CN103725792A - 人类乳头瘤病毒（24型）检测（荧光pcr法）试剂盒及其检测方法 - Google Patents

人类乳头瘤病毒（24型）检测（荧光pcr法）试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于诊断人乳头瘤病毒（HPV）感染的荧光PCR检测方法，以及利用该方法制成的试剂盒检测患者体内分离出的DNA样本中HPV基因型以诊断其是否属于所述24个型中的某一种并判断为高危、中度高危和低危型。属于生命科学和技术领域。该方法包括一个以荧光定量PCR为技术基础聚合酶链式反应（PCR），包含针对多种型别的正向引物、反向引物和探针，在特定PCR条件下可在一个反应管中同时检测HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4和cp8304等24种型的DNA。本发明简便准确快速的检测多型别的HPVDNA，降低了成本，有效应用于子宫颈癌的预防筛查。

Description

人类乳头瘤病毒(24型)检测(荧光PCR法)试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于诊断人乳头瘤病毒（HPV）感染的荧光PCR检测方法，以及利用该方法制成的试剂盒检测患者体内分离出的DNA样本中HPV基因型以诊断其是否属于所述24个型中的某一种并判断为高危、中度高危和低危型，属于生命科学和技术领域。本发明的方法包括一个以荧光定量PCR为技术基础聚合酶链式反应（PCR），包含针对多种型别的正向引物、反向引物和探针，在特定PCR条件下可在一个反应管中同时检测HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4和cp8304等24种型的DNA。
背景技术：
子宫颈癌是妇女中最常见的恶性肿瘤，主要发生于多产妇女的早期绝经期。每年全世界有约19万人死于子宫颈癌，而其中超过3/4的死亡发生在发展中国家。子宫颈癌的发生率在所有癌症中排名第七，而在妇女中排名第三，仅次于乳腺癌和大肠癌。在发展中国家，少于50％的患子宫颈癌的妇女能存活5年以上，而在发达国家，5年存活率是66％左右。 
在过去的10年中，估计全世界每年有将近371000例新的侵入性子宫颈癌，占到整个妇女癌症的10％。子宫颈癌高发病区主要位于中南美洲、南非、东非和加勒比地区，这些地区每年的平均发病率达到万分之四。东欧和北美的发病率低于每年万分之三，但在巴西东北部，发病率要比北美高10倍，一生中累积风险性可高达10％。
由于感染HPV是引起子宫颈癌的一大原因，所以现在这一研究已成为子宫颈癌预防的前沿学科。在西方工业化国家，对于所有的恶性肿瘤疾病，子宫颈癌也许是公共预防措施做得最好的例子。 
现有子宫颈癌的筛查技术可分两类，基于形态学的方法是在细胞或组织水平检查以识别不正常，基于分子生物学的方法是检查子宫颈上皮瘤的子宫颈癌的标志物。进一步区分这些方法可根据他们释放借助于显微镜或物理和电光学的特性。表1总结了当前各种子宫颈癌筛查的方法，而其中最关联或最有先兆的方法总结在如下几节。 
Pap细胞学：Pap检测是最早的癌症检测方法之一，毫无疑问，它同时也是现代医学中最有成效的一种方法。Pap检测主要是检查子宫颈癌先兆，通过重复检测，可以密切监测可疑的或低度异常，或提议病人立即进行阴道镜、细胞切片检查，并对高度或严重的损害进行治疗。通过Pap检测预防侵入性子宫颈癌，可在它还只是上皮组织时就阻止其恶性发展。 
薄层液相为基础的细胞学：ThinPrepTM和Autocyte Prep系统是两种基于液体的用于代替传统Pap涂片的制片方法。从子宫颈取得的样本被溶于细胞保存液而不是直接涂在玻璃片上。通过这种方法几乎所有的细胞都可给予检测。在传统Pap涂片法中，约20％从子宫颈收集的细胞会被置于玻璃片上，而在薄层样本中，多余的血细胞和炎症细胞会被裂解，而含有约50000细胞的随机样本会由自动细胞处理机转移到玻璃片，并形成一薄层涂片，这涂片经染色后由细胞技术员进行检查。这种自动的薄层技术可以使涂片更清晰、均一，并且没有血细胞、炎症细胞碎片和细胞集落这些影响显微镜检测的因子， 从而提高对非典型细胞、癌症先兆和癌症的检出率。
