CN102272329B - 在不同的子宫颈病变中hpv16的诊断性转录产物和剪接模式 - Google Patents
在不同的子宫颈病变中hpv16的诊断性转录产物和剪接模式 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102272329B CN102272329B CN200980154825.6A CN200980154825A CN102272329B CN 102272329 B CN102272329 B CN 102272329B CN 200980154825 A CN200980154825 A CN 200980154825A CN 102272329 B CN102272329 B CN 102272329B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene product
- hpv16
- amount
- ratio
- product
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及在带有HPV16的受试者中区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染的方法,其根据测定受试者的样品中第一基因产物和第二基因产物的量并计算所述第一基因产物的量与所述第二基因产物的量的比例。本发明进一步设想的是包含寡核苷酸混合物的组合物。本发明还设想的是适合于进行本发明的方法的试剂盒和设备。
Description
本发明涉及根据测定样品中基因产物(多个基因产物)的量来区分带有人类乳头状瘤病毒16(HPV16)的受试者中(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染的方法。本发明进一步设想的是包含寡核苷酸混合物的组合物。本发明还设想的是适合于进行本发明的方法的试剂盒和设备。
子宫颈的癌症(CxCa)是在世界范围内妇女中第二常见的恶性肿瘤,由高风险的人类乳头状瘤病毒引起,HPV16是最普遍的类型。在发达国家,常规的细胞学的筛选计划实质上地降低了这种癌症的发生率。然而这些细胞学的筛选计划具有某些缺点。
Papanicolaou测试,通常也称为Pap测试,是设计用于检测子宫颈中的恶性前病变和恶性病变的诊断方法。对于Papanicolaou测试,从子宫颈获得样品,并通过光学显微镜筛选表明恶性或前恶性细胞的细胞形态学方面的改变。然后,样品根据观察到的病变的严重度来分类。然而,通过子宫颈细胞学的诊断是主观的方法,质量取决于提供该服务的实验室的标准。因而,病变分类仅仅是中度可重复的,相比阴道镜检查是低敏感性的(Baldwin,P.,R.Laskey,and N.Coleman.2003.Translational approaches to improving cervical screening.Nat RevCancer 3:217-26)。此外,假阳性结果导致了大量的患者被过度治疗。
在近二十年来,开发了用于HPV的各种新的诊断测试。这些方法基于病毒、分子和生物化学标志物,例如,HPV蛋白、DNA和RNA的检测。
FDA批准的Hybrid Capture II测试系统(HC2)(以前的DigeneCorp.USA,现在的Qiagen,Germany)被认为是临床实践中HPV DNA测试的金标准,然而它显示了几个缺点:a)不进行基因分型,代之以HPV感染完全地归于“低风险”或“高风险”组,b)不能鉴定多次感染,c)相比基于PCR的方法对HPV检测是较低敏感性的(Birneret al.2001.Mod.Pathol.14:702-709),以及d)对于预测子宫颈癌前期和癌症风险是中度地特异性的。它对临床终点的一定的非特异性可以归于与非致癌的HPV基因型的交叉反应性(Castle,P.E.,D.Solomon,C.M.Wheeler,P.E.Gravitt,S.Wacholder,and M.Schiffman.2008.Human papillomavirus genotype specificity of hybrid capture 2.JClin Microbiol 46:2595-604)。此外,它仅容许评估受试者是否感染了HPV。该测试不容许评估HPV感染的严重度。因而,一旦诊断了HPV,需要进一步的检查。
