CN109554506A - 一种用于检测病原体的引物和探针的设计方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于检测高危型HPV等病原体多种亚型的引物和探针的设计方法,所设计的引物和探针可用于对样品中可能存在的病原体多种亚型进行初步检测和型别鉴定。本发明基于高危型HPV等病原体多种亚型在进化树上的亲缘性,设计病原体多种亚型引物和探针,在保证检测准确性、灵敏度和特异性的同时,显著降低背景荧光值,并显著增加检测通量和极大地降低检测成本。
Description
本申请为申请号:201610027771.9,申请名称:用于检测高危型HPV的方法、寡核苷酸和试剂盒的分案申请。
技术领域
本发明属于生物科学和生物技术领域,特别涉及一种检测病原体多种亚型的引物和探针的设计方法,所设计出的引物和探针可用于对临床样品中可能存在的高危型HPV等病原体的多种亚型进行初步检测和型别鉴定。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一类可感染人表皮和粘膜鳞状上皮的小DNA病毒,能够引发尖锐湿疣和宫颈癌等疾病。人类是HPV的唯一宿主。HPV基因组为双链环状DNA,长约7900对碱基(bp),含8个开放阅读框(open reading frames,ORFs),由3个基因区组成,包括早期区(E区)、晚期区(L区)以及非编码区或上游调控区。E区按顺序可分为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7个基因,其中E6和E7是HPV的主要致癌基因,与HPV的细胞转化功能和致癌性相关。L区主要有L1和L2两个基因。
目前科学家们已发现120种以上的HPV亚型。不同的HPV亚型感染导致不同病变,根据其是否可以引起癌症,HPV亚型可分为:高危型HPV,与宫颈癌和宫颈上皮内瘤变(CIN I/II/III)的发生相关,常见的有HPV16、18、31、33、35、45、51、52、56、58、29、68等亚型;低危型HPV,一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关,极少引起浸润癌,常见的有如HPV6、11、42、43、44等亚型。关于高危型HPV与低危型HPV的划分,国际上许多机构都给出了参考建议,依据WHO国际癌症研究机构(IARC)及其他国际组织的研究成果,将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68共13种亚型列为高危HPV,并将HPV26、53、66、73和82共5种亚型列为中等风险HPV。在实际检测时,常常将中等风险HPV亚型也归于高危型HPV。
80%的女性一生中都会感染HPV病毒,通常病毒在6~8个月内会自然清除,仅25%会发生癌前病变。高危型HPV的反复或持续感染被视为几乎所有宫颈癌发生的必要条件。现有研究结果显示,宫颈病变程度越重,高危型HPV感染率越高;在CINI、CINII和CINIII患者中,高危型HPV感染率分别为30%、55%和65%,而99.8%以上的宫颈癌患者体内能检测到高危型HPV感染,HPV阴性者几乎不会发生宫颈癌。在这些高危型HPV中,最为常见的是HPV16,其次为HPV18,这两种高危型HPV亚型的感染率最高,可达70%;若再加上HPV45和HPV31,这4种高危型HPV的感染率可达80%左右。我国一项横跨7个宫颈癌发病率不同地区的19家医院、共纳入1244个病例的中国宫颈癌相关高危型HPV亚型分布(以医院为基础的)多中心研究证实,中国不同区域的宫颈癌及宫颈高度病变都是以感染HPV16/18为主,大约85%的宫颈癌确诊病例属于这两种亚型,且HPV16/18的感染率和致癌率都明显高于其他高危型HPV(Chen W et al.Human papillomavirus type-distribution in cervicalcancer in China:the importance of HPV 16and 18.Cancer Causes and Control,2009,20:1705-1713)。
