CN110628953A - 一种用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于人乳头瘤的诊断试剂技术领域，具体涉及一种用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括引物探针预混液；所述引物探针预混液包括检测16，18，52，58型HPV的上下游引物、分别检测16，18，52，58型HPV的荧光探针、检测人actb基因的上下游引物和检测人actb基因的荧光探针。本发明提供的试剂盒在通用引物中加入了简并碱基，提高不同分型HPV的覆盖度，有效做到不漏检。在荧光探针中加入锁核酸设计，提高检测特异性；在保证反应高效准确的前提下极大提高了芯片进孔效率，使用热启动的DNA聚合酶和UDG酶，降低反应假阳性。

Description

一种用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒

技术领域

本发明属于人乳头瘤的诊断试剂技术领域，具体涉及一种用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒及检测方法。

背景技术

人乳头状瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)属于乳头瘤病毒属，是一种特异性感染皮肤或粘膜复层上皮的病毒。HPV是一种双链DNA病毒，基因组大小约为8000对碱基。

目前已经确定的HPV类型超过120种，在临床上根据其致癌的风险不同分为高危型和低危型。低危型与性传播疣或尖锐湿疣有关，一般不诱发癌变，常见的低危型为6、11、44、81等；高危型的感染则是子宫颈癌及子宫上皮内瘤变发生的必要条件，常见的高危型有16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68等。而我国较流行的除了16和18型外，还有58和52型。

1、HPV与宫颈癌的关系：

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，全世界每年宫颈癌的新发病例大约500000，是除乳腺癌之外威胁女性生命健康的第二大恶性肿瘤。导致宫颈癌的发病的因素很多，但其中99.7％都与高危型HPV的反复感染有关。因此，HPV普查对于宫颈癌的预防，早期发现及治疗都具有重要的意义。

2、HPV检测方法及缺陷：

由于HPV至今尚不能在体外培养，又无合适的实验动物，因而对其检测主要依赖于形态学鉴定和分子生物学检测技术。目前已经在临床中应用的HPV检测方法主要包括如下几大类：细胞病理学检查，组织学检查，免疫学检查和分子生物学检查等。

细胞学检查包括传统巴氏涂片(CV)、液基薄层细胞学技术(TCT)、自动细胞学检测系统(CT)等。该方法优点：操作简单，价格低廉，适宜作初步筛查；缺点：凹空细胞是HPV感染的主要形态学改变，但由于其他病毒感染及人为因素均有可能造成细胞内出现空泡或凹空样变，而且细胞学检查易受取材、染色及细胞病理医生的主观判断等因素的影响，因此应用细胞病理学检测HPV存在灵敏度低、特异性差、假阴性率和假阳性率高、不能对HPV进行分型。

组织学检查包括肉眼观察；阴道镜观察；组织检查。该方法优点：操作简单，价格低廉，适宜作初步筛查；缺点：准确率低，人员素质要求高，病人痛苦程度大，心里抵触不愿意配合检查。

免疫组化检查包括ELISA，免疫沉淀法等。该方法优点：原理明确，操作相对简单；缺点：血清学检测的对象是抗原和抗体，由于人体对HPV产生免疫应答有一定的迟滞性，所以血清学检测对无免疫应答者和HPV潜伏期感染者会产生漏检。

随着分子生物学技术的发展，通过检测HPV-DNA的方法来鉴别HPV感染类型在临床上的应用越来越广泛。具体可以分为三类：

第一类是直接探针结合法，如有HPV类型特异性探针的Southern印迹和点印迹，原位杂交过滤(FISH)等法，由于其低灵敏度、操作繁琐费时及需要大量纯化的探针，现已很少采用。

第二类是信号放大法，如杂交捕获法和bDNA法。杂交捕获(Hybrid Capture)法是美国Digene公司的检测HPV-DNA的技术，是目前获得美国FDA批准可在临床使用的一种检测HPV-DNA的检测技术，在上述方法中，利用Hybrid Capture的液体杂交和普通引物PCR之后线性探针测试被认为是针对于诊断目的最合适的方法。商业化的Hybrid Capture试剂盒无须PCR扩增即可检出临床样品中的HPV-DNA，并且可区别出高危型和低危型。但是，使用RNA探针可能会影响试剂盒的稳定性，并且也不能排除交叉反应的可能。

