CN109402297A - 单管检测15种hpv基因型的试剂盒及方法 - Google Patents
单管检测15种hpv基因型的试剂盒及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109402297A CN109402297A CN201811307136.1A CN201811307136A CN109402297A CN 109402297 A CN109402297 A CN 109402297A CN 201811307136 A CN201811307136 A CN 201811307136A CN 109402297 A CN109402297 A CN 109402297A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hpv
- kinds
- kit
- single tube
- detects
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 claims description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 21
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 abstract description 5
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 46
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 2
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000007951 cervical intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种单管检测15种HPV基因型的试剂盒及方法，其中，所述试剂盒包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括：特异性扩增HPV的上游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：1‑3所示；特异性扩增HPV的下游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：4‑5所示；用于检测HPV的探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6‑8所示。本发明具有在常规用量时，最大限度的减少引物、探针间的相互干扰，使得检测性能大幅度的提升的优点。
Description
技术领域
本发明涉及病原体检测领域，特别涉及一种单管检测15种HPV基因型的试剂盒及方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的存在与长期感染与多种皮肤黏膜的良、恶性增生，特别是宫颈癌的发生、发展密切相关，病毒的各型基因序列与其生物学行为存在着高度相关性。不同基因型别的HPV具有不同的致病危险性。人乳头瘤病毒DNA的检测和分型对了解相关病情、判断预后及指导治疗具有重要价值，特别是对女性生殖道肿瘤的癌情预报具有重要意义。
目前世界上发现的HPV有110余种亚型，20余种HPV亚型从宫颈癌组织中分离，根据其致病力的大小分为高危型和低危型两种。低危型HPV主要引起生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CINI)，多呈一过性，可自然逆转。高危型HPV主要导致CINII-III级病变和宫颈癌的发生，持续高危型HPV感染的CINⅠ级易进展为CINII-III。根据我国目前临床和流行病调研资料，国内HPV高危型主要有16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304等型别。
目前HPV感染的实验室诊断方法主要有两大类，第一类是检查HPV的感染间接证据，如醋酸白试验，细胞学及组织学检查等。由于这些方法检测的是HPV感染后对机体造成的异常变化，而HPV感染后对机体造成特定的异常变化需要一定的时间，因此这些方法只能检测出亚临床期和临床期，检测不出潜伏期，对临床的早期诊断意义不大。
第二类是检查组织中是否有HPV存在，如免疫组化，超薄切片电镜技术或负染技术，以PCR为基础和HPV核酸分子检测等。由于这些方法检测的是HPV感染的直接证据，在时间上可比第一类方法能更早地检测出HPV感染，更适合早期诊断。免疫组化检测标本中是否存在HPV抗原，敏感性低，特异性高，繁琐、费时，目前已逐渐被淘汰。核酸印迹杂交的灵敏度及特异性均较高，但费时，繁杂，花费大，需用新鲜标本，实验室条件要求高，目前还未普遍用于临床。超薄切片电镜技术及负染技术可在电镜下看到典型的乳头瘤病毒颗粒，但受实验条件限制，一般的实验室很少采用。以PCR为基础和HPV核酸分子检测成为目前HPV检测的主流方法，包括测序分析法、限制性片段长度多态性、基因型特异性引物扩增法、型特异性核酸探针杂交法、实时荧光PCR技术。
以往采用实时荧光PCR技术同时检测多种HPV型别的方法，为兼顾不同型别的序列多态性，需要使用较多不同序列的荧光探针。如每个序列的探针使用常规浓度，则探针总浓度增加，荧光背景升高。由于荧光PCR仪的荧光检测量程有限，高荧光背景势必导致可检测的荧光增量减少，限制反应体系的检测性能。如每个序列的探针使用较低浓度，虽然可以获得较低的荧光背景，但由于反应前每个序列的探针绝对数量较少，也势必影响反应后的荧光增量，同样限制反应体系的检测性能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种单管检测15种HPV基因型的试剂盒及方法，在常规用量时，最大限度的减少引物、探针间的相互干扰，使得检测性能大幅度的提升。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种单管检测15种HPV基因型的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括：
特异性扩增HPV的上游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：1-3所示；
特异性扩增HPV的下游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：4-5所示；
用于检测HPV的探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6-8所示。
一种单管检测15种HPV基因型的方法，通过使用上述的单管检测15种HPV基因型的试剂盒中的PCR反应试剂进行PCR扩增核酸样品。
本发明的有益效果在于：