自动化细胞学：自动化的系统正处于测试和市场推广的阶段。这些系统包括一种能自动把子宫颈癌细胞悬浮液制成标准薄层玻璃片的装置，及通过计算机辅助扫描来首先发现不正常细胞，并把这些涂片分离处理以便作进一步的人工细胞学检测。这些方法最关键的优点是可减轻因缺乏合格的细胞学家而引起的人员紧张。现在在北美和欧洲，有许多私人公司赞助的比较性实验正在验证这些自动化机器的筛查效率和经济效益。 
醋酸法目视筛查（VIA）：在低收入国家，目查法已成为一种技术要求低、能代替细胞学筛查的方法。这些目查法包括直接检查子宫颈，借助醋酸的目查法（也称为直接目查DVI,子宫镜和辅助目查），低倍镜醋酸目查（VIAM），Lugol’s碘酒目查法(VILI)和子宫颈图像。 
筛查中检查HPV：目前研究人员正在比较HPV检测与Pap检测作为子宫颈癌筛查方法的优缺点。由于HPV难以进行体外培养，而且不是所有的感染者都有可检测的抗体反应。因此，HPV DNA的检测是非介入式检测HPV感染最好方法。目前HPV检测的方法主要有三类：
第一类是直接探针结合，如southern印迹和点印迹，原位杂交过滤法等。这些方法普遍存在灵敏度低，操作繁琐等缺点。
第二类是信号放大法，大多数的研究所采用的是唯一经FDA批准的Digene的第一和第二代Hybrid Capture (HC)系统。另一些用不同的 PCR方法来检测HPV。相比于HC法，PCR的检测灵敏度更高，但第二代HC2的检测灵敏度已大大提高，接近于PCR的水平。HC2检查是通过微孔板化学发光信号扩增的核酸杂交技术，定性检查子宫颈样本中高危HPV病毒，这些病毒通常与子宫颈癌有联系，它们是：16、18、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。
第三类是基于PCR的把序列片段扩增，PCR方法是用型别特异或通用引物扩增目标片段并与特异性探针杂交。实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测  荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增。
定量PCR技术所使用的探针有多种，包括：水解探针或Taqman探针、分子信标、scorpions等。相比较于Taqman探针，后期发明的Taqman-MGB探针、分子信标、scorpions等具有分析灵敏度高等优点，缺点在于价格昂贵。本发明在Taqman探针的基础上，通过优化探针序列和PCR反应体系，使用Taqman探针同样达到准确检测的目的。
目前使用荧光定量PCR进行HPV基因检测的专利有
1. GenoID公司的GenoID Real-Time HPV Assay (GenoID)试剂盒，有两个试剂盒构成，分别检测14高危（16, 18, 31, 33, 35, 39,45, 51,52, 56, 58, 59,66, 68）和5个低危（6, 11, 42, 43, 44(Lightcycler only)）。   
2. Abbott公司的RealTime High Risk HPV test试剂盒，能检测14高危（16, 18, 31,33, 35, 39,45, 51, 52,56, 58, 59,66, 68）。
3. 港龙公司的人乳头瘤病毒（HPV）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒，由两个试剂盒构成，分别检测13高危（16, 18, 31, 33, 35, 39,45, 51,52, 56, 58, 59,68）和5个低危（6, 11, 42, 43, 44）。
上述专利和产品，一管中只能检测最多14个HPV型，而且由于使用新型探针造成的成本增加使得难以进行应用于临床诊断。
基于上述内容，尽管HPV DNA检测已发展诸多技术，但开发一种操作简单、准确、便宜及具有多型HPV检测能力的方法是十分有用的。
发明内容：