此外,已有研究表明感染HPV16/18的女性,不论是近期还是远期,进展为高度宫颈病变的风险都远远高于其它高危型HPV。基于此,2013年美国阴道镜检查与宫颈病理学会(ASCCP)特别提出要对细胞学ASC-US(即通过宫颈液基薄层细胞学检查发现的细胞学上无明确意义的非典型鳞状细胞的改变)阴性、HPV阳性的30岁以上女性进行HPV16/18基因分型检测。由于不同HPV亚型的致病性及预后的差异,对HPV16/18进行分型,将有助于更好地对高风险人群进行风险分层管理,及时发现细胞学正常结果中患CIN的高危人群,以及ASC-US阳性结果中需要更密切随访的人群。
宫颈癌早期症状并不明显,发展过程中存在较长的、可逆转的癌前病变期。从一般的宫颈癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间。如能在癌前病变阶段进行医学干预,宫颈癌治愈率可达98%。因此,对高危型HPV进行筛查仍是目前预防宫颈癌的关键。
目前常见的高危型HPV检测方法有荧光PCR法、杂交捕获法和PCR-反向点杂交法等。杂交捕获法的缺点是无内标,检测时间长(一般需要5-6小时),灵敏度低(3.5×105copies/ml),操作复杂,检测基因型偏少,假阳性率较高。PCR-反向杂交法虽然能够检测比较多的HPV亚型,但是其缺点是检测时间长(至少需要4小时),检测成本高,检测灵敏度低(104copies/ml),操作复杂,不能满足临床高通量筛查的需要。
荧光PCR法具有较高的灵敏度和特异性,而且能对扩增产物进行实时在线检测,能够大幅度地降低检测时间,同时还避免残留污染的发生。常见的荧光PCR法有SYBR Green I染料法,双探针杂交法以及Taqman探针法等。其中SYBR Green I由于是非饱和染料,特异性不如双探针杂交法以及Taqman探针法,必须通过观察溶解曲线来判断其特异性;而双探针法杂交法成本又较为昂贵。
目前国内市场上,已有不少厂家开发出基于荧光PCR法检测高危型HPV的产品,且大多是同时检测13、14或15种高危型HPV的,只有少数厂家利用荧光PCR法开发出同时检测常见的18种高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82)的产品,然而,在这些产品中,有的是针对每种高危型HPV设计一对型特异性引物和一条型特异性探针,这会急剧增加检测成本,同时这么多探针的存在也会显著增加背景荧光信号;有的还是进行多管检测,这会显著增加样品和检测试剂的用量,增加检测成本,且也不能对HPV16和HPV18进行分型;更有甚者,针对不同高危型HPV设计出的引物和/或探针局限在同一个基因区域上,碱基序列差别太小,会导致交叉性的扩增反应,产生假阳性,不能准确地区分其具体型别。
发明内容
针对现有技术的不足之处,本发明提供一种用于检测高危型HPV(尤其是常见的18种高危型HPV,即HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82)的方法、寡核苷酸和试剂盒,所述方法、寡核苷酸和试剂盒所涉及的引物和探针是通过构建高危型HPV的进化树,基于这些高危型HPV在进化树上的亲缘性,让一些高危型HPV共用上游或下游引物和探针,在保证检测准确性、灵敏度和特异性的同时,显著增加检测通量,并极大地降低检测成本。
本发明中的引物和/或探针的碱基序列若含有字母“Y”、“S”、“R”或“M”,则表明该引物和/或探针为简并引物或简并探针,其中Y代表C或T,S代表G或C,R代表A或G,M代表A或C。
本发明提供一种用于检测高危型HPV的引物和探针的设计方法,包括以下步骤:在为HPV31、HPV33、HPV 35、HPV52和HPV58设计上下游引物和探针时,选择HPV31、HPV33、HPV35、HPV52和HPV58在E1基因上比较高的同源性区域,让HPV31和HPV35共用下游引物,HPV33、HPV52和HPV58共用下游引物,同时这5种高危型HPV共用一条探针;在为HPV45和HPV59设计上下游引物和探针时,选择HPV45和HPV59在E2基因上比较高的同源性区域,让HPV45和HPV59共用一条探针;在为HPV39和HPV68设计上下游引物和探针时,选择HPV39和HPV68在E2基因上比较高的同源性区域,让HPV39和HPV68共用上游引物、下游引物和一条探针;在为HPV26、HPV51和HPV82设计上下游引物和探针时,HPV26、HPV51和HPV82在E2基因上比较高的同源性区域,让HPV51和HPV82共用上游引物,HPV51、HPV82和HPV26共用下游引物和一条探针;在为HPV53、HPV56和HPV66设计上下游引物和探针时,选择HPV53、HPV56和HPV66在E7基因上比较高的同源性区域,让HPV56和HPV66共用上游引物,HPV56、HPV66与HPV53共用一条探针。
