CN104195247A - 多色高危hpv荧光检测试剂盒 - Google Patents

多色高危hpv荧光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了多色高危HPV荧光检测试剂盒，包括热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，荧光探针为HPV特异性MGB探针。本发明的试剂盒适用于定性检测宫颈脱落细胞和生殖泌尿道分泌物样本中18种可引起宫颈癌的高风险HPV基因型。本试剂盒应用多重荧光PCR技术实现了在同一管扩增体系中检测18种HPV基因型，同时本试剂盒在同时检测15种常见高风险HPV基因型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82）时，还可检测三种少见高风险HPV基因型（26、53、73）。本发明的检测试剂盒，检测通量高，大大降低了筛查成本。

Description

多色高危HPV荧光检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种HPV荧光检测试剂盒，特别涉及一种多色高危HPV荧光检测试剂盒。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。宫颈癌的早期发现和治疗是有效治疗宫颈癌的关键。
现有研究表明，宫颈癌的主要病因是由高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）的持续感染或反复感染所致。90%以上的宫颈癌伴有高危型HPV感染，高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要危险因素。因此，HPV DNA检测在世界范围内多个国家已经成为宫颈癌筛查和健康管理的一个重要部分。人乳头瘤病毒有多种基因型，依据不同型别与宫颈癌发生危险性的高低可将其分为低危型和中高危型HPV。HPV DNA检测的主要意义在于：1）基于液基细胞学结果决定患者是否需要进一步进行阴道镜检查；2）液基细胞学异常而阴道镜检或活检阴性患者随访；3）高级别宫颈上皮内病变患者临床处理后治疗结果预测；4）年龄≥30岁女性联合巴氏涂片针对宫颈癌早期筛查。
现有的运用荧光PCR方法进行高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的技术的缺点主要是扩增灵敏度低，耗时长。前期一般都需要经过步骤繁琐的核酸提取，然后运用普通Taqman探针的方法进行多重PCR扩增，而且一般都是FAM和HEX两通道检测，无法具体分区高危HPV型别，难以满足实际使用的需要。
开发出可以快速、高效的HPV高危型检测试剂盒，具有非常实际的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多色高危HPV荧光检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
多色高危HPV荧光检测试剂盒，包括热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，荧光探针为HPV特异性MGB探针，HPV特异性MGB探针的序列如下：
探针1  TTGGCATAATCAATTATTT
探针2  TGGGGCAATCAGTTRTTTGT
探针3  CTGATTGTTCCARCARATG
探针4  AATCAGTTGTTTGTTACTGT
探针5  TTTRTTACCTGTGTTGATAC
探针6  TAACTGTTGTGGATACCAC
探针7  TATATGTTGGCACAATCAA
探针8  TGGTTACCCCAACAAATG
探针9  TAATTGATTATGCCAGCAAACA
探针10       TTACCTGTGTTGATACYAC
探针11       CTGATTGCCCCAACAAAT
探针12       TATWTGTTGGCATAATCAATTA
探针13       ACAAAYAACTGATTGCCCCA
探针14       ACTACAGTAACAAAYAATTG
探针15       ACAAACAACTGATTATGCCAAC
探针16       CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC
探针17       TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG
探针18       CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC；
上述探针的3’端连接有MGB，5’端连接有荧光基团，其中，三色高危HPV荧光检测试剂盒探针1～15分别用于检测15种常见高风险HPV基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82；探针16～18分别用于检测三种少见高风险HPV基因型26、53、73。四色高危HPV荧光检测试剂盒探针1用于检测常见高风险HPV基因型16型；探针2用于检测常见高风险HPV基因型18型；探针3～18分别用于检测另外13种常见高风险HPV基因型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82和三种少见高风险HPV基因型26、53、73。
优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的通用引物为：
引物1 GCMCAGGGWCATAAYAATGG
引物2 GCTCAGGGTTTAAACAATGG
引物3 GCCCAGGGCCACAATAATGG
引物4 GCNCAGGGNCACAATAATGG
引物5 GCNCAGGGNCATAACAATGG
引物6 GCNCAGGGNCATAATAATGG
引物7 CGTCCMARRGGAWACTGATC
引物8 TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
引物9 CCTATTCTTCACCATGCCTTA
引物10 TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC；
引物中的N指肌苷。
优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒设有内标引物及内标探针，内标引物如下：