本发明采用实时荧光PCR技术，通过HPV全基因组序列比对，筛选15种HPV高危型(包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)基因序列的一致保守区，并对引物和探针进行兼并优化，仅使用上述SEQ ID NO：1-8所示的3条上游引物、2条下游引物和3条探针，在常规用量时，可最大限度的减少引物、探针间的相互干扰，使得检测性能大幅度的提升。
附图说明
图1A-B为本发明实施例的准确性和特异性评价实验部分结果图；
图2为本发明实施例的最低检出限评价实验部分结果图；
图3为本发明实施例的精密度评价实验结果图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：设计上述SEQ ID NO：1-8所示的3条上游引物、2条下游引物和3条探针，实现单管检测15种HPV基因型，可最大限度的减少引物、探针间的相互干扰。
本发明提供一种单管检测15种HPV基因型的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括：
特异性扩增HPV的上游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：1-3所示；
特异性扩增HPV的下游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：4-5所示；
用于检测HPV的探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6-8所示。
并提供一种单管检测15种HPV基因型的方法，通过使用上述的单管检测15种HPV基因型的试剂盒中的PCR反应试剂进行PCR扩增核酸样品。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：
本发明采用实时荧光PCR技术，通过HPV全基因组序列比对，筛选15种HPV高危型(包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)基因序列的一致保守区，并对引物和探针进行兼并优化，仅使用上述SEQ ID NO：1-8所示的3条上游引物、2条下游引物和3条探针，在常规用量时，可最大限度的减少引物、探针间的相互干扰，使得检测性能大幅度的提升。
实施例
本实施例的单管检测15种HPV基因型的试剂盒，包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括：特异性扩增HPV的上游引物；特异性扩增HPV的下游引物；用于检测HPV的探针；以及纯水、10×PCR buffer、MgCl2、dATP、dUTP、dGTP、dCTP、Taq酶和UNG酶。
具体引物和探针设计如下表1所示。
表1
其中，各探针5’端修饰FAM，3’端修饰BHQ1。
PCR反应体系配方具体参见下表2所示，其反应条件程序具体参见下表3所示。
表2
表3
结果分析
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在1～2、End值可设在5～10，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果，实际CT值＝实验报告CT值+10)。
试验结果的判定
(1)如果检测样本无典型S型扩增曲线或Ct值＞40.0，则判样本为15种基因型HPV低于最低检出限；
(2)如果检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤40.0，则判样本为15种HPV基因型单型或者混合型阳性。
效果分析/产品性能指标：例如，对试剂盒准确性、特异性、重复性、稳定性、灵敏度和精密度的分析检测，以及对应的检测结果图。
产品性能
1、准确性和特异性
以原国家食品药品监督管理总局批准的HPV分型试剂盒作为对照试剂，检测187例样本，结合图1A-B，结果如下表4。
表4
准确性＝80/80*100％＝100％。
特异性＝(16+91)/(16+91)*100％＝100％。
2、最低检出限
采用PCR产物克隆PUC57载体方法，制备得15种HPV基因型阳性质粒，经纯化和紫外分光测定和换算定量，并稀释到2500、500、100copies/mL，每种HPV基因型阳性质粒的每个稀释浓度分别使用本试剂重复检测20次，取15种HPV基因型阳性检出率均≥95％的最低稀释浓度作为本试剂的最低检出限。结合图2，结果如下表5。
表5
经分析，本试剂的最低检出限为500copies/mL。
3、精密度
采用HPV16型阳性质粒(浓度为2500copies/mL)作为精密度参考品，使用三批转生产成品试剂进行检测，每批试剂分别重复检测10次，计算检测结果Ct值的平均值、标准差和变异系数CV，结合图3，具体如下表6。
表6
经分析，本试剂的检测精密度≤2.0％。
综上所述，本发明提供的单管检测15种HPV基因型的试剂盒具有在常规用量时，最大限度的减少引物、探针间的相互干扰，使得检测性能大幅度的提升的优点。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 泰普生物科学（中国）有限公司
<120> 单管检测15种HPV基因型的试剂盒及方法
<130> 2018
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aartgatrar aaytggaaat cc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
artrayriaa aytggaaatg t 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatkaayray gaaaattgga aa 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttstcctgir acicayttaa acg 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctgcactgc ayttaaacg 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tttgaaarga citggtscag att 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tttctcaagg acgtggtsca ra 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
caaggacgtg gtccagatta arttt 25
Claims (10)
1.一种单管检测15种HPV基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括：
特异性扩增HPV的上游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：1-3所示；