近年来开发了几种基于PCR的方法,容许HPV感染的更精确的检测。这种PCR系统的大部分使用了结合HPV基因组的高度保守区域,例如L1区域的共有的或一般的引物。扩增的PCR产物然后进行进一步的分析(例如,测序,限制性片断长度多态性(RFLP)分析或杂交)以鉴定特定的粘膜HPV基因型。纵向的群组研究已经显示了,相比单独的细胞学测试,组合的Pap和HPV测试展现了针对CIN3的更好的敏感性并预测了更好的长期保护(在具有两种测试的正常结果的女性中)(Bulkmans,N.W.,J.Berkhof,L.Rozendaal,F.J.vanKemenade,A.J.Boeke,S.Bulk,F.J.Voorhorst,R.H.Verheijen,K.vanGroningen,M.E.Boon,W.Ruitinga,M.van Ballegooijen,P.J.Snijders,and C.J.Meijer.2007.Human papillomavirus DNA testing for thedetection of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 and cancer:5-yearfollow-up of a randomised controlled implementation trial.Lancet370:1764-72,Hoyer,H.,C.Scheungraber,R.Kuehne-Heid,K.Teller,C.Greinke,S.Leistritz,B.Ludwig,M.Durst,和A.Schneider.2005.Cumulative 5-year diagnoses of CIN2,CIN3 or cervical cancer afterconcurrent high-risk HPV and cytology testing in a primary screeningsetting.Int J Cancer 116:136-43.)。然而,HPV PCR测试的高敏感性也导致了临床上不相关的感染或回复性病变的鉴定。因而,在个体的高风险HPV DNA阳性结果之后存在高级的病变或发生子宫颈癌症的阳性预测值(PPV)是低的。产生的高比例测试阳性而疾病阴性的诊断导致了过度治疗、额外的费用和牵涉到的女性的相当大的焦虑(International Agency for Research on Cancer.2005.Cervix CancerScreening.IARC Press,Lyon)。
不同于HPV DNA测试,RNA测试容许转录活性的病毒的鉴定和分析。除了DNA和细胞形态学之外,子宫颈刮片的保存介质的新的引入,也保存了RNA,增强了RNA检测方法的发展。迄今为止,已经引入了两种商业的HPV RNA检测分析:i)来自Biomérieux(以前的NorChip)的PreTect HPV Proofer其检测来自hrHPV型16、18、31、33和45的早期全长mRNA靶向性E6和E7序列(E6/E7),ii)AptimaHPV测试,来自GenProbe的一种广谱的E6/E7全长mRNA扩增方法。来自这些测试的有限数据表明,全长HPV E6/E7 mRNA而不是单独的HPV DNA的测试仅仅稍微地提高了子宫颈癌症和其前体发生的PPV,而同时,降低了敏感性和由此的阴性预测值(NPV)(Cuschieri,K.S.,M.J.Whitley,and H.A.Cubie.2004.Humanpapillomavirus type specific DNA and RNA persistence--implications forcervical disease progression and monitoring.J Med Virol 73:65-70)。这些技术的主要缺点涉及以下事实,它们不能仅由于单个全长病毒癌基因转录产物的定性测定来预测疾病。此外,子宫颈刮片可能包含不同量的HPV感染的细胞,其不能通过这些技术来控制。
子宫颈癌症的发生与HPV基因组向宿主细胞染色体中的整合紧密相关。在低级的病变中,大部分的HPV基因组以游离状态存在,而高级别的病变和癌中,HPV基因组可以整合到宿主基因组中。然而,已经展现的是,不是所有的宫颈癌病例中HPV基因组都以整合形式存在(Vinokurova,S.,N.Wentzensen,I.Kraus,R.Klaes,C.Driesch,P.Melsheimer,F.Kisseljov,M.Durst,A.Schneider,and M.von KnebelDoeberitz.2008.Type-dependent integration frequency of humanpapillomavirus genomes in cervical lesions.Cancer Res 68:307-13.)。HPV16基因组向宿主基因组中的整合仅在约60%的子宫颈癌症病例中存在。因而,仅仅测定HPV基因组的整合状态的诊断手段对于风险分层不是可靠的。
