CN111321206A - 五重荧光pcr的检测体系及其应用和产品 - Google Patents
五重荧光pcr的检测体系及其应用和产品 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种五重荧光PCR的检测体系及其应用和产品。该检测体系利用的是发射波长分别为470nm‑525nm、523nm‑564nm、571nm‑612nm、628nm‑692nm和678nm‑718nm的荧光染料来进行荧光检测。该检测体系利用位于五个特定波段的发射波长的荧光染料作为五重荧光PCR的检测染料，通过五个可以在同一PCR反应体系内同时进行检测的检测通道(波段)，可以实现同一个PCR反应体系中的五重检测，并且五个检测通道的检测结果之间无串扰的现象，结果准确适用于高通量检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种五重荧光PCR的检测体系及其应用和产品。
背景技术
荧光PCR技术本质上仍然属于PCR技术，但与之不同的是荧光PCR在原来的PCR的技术基础上加入了受激发光激发后可以发出特定波长荧光的化学基团，通过荧光信号的累积而实现实时监测PCR全过程的目的。现阶段，荧光PCR技术涉及到的信号表征方法主要分为染料法和探针法。染料法荧光PCR多以SYBR Green I为信号表征载体，这种染料的特性是能结合DNA双螺旋结构中的小沟部位，当染料与DNA结合并受到一定波长的光发射时能发出特定波长的荧光信号，从而被仪器检测并记作一次有效信号；探针法荧光PCR主要以各种荧光染料标记的核酸探针为信号表征载体，这种信号表征载体会与目标核酸序列特异性结合，之后通过水解或复性的方式传递PCR信号。
荧光PCR技术有着检测时间短，特异性高以及污染风险小等优点被大范围使用，但是不同的应用领域会对该技术提出不同的技术要求。以体外分子诊断试剂为例，该类试剂主要应用于人源或与人疾病相关的非人源核酸序列检测，从而帮助医生作出及时有效的诊断。荧光PCR技术作为此领域常用的技术手段之一，除了上述优点外，还要兼顾高通量检测和检测通道间无串扰等需求。而现阶段荧光PCR技术受限于可用荧光通道的缺少和同管多重PCR体系不易优化的状况而难以满足上述两点需求。据调查，目前市面上可以大规模商用的同管多色荧光PCR方法仅做到了同管四色，并且有的同管多色荧光PCR法的检测通道间有较为严重的串扰现象出现。所以筛选可用的荧光通道和优化出同管多重PCR体系便是满足高通量检测和检测通道间无串扰这两点需求的根本目的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种五重荧光PCR的检测体系。
本发明的第二目的在于提供上述检测体系的应用。
本发明的第三目的在于提供一种五重荧光PCR的检测产品。
本发明的第四目的在于提供一种HPV核酸分型检测试剂盒。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种五重荧光PCR的检测体系，所述检测体系采用的五种荧光染料的发射波长分别位于470nm-525nm、523nm-564nm、571nm-612nm、628nm-692nm和678nm-718nm波段。
进一步地，所述检测体系采用的五种荧光染料分别为FAM、HEX、ROX、Cy5和Cy5.5。
进一步地，所述检测体系采用的淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或BHQ3中的至少一种。
进一步地，所述检测体系还包括聚合酶、dNTP、缓冲液、金属离子、任选的甘油和任选的二甲基亚砜。
进一步地，聚合酶为Taq酶，优选为1.4-1.7U/μL的Taq酶；
优选地，金属离子为镁离子和钾离子，优选为2-6mmol/L的镁离子和45-55mmol/L的钾离子；
优选地，缓冲液为pH7.5-8.5的Tris-HCl；
优选地，甘油的含量为0-7v/v％，优选为3-7v/v％；
优选地，二甲基亚砜的含量为0-3v/v％，优选为1-3v/v％；
优选地，dNTP的含量为250-350μmol/L。
上述检测体系在荧光PCR检测或制备荧光PCR检测产品中的应用。
进一步地，荧光PCR检测产品包括试剂或试剂盒。
一种五重荧光PCR的检测产品，所述检测产品采用上述的检测体系进行检测。
一种HPV核酸分型检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测引物、检测探针和上述的检测体系。
进一步地，检测引物和检测探针为如下四组检测引物和检测探针中的至少一组：
第一组：
第二组：
第三组：
第四组：
优选地，所述四组检测引物和检测探针均独立地为同管包装。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种五重荧光PCR的检测体系，该检测体系利用的是发射波长分别为470nm-525nm、523nm-564nm、571nm-612nm、628nm-692nm和678nm-718nm的荧光染料来进行荧光检测。该检测体系利用位于五个特定波段发射波长的荧光染料作为五重荧光PCR的检测染料，通过五个可以在同一PCR反应体系内同时进行检测的检测通道(波段)，可以实现同一个PCR反应体系中的五重检测，并且五个检测通道的检测结果之间无串扰的现象，结果准确适用于高通量检测。例如，发明人利用该检测体系对HPV核酸分型的准确性进行检测，结果表明该检测体系可以实现准确检测并且不存在串扰现象。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4中质粒混合液1的五重荧光PCR检测结果；