第三类方法是基于PCR的靶序列片段扩增技术，应用PCR对特异型HPV靶序列片段进行扩增，用型特异性的寡核苷酸探针鉴别HPV型别。常见的方法有：Amplicor微孔板检测法，反向点杂交法等。等这些基于通用引物PCR的方法，都存在几个缺点，一是经过PCR反应之后，样本需要通过进一步的开盖操作才能完成检测；二是对于多重感染的样本，通用引物具有一定的偏好性，会选择性的放大优势类型，而劣势类型可能会淹没在背景中。另外还有在临床上比较流行的荧光定量PCR方法。该方法已经有非常成熟的产品体系，能够对HPV进行分型定量，但是也存在一些不足。如检测通量和分型种类无法兼顾，对于病毒量极低(低于103copies/微升)的样本无法稳定检出阳性结果等。

数字PCR(dPCR)技术是近几年兴起的第三代PCR技术，数字PCR一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应。不同于qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字PCR技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。该方法极大的提高了检测目标DNA的灵敏度，理论上可以达到1copy/μl。同时，由于将样本分散到数万个独立的反应单元中，使得原来存在于反应体系中的抑制剂被分离局限，从而降低了整个反应对样本DNA质量的要求。但目前临床上还未见到将数字PCR技术应用于HPV16/18/52/5的试剂盒及检测方法。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本申请的发明目的在于提供一种基于数字PCR检测技术用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒。该试剂盒能够对宫颈拭子样本、尿液样本中HPV进行有效的分型定性定量检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒，包括引物探针预混液；所述引物探针预混液包括检测16，18，52，58型HPV的上下游引物、分别检测16，18，52，58型HPV的荧光探针、检测人actb基因的上下游引物和检测人actb基因的荧光探针；

所述检测16，18，52，58型HPV的上游引物包括核苷酸序列SEQ ID NO:15’-GGTGTTGGYVTWAGTGGBCATC-3’；

下游引物包括核苷酸序列SEQ ID NO:2

5’-TRTCTRTRGATTAYAARCARAC-3’。

优选地，所述检测16，18，52，58型HPV的荧光探针序列如下：

检测HPV16型的荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示：

5’-TAGTGCTTATGCAGC-3’；

检测HPV18型的荧光探针的序列如SEQ ID NO:4所示：

5’-GTTTCTGAGGACGTT-3’；

检测HPV52型的荧光探针的序列如SEQ ID NO:5所示：

5’-TGGTAAACCTGGTATA-3’；

检测HPV58型的荧光探针的序列如SEQ ID NO:6所示：

5’-CGCACAGCCAGGGTCT-3’。

优选地，所述检测人actb基因的上游引物序列如SEQ ID NO:7所示：

5’-CTAGCTGGCCCGATTTCTCC-3’；

所述检测人actb基因的下游引物序列如SEQ ID NO:8所示：

5’-CGCCCAATACGACCAAATCAGA-3’。

优选地，所述检测人actb基因的荧光探针序列如SEQ ID NO:9所示：

5’-TCCGGGTGATGCTTTTCCTAGA-3’。

优选地，还包括反应预混液；所述反应预混液中含有dNTP、MgCl₂、Tris-HCl缓冲液、热启动taq酶、尿嘧啶-DNA-糖基酶UDG和单分子扩增增强剂。

进一步优选地，所述dNTP包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP。

进一步优选地，所述单分子扩增增强剂选自Triton X-100、甜菜碱和热稳定焦磷酸酶。

进一步优选地，所述反应预混液中还包括BSA。

进一步优选地，所述反应预混液中还包括、水、阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为含有HPV16、18、52、58型目的片段的线性化质粒组合，其中每种目的片段的浓度均为105copies/μL，外加浓度为10ng/μL的人正常宫颈上皮细胞系DNA的水溶液；所述阴性质控品为浓度为100ng/μL的人正常宫颈上皮细胞系DNA的水溶液。

优选地，所述检测16，18，52，58型HPV的荧光探针的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，所述16，18，52，58型HPV的荧光探针的荧光基团依次为FAM，CY3，CY5和HEX；所述16，18，52，58型HPV的的荧光探针的淬灭基团依次为BHQ-1，BHQ-2，BHQ-3和BHQ-1。