特异性扩增HPV的下游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：4-5所示；
用于检测HPV的探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6-8所示。
2.根据权利要求1所述的单管检测15种HPV基因型的试剂盒，其特征在于，所述探针的5'端用荧光染料标记，3'端用淬灭荧光染料标记。
3.根据权利要求1所述的单管检测15种HPV基因型的试剂盒，其特征在于，所述探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1。
4.根据权利要求1所述的单管检测15种HPV基因型的试剂盒，其特征在于，各上游引物的终浓度分别为3-9μM，各下游引物的终浓度分别为3-9μM，各探针的终浓度为3-6μM。
5.根据权利要求1所述的单管检测15种HPV基因型的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂还包括纯水、10×PCR buffer、MgCl2、dUTP、Taq酶和UNG酶，所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP和dCTP。
6.根据权利要求5所述的单管检测15种HPV基因型的试剂盒，其特征在于，所述MgCl2的终浓度为2.5-3.75mM，所述dATP的终浓度为0.2-0.4mM，所述dCTP的终浓度为0.2-0.4mM，所述dGTP的终浓度为0.2-0.4mM，所述dUTP的终浓度为0.2-0.4mM，所述Taq酶的终浓度为2.5U，所述UNG酶的终浓度为0.1U。
7.根据权利要求5所述的单管检测15种HPV基因型的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂的组分含量为：
10×PCR buffer：4-6μL；
25mM MgCl2：5-7.5μL；
100mM dATP：0.1-0.2μL；
100mM dUTP：0.1-0.2μL；
100mM dGTP：0.1-0.2μL；
100mM dCTP：0.1-0.2μL；
100μM上游引物：各0.5-1.5μL；
100μM下游引物：各0.5-1.5μL；
100μM探针：0.5-1μL；
2.5U/μL Taq酶：1μL；
1U/μL UNG酶：0.1μL。
8.根据权利要求5所述的单管检测15种HPV基因型的试剂盒，其特征在于，所述10×PCRbuffer包括50mM的KCl与pH值为7.5-8.5的10mM Tris。
9.一种单管检测15种HPV基因型的方法，其特征在于，通过使用权利要求1-6任意一项所述的单管检测15种HPV基因型的试剂盒中的PCR反应试剂进行PCR扩增核酸样品。
10.根据权利要求9所述的单管检测15种HPV基因型的方法，其特征在于，PCR扩增核酸样品的扩增程序为：37-50℃下2min，1个循环；95℃下3min，1个循环；94℃下20-30sec且50-60℃下35-50sec，10个循环；94℃下20-30sec且50-60℃下35-50sec，30个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811307136.1A CN109402297A (zh) | 2018-11-05 | 2018-11-05 | 单管检测15种hpv基因型的试剂盒及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811307136.1A CN109402297A (zh) | 2018-11-05 | 2018-11-05 | 单管检测15种hpv基因型的试剂盒及方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109402297A true CN109402297A (zh) | 2019-03-01 |
Family
ID=65471353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811307136.1A Pending CN109402297A (zh) | 2018-11-05 | 2018-11-05 | 单管检测15种hpv基因型的试剂盒及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109402297A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101017141A (zh) * | 2006-02-09 | 2007-08-15 | 港龙生物技术（深圳）有限公司 | 诊断人类乳头状病毒（hpv）感染的荧光聚合酶链式反应（pcr）的方法和试剂盒 |
| CN101676408A (zh) * | 2008-09-19 | 2010-03-24 | 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 | 6、11型人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测方法及其试剂盒 |
| CN102559932A (zh) * | 2012-01-18 | 2012-07-11 | 泰普生物科学（中国）有限公司 | 一种高危人乳头瘤病毒的pcr检测试剂盒 |
| CN105603121A (zh) * | 2016-01-15 | 2016-05-25 | 艾康生物技术(杭州)有限公司 | 用于检测高危型hpv的方法、寡核苷酸和试剂盒 |
| CN105695627A (zh) * | 2016-02-05 | 2016-06-22 | 陕西佰美基因股份有限公司 | 一种用于荧光定量pcr检测15型hpv的特异性引物和探针的组合以及试剂盒 |
| CN107043828A (zh) * | 2017-03-17 | 2017-08-15 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | 一种高危人乳头瘤病毒分型检测方法与试剂盒 |
| CN108060268A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-05-22 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | Hpv分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法 |
-
2018
- 2018-11-05 CN CN201811307136.1A patent/CN109402297A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101017141A (zh) * | 2006-02-09 | 2007-08-15 | 港龙生物技术（深圳）有限公司 | 诊断人类乳头状病毒（hpv）感染的荧光聚合酶链式反应（pcr）的方法和试剂盒 |