引物11 CAACTTCATCCACGTTCACC
引物12 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 
内标探针的序列如下：
探针19, TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC。
优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统中添加有UDG酶。
优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统含有经过化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为5U，dNTPs为0.2mmol/L，UDG酶为0.3U。
优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒还设有DNA提取液，DNA提取液的组成为EDTA的浓度为0.25mol/L、乙酸钠的浓度为25mmol/L和DTT的浓度为1mmol/L。
优选的，上述三色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的探针16～18连接的荧光基团不同于探针1～15连接的荧光基团。
优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒为三色高危HPV荧光检测试剂盒，其中所使用的内标探针上连接的荧光基团不同于探针1～18的。
优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒为四色高危HPV荧光检测试剂盒，其中所使用的探针1连接的荧光基团不同于探针2，3～18连接的荧光基团。
优选的，上述四色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的探针2连接的荧光基团不同于探针1，3～18连接的荧光基团。
优选的，上述四色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的内标探针上连接的荧光基团不同于探针1～18的。
本发明的有益效果是：
本发明的试剂盒适用于定性检测宫颈脱落细胞和生殖泌尿道分泌物样本中18种可引起宫颈癌的高风险HPV基因型。本发明应用多重荧光PCR技术实现了在同一管扩增体系中检测18种HPV基因型，同时三色高危HPV荧光检测试剂盒在同时检测15种常见高风险HPV基因型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82）时，还可检测三种少见高风险HPV基因型（26、53、73）。四色高危HPV荧光检测试剂盒在同时检测13种常见高风险HPV基因型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82）和三种少见高风险HPV基因型（26、53、73），同时还能具体分型高风险HPV基因型16型和18型，本发明的检测试剂盒，检测通量高，大大降低了筛查成本。
通过加入UDG酶防污染，使得本发明试剂盒的灵敏度更高，最低检出量为1.0E+03拷贝/反应。
附图说明
图1～6是本试剂盒检测范围内的检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步说明本发明。
三色高危HPV荧光检测试剂盒，包括DNA提取液、热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，荧光探针为HPV特异性MGB探针，HPV特异性MGB探针的序列如下：
探针1  TTGGCATAATCAATTATTT（SEQ ID NO：1）
探针2  TGGGGCAATCAGTTRTTTGT（SEQ ID NO：2）
探针3  CTGATTGTTCCARCARATG（SEQ ID NO：3）
探针4  AATCAGTTGTTTGTTACTGT（SEQ ID NO：4）
探针5  TTTRTTACCTGTGTTGATAC（SEQ ID NO：5）
探针6  TAACTGTTGTGGATACCAC（SEQ ID NO：6）
探针7  TATATGTTGGCACAATCAA（SEQ ID NO：7）
探针8  TGGTTACCCCAACAAATG（SEQ ID NO：8）
探针9  TAATTGATTATGCCAGCAAACA（SEQ ID NO：9）
探针10       TTACCTGTGTTGATACYAC（SEQ ID NO：10）
探针11       CTGATTGCCCCAACAAAT（SEQ ID NO：11）
探针12       TATWTGTTGGCATAATCAATTA（SEQ ID NO：12）
探针13       ACAAAYAACTGATTGCCCCA（SEQ ID NO：13）
探针14       ACTACAGTAACAAAYAATTG（SEQ ID NO：14）
探针15       ACAAACAACTGATTATGCCAAC（SEQ ID NO：15）
探针16       CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC（SEQ ID NO：16）
探针17       TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG（SEQ ID NO：17）
探针18       CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC（SEQ ID NO：18）；
上述探针的3’端连接有MGB，5’端连接有荧光基团，其中，探针1～15连接的荧光基团为FAM，探针16～18连接的荧光基团为ROX。
四色高危HPV荧光检测试剂盒，包括DNA提取液、热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，荧光探针为HPV特异性MGB探针，HPV特异性MGB探针的序列如下：
探针1  TTGGCATAATCAATTATTT（SEQ ID NO：1）
探针2  TGGGGCAATCAGTTRTTTGT（SEQ ID NO：2）
探针3  CTGATTGTTCCARCARATG（SEQ ID NO：3）
探针4  AATCAGTTGTTTGTTACTGT（SEQ ID NO：4）