进一步地,鉴于HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82这16种高危型HPV感染比例相应较低,让为所述16种高危型HPV设计的探针共用相同的荧光报告基团。
进一步地,为了确定HPV16和HPV18的型别,针对HPV16和HPV18在L1基因上的序列差异,分别设计一对上下游引物和一条探针,让为HPV16设计的探针和为HPV18设计的探针具有不同的荧光报告基团。
进一步地,让为HPV16设计的探针和为HPV18设计的探针的荧光报告基团与为HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82这16种高危型HPV设计的探针的荧光报告基团均不相同。
进一步地,在设计HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82的上下游引物和探针之前,依据HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82共18种高危型HPV亚型的DNA序列,绘制它们的进化树,确定这18种高危型HPV亚型的亲缘关系。
进一步地,所使用的每条探针的荧光报告基因选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640或LC RED705。
进一步地,所使用的每条探针的淬灭基团选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse或NFQ。
本发明还提供一种检测病原体多种亚型的引物和探针的设计方法,包括以下步骤:(1)分析和确定不同亚型之间具有较高同源性区域的基因;(2)按具有较高同源性区域的基因,将所述多种亚型分为不同的检测组;(3)针对步骤(1)中选择的基因以及步骤(2)中的检测组,让检测组中的至少两种亚型共用一条上游引物,或一条下游引物,或一条探针。
进一步地,还包括在步骤(1)之前还包括绘制不同亚型的进化树,以确定不同亚型的亲缘关系。
进一步地,所述病原体为HPV,在为HPV31、HPV33、HPV 35、HPV52和HPV58检测组设计上下游引物和探针时,选择HPV31、HPV33、HPV 35、HPV52和HPV58在E1基因上比较高的同源性区域,让HPV31和HPV35共用下游引物,HPV33、HPV52和HPV58共用下游引物,同时这5种高危型HPV共用一条探针;在为HPV45和HPV59检测组设计上下游引物和探针时,选择HPV45和HPV59在E2基因上比较高的同源性区域,让HPV45和HPV59共用一条探针;在为HPV39和HPV68检测组设计上下游引物和探针时,选择HPV39和HPV68在E2基因上比较高的同源性区域,让HPV39和HPV68共用上游引物、下游引物和一条探针;在为HPV26、HPV51和HPV82检测组设计上下游引物和探针时,HPV26、HPV51和HPV82在E2基因上比较高的同源性区域,让HPV51和HPV82共用上游引物,HPV51、HPV82和HPV26共用下游引物和一条探针;在为HPV53、HPV56和HPV66检测组设计上下游引物和探针时,选择HPV53、HPV56和HPV66在E7基因上比较高的同源性区域,让HPV56和HPV66共用上游引物,HPV56、HPV66与HPV53共用一条探针。
进一步地,鉴于HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82这16种高危型HPV感染比例相应较低,让为所述16种高危型HPV设计的探针共用相同的荧光报告基团。
进一步地,为了确定HPV16和HPV18的型别,针对HPV16和HPV18在L1基因上的序列差异,分别设计一对上下游引物和一条探针,让为HPV16设计的探针和为HPV18设计的探针具有不同的荧光报告基团。
进一步地,让为HPV16设计的探针和为HPV18设计的探针的荧光报告基团与为HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82这16种高危型HPV设计的探针的荧光报告基团均不相同。