已知与宫颈癌高度相关的HPV约有20个型，能导致皮肤疣状病变的HPV约有5个型，临床上需要一种能针对多种HPV进行检测，尤其是能区别高危、中度高危和低危型HPV的方法。实时荧光定量PCR技术结合了PCR的高灵敏度，DNA杂交的高特异性和光检测的高精确性等优点，具有操作简单，结果直观和无污染的特点。
本方法涉及一种使用简并引物的PCR检测方法，本方法在单一管中进行24个型别HPV检测并判断其属于低危亚型（6、11、42、43、44）、高危亚型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）和中度高危亚型（53、66、73、83、MM4和cp8304）某一类。
本发明采用一对简并引物来扩增24个型别HPV DNA，相比较于单一引物的PCR时由于1对引物无法和24个型别HPV DNA完全匹配造成的扩增效率的下降，也避免了采用型特异性引物时多种引物造成的干扰导致的扩增效率的下降。本发明使用针对每个型别的HPV设计的特异性探针，通过使用不同的荧光标记来达到对24个型别HPV进行分类的目的。
一种人类乳头瘤病毒（24型）检测（荧光PCR法）试剂盒，该试剂盒含有：
（1）    DNA提取：NP-40；chelex100；TRIS-HCL；
（2）    DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶； UNG酶；
（3）    PCR反应液：dNTPs ，引物，DNA聚合酶Buffer；
（4）    PCR反应体系：DNA聚合酶选择Taq HS DNA聚合酶及引物探针：
PCR反应引物：
Taq-man探针：
（5）    阳性对照为人乳头瘤病毒16、11、66型基因组DNA；
（6）    内参为人肌动蛋白基因。
该试剂盒其探针5′端标记荧光基团为是FAM、HEX、ROX、CY3和CY5中的4种。探针3'端使用BHQ或TAMARA标记。
利用上述的试剂盒检测人类乳头瘤病毒（24型）核酸的检测方法，包括以下步骤：
（1）根据待检测的HPV基因的特异性核酸序列设计用于PCR扩增临床样本获得DNA的引物，上下游引物分别能与靶序列上游的一个位点和下游的一个位点杂交；
（2）根据各型HPV基因的特异性核酸序列中的序列设计的用于检测HPV的一组荧光探针，该探针能与靶序列上游的一个位点和下游的一个位点之间的一个位点杂交；
（3）使用步骤（1）中的引物和步骤（2）中的荧光探针的反应体系对HPV样品进行PCR扩增，一个反应体系中可针对一个或多个HPV基因的特异性核酸序列；
（4）采用多个不同的荧光对不同的探针进行标记，通过反应体系中荧光的变化检测样本中是否含有HPV DNA，以及HPV的类别。
用于检测的荧光探针是Taqman探针，5′端标记荧光基团为是FAM、HEX、ROX、CY3和CY5中的4种，探针3'端使用BHQ或TAMARA标记。
进一步使用高温裂解后离心去除杂质的方法将HPV DNA制备成模板，在反应体系中进行扩增病毒的特异性片段，同时进行HPV的定量或定性检测，所使用的样本为妇女子宫颈脱落细胞或生殖道分泌物。
所述的检测人类乳头瘤病毒（24型）核酸的检测方法，使用的方法为多重引物的PCR反应。由一对简并引物进行如下反应：模板变性，模板变性温度在95℃；引物退火及延伸，引物退火及延伸温度为52℃，反应体系满足Taqman探针退火温度低的缺陷；按模板变性-引物退火及延伸进行扩增，其循环数为35-45个。
步骤（1）中所述的引物对为一对简并引物，相距160～200个碱基，步骤（2）中所述的探针特异性针对24个型别HPV，并使用不同荧光标记，步骤（4）中所述的PCR反应的产物在同一样品管中同时检测24种HPV型别的DNA， 24种HPV型别是：HPV6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV42，HPV43，HPV44，HPV45，HPV51，HPV52， HPV53，HPV56，HPV58，HPV59，HPV66，HPV68，HPV73， cp8304，HPV83，HPVmm4，并根据致癌风险高低不同确定得到高危、中度高危或低危型HPV。
本发明的有益效果在于：
1、  本发明HPV检测时，采样过程要求较高，本发明设计内标来监控采样，有效避免采样可能造成的假阴性问题；