图2为本发明实施例4中质粒混合液2的五重荧光PCR检测结果；
图3为本发明实施例4中质粒混合液3的五重荧光PCR检测结果；
图4为本发明实施例4中质粒混合液4的四重荧光PCR检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种五重荧光PCR的检测体系，该检测体系采用的五种荧光染料的发射波长分别位于470nm-525nm、523nm-564nm、571nm-612nm、628nm-692nm和678nm-718nm波段。该检测体系利用的是发射波长分别为470nm-525nm、523nm-564nm、571nm-612nm、628nm-692nm和678nm-718nm的荧光染料来进行荧光检测。该检测体系利用位于五个特定波段的发射波长的荧光染料作为五重荧光PCR的检测染料，通过五个可以在同一PCR反应体系内同时进行检测的检测通道(波段)，可以实现同一个PCR反应体系中的五重检测，并且五个检测通道的检测结果之间无串扰的现象，结果准确适用于高通量检测。例如，发明人利用该检测体系对HPV核酸分型的准确性进行检测，结果表明该检测体系可以实现准确检测并且不存在串扰现象。
在优选的实施方式中，检测体系采用的五种荧光染料分别为FAM、HEX、ROX、Cy5和Cy5.5。FAM荧光染料的吸收/发射光谱为494/525nm，检测通道(波段)为470-525nm；HEX荧光染料的吸收/发射光谱为535/556nm，检测通道(波段)为523-564nm；ROX荧光染料的吸收/发射光谱为587/607nm，检测通道(波段)为571nm-612nm；Cy5荧光染料的吸收/发射光谱为646/667nm，检测通道(波段)为628nm-692nm；Cy5.5荧光染料的吸收/发射光谱为683/705nm，检测通道(波段)为678nm-718nm。
在优选的实施方式中，检测体系采用的淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或BHQ3中的至少一种。例如，FAM荧光染料对应的淬灭基团为BHQ1；HEX荧光染料对应的淬灭基团为BHQ2；ROX荧光染料对应的淬灭基团为BHQ2；Cy5荧光染料对应的淬灭基团为BHQ3和Cy5.5荧光染料对应的淬灭基团为BHQ3。
在更优选的实施方式中，荧光染料标记于寡核苷酸序列的5’端，淬灭基团标记于寡核苷酸序列的3’端。
在优选的实施方式中，检测体系还包括聚合酶、dNTP、缓冲液、金属离子、任选的甘油和任选的二甲基亚砜。聚合酶可以为Taq酶，优选为1.4-1.7U/μL的Taq酶；金属离子可以为镁离子和钾离子，优选为2-6mmol/L的镁离子和45-55mmol/L的钾离子，该浓度范围的镁离子和钾离子可以保证反应体系的扩增效率同时确保扩增特异性；缓冲液可以为pH7.5-8.5的Tris-HCl；甘油的含量可以为0-7v/v％(本发明中，v/v％是指体积百分比)，优选为3-7v/v％，二甲基亚砜的含量可以为0-3v/v％，优选为1-3v/v％，甘油和二甲基亚砜均可以提高扩增反应的特异性，减少二聚体的形成；dNTP的含量可以为250-350μmol/L。
在更优选的实施方式中，检测体系中的组分包括1.6U/μL的Taq酶、4mmol/L的镁离子、300μmol/L的dNTP、5v/v％的甘油、2v/v％的二甲基亚砜、10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)和50mmol/L的钾离子。
本发明还保护上述的检测体系在荧光PCR检测或制备荧光PCR检测产品中的应用。具体地，荧光PCR检测产品可以为试剂或试剂盒。
本发明还保护一种五重荧光PCR的检测产品，该检测产品采用本发明的检测体系进行检测。本发明提供的检测体系配合不同的引物和探针即可实现不同目标基因的检测，即在同一PCR反应体系中实现检测五类物质，该五类物质可以为五个目标基因，也可以为五份混合物，每一份混合物对应一种荧光信号。
本发明最后保护一种HPV核酸分型检测试剂盒，该检测试剂盒包括检测引物、检测探针和本发明的检测体系。可以理解的是，该检测试剂盒中，荧光染料标记于检测探针序列的5’端，淬灭基团标记于检测探针的3’端。
在优选的实施方式中，检测引物和检测探针为如下四组检测引物和检测探针中的至少一组：
第一组：
第二组：
第三组：
第四组：
在优选地实施方式中，四组检测引物和检测探针中的任一组的检测引物和检测探针均可以为同管包装。由于每一组中的探针均修饰有不同的荧光染料，可以实现同管检测，最多五重的荧光检测，当检测试剂盒中含有上述四组的检测引物和检测探针时，可以通过四个多重检测直接确定检测样本的核酸分型。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1检测体系
本实施例提供一种五重荧光PCR检测体系，其中，荧光染料和检测通道信息如下表1所示，组分如下表2所示：
表1
表2
| 组分名称 | 体系中该物质的浓度 | 物质说明 |