进一步地,在设计HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82的上下游引物和探针之前,依据HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82共18种高危型HPV亚型的DNA序列,绘制它们的进化树,确定这18种高危型HPV亚型的亲缘关系。
进一步地,所使用的每条探针的荧光报告基因选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640或LC RED705。
进一步地,所使用的每条探针的淬灭基团选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse或NFQ。
有益效果:基于18种高危型HPV及其他型别在进化树上的亲缘性,本发明设计高危型HPV引物和探针,让一些高危型HPV亚型共享上游/下游引物和探针,从而显著降低引物和探针的使用数量,在保证检测准确性、灵敏度和特异性的同时,显著降低背景荧光值,并显著增加检测通量和极大地降低检测成本;此外,本发明设计的引物和探针是针对于选择多个基因的同源性比较高的区域,而不是局限于单个基因区域内,这有助于避免交叉反应和进一步开展型别鉴定。
附图说明
图1为18种常见的高危型HPV进化树图。
图2为临床宫颈棉拭子样品VIC通道(检测样品中是否存在HPV16)检测结果图。
图3为临床宫颈棉拭子样品Texas Red通道(检测样品中是否存在HPV18)检测结果图。
图4为临床宫颈棉拭子样品FAM通道(检测样品中是否存在除HPV16和HPV18之外的其他16种高危型HPV中的至少一种)检测结果图。
图5为临床宫颈棉拭子样品Cy5通道(检测内标β-globin)检测结果图。
图6为HPV16阳性参考品VIC通道检测结果图。
图7为HPV18阳性参考品Texas Red通道检测结果图。
图8为HPV26、31、33、35、45、56、58、59、66、73、82阳性参考品FAM通道检测结果图。
图9为HPV国家参考品内标Cy5通道检测结果图。
图10为13种高危型HPV阳性参考品灵敏度检测结果图。
图11为背景荧光信号的对比结果图。
具体实施方式
在检测18种常见的高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82)中,由于HPV16/18的感染率和致癌率都明显高于其他高危型HPV亚型,因此有必要在检测样品中是否存在至少一种高危型HPV亚型存在的同时,同时还应对HPV16和HPV18进行分型。
在发明中,为了尽可能地降低荧光PCR扩增时可能产生的非特异性扩增,在荧光PCR反应液中加入抗Taq DNA聚合酶抗体,该抗体可结合Taq DNA聚合酶的活性位点,从而使得Taq DNA聚合酶不能发挥作用,只有在变性阶段,抗Taq DNA聚合酶抗体在高温下失活而不能结合到Taq DNA聚合酶的活性位点上,从而使得Taq DNA聚合酶能够发挥催化作用,合成出新的DNA链。
本发明的引物和探针设计及其基因分型思路如下:首先依据这18种高危型HPV亚型的DNA序列,绘制它们的进化树(如图1所示),根据它们在进化树上的亲缘关系,让一些高危型HPV亚型共享上游/下游引物和探针,同时从而显著降低引物和探针的数量,不仅显著降低检测成本,同时也显著降低背景荧光信号,提高检测准确性。
鉴于HPV的L1基因同源性较差,常用于分型,本发明成功地选择一些高危型HPV同源性比较高的基因组区域作为靶标来设计一些共用的引物和探针,其中HPV31、33、35、52和58在E1基因上具有比较高的同源性区域;HPV45和59在E2基因上具有比较高的同源性区域;HPV39和68在E2基因上具有比较高的同源性区域;HPV26、51和82在E2基因上具有比较高的同源性区域;HPV53、56和66在E7基因上具有比较高的同源性区域。基于此,在设计引物和探针时,本发明让HPV31和HPV35共用下游引物(HPV31/35R),HPV33、HPV52和HPV58共用下游引物(HPV33/52/58R),同时这5种高危型HPV共用一条探针(Probe3);HPV45和HPV59共用一条探针(Probe4);HPV39和HPV68共用上游引物(HPV39/68F)、下游引物(HPV39/68R)和一条探针(Probe5);HPV56和HPV66共用上游引物(HPV56/66F),这两种高危型HPV亚型还与HPV53共用一条探针(Probe6);HPV51和HPV82共用上游引物(HPV51/82F),这两种高危型HPV亚型还与HPV26共用下游引物(HPV26/51/82R)和一条探针(Probe7),这就显著降低引物和探针的数量,同时鉴于除HPV16和HPV18之外的其他16种高危型HPV亚型的感染比例相应较低,让探针Probe3、Probe4、Probe5、Probe6、Probe7和Probe8共用相同的荧光报告基团,这些都有助降低试剂开发成本,便于产品的开发。