阴道镜检查允许检查子宫颈和阴道。通过这种肉眼检验,这些区域中的许多恶变前的病变和恶性病变可以被检出。由于它的高可靠性,阴道镜检查被认为是诊断子宫颈疾病的金标准。然而这种诊断操作是高成本和费时的。阴道镜检查需要高度受训的人员,并且通常涉及侵入性的操作(活检和随后的组织分析)。因此,阴道镜检查不能用于子宫颈癌症前兆筛选计划。
本发明的技术问题可以看作是提供有效地和可靠地区分HPV16感染的轻型和重型而没有上述缺点的手段和方法。并且,对于HPV基因组没有整合到基因组中的受试者的可靠的风险分层需要手段和方法。通过在权利要求和下文中表征的实施方式解决了该技术问题。
因而,本发明涉及区分带有HPV16的受试者中(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染的方法,包括步骤
a)测定所述受试者的样品中第一基因产物的量,所述第一基因产物是880^2582的基因产物,
b)测定所述受试者的样品中第二基因产物的量,所述第二基因产物选自由3632^5639的基因产物、880^3358的基因产物、Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、E1的基因产物、E5的基因产物、L1的基因产物和E6*I的基因产物构成的组,
c)计算步骤a)中测定的所述第一基因产物的量与步骤b)中测定的所述第二基因产物的量的比例,
d)与参考比例比较步骤c)中计算的所述比例,和
e)区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染。
本发明的方法优选地是体外方法。此外,它可以包括以上明确叙述的那些之外的步骤。例如,进一步的步骤可以涉及样品预处理或所述方法获得的结果的评估。本发明的方法优选地用于区分被HPV16感染的受试者中的轻型和重型HPV16感染。然而,本发明的方法还可以用于所述受试者的监视、确认和细分类。所述方法可以人工地进行或由自动装置辅助。优选的,步骤(a)、(b)、(c)、(d)和/或(e)可以全部或部分地由自动装置辅助,例如,用于步骤(a)和(b)中的测定的适合的机器人和传感设备,或在步骤(e)中计算机实现的计算步骤,或步骤(d)中计算机实现的比较。
如在此使用的术语“区分”是指区分(i)轻型HPV16感染和(ii)重型HPV16感染。如在此使用的,该术语优选地包括差异性地诊断/检测轻型和重型的HPV16感染。
本领域技术人员将理解的是,前述的区分通常不是指对被分析的100%的受试者是正确的。然而,该术语需要的是,评估对于被分析的受试者的统计学上显著的部分是有效的。部分是否是统计学上显著的可以由本领域的技术人员使用各种公知的统计评价工具,例如,置信区间的确定,p-值测定,student T测试,Mann-Whitney测试,等等来不用再费周折地确定。细节在Dowdy and Wearden,Statistics forResearch,John Wiley & Sons,New York 1983中。优先的置信区间是至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。p值优选地是0.1、0.05、0.01、0.005或0.001。优选的,本发明设想的概率容许的是,所述区分对于给定群组的受试者的至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%是正确的。
如在此使用的,术语“受试者”涉及动物,优选的哺乳动物,更优选的人类。然而,根据本发明的前述方法设想的是,受试者应当被HPV16感染。如何评估受试者是否被HPV16感染是本领域公知的。例如,HPV16感染可以通过Southern和斑点印迹杂交、原位杂交,通过信号扩增分析或通过各种PCR方法,在受试者的样品中基因分型HPV16 DNA来评估(Molijn,A.,B.Kleter,W.Quint,and L.J.vanDoorn.2005.Molecular diagnosis of human papillomavirus(HPV)infections.J Clin Virol 32 Suppl 1:S43-51)。
人类乳头状瘤病毒是感染皮肤和粘膜的DNA病毒。已经描述了超过100种HPV基因型(de Villiers,E.M.,C.Fauquet,T.R.Broker,H.U.Bernard,and H.zur Hausen.2004.Classification of papillomaviruses.Virology 324:17-27)。HPV16属于高风险HPV基因型,是子宫颈癌症发生的主要原因。还已知的是,HPV16可以导致阴门、肛门、阴道、阴茎和口咽的癌症,以及阴道上皮内瘤形成、肛门上皮内瘤形成、阴户上皮内瘤形成和阴茎上皮内瘤形成。