2、  本发明在单一管中检测24个型别的HPV，解决了以往定量PCR试剂通量小的问题，缩短大批量样本检测时间，节约人力物力；
3、  高危型、中度高危型和低危型病毒感染临床处理过程不同。本发明在结果中直接报告病毒所属类别，可以快速进行治疗，减少病人致病风险。
4、  因用于检测的荧光探针是Taqman探针，相对于其它使用MGB或分子信标的方法，大幅降低了成本。
附图说明
图1是 中等浓度HPV16型梯度稀释荧光PCR扩增曲线
图2是 临床样本的荧光PCR扩增曲线
具体实施方式：
本发明的具体方法步骤包括：A)根据待检测的HPV基因的特异性核酸序列分别合成1对简并引物，上下游引物之间相距160～200个碱基；B)并根据各型HPV基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列分别设计、合成Taqman荧光探针；C)使用步骤A)中的引物和步骤B)中的荧光探针荧光反应体系，其中镁离子的浓度为5～10mM，Taq聚合酶0.5～2U，各种引物及探针浓度为100～200nM；D)从待测临床标本中提取DNA，取适量加入步骤；C)中的反应体系中，经离心混合后将反应管放入实时定量PCR反应仪，进行40次循环扩增反应，反应结束后测定反应管中的荧光增值。
实施例1：引物探针设计
研究表明，HPV各型基因组的L1区既有一定的同源性又有一定的特异性，可以根据同源性序列设计简并引物。本发明检测24个型别HPV DNA的引物探针设计原理是：HPV各型基因组的L1区选择同源性高的序列设计正向和反向引物，在特异性高的序列设计探针序列，在同一管中进行PCR，同时使用Taqman探针检测24个型别HPV。模板变性温度在95℃；引物退火及延伸温度在52℃；进行扩增反应的循环数为35-45个。
表1中为扩增的靶序列的基因库编号
HPV型别 基因库编号 靶序列位置
HPV6探针 X00203 6227-6409
HPV11探针 M14119 6220-6402
HPV16探针 K02718 6073-6267
HPV18探针 X05015 6229-6409
HPV31探针 J04353 6120-6302
HPV33探针 M12732 6210-6392
HPV35探针 M74117 6290-6372
HPV39探针 M62849 6240-6422
HPV42探针 M73236 6286-6469
HPV43探针 AJ620205 6200-6388
HPV44探针 U31788 6231-6419
HPV45探针 X74479 6190-6382
HPV51探针 M62877 6230-6412
HPV52探针 X74481 6224-6406
HPV53探针 X74482 6233-6415
HPV56探针 X74483 6231-6413
HPV58探针 D90400 6226-6408
HPV59探针 X77858 6218-6400
HPV66探针 U31794 6302-6492
HPV68探针 M73258 6020-6202
HPV73探针 X94165 6224-6404
HPV81探针 U12480 6230-6423
HPV83探针 AF151983 6226-6412
HPVMM4探针 U12488 6200-6391
实施例2：样本制备
为了能快速简便的制备能作为用于PCR扩增的HPV DNA模板，本发明采用非离子去污剂配合高温环境对HPV外膜蛋白进行裂解释放其中的DNA，同时采用chelex-100去除其中的金属离子等对PCR有抑制作用的杂质，以达到提高检测效率。
实施例3：体系优化
为了能在同一反应管中同时进行24个型别HPV的检测，就必须对引物探针浓度以及反应体系进行优化，以避免引物探针间干扰和Taqman探针杂交所需要的较低的延伸温度。
实施例4：使用本试剂盒检测临床样本中的HPV感染
为了检测本发明试剂盒诊断HPV感染的准确性和有效性，对230例临床样本进行扩增和检测。同时使用HC2方法对相同的临床样本进行检测，并对所有的样本进行测序鉴定HPV的型别，以鉴定本发明使用方法临床诊断的效果（结果见表2所示）。