| CN101676408A (zh) * | 2008-09-19 | 2010-03-24 | 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 | 6、11型人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测方法及其试剂盒 |
| CN102559932A (zh) * | 2012-01-18 | 2012-07-11 | 泰普生物科学（中国）有限公司 | 一种高危人乳头瘤病毒的pcr检测试剂盒 |
| CN105603121A (zh) * | 2016-01-15 | 2016-05-25 | 艾康生物技术(杭州)有限公司 | 用于检测高危型hpv的方法、寡核苷酸和试剂盒 |
| CN105695627A (zh) * | 2016-02-05 | 2016-06-22 | 陕西佰美基因股份有限公司 | 一种用于荧光定量pcr检测15型hpv的特异性引物和探针的组合以及试剂盒 |
| CN107043828A (zh) * | 2017-03-17 | 2017-08-15 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | 一种高危人乳头瘤病毒分型检测方法与试剂盒 |
| CN108060268A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-05-22 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | Hpv分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SOTLAR K等: "Detection of high-riskhuman papillomavirus E6 and E7oncogene transcripts in cervi-cal scrapes by nested RT-polymerase chain reaction", 《J MEDVIROL》 * |
| 曲守方等: "一种荧光PCR方法用于高危型HPV基因分型检测", 《药物分析杂志》 * |
| 王少峡等: "利用生物信息学资源设计简并引物", 《天津师范大学学报(自然科学版)》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105624335B (zh) | 一种基因检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒 | |
| CN102272329B (zh) | 在不同的子宫颈病变中hpv16的诊断性转录产物和剪接模式 | |
| Peng et al. | Human papillomavirus types 16 and 33, herpes simplex virus type 2 and other risk factors for cervical cancer in Sichuan Province, China | |
| CN101487063B (zh) | 人乳头状瘤病毒感染基因扩增荧光检测试剂盒 | |
| CN103642945B (zh) | 一种含内参照的高灵敏Epstein-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒 | |
| WO2024187843A1 (zh) | 一种检测高危型人乳头瘤病毒的引物、引物探针组合物及试剂盒 | |
| CN107177699A (zh) | 一种人类乳头瘤病毒（hpv）分型快速检测方法 | |
| CN104017907B (zh) | 一种hpv高危型荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN104630353A (zh) | 一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒 | |
| WO2024187844A1 (zh) | 引物及其和探针的组合物在制备检测hpv的试剂盒中的应用 | |
| CN108060268A (zh) | Hpv分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法 | |
| CN107723384A (zh) | 一种检测人乳头状瘤病毒的pcr试剂盒及其制备方法 | |
| CN104017906B (zh) | 一种hpv高危型分型荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN113584225B (zh) | 一种检测hpv病毒的引物和探针组合及其分型检测的试剂、应用 | |
| CN105385786A (zh) | 一种人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法 | |
| Han et al. | HPV prevalence and genotype distribution in 2,306 patients with cervical squamous cell carcinoma in central and eastern China | |
| CN113755641B (zh) | 检测人乳头瘤病毒16型和18型的等温核酸扩增用引物探针组和试剂盒 | |
| CN110241256A (zh) | 一种多重定量检测eb病毒和巨细胞病毒的试剂盒 | |
| CN102071247B (zh) | 一种区分非嗜肺与嗜肺军团菌的检测方法及试剂盒 | |
| CN101886137B (zh) | 荧光定量pcr定性检测高危型hpv的试剂盒 | |
| CN108179226A (zh) | 一种检测人乳头瘤病毒的核酸组合及其应用和试剂盒 | |
| CN105950788B (zh) | 检测18种高危型hpv核酸的引物、探针及试剂盒 | |
| CN101665834A (zh) | Ki67mRNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒 | |
| CN117089614A (zh) | 一种宫颈癌相关基因dna甲基化pcr-荧光探针法检测试剂盒 | |
| JP5546085B2 (ja) | 早期がん予測のための方法及びキット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190301 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |