光团的组合。
经过1-3轮的探针/引物重新设计得到表3中的多重配方。
表3.多重PCR混合物的组成
多重组1.HPV18、52、59
  引物   序列  SEQ ID NO   浓度
  PTf   5-TG(CT)AAA TAT CC(AT)GAT TAT(AT)TI IAA ATG-3  1   600nM
  PTrGr1b   5-TGT AGC CAG TAT GG(CT)TTA TTG AA-3  2   600nM
Figure BDA0000115388910000181
多重组2.HPV39、51、56、66
  引物   序列  SEQ ID NO   浓度
  PTf   5-TG(CT)AAA TAT CC(AT)GAT TAT(AT)TI IAA ATG-3  1   600nM
  PTrGr2   5-TG(GT)AGC CAA TAA GGT TTA TTA AA-3  3   600nM
多重组3.HPV16、45、58
  引物   序列  SEQ ID NO   浓度
  PTf   5-TG(CT)AAA TAT CC(AT)GAT TAT(AT)TI IAA ATG-3  1   600Nm
  PTr957   5-TGI AIC CAA TAI GG(CT)TTA TTG AA-3  4   600Nm
  探针 序列  SEQ ID NO   类型   浓度
  PTp16(6) 5-FAM ATT TGC AGT AGA CCC AGA G-3 14   TaqMan MGB   150Nm
  PTp45(6) 5-VIC GTG AAA CCC CTG GCA GT-3  15   TaqMan MGB   150Nm
  PTp58 5-NED TCC GGT AAT ACT GCA G-3  16   TaqMan MGB   50Nm
多重组4.HPV6、31、33、35
Figure BDA0000115388910000191
实施例10-内部对照
使用含有非致瘤性HPV型HPV6的基因组的质粒作为内部对照。像对其他探针一样设计和测试HPV6内部对照探针。为确定内部对照的适合的浓度，HPV6按每个反应4.103GU到40GU的10×系列稀释浓度加入到组4PCR反应中。在使用HPV型31、33和3510×稀释系列的扩增测试中使用包括内部对照的多重混合物，以确定哪些内部对照浓度(如果有的话)降低靶型的分析灵敏度。
实施例11-针对临床样品进行评估
一旦根据上述测试结果确定测试的最终配方，在37个临床样本中评估测试并且将结果与之前杂交捕获HCII测试的结果和之前使用反向线性杂交测试的分型结果比较。
表4比较37个临床样品的通用多重PCR的结果，与杂交捕获(HCII)测试和之前采用反向线性杂交分型的结果相比较。没有发现对于之前的测试的假阴性结果。1个样品对于HCII测试为假阴性而1个样品中通用多重测试未能检测到所述之前分型测试发现的型。
结果由此表明在5个样品中根据本发明的通用多重测试检测到之前分析未检测到的其他型。
表4.临床样品上通用实时测试的评估
  样品   HCII结果   之前分型结果   通用多重结果
  1   +   HPV16   HPV16
  2   -   -   -
  3   -   -   -
  4   +   HPV35   HPV16，35，52
  5   -   -   -
  6   +   HPV31   HPV31，52
  7   -   -   -
  8   +   HPV51   HPV51，56
  9   +   HPV51   HPV51
  10   -   -   -
  11   -   -   -
  12   -   -   HPV51，66
  13   -   -   -
  14   -   -   -
  15   -   -   -
  16   -   -   -
  17   -   -   -
  18   +   HPV39   HPV39
  19   -   -   -
  20   -   HPV51   HPV51
  21   -   -   HPV16，45
  22   -   -   -
  23   -   -   -
  24   -   -   -
  25   -   -   -
  26   +   -   -
  27   -   -   -
  28   -   -   -
  29   -   -   -
  30   ±   HPV45   HPV45
  31   -   -   -
  32   +   HPV16   HPV16
  33   -   -   -
  34   -   HPV31   HPV31
  35   +   HPV51，52，59   HPV51，52
  36   -   -   -
  37   -   -   -
表4由此比较37个临床样品的通用多重PCR的结果，与HCII测试和之前采用反向线性杂交分型的结果相比较。28个样品的结果完全一致，其中5个呈阳性且23个呈阴性。有2个样品的HCII呈阴性而反向线性杂交和通用多重PCR给出一致的结果。在5个样品中通用多重测试检测到反向线性杂交未检测到的额外的型。这些型是HPV66(1个样品)，其并未包括在反向线性杂交测定中；HPV52(2个样品)和HPV56(1个样品)，已知反向线性杂交测定对其具有降低的灵敏度；以及HPV35、HPV16和HPV45(各一个)。在1个样品中通用多重测试未能检测到反向线性杂交检测到的型(HPV59)。1个样品仅在HCII测试中呈阳性。
实施例12-通用实时PCR设置
21个临床样品使用以下步骤分析。样品为使用MagNAPure自动DNA提取仪提取的来自宫颈刷的样品的DNA。
1.根据下表在独立的管中准备多重组1、2、3和4的PCR混合物。
表5
HPV组1，mastermix配方：50μl反应。
引物浓度600nM。
探针浓度对HPV18为150nM，对HPV52为50nM且对HPV59为100nM。
Figure BDA0000115388910000221
表6
HPV组2，mastermix配方：50μl反应。
引物浓度600nM。
探针浓度对HPV39为50nM，对HPV51为100nM，对HPV56为50nM且对HPV66为100nM。
Figure BDA0000115388910000231
表7
HPV组3，mastermix配方：50μl反应。
引物浓度600nM。
探针浓度对HPV16为150nM，对HPV45为150nM且对HPV58为50nM。
Figure BDA0000115388910000232
表8
HPV组4，mastermix配方：50μl反应。
引物浓度600nM。
探针浓度对HPV6为50nM，对HPV31为50nM，对HPV33为150nM且对HPV35为100nM。
Figure BDA0000115388910000241
2.PCR程序：95℃，12分钟，之后是如下的45个循环：95℃，15秒；45℃，30秒；60℃，60秒。AB7300实时PCR仪。使用以下96孔板设置：
行1、2、3：组1的检测器(detector)，
行4、5、6：组2的检测器，
行7、8、9：组3的检测器和
行10、11、12：组4的检测器。
并且输入所述21个样品每一个的样品编号。
每个样品在所有组中运行。此外，含有组中所有HPV型的组特异性对照混合物和阴性对照也包括在内。
因此包括下列对照：
阳性对照
13-型对照，每5μl等分试样包括4000GU的HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66。
组阳性对照，包括4000GU的HPV18、52和59(组1)，HPV39、51、59和66(组2)，HPV16、45和58(组3)以及HPV31、33和35(组4)，与它们各自的组一起使用。
每个多重组运行13-型多重对照，组对照和阴性对照(不加DNA)。
3.按照板的设置，等分如(1)所描述的PCR混合物，每孔45μl。
根据板的设置加入5μl样品DNA，阳性对照或阴性对照。
将PCR板密封并放入PCR仪。PCR程序大约需要2.5小时。
后勤考虑事项
完成20个样品的分析所需时间为8小时-4.5小时用于样品处理，15分钟用于PCR设置，2.5小时PCR运行时间和1小时用于分析。这其中，2.5小时为操作时间。
图1-13表示特异性检测HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66的通用多重实时PCR类型的样品和扩增曲线的分析。纵轴为适合的颜色通道的减去背景的对数(荧光)。横轴为PCR循环。右侧纵轴上标有箭头的水平线表示在背景荧光校正后手动放置的阈值线。与阈值线交叉的扩增曲线视为阳性，且扩增曲线与阈值线交叉时的分部(fractional)PCR循环为所附报告中给出的阈值循环(CT)。图4表示内部对照HPV6的扩增。
多重组1.HPV18、52和59的结果.
图1表示多重组1中HPV18的扩增。两条阳性曲线为阳性对照。不存在HPV18-阳性样品。
图2表示多重组1中HPV52的扩增。可见4条阳性曲线。右侧橙色和灰色的曲线为阳性对照。两条蓝色的曲线为含有HPV52的阳性样品(样品4和6)。
图3表示多重组1中HPV59的扩增。两条阳性曲线为阳性对照。不存在HPV59-阳性样品。
多重组2.HPV39、51、56和66的结果.