表2 本发明试剂盒对比HC2以及DNA序列测定结果的比较
样本编号 HC2结果 本发明荧光PCR结果 测序结果
2995592 + 高危阳性 hpv52
6870879 + 高危阳性 hpv16
5593896 － 中高危阳性 hpv cp8304
2438018 + 高危阳性 hpv16
6439045 + 高危阳性 hpv33
5882313 + 高危阳性 hpv58
5267353 + 高危阳性 hpv18
5707526 + 低危阳性 hpv11
5905311 + 高危阳性 hpv16
3563225 + 高危阳性 hpv16
6865326 + 高危阳性 hpv33
6439085 + 高危阳性 hpv52
3068356 + 高危阳性 hpv58
7104914 + 高危阳性 hpv33
6240065 + 高危阳性 hpv53
2425649 － 中高危阳性 hpv66
6803721 + 高危阳性 hpv16
2204287 － 中高危阳性 hpv66
2999061 + 高危阳性 hpv58
3964749 + 高危阳性 hpv18
482663 + 高危阳性 hpv31
483082 + 高危阳性 hpv58
482921 + 高危阳性 hpv58
482662 + 高危阳性 hpv33
483145 + 高危阳性 hpv16
483125 + 低危阳性 hpv11
3964028 + 高危阳性 hpv16
6237071 + 高危阳性 hpv68
5509927 + 高危阳性 hpv52
5716766 + 高危阳性 hpv33
6872032 + 高危阳性 hpv33
6438178 + 高危阳性 hpv33
1297319 + 高危阳性 hpv52
6238832 + 高危阳性 hpv52
2572286 + 高危阳性 hpv68
1687100 + 高危阳性 hpv16
2814276 + 高危阳性 hpv18
1302060 + 高危阳性 hpv16
7005533 + 高危阳性 hpv39
2264252 + 高危阳性 hpv31
3152953 + 高危阳性 hpv52
6958132 + 高危阳性 hpv58
5725988 + 高危阳性 hpv33
6244377 － 中高危阳性 hpv53
3068503 + 高危阳性 hpv58
483282 + 高危阳性 hpv16
483266 + 高危阳性 hpv16
483243 + 高危阳性 hpv58
483344 + 高危阳性 hpv16
483135 + 高危阳性 hpv16
5510070 + 高危阳性 hpv52
3068516 + 高危阳性 hpv52
2264347 + 高危阳性 hpv16
5509981 + 高危阳性 hpv33
5909640 + 高危阳性 hpv16
5268977 + 高危阳性 hpv39
5510032 + 高危阳性 hpv52
2828000 + 高危阳性 hpv52
5509984 + 高危阳性 hpv52
2827963 + 高危阳性 hpv16
4551346 + 高危阳性 hpv18
6999120 + 高危阳性 hpv52
3068317 + 高危阳性 hpv58
3068528 + 低危阳性 hpv11
7006071 + 高危阳性 hpv16
3946552 + 高危阳性 hpv58
6819949 + 高危阳性 hpv39
6236155 + 高危阳性 hpv52
3184163 + 高危阳性 hpv52
6961057 － 中高危阳性 hpv66
1687077 + 高危阳性 hpv16
7204942 + 高危阳性 hpv31
7204886 + 高危阳性 hpv16
2543914 + 高危阳性 hpv31
4576923 + 高危阳性 hpv16
3059070 + 高危阳性 hpv52
483415 + 高危阳性 hpv16
1686435 + 高危阳性 hpv56
5726033 + 高危阳性 hpv33
5816386 + 高危阳性 hpv33
2264429 + 高危阳性 hpv16
2994895 + 高危阳性 hpv16