更重要的是,本发明在检测宫颈癌高风险临床样品时,每次单管检测就可确定每份样品是否含有HPV16和HPV18,同时还可判断是否存在其他16种高危型HPV亚型中的至少一种,若存在其他16种高危型HPV亚型中的至少一种,还可选择其他16种高危型HPV亚型中每种亚型的特异性引物和探针再次进行荧光PCR检测,进一步确定其型别。基于HPV16和HPV18的感染率为70%,利用本发明提供的引物和探针,单管检测一次就可排除大部分样品中没有感染上其他16种高危型HPV亚型,而不必再进行后续的型别检测,这不仅节省了检测成本,同时也增加了一个批次的检测通量。再者,本发明并没有像市场上一些产品那样,针对HPV同一个基因(主要为L1基因)上设计引物和探针,而是在4个基因(L1、E1、E2和E7)上设计引物和探针,这样就可尽可能避免在同一个基因上设计不同高危型HPV引物和探针时因一些型特异性引物和探针的碱基序列差异性过小而导致交叉反应产生,从而不能准确地区分高危型HPV(尤其是HPV16和HPV18)的型别。最后,本发明还引入内标检测,这会增加检测准确性和可靠性。
本发明使用9条TaqMan探针,每条探针的5’端为荧光报告基团,3’端为发出荧光或不发出荧光的淬灭基团,其中探针Probe1和Probe2使用不同的荧光报告基团;Probe3、Probe4、Probe5、Probe6、Probe7和Probe8使用相同的荧光报告基团;Probe1、Probe2和Probe9使用的荧光报告基团各不相同,且这三者还与Probe3、Probe4、Probe5、Probe6、Probe7和Probe8使用的荧光报告基团也不相同。这9条探针的荧光报告基团可选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640和LC RED705等;淬灭基团可选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse和NFQ等,淬灭基团的选择原则在于淬灭基团的荧光吸收光谱与荧光报告基团的发射光谱存在重叠。
为了便于说明,以表1给出的引物和探针为例进行说明。这样在单一反应管中,对临床样品进行荧光PCR扩增,分四色检测HPV16(VIC通道)、HPV18(Texas Red通道)、除HPV16和HPV18之外的其他16种高危型HPV(FAM通道)、内标β-globin(Cy5通道),不仅可以检测样品中是否存在至少一种高危型HPV亚型,而且还能对HPV16和HPV18进行分型。
表1.引物和探针
以下实施例进一步说明本发明。这些实施例不是用来限制本发明范围,而是提供对本发明的进一步理解。
实施例1:样品DNA提取
为了便于说明,本实施例以宫颈棉拭子样品以及所用的样品核酸提取试剂含有裂解液、异丙醇和1×TE缓冲液为例进行说明:
(1)取出宫颈棉拭子样品,震荡混匀后,吸取1mL样品于1.5mL离心管中,12000rpm离心1min,小心吸弃上清液,保留沉淀;
(2)往(1)中的沉淀加入500μl裂解液,震荡混匀,100℃水浴或者干浴10min,其中裂解液为含0.2M NaCl、10mM NaOH、0.1%SDS、0.5%NP-40和0.5%Tween-20的1×TE缓冲液;
(3)加入500μl异丙醇,震荡混匀,室温放置2min,12000rpm离心5min,弃上清液,室温放置2min;
(4)加入50μl 1×TE缓冲液,充分溶解,室温静置5min,12000rpm离心1min,上清液即为DNA溶液,备用。
实施例2:荧光PCR反应步骤