优选地，所述检测人actb基因的荧光探针以Texas Red为荧光基团，BHQ-2为淬灭基团。

所述的试剂盒包括盒体，以及装于盒体内的容器，所述的引物和探针以各自独立或混合的形式装于容器中。

采用本发明提供的试剂盒检测人乳头瘤病毒的方法，包括如下步骤：

利用如上所述的用于检测人乳头瘤病毒的分型试剂盒对待测样品进行荧光检测，从而判断待测样品中是否存在16，18，52，58型人乳头瘤病毒或者16，18，52，58型人乳头瘤病毒的含量。

优选地，利用所述分型试剂盒对待测样品进行荧光检测包括如下步骤：

1)待测样品的准备

采集宫颈子拭样本或尿液样本；

2)DNA模板制备

人工合成分别含有16，18，52，58型HPV-DNA目的片段的DNA片段，并将其连接进载体质粒中，转入E.coli筛选阳性菌进行克隆，提取纯化质粒，限制性内切酶酶切质粒，得到线性DNA模板；

3)试剂配制

分别配制引物探针预混液和PCR反应预混液；

4)PCR扩增反应

参照如下表中的扩增循环参数进行扩增反应

5)结果判定

根据检测得到的不同通道的荧光信号，计算各通道阳性点，确定4种HPV-DNA的拷贝数，进而判断HPV分型。

与现有技术相比，本发明提供的用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒具有如下有益效果：

(1)本试剂盒使用自主设计的引物探针组合，在通用引物中加入了简并碱基，提高不同分型HPV的覆盖度，有效做到不漏检。在荧光探针中加入锁核酸设计，提高检测特异性；

展示灵敏度所使用的标准品，采用人正常宫颈上皮细胞系DNA作为背景，更真实的模拟临床样本，使检测得到的灵敏度数据更加真实；

本试剂盒使用自主优化的反应体系，在保证反应高效准确的前提下极大提高了芯片进孔效率，使用热启动的DNA聚合酶和UDG酶，降低反应假阳性。

利用数字PCR超高灵敏度的优势，能够从尿液样本中检测微量的HPV，减少宫颈拭子采样过程中对患者生理和心理上的损害。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的和技术方案更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

1主要试验仪器：

Qubit 3.0荧光定量仪：Thermo Fisher公司；

离心机：Thermo Fisher公司；

PCR扩增仪：我公司自主研发公司；

水浴锅：常州智博瑞仪器制造有限公司；

生物安全柜：海尔集团。

一种用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒，其包括引物探针预混液、PCR反应预混液，水，阳性质控品，阴性质控品；所述引物探针预混液包括检测16，18，52，58型HPV的上下游引物和分别检测16，18，52，58型HPV的荧光探针、检测人actb基因的上下游引物、检测人actb基因的荧光探针；其中，试剂盒中各荧光探针和上下游引物的序列如表1所示。

表1各核苷酸探针和上下游引物

表2引物探针预混液中各组分及规格

其中，表中“用量”是指各成分在引物探针预混液中的比例，即如果引物探针预混液是100μL，则每种成分都是10μL；引物探针预混液中各成分的终浓度要在表中的浓度基础上除以十。

所述检测16，18，52，58型HPV的荧光探针的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，所述16型HPV的荧光探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ-1；所述18型HPV的荧光探针的荧光基团为CY3，淬灭基团为BHQ-2；所述52型HPV的荧光探针的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ-3；

所述58型HPV的荧光探针的荧光基团为HEX，淬灭基团为BHQ-1。

所述检测人actb基因的荧光探针以Texas Red为荧光基团，BHQ-2为淬灭基团。

表3 PCR反应预混液中各组分及规格

阳性质控品为含有HPV16、18、52、58型目的片段的线性化质粒组合，其中每种目的片段的浓度均为105copies/μL，外加浓度为10ng/μL的人正常宫颈上皮细胞系DNA的水溶液；阴性质控品为浓度为100ng/μL的人正常宫颈上皮细胞系DNA的水溶液。

以下实施例采用上述试剂盒做性能指标测试

一、样本准备

1.1、采样

本试剂盒可对宫颈拭子样本，尿液样本中HPV进行有效的分型检测。

样品的采集参照本领域常规手段，如宫颈拭子样本是由医护人员以专业的设备打开阴道，暴露出宫颈，用棉拭子清理宫颈口过多的分泌物。用宫颈刷插入到宫颈口，顺时针旋转3-5周获得足量的脱落细胞样本，然后取出宫颈刷，并将其刷头插入到保存液管底，使刷头完全浸入保存液中，旋紧管盖。