5726030 + 高危阳性 hpv52
5986498 + 高危阳性 hpv33
5726100 + 高危阳性 hpv18
5726068 － 中高危阳性 hpv66
5679752 + 高危阳性 hpv16
2562815 + 高危阳性 hpv68
7006367 + 高危阳性 hpv52
4566117 + 高危阳性 hpv16
6961084 + 高危阳性 hpv58
5497236 + 高危阳性 hpv52
5816172 + 高危阳性 hpv58
5221386 + 高危阳性 hpv16
3964906 － 中高危阳性 hpv MM4
6439032 + 高危阳性 hpv16
5266623 + 高危阳性 hpv16
7205030 + 高危阳性 hpv16
7104621 + 高危阳性 hpv59
1301578 + 高危阳性 hpv16
5816536 + 高危阳性 hpv33
2264560 + 高危阳性 hpv16
4557053 + 高危阳性 hpv16
2264523 + 高危阳性 hpv33
6439273 + 高危阳性 hpv33
3567673 + 高危阳性 hpv33
483535 + 高危阳性 hpv16
483512 + 高危阳性 hpv33
483572 + 高危阳性 hpv16
序列表 本发明检测HPV所使用引物和探针的序列表
序列编号 序列名称 核苷酸序列5’-3’
SEQ ID NO.1 上游简并引物 GCMCAGGGWCATAAYAATGG
SEQ ID NO.2 下游简并引物 GAAAAATAWACTGMAAATCATY
SEQ ID NO.3 HPV6探针 FAM- AACTACATCTTCCACATACAC-BHQ1
SEQ ID NO.4 HPV11探针 FAM- GTCTAAATCTGCTACATACAC-BHQ1
SEQ ID NO.5 HPV16探针 ROX-ATTATGTGCTGCCTTATTTACTTC–BHQ2
SEQ ID NO.6 HPV18探针 ROX- TGCTTCTACACAGTCTCCT–BHQ2
SEQ ID NO.7 HPV31探针 ROX- TATGTCTGTTTGTGCTGC–BHQ2
SEQ ID NO.8 HPV33探针 ROX- TATGTCTGTTTGTGCTGC–BHQ2
SEQ ID NO.9 HPV35探针 ROX- ATGCACACAAGTAACTA–BHQ2
SEQ ID NO.10 HPV39探针 ROX- GTGTTCTGCTGTGTCTTCTA–BHQ2
SEQ ID NO.11 HPV42探针 FAM- CATGACTTTTTGTGCCACTGC-BHQ1
SEQ ID NO.12 HPV43探针 FAM- TGCCTCTACTGACC -BHQ1
SEQ ID NO.13 HPV44探针 FAM- CTACACAGTCCCCTCC -BHQ1
SEQ ID NO.14 HPV45探针 ROX- GAGTCTTCCATACCTTCT –BHQ2
SEQ ID NO.15 HPV51探针 ROX- TGCCTCTACACAAAAT–BHQ2
SEQ ID NO.16 HPV52探针 ROX- CTGCTGCGGTTTCC –BHQ2
SEQ ID NO.17 HPV53探针 HEX- CGCAACCACACAGTCTAT –BHQ2
SEQ ID NO.18 HPV56探针 ROX- ATGTGCTGAGGATAAAAAG –BHQ2
SEQ ID NO.19 HPV58探针 ROX-ACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATA–BHQ2
SEQ ID NO.20 HPV59探针 ROX- CACTGAAGTAACTAAGG–BHQ2
SEQ ID NO.21 HPV66探针 HEX- AAAAACACATTAACTAA –BHQ2
SEQ ID NO.22 HPV68探针 ROX- ATTGTCCACTACTACAGACTC–BHQ2
SEQ ID NO.23 HPV73探针 HEX- TGTAGGTACACAGGCTAGTAG–BHQ2