(1)配制高危型HPV荧光PCR反应液:4μl 10×PCR Buffer(100mM Tris-HCl,500mMKCl);0.08μl dATP(0.4mM)、0.08μl dTTP(0.4mM)、0.08μl dCTP(0.4mM)、0.08μl dGTP(0.4mM);0.8μl BSA(10mg/mL);6.4μl MgCl2(25mM);0.05μl HPV16F(100μM)、0.08μlHPV16F(100μM)、0.08μl Probe1(100μM);0.05μl HPV18F(100μM)、0.08μl HPV18F(100μM)、0.08μl Probe2(100μM);0.08μl HPV31F(100μM)、0.08μl HPV35F(100μM)、0.08μl HPV31/35R(100μM)、0.08μl HPV33F(100μM)、0.08μl HPV52F(100μM)、0.08μl HPV58F(100μM)、0.08μl HPV33/52/58R(100μM)、0.06μl Probe3(100μM);0.08μl HPV45F(100μM)、0.06μlHPV45R(100μM)、0.08μl HPV59F(100μM)、0.06μl HPV59R(100μM)、0.06μl Probe4(100μM);0.08μl HPV39/68F(100μM)、0.08μl HPV39/68R(100μM)、0.06μl Probe5(100μM);0.08μlHPV53F(100μM)、0.08μl HPV53R(100μM)、0.08μl HPV56/66F(100μM)、0.08μl HPV56R(100μM)、0.08μl HPV66R(100μM)、0.06μl Probe6(100μM);0.08μl HPV26F(100μM)、0.06μlHPV51/82F(100μM)、0.08μl HPV26/51/82R(100μM)、0.06μl Probe7(100μM);0.08μlHPV73F(100μM)、0.08μl HPV73R(100μM)、0.05μl Probe8(100μM);0.04μl IC-F(100μM)、0.04μl IC-R(100μM)、0.03μl Probe9(100μM);0.4μl Taq DNA聚合酶(购买自Promega)、0.067μl抗Taq DNA聚合酶抗体;剩下的加入ddH2O使其体积为36μl,其中所述Taq DNA聚合酶和抗Taq DNA聚合酶抗体最好在使用前加入到高危型HPV荧光PCR反应液中;
(2)计算需准备的样品数n份[n=临床样品数+1管阳性对照液+1管阴性对照液],将36μl(1)中配制的高危型HPV荧光PCR反应液加入到不同的反应管中,然后分别往不同的反应管中加入4μl实施例1中提取的DNA溶液、4μl阴性对照溶液和4μl阳性对照溶液,其中阳性对照液为含有高危型HPV核酸的溶液,阴性对照液为不含有高危型HPV核酸的溶液。
(3)将各反应管按一定顺序放入荧光PCR仪上,按以下程序进行PCR扩增,扩增程序如表2所示:
表2荧光PCR扩增程序
(4)步骤(3)结束后,根据FAM通道、VIC通道、Texas Red通道、Cy5通道的Ct值检测高危型HPV是否存在,其检测结果判断如表3所示:
表3检测结果判断
实施例3:临床样品检测
按实施例1中的方法提取140例HPV宫颈棉拭子样品中的DNA,然后按照实施例2中的方法分别对这140例HPV宫颈拭子样品中的DNA进行荧光PCR扩增。与此同时,为了便于比较,利用Roche Combas 480 14种高危型HPV(即HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和66)检测试剂盒对这140例HPV宫颈拭子样品中的DNA进行检测,检测结果如表4所示。
表4检测结果
临床样品例数 | Roche检测结果 | Acon检测结果 |
16 | HPV16 | HPV16 |
5 | HPV18 | HPV18 |
8 | ++、HPV16 | ++、HPV16 |
3 | ++、HPV18 | ++、HPV18 |
93 | ++ | ++ |
9 | -- | -- |
6 | -- | ++ |
表4中的结果结果表明,在这种140例临床样品中,本发明对134例临床样品的检测结果与Roche试剂盒中的一致,但还有6例临床样品,本发明能够检测出高危型HPV的存在,而Roche试剂盒则不能检测出高危型HPV的存在。通过Sanger测序法确认,这6例样品分别含有HPV53、HPV82、HPV73、HPV53、HPV26和HPV26。这进一步验证了本发明的检测准确性。此外,本发明是在单个反应管中对临床样品中可能存在的18种高危型HPV进行四通道荧光PCR检测,其中图2为VIC通道(检测临床样品中是否存在HPV16)检测结果;图3为Texas Red通道(检测临床样品中是否存在HPV18)检测结果;图4为FAM通道(检测临床样品中是否存在除HPV16和HPV18之外的其他16种高危型HPV中的至少一种)检测结果;图5为Cy5通道(检测内标β-globin)检测结果。优选地,对于那些在第一次荧光PCR扩增中确定含有除HPV16和HPV18之外的至少一种高危型HPV的临床样品,本发明还可再利用除HPV16和HPV18之外的其他16种高危型HPV亚型的特异性引物和探针再进行荧光PCR扩增,从而确定其具体型别。