图4表示多重组2中HPV39的扩增。绿色的曲线为含有组2靶型的阳性对照。在含有全部14种靶型的第二个阳性对照未能扩增HPV39。黑色曲线是含有HPV39的强阳性样品(样品18)。
图5表示多重组2中HPV51的扩增。可见6条阳性曲线。与阈值线相交于循环29的绿色和棕色的曲线为阳性对照。剩下4条曲线为HPV51-阳性样品，其中两个(样品8和9)为非常强的阳性。这两个样品的黑色和蓝色的曲线几乎重合。样品20(绿色曲线)与阈值线相交接近于阳性对照，说明其含有相似量的HPV51(4000GU)。样品12(红色曲线)为弱阳性。
图6表示多重组2中HPV56的扩增。可见3条阳性曲线。绿色和棕色的曲线为阳性对照。蓝色的曲线为阳性样品(样品8)。平滑曲线由该样品中非常高浓度的HPV51的竞争效应造成。
图7表示多重组2中HPV66的扩增。最右侧绿色和棕色的阳性曲线为阳性对照。红色曲线为阳性样品。
多重组3.HPV16、45和58的结果.
图8表示多重组3中HPV16的扩增。可见4条阳性曲线。与阈值线相交于循环34的棕色和红色的曲线为阳性对照。棕色曲线比红色曲线显著地更平缓，可能是因为棕色曲线代表的阳性对照包括所有14种靶型，产生更大的竞争潜能。黑色和绿色的曲线为HPV16-阳性样品(样品1和21)，其中之一为非常弱的阳性。
图9表示多重组3中HPV45的扩增。可见3条阳性曲线。棕色和红色的曲线为阳性对照。绿色的曲线为HPV45阳性样品(样品21)。
图10表示多重组3中HPV58的扩增。2条阳性曲线为阳性对照。不存在HPV58-阳性样品。
多重组4.HPV31、33、35和内部对照(HPV6)的结果
图11表示多重组4中HPV31的扩增。可见3条阳性曲线。2条相似的绿色曲线为阳性对照。蓝色曲线为含有大量HPV31的阳性样品(样品6)。
图12表示多重组4中HPV33的扩增。2条相似的绿色曲线为阳性对照，是仅有的阳性信号。不存在HPV33阳性样品。
图13表示多重组4中HPV35的扩增。可见3条阳性曲线。2条相似的绿色曲线为阳性对照。栗色曲线为含有HPV35的阳性样品(样品4)。
图14表示内部对照扩增曲线。样品均含有等量的HPV6且曲线成簇，表明抑制的缺乏。主要曲线簇右侧的曲线表明部分抑制或竞争。观察到5条这样的曲线。1条曲线(样品4)中内部对照的扩增几乎完全被抑制。这是在同一管中与强HPV35扩增信号的竞争所致。第二个轻微抑制的样品，样品9，含有异常高浓度的HPV51。虽然多重组4中不包括HPV51，但在这样的热的样品(hot sample)中引物序列的相似性可能足以产生竞争性扩增。其余3个样品(3、8和17)为阴性并且可能部分抑制。
内部对照，HPV6可能因此以每个反应400-4000GU的水平加入到组4多重反应而不影响HPV31、HPV33或HPV35的分析灵敏度。选择每个反应4000GU为内部对照的标准浓度。
表9.分析灵敏度
  HPV型   分析灵敏度(GU)   分析灵敏度(GU)
  (100ng/μl人类DNA)   (10ng/μl人类DNA)
  HPV16   40   4
  HPV18   40   4
  HPV31   4   4
  HPV33   400   40
  HPV35   400   40
  HPV39   40   4
  HPV45   400   4
  HPV51   4   4
  HPV52   400   40
  HPV56   40   4
  HPV58   400   40
  HPV59   40   4
  HPV66   400   40
此表关于多重PCR反应的分析灵敏度。使用表5-8描述的多重配方实施反应。靶DNA为100ng/μl或10ng/μl人类DNA中10倍系列稀释的HPV质粒，分别相当于样品中500或50ng的人类DNA。分析灵敏度为给出能够清晰地区别于背景荧光的扩增曲线的最低拷贝数(GU)。
实施例13-PTr2引物的使用
用引物PTf和PTr2对HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35和HPV56的稀释系列实施扩增。
由此在100μl反应中实施扩增，所述100μl反应在Amplitaq Gold缓冲液中使用500ng每种引物，1.5u Amplitaq Gold(Applied Biosystems)，1.5mM MgCl2，和200μM dNTP。PCR程序为93℃，30秒；40℃，30秒；72℃，90秒；40个循环。以10μl扩增材料上样于1.5％琼脂糖凝胶并进行90分钟130V电泳，根据制造商的使用说明使用SYBR绿色染色并在300nm紫外照明下拍照。结果在图15-22中展示。
PTr2因此适于HPV型的扩增。
实施例14-诊断试剂盒
根据本发明的诊断试剂盒可能具有以下构成，但很明确本领域技术人员可做出未背离本发明的范围或精神的各种变化和修改。
所述试剂盒可含有4行，每行6个管(管1-6)含有检测HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66所需的全部试剂。
管1包括500μl溶液，所述溶液含有正向引物PTf和反向引物PTrGr1，加上HPV18(FAM标记)的、HPV59(NED标记)的TaqMan MGB探针，和HPV52(ROX标记)的LNA探针。