对于尿液样本，则按常规流程，收集中段尿5mL左右，保存至无菌密封管子中，尽快送检。

1.2、样本保存

对于收集的样品，如果能立即送检，则无需特殊保存，仅常温保存送检，如果不能立即送检，则需要每周集中检测一次，即一周之内能够检测的，4度保存即可。如果需要长时间保存，建议-80摄氏度保存。如果需要运输，建议使用4度冷链运输。

二、样本检测

2.1不同浓度的DNA模板的制备

人工合成(生工生物工程(上海)股份有限公司)分别含有16，18，52，58型HPV-DNA目的片段的长度为500bp的DNA片段，并将其连接进载体质粒中。转入E.coli筛选阳性菌进行克隆，提取纯化质粒，限制性内切酶将质粒切成线性，以Qubit 3.0进行双链DNA定量并根据如下公式计算真实拷贝数：

(6.02x 10²³)x(DNA浓度x 10^-9)/(DNA length x 660)＝拷贝数浓度；即9.12x10¹¹x DNA浓度/DNA length＝拷贝数浓度，其中DNA浓度单位为ng/ul，DNA长度单位为bp，拷贝数浓度单位为copies/ul。

另培养(培养基为1640培养基加10％胎牛血清，厂家均为HyClone。37摄氏度，5％CO2培养)人正常宫颈上皮细胞系H8，提取其DNA，使用Qubit 3.0进行定量，之后稀释至10ng/ul的浓度。

分别配置16，18，52，58型HPV-DNA拷贝数浓度为2×10¹-2×10⁷拷贝的DNA模板溶液。等体积加入人正常宫颈上皮细胞系H8的DNA作为背景，制成标准品，以展示本发明检测下限。

2.2试剂的配制

分别按如上表1-3中的比例配制PCR反应预混液和引物探针预混液；

2.3反应体系的配制

A向反应管中依次加入4uL水、10uLPCR反应预混液、4uL引物探针预混液混合均匀，并将混匀后的反应混合液分装入8支PCR扩增用反应管中；

B然后将之前配制好的不同比例的模板DNA加入管中，每管加2uLDNA样本，盖上盖子，轻微震荡15s混匀，离心10-20秒去除气泡；

C将PCR扩增用反应管放到PCR荧光仪上进行扩增反应，其中循环参数如下表4

表4 PCR扩增循环参数

其中，仪器的检测通道为FAM、CY3、CY5、HEX，内参通道为Texas Red；有荧光信号说明反应正常，结果有效。

2.4结果判定

每个通道分别检测不同分型的HPV标准品，根据阳性点数量计算标准品中HPV-DNA的拷贝数；检测结果如下表5-8。

其中，所述根据阳性点数量计算标准品中HPV-DNA的拷贝数包括如下步骤：

首先会在不同通道下拍摄反应完成后芯片的灰度照片，然后图像处理程序会识别每个反应孔中的灰度，确认一个阈值，大于阈值的点判定为阳性点，最后根据泊松分布的算法，根据阳性点数量计算DNA拷贝数。

表5

表6

表7

表8

结果表明，本发明提供的试剂盒能够有效检测DNA终浓度为1ng/μL的样本，能够有效分辨终浓度低至1copy/μL的标准品，准确度高，重复性好，无反应假阳性。

实验例1

参照如上对标准品的检测步骤，采用样本DNA代替质粒标准品DNA，检测临床样本中的HPV感染情况；其中样本DNA的提取按照所使用的DNA提取试剂盒的说明书进行。

用上述试剂盒对50例HPV阳性患者的宫颈拭子样本和尿液样本进行检测，所有宫颈拭子样本均有qPCR法试剂盒检测结果作为参照，检测结果和分析结果见下表9。

表9

结果说明：目前临床使用的qPCR法检测HPV的试剂盒，均不提供定量检测，只单纯定性分型检测。这是因为对于宫颈拭子样本来说，医师的采样手法，采样位置，主要感染位置等多种因素都会极大的影响样本中HPV的含量，也就是说，HPV感染的严重程度无法通过宫颈拭子样本中HPV的含量来客观表现。因此临床检测中并不要求对HPV进行定量分析。而且对于qPCR法来说，做定量需要额外使用标准品做标准曲线，费时费力。而数字PCR平台采用绝对定量，通过直接展示定量结果来定性，所以表9中都带有样本DNA中HPV的拷贝数浓度，虽然不能直接反应HPV感染的严重程度，但侧面体现了数字PCR平台检测的灵敏度明显高于qPCR法。