| Taq酶 | 1.6U/μL | 经抗体修饰的热启动酶 |
| Mg<sup>2+</sup> | 4mmol/L | 添加成分为MgCl<sub>2</sub> |
| dNTP | 300μmol/L | dATP、dTTP、dGTP、dCTP等四种脱氧核苷酸等比例混合液 |
| 甘油 | 5％ | |
| DMSO | 2％ | |
| Tris-HCl | 10mmol/L | pH＝8.0 |
| KCl | 50mmol/L |
实施例2HPV核酸分型检测试剂盒
本实施例提供的HPV核酸分型检测试剂盒包括实施例1中的检测体系，还包括检测引物和探针。该试剂盒可对20种HPV亚型同时进行检测并分型，其引物探针序列信息如表3-6所示，其中，检测体系中的五个波段的荧光染料分别修饰在探针的5’端，具体探针的荧光基团和淬灭基团信息参见表3-6：
表3HPV核酸分型检测试剂盒引物探针序列
表4
表5
表6
注：本表中上下游引物与其对应的探针序列合并使用；探针序列5’端标记荧光基团；3’端标记淬灭基团，其标记格式为5’荧光基团；3’淬灭基团。
实施例3模拟复合感染样本检测
步骤(1)：模拟复合感染样本的制备
模拟感染样本是指采用含有各型HPV基因片段的重组质粒经过HPV国家标准品浓度标定后的一系列质粒稀释液。模拟复合感染样本则使用上述的质粒稀释液进行等比例混合稀释后得到质粒混合溶液。质粒混合溶液的制备方法如表7所示。
表7
1*：HPV-6是指HPV6型的重组质粒，下同。
2*：内参基因是该试剂盒基于人基因组核酸序列设计的用于质控整个采样以及检测过程的参考基因。在本实施例中使用浓度为2ng/μL的人基因组稀释液作为质粒混合液1的组分。
3*：HPV-中危指HPV26、73和82型。在本实施例中，这3种HPV型别的重组质粒浓度均为105copies/mL。
4*：105copies/mL是指在各个质粒混合液中每个组分的浓度均为105copies/mL。
步骤(2)：PCR扩增
以实施例2中的试剂盒分别检测步骤1得到的质粒混合液1-4。反应体系及程序如表8所示。
表8
1*：引物探针混合液是含有模板型别对应的引物和探针的溶液。
质粒混合液1-4的检测结果分别如图1-4所示。
图1有5组正常的扩增曲线，(对应的HPV型别及其检测通道分别为HPV6型-FAM、HPV11型-HEX、HPV31型-ROX、内参基因-Cy5和HPV59型-Cy5.5)，每组两个重复。从图中可以看出各通道间均正常扩增，无交叉和串扰现象出现，且其检测结果(各检测通道荧光信号强度和Ct值)均符合试剂盒要求。
图2有5组正常的扩增曲线，(对应的HPV型别及其检测通道分别为HPV18型-FAM、HPV16型-HEX、HPV35型-ROX、HPV45型-Cy5和HPV51型-Cy5.5)，每组两个重复。从图中可以看出各通道间均正常扩增，无交叉和串扰现象出现，且其检测结果(各检测通道荧光信号强度和Ct值)均符合试剂盒要求。
图3有5组正常的扩增曲线，(对应的HPV型别及其检测通道分别为HPV33型-FAM、HPV58型-HEX、HPV52型-ROX、HPV68型-Cy5和HPV39型-Cy5.5)，每组两个重复。从图中可以看出各通道间均正常扩增，无交叉和串扰现象出现，且其检测结果(各检测通道荧光信号强度和Ct值)均符合试剂盒要求。
图4有4组正常的扩增曲线，(对应的HPV型别及其检测通道分别为HPV53型-FAM、HPV56型-HEX、HPV中危型-ROX和HPV66型-Cy5)，每组两个重复。从图中可以看出各通道间均正常扩增，无交叉和串扰现象出现，且其检测结果(各检测通道荧光信号强度和Ct值)均符合试剂盒要求。
实施例5临床样本检测
使用实施例2中所述的HPV检测试剂盒对78例临床样本进行了检测，检测结果与医疗机构诊断结果进行了比较，对比结果如表9所示：
表9
注：表格中标注为“-”为未检出；“中危”指HPV26、73和82型中至少感染一种
根据表中的结果进行统计后发现，本试剂盒与医疗机构诊断结果的阳性符合率为100％(74(本试剂盒与医疗机构诊断结果一致的阳性样本例数)/74(总阳性样本例数)＝100％)，阴性符合率因样本例数过少(仅4例)，因此暂不予统计。符合国家关于体外诊断试剂的临床试验评价要求。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州博日科技有限公司
<120> 五重荧光PCR的检测体系及其应用和产品
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<170> PatentIn version 3.5
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agaatagtta ctgattgcac 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
tcagtgcaca gtatgccttg 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
cacatccgcg ttacaaaatt 20
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ttggcagtgg aaagcagtg 19