另外,相对于Roche的14种高危型HPV检测试剂盒,本发明能够检测更多的高危型HPV型别,更重要的是,针对多增加的高危型HPV型别,本发明并不只是简单地为它们中的每个型别设计特异性的引物和探针,而且考虑到它们与其他型别的亲缘关系,让HPV53与HPV56和HPV66共用同一条探针,让HPV82与HPV51共用上游引物,让HPV82、HPV51和HPV26共用下游引物和一条探针,同时还让检测HPV53、73、82、26与HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和66时所使用的探针共用同一个检测通道,这会有效地降低引物、探针和检测通道的数量,从而有效地降低检测成本和背景荧光信号。
实施例4:特异性检测结果
HPV国家参考品设置如下所示:
5种阴性参考品N1-N5:依次为沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、淋病奈瑟球菌(NG)、单纯疱疹病毒II型(HSV-2)、HPV核酸阴性宫颈棉拭子样品;
20种阳性参考品:依次为HPV6、11、61、67、69、71、81、16、18、26、31、33、35、45、56、58、59、66、73和82阳性参考品。
按照实施例2中的方法对每个HPV国家参考品进行荧光PCR扩增对每个HPV国家参考品进行荧光PCR检测,结果如下所示:
阴性参考品N1-N5和HPV6、11、61、67、69、71、81等5种阳性参考品的FAM、VIC和Texas Red通道检测结果均为阴性;HPV16阳性参考品的VIC通道检测结果为阳性,如图6所示;HPV18阳性参考品的Texas Red通道检测结果为阳性,如图7所示;HPV26、31、33、35、45、56、58、59、66、73、82阳性参考品FAM通道检测结果为阳性,如图8所示;内标Cy5通道检测结果为阳性,如图9所示。
实施例5:灵敏度检测结果
分别对实施例4中的HPV16、18、26、31、33、35、45、56、58、59、66、73和82阳性参考品进行梯度稀释至浓度为1×103copies/ml,按照实施例2中的方法对每个阳性参考品进行荧光PCR扩增,测试结果均为阳性,即本发明的检测灵敏度为1×103copies/ml。结果如图10所示。
实施例6:背景荧光信号检测结果
分别对实施例4中的HPV16、18、26、31、33、35、45、56、58、59、66、73和82阳性参考品按照本发明实施例2中的方法对每个阳性参考品进行荧光PCR扩增;同时为了进行对照,针对本发明能够检测的18种常见的高危型HPV,为每个高危型HPV设计一对特异性的引物和一条特异性的探针,在相同条件下也分别对同样的阳性参考品进行荧光PCR扩增,以FAM通道检测为示例,进行背景荧光信号的对比,对比结果如图11所示。由图11可知,本发明由于使用的探针数量显著减少,背景荧光信号显著降低,便于结果判读。
序列表
<110> 艾康生物技术(杭州)有限公司
<120> 一种用于检测病原体的引物和探针的设计方法
<160> 38
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Claims (10)
1.一种用于检测高危型HPV的引物和探针的设计方法,其特征在于:包括以下步骤:在为HPV31、HPV33、HPV 35、HPV52和HPV58设计上下游引物和探针时,选择HPV31、HPV33、HPV35、HPV52和HPV58在E1基因上比较高的同源性区域,让HPV31和HPV35共用下游引物,HPV33、HPV52和HPV58共用下游引物,同时这5种高危型HPV共用一条探针;在为HPV45和HPV59设计上下游引物和探针时,选择HPV45和HPV59在E2基因上比较高的同源性区域,让HPV45和HPV59共用一条探针;在为HPV39和HPV68设计上下游引物和探针时,选择HPV39和HPV68在E2基因上比较高的同源性区域,让HPV39和HPV68共用上游引物、下游引物和一条探针;在为HPV26、HPV51和HPV82设计上下游引物和探针时,HPV26、HPV51和HPV82在E2基因上比较高的同源性区域,让HPV51和HPV82共用上游引物,HPV51、HPV82和HPV26共用下游引物和一条探针;在为HPV53、HPV56和HPV66设计上下游引物和探针时,选择HPV53、HPV56和HPV66在E7基因上比较高的同源性区域,让HPV56和HPV66共用上游引物,HPV56、HPV66与HPV53共用一条探针。