HPV基因组由约7,906个碱基对(bp)的双链、环形闭合的DNA的单个分子组成。HPV16基因组的核酸序列,HPV16R,在SEQ ID NO:1中示出(参见,例如Myers,G.,H.Delius,J.Icenogle,H.U.Bernard,M.Favre,M.van Ranst,and C.M.Wheeler.1997.Human papillomaviruses1997:a compilation and analysis of nucleic acid and amino acidsequences.Theoretical Biology and Biophysics,Los Alamos NationalLaboratory,Los Alamos,N.Mex.)。三个开放阅读框(ORF)位于一条链上。已经定义了三个功能单位,长控制区域(LCR),以及“早期”和“晚期”转录区域。LCR是850bp长度的非编码上游区域,对DNA复制和转录的调节负责。它含有病毒E2和其他细胞转录因子的几个结合位点,以及病毒E1复制蛋白的结合位点。此外,它含有沉默子以及增强子序列,带有靠近E6 ORF的p97核心启动子;它是病毒基因组中最高变异程度的区域。“早期”区域由ORF E1、E2、E4、E5、E6和E7组成,它们涉及病毒复制和细胞转化。“晚期”区域编码L1和L2结构蛋白质,它们形成病毒衣壳。对于“早期”蛋白,恶性疾病的两种最重要的HPV蛋白是E6和E7,其协同地起作用来将细胞从正常转化到永生状态。本领域已知的是,HPV16转录子展现了几种剪接供体(在HPV16R参考基因组的核苷酸位置226、880、1302和3632处)和剪接接受体位点(在HPV16R参考空白基因组的核苷酸位置409、526、742、2582、2709、3358和5639处),产生至少11种不同的剪接接点(Baker,C.,and C.Calef.1996.Maps of papillomavirusmRNA transcripts.Los Alamos National Laboratories,Los Alamos,NM,USA.;Zheng,Z.M.,and C.C.Baker.2006.Papillomavirus genomestructure,expression,and post-transcriptional regulation.Front Biosci11:2286-302.)。剪接产物在此根据用来产生该产物的剪接供体和接受体位点来表征。相应的剪接供体和接受体由“^”来分隔。
本领域已知的是,HPV16的感染可以细分类成各种表现。经过组织学上分类为子宫颈上皮内瘤形成1到3(CIN1到CIN3)的一系列定义明确的阶段,子宫颈癌症从持续HPV感染的区域发生。HPV发展的阶段也细胞学地称为低级和高级鳞状上皮内病变(LSIL和HSIL)。LSIL相当于CIN1,而CIN2和CIN3,优选地,相当于HSIL。HPV16的起始感染可以导致CIN1的发生,其通过上皮的下三分之一处中正常分化的抑制而显现。这些病变的大部分在免疫活性的个体中自发地退化,可能由细胞免疫所介导。然而,在某些个体中,由于遗传的或诱导的免疫缺陷,存在着HPV16感染持续和CIN1病变进展到CIN2病变的风险。CIN2病变也显示了高退化率,然而,CIN2病变也可能发展到高级的疾病(CIN3),其可能发展到癌(原位癌或甚至侵入性的)癌。
在此所指的“轻型HPV感染”,优选地,是指一种形式的HPV感染,其组织学地分类为正常的子宫颈组织或CIN1(最小的或轻度的子宫颈发育异常),或细胞学地分类为NIL/M(上皮内病变或恶性肿瘤为阴性的)或LSIL(低级的鳞状上皮内病变)。因而,轻型HPV感染,优选地,涵盖了良性的子宫颈病变,以及,因而,轻度疾病的HPV病变(综述参见Smith,J.H.2002.Bethesda 2001.Cytopathology13:4-10)。
在此所指的“重型HPV感染”优选地是指一种形式的HPV感染,其组织学地分类为CIN2(中度子宫颈上皮发育异常)或CIN3(严重的子宫颈发育异常)或癌症(原位的或侵入性的)。因此,术语“重型HPV16感染”优选地是指细胞学上分类为HSIL或癌症的一种HPV16感染形式。因而,重型HPV感染,优选地,涵盖恶性的子宫颈病变,因而是高级别的HPV病变(综述参见Smith,J.H.2002.Bethesda 2001.Cytopathology 13:4-10)。