SEQ ID NO.24 HPV81探针 HEX- CACTGCTGTTACTCAATCTGT–BHQ2
SEQ ID NO.25 HPV83探针 HEX- GCTACATCTGCTGCT–BHQ2
SEQ ID NO.26 HPVMM4探针 HEX-GCTACACAGGCAAATGAATACACA–BHQ2

Claims (7)

1.一种人类乳头瘤病毒（24型）检测（荧光PCR法）试剂盒，其特征在于：
该试剂盒含有：
DNA提取：NP-40；chelex100，TRIS-HCL；
DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶， UNG酶；
PCR反应液：dNTPs ，引物，DNA聚合酶Buffer；
PCR反应体系：DNA聚合酶选择Taq HS DNA聚合酶及引物探针：
PCR反应引物：
Taq-man探针：
阳性对照为人乳头瘤病毒16、11、66型基因组DNA；
内参为人肌动蛋白基因。
2.根据权利要求1所述的一种人类乳头瘤病毒（24型）检测（荧光PCR法）试剂盒，其特征在于，探针5′端标记荧光基团为FAM、HEX、ROX、CY3和CY5中的4种，探针3'端使用BHQ或TAMARA标记。
3.一种利用权利要求1或2所述的试剂盒检测人类乳头瘤病毒（24型）核酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）根据待检测的HPV基因的特异性核酸序列设计用于PCR扩增临床样本获得DNA的引物，上下游引物分别能与靶序列上游的一个位点和下游的一个位点杂交；
（2）根据各型HPV基因的特异性核酸序列中的序列设计的用于检测HPV的一组荧光探针，该探针能与靶序列上游的一个位点和下游的一个位点之间的一个位点杂交；
（3）使用步骤（1）中的引物和步骤（2）中的荧光探针的反应体系对HPV样品进行PCR扩增，一个反应体系中可针对一个或多个HPV基因的特异性核酸序列；
（4）采用多个不同的荧光对不同的探针进行标记，通过反应体系中荧光的变化检测样本中是否含有HPV DNA，以及HPV的类别。
4.根据权利要求3中所述的检测人类乳头瘤病毒（24型）核酸的检测方法，其特征在于，用于检测的荧光探针是Taqman探针，5′端标记荧光基团为是FAM、HEX、ROX、CY3和CY5中的4种，探针3'端使用BHQ或TAMARA标记。
5. 根据权利要求3中所述的检测人类乳头瘤病毒（24型）核酸的检测方法，其特征在于，使用高温裂解后离心去除杂质的方法将HPV DNA制备成模板，在反应体系中进行扩增病毒的特异性片段，同时进行HPV的定量或定性检测，所使用的样本为妇女子宫颈脱落细胞或生殖道分泌物。
6. 根据权利要求3中所述的检测人类乳头瘤病毒（24型）核酸的检测方法，使用的方法为多重引物的PCR反应，其特征在于，由一对简并引物进行如下反应：模板变性，模板变性温度在95℃；引物退火及延伸，引物退火及延伸温度为52℃，反应体系满足Taqman探针退火温度低的缺陷；按模板变性-引物退火及延伸进行扩增，其循环数为35-45个。
7.根据权利要求3中所述的检测人类乳头瘤病毒（24型）核酸的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的引物对为一对简并引物，相距160～200个碱基，步骤（2）中所述的探针特异性针对24个型别HPV，并使用不同荧光标记，步骤（4）中所述的PCR反应的产物在同一样品管中同时检测24种HPV型别的DNA， 24种HPV型别是：HPV6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV42，HPV43，HPV44，HPV45，HPV51，HPV52， HPV53，HPV56，HPV58，HPV59，HPV66，HPV68，HPV73， cp8304，HPV83，HPVmm4，并根据致癌风险高低不同确定得到高危、中度高危或低危型HPV。
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