探针5  TTTRTTACCTGTGTTGATAC（SEQ ID NO：5）
探针6  TAACTGTTGTGGATACCAC（SEQ ID NO：6）
探针7  TATATGTTGGCACAATCAA（SEQ ID NO：7）
探针8  TGGTTACCCCAACAAATG（SEQ ID NO：8）
探针9  TAATTGATTATGCCAGCAAACA（SEQ ID NO：9）
探针10       TTACCTGTGTTGATACYAC（SEQ ID NO：10）
探针11       CTGATTGCCCCAACAAAT（SEQ ID NO：11）
探针12       TATWTGTTGGCATAATCAATTA（SEQ ID NO：12）
探针13       ACAAAYAACTGATTGCCCCA（SEQ ID NO：13）
探针14       ACTACAGTAACAAAYAATTG（SEQ ID NO：14）
探针15       ACAAACAACTGATTATGCCAAC（SEQ ID NO：15）
探针16       CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC（SEQ ID NO：16）
探针17       TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG（SEQ ID NO：17）
探针18       CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC（SEQ ID NO：18）；
上述探针1～18的3’端连接有MGB，5’端连接有荧光基团，其中，探针1连接的荧光基团为HEX，探针2连接的荧光基团为ROX，3～18连接的荧光基团为FAM。
上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的通用引物为：
引物1 GCMCAGGGWCATAAYAATGG（SEQ ID NO：19）
引物2 GCTCAGGGTTTAAACAATGG（SEQ ID NO：20）
引物3 GCCCAGGGCCACAATAATGG（SEQ ID NO：21）
引物4 GCNCAGGGNCACAATAATGG（SEQ ID NO：22）
引物5 GCNCAGGGNCATAACAATGG（SEQ ID NO：23）
引物6 GCNCAGGGNCATAATAATGG（SEQ ID NO：24）
引物7 CGTCCMARRGGAWACTGATC（SEQ ID NO：25）
引物8 TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC（SEQ ID NO：26）
引物9 CCTATTCTTCACCATGCCTTA（SEQ ID NO：27）
引物10 TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC（SEQ ID NO：28）；
引物中的N指肌苷，可与A、T、C、G中的任一种配对。
上述多色高危HPV荧光检测试剂盒设有内标引物及内标探针，内标引物如下：
引物11 CAACTTCATCCACGTTCACC（SEQ ID NO：29）
引物12 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC （SEQ ID NO：30）
内标探针的序列如下：
探针19, TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC（SEQ ID NO：31），三色高危HPV荧光检测试剂盒探针的5’端连接荧光基团HEX，3’端连接有MGB；四色高危HPV荧光检测试剂盒探针的5’端连接荧光基团CY5，3’端连接有MGB。
上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统含有经过化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为5U，dNTPs为0.2mmol/L，UDG酶为0.3U。
上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的DNA提取液的组成为EDTA的浓度为0.25mol/L、乙酸钠的浓度为25mmol/L和DTT的浓度为1mmol/L，1200μl / 管。
阴性质控品：灭菌纯化水，100μl / 管；
HPV阳性质控品：HPV-18型样本，100μl / 管。
检测操作如下：
1.      样本处理与DNA提取
1.1  向宫颈刷保存管中加入2ml灭菌生理盐水（务必使拭子头完全浸入液体中），震荡60秒（使细胞充分落入液体，灭菌生理盐水变浑浊），将全部洗涤液转至相应编号的2ml 离心管；
1.2  编好号的样品10,000rpm离心3分钟，弃上清；
1.3  样品沉淀中加入1ml灭菌生理盐水，洗涤沉淀，10,000rpm离心3分钟，弃上清；
1.4  样品沉淀中加入50μl病毒提取液，震荡60秒，充分悬浮细胞沉淀，备用。
DNA的提取也可以使用其他公知的方法进行。
2.       质控品处理
取装有HPV阳性质控品、阴性质控品的离心管，10,000rpm离心30秒，然后按1.3～1.4的提取步骤操作。
3.      核酸扩增试剂准备（试剂准备区，冰上操作）
1)      从试剂盒中取出HR HPV PCR 反应管，瞬时离心备用；
2)      往上述反应管中分别加入提取后的待测样本核酸20μl（如样本不足20μl，请用灭菌纯化水补足20μl后加样）、阴性质控品、阳性质控品各20μl。盖紧管盖，5000rpm离心30秒后转移至扩增检测区。
4.      PCR扩增
PCR参数为：
50℃，3 min；95℃，5min；
95℃， 5 s，58℃，31 s，循环45次。
在58℃时测定荧光值。
根据荧光值变化曲线，确定检测结果。
质量控制
。
使用本试剂盒和对照试剂盒对临床样本进行检测，两者不符的使用复核试剂盒进行检测，并根据对照与复核检测结果将样本分为阳性组和阴性组，对比本试剂盒检测的Ct值，从而确定本试剂盒参考值，当本试剂盒Ct值大于37时，均属于阴性组，当本试剂盒Ct值小于等于37时，均属于阳性组。因此，将Ct值大于37作为为本试剂盒的参考值（CUTOFF值）。
使用本发明检测试剂盒的检测结果示意图如图1～6所示。从图中可以清楚地看出，本发明的检测试剂盒可以有效地检测出高危型HPV，检测结果准确可靠。
<110>  NN
 