2.如权利要求1所述的设计方法,其特征在于,让为HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82这16种高危型HPV设计的探针共用相同的荧光报告基团。
3.如权利要求1所述的设计方法,其特征在于,所述方法还包括以下步骤:针对HPV16和HPV18在L1基因上的序列差异,分别设计一对上下游引物和一条探针,让为HPV16设计的探针和为HPV18设计的探针具有不同的荧光报告基团。
4.如权利要求3所述的设计方法,其特征在于,所述HPV16的探针和HPV18的探针的荧光报告基团与所述HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82这16种高危型HPV的探针的荧光报告基团均不相同。
5.如权利要求1所述的设计方法,其特征在于,在设计HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82的上下游引物和探针之前,依据HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82共18种高危型HPV亚型的DNA序列,绘制它们的进化树,确定这18种高危型HPV亚型的亲缘关系。
6.如权利要求1-5之一所述的设计方法,其特征在于,所使用的每条探针的荧光报告基因选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640或LC RED705。
7.如权利要求1-5之一所述的设计方法,其特征在于,所使用的每条探针的淬灭基团选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse或NFQ。
8.一种检测病原体多种亚型的引物和探针的设计方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)分析和确定不同亚型之间具有较高同源性区域的基因;(2)按具有较高同源性区域的基因,将所述多种亚型分为不同的检测组;(3)针对步骤(1)中选择的基因以及步骤(2)中的检测组,让检测组中的至少两种亚型共用一条上游引物,或一条下游引物,或一条探针。
9.根据权利要求8所述的设计方法,其特征在于,还包括在步骤(1)之前还包括绘制不同亚型的进化树,以确定不同亚型的亲缘关系。
10.根据权利要求8至9之一所述的设计方法,其特征在于,所述病原体为HPV,在为HPV31、HPV33、HPV 35、HPV52和HPV58检测组设计上下游引物和探针时,选择HPV31、HPV33、HPV 35、HPV52和HPV58在E1基因上比较高的同源性区域,让HPV31和HPV35共用下游引物,HPV33、HPV52和HPV58共用下游引物,同时这5种高危型HPV共用一条探针;在为HPV45和HPV59检测组设计上下游引物和探针时,选择HPV45和HPV59在E2基因上比较高的同源性区域,让HPV45和HPV59共用一条探针;在为HPV39和HPV68检测组设计上下游引物和探针时,选择HPV39和HPV68在E2基因上比较高的同源性区域,让HPV39和HPV68共用上游引物、下游引物和一条探针;在为HPV26、HPV51和HPV82检测组设计上下游引物和探针时,HPV26、HPV51和HPV82在E2基因上比较高的同源性区域,让HPV51和HPV82共用上游引物,HPV51、HPV82和HPV26共用下游引物和一条探针;在为HPV53、HPV56和HPV66检测组设计上下游引物和探针时,选择HPV53、HPV56和HPV66在E7基因上比较高的同源性区域,让HPV56和HPV66共用上游引物,HPV56、HPV66与HPV53共用一条探针。
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