样品可以通过公知的技术获得,包括来自表达或产生在此涉及的基因产物的那些细胞、组织或器官的样品。优选的,样品从泌尿生殖道或口咽道刮擦或活检出来。这样的样品可以通过使用刷子、(棉)拭子、刮勺、清洗/洗涤液、穿孔活检设备、带有针头的沟槽的穿刺或外科装置来获得。优选的,刮擦物含有粘膜的细胞。更优选的,样品是子宫颈涂片或Pap涂片。分离的细胞可以通过分离技术,例如,过滤、离心或细胞分选从体液或组织或器官获得。此外,样品可以进一步通过公知的方法加工以进一步富集和/或纯化在此涉及的基因产物。基因产物的进一步的加工,优选地,取决于基因产物的性质,即,基因产物是多肽还是RNA分子。优选的,如果基因产物是多肽,则多肽通过技术人员公知的方法富集和/或纯化。优选的,如果基因产物是mRNA分子,则所述RNA分子可以通过本领域公知的方法富集和/或纯化。
如在此使用的术语“基因产物”优选地涉及转录产物,因而涉及mRNA或涉及多肽。
前述的方法包括第一基因产物与第二基因产物的量比例的计算。用于比例计算的至少一种量是HPV16的剪接的mRNA(或所述剪接的mRNA编码的多肽)的量。如在此下文中阐述的,HPV16的剪接的mRNA(或所述剪接的mRNA编码的多肽)的量对于区分轻型和重型HPV感染是特别有益的。
前述的方法优选地设想以下比例的鉴别:880^2582的基因产物(优选的,HPV16R的880^2582剪接的mRNA)的量与3632^5639的基因产物(优选的HPV16R的3632^5639剪接的mRNA)的量的比例,或880^2582的基因产物(优选的,HPV16R的880^2582剪接的mRNA)的量与880^3358的基因产物(优选的,HPV16R的880^3358剪接的mRNA)的量的比例,或880^2582的基因产物(优选的,HPV16R的880^2582剪接的mRNA)的量与Apm1的基因产物(优选的,Apm1mRNA)的量的比例,或880^2582的基因产物(优选的,HPV16R的880^2582剪接的mRNA)的量与遍在蛋白C(Ubc)的基因产物(优选的Ubc mRNA)的量的比例,或880^2582的基因产物(优选的,HPV16R的880^2582剪接的mRNA)的量与U1A的基因产物(优选的,U1A mRNA)的量的比例,或880^2582的基因产物(优选的,HPV16R的880^2582剪接的mRNA)的量与E1的基因产物(优选的,HPV16R的E1全长mRNA)的量的比例,或880^2582的基因产物(优选的,HPV16R的880^2582剪接的mRNA)的量与E5的基因产物(优选的HPV16R的E5全长mRNA)的量的比例,或880^2582的基因产物(优选的,HPV16R的880^2582剪接的mRNA)的量与L1的基因产物(优选的HPV16R的L1全长mRNA)的量的比例,或880^2582的基因产物(优选的,HPV16R的880^2582剪接的mRNA)的量与226^409的基因产物(优选的,HPV16R的226^409剪接的mRNA(E6*I))的量的比例。
本发明的前述方法的上下文中的第一基因产物优选地是880^2582的基因产物。优选的,术语“880^2582的基因产物”是指HPV16R的880^2582剪接的mRNA,或是指E1C多肽。880^2582转录产物是在位置880和2582处剪接的HPV16R的可选择性剪接的转录产物(参见下文)。
E1C多肽是HPV的E1多肽的N-末端截短的变体,被认为充当了LCR的反式激活物。HPV16R的E1C的氨基酸序列在SEQ ID NO:2中示出。编码所述HPV16R的E1C多肽的核酸序列在SEQ ID NO:3中示出。
优选的,880^2582剪接的mRNA是包含880^2582剪接接点的HPVmRNAs。因而,所述mRNA是由HPV16R编码的mRNA,是在核酸位置880(供体核苷酸)和2582(接受体核苷酸)处剪接HPV16转录产物并连接供体核苷酸和接受体核苷酸的结果。在本发明的上下文中,剪接的mRNA的第一数字,在此为880,优选地表明剪接的供体核苷酸的位置,因而是5′-剪接接点,而第二数字,在此为2582,表明剪接的接受体核苷酸的位置,因而是3′剪接接点。标明的位置是相对于SEQ ID NO:1中所示的HPV16R的7906bp基因组。本领域已知的是,HPV的各种mRNA种类包含880^2582剪接的序列,例如,种类K-N,参见附图1。因此,880^2582剪接的mRNA的量的测定,优选地涵盖了所有含有880^2582的mRNA种类的累积量的测定。