<120>  多色高危HPV荧光检测试剂盒
 
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<210>  19
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<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  19
gcmcagggwc ataayaatgg                                                   20
 
 
<210>  20
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  20
gctcagggtt taaacaatgg                                                   20
 
 
<210>  21
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  21
gcccagggcc acaataatgg                                                   20
 
 
<210>  22
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (3)..(3)
<223>  n为肌苷
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(9)
<223>  n为肌苷
 
<400>  22
gcncagggnc acaataatgg                                                   20
 
 
<210>  23
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (3)..(3)
<223>  n为肌苷
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(9)
<223>  n为肌苷
 
<400>  23
gcncagggnc ataacaatgg                                                   20
 
 
<210>  24
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (3)..(3)
<223>  n为肌苷
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(9)
<223>  n为肌苷
 
<400>  24
gcncagggnc ataataatgg                                                   20
 
 
<210>  25
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  25
tgaaaaataa actgtaaatc atattc                                            26
 
 
<210>  26
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  26
tgaaaaataa actgtaaatc atattc                                            26
 
 
<210>  27
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  27
cctattcttc accatgcctt a                                                 21
 
 
<210>  28
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  28
tggtattgat attatgaatg tatgac                                            26
 
 
<210>  29
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  29
caacttcatc cacgttcacc                                                   20
 
 
<210>  30
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  30
gaagagccaa ggacaggtac                                                   20
 
 
<210>  31
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  31
tctccctgca gagggttaag gcgc                                              24

Claims (9)

1.多色高危HPV荧光检测试剂盒，包括热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，其特征在于：所述荧光探针为HPV特异性MGB探针，HPV特异性MGB探针的序列如下：
探针1  TTGGCATAATCAATTATTT
探针2  TGGGGCAATCAGTTRTTTGT
探针3  CTGATTGTTCCARCARATG
探针4  AATCAGTTGTTTGTTACTGT
探针5  TTTRTTACCTGTGTTGATAC
探针6  TAACTGTTGTGGATACCAC
探针7  TATATGTTGGCACAATCAA
探针8  TGGTTACCCCAACAAATG
探针9  TAATTGATTATGCCAGCAAACA
探针10 TTACCTGTGTTGATACYAC
探针11 CTGATTGCCCCAACAAAT
探针12 TATWTGTTGGCATAATCAATTA
探针13 ACAAAYAACTGATTGCCCCA
探针14 ACTACAGTAACAAAYAATTG
探针15 ACAAACAACTGATTATGCCAAC
探针16 CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC
探针17 TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG
探针18 CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC；
上述探针的3’端连接有MGB，5’端连接有荧光基团。
2.根据权利要求1所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述通用引物为：
引物1 GCMCAGGGWCATAAYAATGG
引物2 GCTCAGGGTTTAAACAATGG
引物3 GCCCAGGGCCACAATAATGG
引物4 GCNCAGGGNCACAATAATGG
引物5 GCNCAGGGNCATAACAATGG
引物6 GCNCAGGGNCATAATAATGG
引物7 CGTCCMARRGGAWACTGATC
引物8 TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
引物9 CCTATTCTTCACCATGCCTTA
引物10 TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC；
引物中的N指肌苷。
3.根据权利要求1或2所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒设有内标引物及内标探针，内标引物如下：
引物11 CAACTTCATCCACGTTCACC
引物12 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 
内标探针的序列如下：
探针19 TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC。
4.根据权利要求1或2所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述热启动Taq酶系统中添加有UDG酶。
5.根据权利要求1或2所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还设有DNA提取液，DNA提取液的组成为EDTA的浓度为0.25mol/L、乙酸钠的浓度为25mmol/L和DTT的浓度为1mmol/L。
6.根据权利要求4所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述热启动Taq酶系统含有经过化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为5U，dNTPs为0.2mmol/L，UDG酶为0.3U。
7.根据权利要求1、2或6所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述多色高危HPV荧光检测试剂盒为三色高危HPV荧光检测试剂盒，其探针16～18连接的荧光基团不同于探针1～15连接的荧光基团。
8.根据权利要求1、2或6所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述多色高危HPV荧光检测试剂盒为四色高危HPV荧光检测试剂盒，其探针1～2连接的荧光基团不同于探针3～18连接的荧光基团。
9.根据权利要求3所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：内标探针连接的荧光基团不同于探针1～18连接的荧光基团。
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