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cagaaacaga catcagagaa 20
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tgacatcaga caactacaag a 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
acacaagtag atattcgcat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
cggattgcga gccttacagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tctctctccc actcagcagc tat 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
attcgtactt tggaagacct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
agcagctgtt tctgaacacc c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
acatacgtaa attggaagat t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
agagctcggc agatgacctt a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
agcagatgtt aatgggcgaa 20
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<212> DNA
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caacagtaca gcaagtgacc t 21
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ctacgtgtgg tacaacagct 20
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<211> 20
<212> DNA
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tagagtgata gaagatttgc 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
caggtgttca agtttgctac a 21
Claims (10)
1.一种五重荧光PCR的检测体系，其特征在于，所述检测体系采用的五种荧光染料的发射波长分别位于470nm-525nm、523nm-564nm、571nm-612nm、628nm-692nm和678nm-718nm波段。
2.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系采用的五种荧光染料分别为FAM、HEX、ROX、Cy5和Cy5.5。
3.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系采用的淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或BHQ3中的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还包括聚合酶、dNTP、缓冲液、金属离子、任选的甘油和任选的二甲基亚砜。
5.根据权利要求4所述的检测体系，其特征在于，聚合酶为Taq酶，优选为1.4-1.7U/μL的Taq酶；
优选地，金属离子为镁离子和钾离子，优选为2-6mmol/L的镁离子和45-55mmol/L的钾离子；
优选地，缓冲液为pH7.5-8.5的Tris-HCl；
优选地，甘油的含量为0-7v/v％，优选为3-7v/v％；
优选地，二甲基亚砜的含量为0-3v/v％，优选为1-3v/v％；
优选地，dNTP的含量为250-350μmol/L。
6.权利要求1-5任一项所述的检测体系在荧光PCR检测或制备荧光PCR检测产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，荧光PCR检测产品包括试剂或试剂盒。
8.一种五重荧光PCR的检测产品，其特征在于，所述检测产品采用权利要求1-5任一项所述的检测体系进行检测。
9.一种HPV核酸分型检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括检测引物、检测探针和权利要求1-5任一项所述的检测体系。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，检测引物和检测探针为如下四组检测引物和检测探针中的至少一组：
第一组：
第二组：
第三组：
第四组：
优选地，所述四组检测引物和检测探针均独立地为同管包装。
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