由表9可见，在全部50例宫颈拭子样本中，本发明的检测结果与qPCR法结果相比，阳性检出率为100％。值得注意的是，在第7号和24号样本中，本发明额外检测出了极微量的HPV52型感染，这种浓度已经低于qPCR法的检测下限，因此应该属于传统方法的假阴性，对于这两个样本，实际结果应该是复合感染。由于本次选择的样本都是已知的HPV阳性感染样本，所以感觉qPCR只是漏检了一种分型而已，但是，如果待测样本是未知感染情况的，传统qPCR方法很可能就会错把这种微量感染的样本诊断为阴性，从而是患者耽误早期治疗。但话说回来，HPV感染是一种自愈率很高的疾病，大多数无症状的感染患者无需进行治疗，只需定期复查。

对于50例尿液样本，由本发明的检测结果可见，其中HPV的拷贝数浓度均低于常规方法，所以qPCR法是检测不出来的。但是通过跟取自同一患者的宫颈拭子样本进行对比，本发明使用尿液样本检测HPV的检出率同样为100％，对于7号和24号样本，也检出了含量极低的HPV52型。因此，本发明可以准确有效的从宫颈拭子样本或尿液样本中检测出HPV感染，灵敏度极高。

以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒，其特征在于，包括引物探针预混液；所述引物探针预混液包括检测16，18，52，58型HPV的上下游引物、分别检测16，18，52，58型HPV的荧光探针、检测人actb基因的上下游引物和检测人actb基因的荧光探针；

所述检测16，18，52，58型HPV的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：5’-GGTGTTGGYVTWAGTGGBCATC-3’；

下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：

5’-TRTCTRTRGATTAYAARCARAC-3’。

2.根据权利要求1所述的用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒，其特征在于，所述检测16，18，52，58型HPV的荧光探针如下核氨酸序列：

检测HPV16型的荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示：

5’-TAGTGCTTATGCAGC-3’；

检测HPV18型的荧光探针的序列如SEQ ID NO:4所示：

5’-GTTTCTGAGGACGTT-3’；

检测HPV52型的荧光探针的序列如SEQ ID NO:5所示：

5’-TGGTAAACCTGGTATA-3’；

检测HPV58型的荧光探针的序列如SEQ ID NO:6所示：

5’-CGCACAGCCAGGGTCT-3’。

3.根据权利要求1所述的用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒，其特征在于，所述检测人actb基因的上游引物序列如SEQ ID NO:7所示：

5’-CTAGCTGGCCCGATTTCTCC-3’；

所述检测人actb基因的下游引物序列如SEQ ID NO:8所示：

5’-CGCCCAATACGACCAAATCAGA-3’。

4.根据权利要求1所述的用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒，其特征在于，所述检测人actb基因的荧光探针序列如SEQ ID NO:9所示：

5’-TCCGGGTGATGCTTTTCCTAGA-3’。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒，其特征在于，还包括反应预混液；所述反应预混液中含有dNTP、MgCl₂、BSA、Tris-HCl缓冲液、热启动taq酶、尿嘧啶-DNA-糖基酶UDG和单分子扩增增强剂。

6.根据权利要求5所述的用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒，其特征在于，所述单分子扩增增强剂选自Triton X-100、甜菜碱和热稳定焦磷酸酶。

7.根据权利要求5所述的用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒，其特征在于，还包括、水、阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为含有HPV16、18、52、58型目的片段的线性化质粒组合，其中每种目的片段的浓度均为105copies/μL，外加浓度为10ng/μL的人正常宫颈上皮细胞系DNA的水溶液；所述阴性质控品为浓度为100ng/μL的人正常宫颈上皮细胞系DNA的水溶液。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒，其特征在于，所述检测16，18，52，58型HPV的荧光探针的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，所述16，18，52，58型HPV的荧光探针的荧光基团依次为FAM，CY3，CY5和HEX；所述16，18，52，58型HPV的的荧光探针的淬灭基团依次为BHQ-1，BHQ-2，BHQ-3和BHQ-1。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒，其特征在于，所述检测人actb基因的荧光探针以Texas Red为荧光基团，BHQ-2为淬灭基团。