管2包括500μl溶液，所述溶液含有正向引物PTf和反向引物PTrGr2，加上HPV51(FAM标记)的、HPV56(VIC标记)的、HPV66(NED标记)的TaqMan MGB探针，和HPV39(ROX标记)的LNA探针。
管3包括500μl溶液，所述溶液含有正向引物PTf和反向引物PTr，加上HPV16(FAM标记)的、HPV45(VIC标记)的和HPV58(NED标记)的TaqMan MGB探针。
管4包括500μl溶液，所述溶液含有正向引物PTf和反向引物PTrGr4，加上HPV35(FAM标记)的、HPV31(VIC标记)的TaqMan MGB探针，和HPV52(ROX标记)的LNA探针。还包括HPV6内部对照的TaqMan探针和每μl 800个拷贝的浓度的HPV6内部对照靶。
管5包括20μl阳性对照，所述阳性对照含有HPV型16、18、31、33、35、35、39、45、51、52、56、58、59和66的4000个拷贝。
管6包括2500μl 2×PCR mastermix，所述PCR mastermix含有在专有的缓冲溶液中的热稳定的DNA聚合酶和脱氧核苷三磷酸(deoxynucleotidetriphosphate)和氯化镁。
23个样品可以根据以下步骤同时分析。这些样品中的3个可作为阴性对照。而且，使用适合的方法从样品中提取DNA。
1.允许管1到6中的每个管在室温下融解。
2.实施例12中的组1mastermix按此准备：在管1中加入600μlPCR mastermix(管6)并颠倒混合。
3.实施例12中的组2mastermix按此准备：在管2中加入600μlPCR mastermix(管6)并颠倒混合。
4.实施例12中的组3mastermix按此准备：在管3中加入600μlPCR mastermix(管6)并颠倒混合。
5.实施例12中的组4mastermix按此准备：在管4中加入600μlPCR mastermix(管6)并颠倒混合。
6.45μl组1mastermix转移到96-孔500μl光学PCR板的行A和行E的每孔。
7.45μl组2mastermix转移到行B和行F的每孔。
8.45μl组3mastermix转移到行C和行G的每孔。
9.45μl组4mastermix到行D和行H的每孔。
10.加入5μl样品DNA 1到孔A1、B1、C1和D1中。
11.加入5μl样品DNA 2到孔A2、B2、C2和D2中。
12.继续按照相同模式将样品加入孔A3-D3到A12-D12中。
13.继续按照相同模式将样品加入孔D1-H1到D11-H11中。
14.加入5μl阳性对照到D12-H12的每孔中。
15.密封板，放入实时PCR仪并启动PCR程序。
16.将在行A和行E中检测HPV型18、52和59。
17.将在行B和行F中检测HPV型39、51、56和66。
18.将在行C和行G中检测HPV型16、45和58。
19.将在行D和行H中检测HPV型31、33、35和内部对照。
所述PCR程序应为：
聚合酶活化和样品变性：95℃，10分钟。
接下来45个循环：
变性95℃，15秒
退火45℃，30秒
延伸60℃，60秒。
实时PCR仪应按程序收集已被优化检测荧光染料FAM、VIC、NED和ROX的4个颜色通道中的荧光数据。
以上实施例仅意味着阐释本发明。必须理解本领域技术人员可以修改本文描述的方法、试剂盒、探针和引物而不背离本权利要求中陈述的本发明的概念和范围。

Claims (20)

1.一种在生物样品中检测和/或分型和/或定量人乳头瘤病毒(HPV)型的存在的方法，所述测试包括以下步骤：
(i)HPV的核酸片段在以下的存在下的扩增：DNA聚合酶，具有SEQ ID NO：1或其类似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，具有选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或其类似物组成的组的寡核苷酸序列的反向PCR引物，具有选自由SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ IDNO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：80或其类似物组成的组的寡核苷酸序列、标记有荧光染料和猝灭分子的探针，和内部对照；
(ii)检测荧光变化并确定HPV型。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸与HPV扩增子特异性杂交，其中所述HPV型选自HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、59、59、61、66、68、70、72、73和82。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其中所述HPV型选自HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其中所述探针选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20或其类似物组成的组。
5.根据权利要求1-4所述的方法，其中根据权利要求1运行两个或更多个平行反应以同时检测所述HPV型。
6.根据权利要求1-5所述的方法，为在生物样品中同时检测和/或分型和/或定量HPV 18、52、59、39、51、56、66、16、45、58、31、33和35的存在，所述方法包括以下四个平行反应：
反应1-a)HPV 18、52和59的核酸片段在以下的存在下的扩增：
(i)核酸聚合酶
(ii)具有SEQ ID NO：1或其类似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，
(iii)具有SEQ ID NO：2或其类似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，
(iv)具有SEQ ID NO：7、8和9及其类似物的寡核苷酸序列、标记有荧光团和猝灭分子的探针，和
b)检测荧光变化，荧光的波长确定HPV型18、52和59；
反应2-a)HPV 39、51、56和66的核酸片段在以下的存在下的扩增：
(i)核酸聚合酶
(ii)具有SEQ ID NO：1或其类似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，
(iii)具有SEQ ID NO：3或其类似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，
(iv)具有SEQ ID NO：10、11、12和13或其类似物的寡核苷酸序列、标记有荧光团和猝灭分子的探针，和
b)检测荧光变化，荧光的波长确定HPV型39、51、56和66；反应3-a)HPV 16、45和58的核酸片段在以下的存在下的扩增：
(i)核酸聚合酶
(ii)具有SEQ ID NO：1或其类似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，
(iii)具有SEQ ID NO：4或其类似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，
(iv)具有SEQ ID NO：14、15和16或其类似物的寡核苷酸序列、标记有荧光团和猝灭分子的探针，和
b)检测荧光变化，荧光的波长确定HPV型16、45和58；
反应4-a)HPV 31、33、35和内部对照的核酸片段在以下的存在下的扩增：
(i)核酸聚合酶
(i)具有SEQ ID NO：1或其类似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，
(ii)具有SEQ ID NO：5或其类似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，
(iii)具有SEQ ID NO：17、18、19、和20或其类似物的寡核苷酸序列、标记有荧光团和猝灭分子的探针，和
(iv)内部对照和
b)检测荧光变化，荧光的波长确定HPV型31、33、35和内部对照。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述反应平行并且在独立的管中实施。
8.根据权利要求1-7所述的方法，其中所述4种荧光团为FAM、VIC、NED和ROX。
9.根据权利要求1-7所述的方法，其中所述内部对照为HPV6。
10.一种用于HPV扩增的引物，所述引物选自由SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6组成的组。
11.根据权利要求10所述的引物，其中所述引物特别适用于实时多重HPV扩增。
12.根据权利要求1-6、10和11所述的引物，用于检测和/或分型和/或定量生物样品中存在的HPV型。
13.一种用于HPV检测和/或分型和/或定量的探针，所述探针选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ IDNO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：80或其类似物组成的组。
14.根据权利要求13所述的用于HPV检测和/或分型和/或定量的探针，所述探针选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20组成的组。
15.根据权利要求1-6和13所述的探针，用于检测和/或分型和/或定量生物样品中存在的HPV。
16.根据权利要求1和10所述的引物用于检测和/或分型和/或定量HPV的存在的用途。
17.根据权利要求1和13所述的探针用于检测和/或分型和/或定量HPV的存在的用途。
18.一种用于检测和/或分型和/或定量生物样品中的HPV的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括正向引物和反向引物，HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、59、59、61、66、68、70、72、73和82的探针，内部阳性对照和DNA聚合酶。
19.根据权利要求18所述的诊断试剂盒，其中所述引物为根据权利要求10所述的引物且所述探针为根据权利要求13所述的探针。
20.根据权利要求18和19所述的诊断试剂盒，其中所述探针为用于HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66的探针。
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