要理解的是,本发明的上下文中的第一基因产物包含通过将880供体核苷酸连接到2582接受体核苷酸产生的核酸序列,以及由此的在剪接后包含剪接接点的序列。因此,880^2582剪接的mRNA优选地包含通过剪接产生的所述剪接接点。优选的,所述剪接的mRNA包含SEQ ID NO:4中所示的核酸序列。
优选的,E1C多肽是由包含前述的剪接接点的多核苷酸翻译/编码的。因而,HPV16的E1C多肽优选地包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。
本发明的前述方法的上下文中的第二基因产物优选地选自由3632^5639的基因产物、880^3358的基因产物、Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、E1的基因产物、E5的基因产物、L1的基因产物和E6*I的基因产物构成的组。
3632^5639的基因产物、880^3358的基因产物和E6*I的基因产物优选地是HPV16的可选择剪接的mRNA或由所述可选择剪接的mRNA编码的多肽。
如在此使用的,术语“3632^5639的基因产物”优选地是指HPV16的3632^5639剪接的mRNA,或所述3632^5639剪接的mRNA编码的HPV16的截短26个氨基酸的相应的L1多肽(由此编码的)。HPV的L1多肽是衣壳蛋白。在生产性感染的晚期期间,主要的衣壳蛋白,L1多肽在接近上皮的顶部的分化的细胞中表达,与HPV16的L2多肽一起在颗粒层中形成病毒衣壳。由所述3632^5639剪接的mRNA编码的、截短26个氨基酸的L1多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:6中示出。编码所述L1多肽的多核苷酸的序列在SEQ ID NO:7中示出。
3632^5639剪接的mRNA优选地包含通过将3632供体核苷酸连接到5639接受体核苷酸产生的核酸序列。因而,3632^5639剪接的mRNA优选地包含具有所述剪接接点的所述核酸序列。优选的,所述剪接的mRNA包含SEQ ID NO:8中所示的核酸序列(标明的是相应的DNA序列)。
如在此使用的,术语“880^3358的基因产物”优选地是指HPV16的880^3358剪接的mRNA,或所述880^3358剪接的mRNA编码的HPV的多肽,所述多肽优选地是E1多肽的N-末端与HPV16的E4多肽的融合多肽。所述融合多肽经常也称为E1^E4。所述多肽在病毒生命周期的晚期阶段中表达。它在刺状和颗粒细胞层中检出,具有HPV16感染晚期的几种功能。融合多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中示出。编码所述融合肽的核酸序列在SEQ ID NO:10中示出。880^3358的基因产物已经显示了由种类A-D和Q-S编码,如附图1中所示。
880^3358剪接的mRNA优选地包含通过将880供体核苷酸连接到3358接受体核苷酸产生的核酸序列。因而,880^3358剪接的mRNA优选地包含具有所述剪接接点的所述核酸序列。优选的,所述剪接的mRNA包含SEQ ID NO:11中所示的核酸序列。因而,HPV16的E1^E4融合多肽优选地包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。
如在此使用的,术语“E6*I的基因产物”优选地是指HPV16的226^409剪接的mRNA,或所述226^409剪接的mRNA编码的HPV的E6*I多肽。已经提出的是E6*I多肽可以反式激活病毒LCR(Alloul,N.,and L.Sherman.1999.Transcription-modulatory activities ofdifferentially spliced cDNAs encoding the E2 protein of humanpapillomavirus type 16.J Gen Virol 80(Pt 9):2461-70.)。融合多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中示出。编码所述融合肽的核酸序列在SEQ ID NO:14中示出。
226^409剪接的mRNA优选地包含通过将226供体核苷酸连接到409接受体核苷酸产生的核酸序列。因而,226^409剪接的mRNA优选地包含所述核酸序列。优选的,所述剪接的mRNA包含SEQ ID NO:15中所示的核酸序列。因而,HPV16的E6*I多肽优选地包含SEQ IDNO:16中示出的氨基酸序列。
Ubc、U1A和Apm1是宿主细胞的基因组中包含的基因。因而,所述基因不由HPV16的基因组编码。在本发明的上下文中,宿主特异性的基因也称作细胞的基因。Ubc、U1A和Apm1的基因产物优选地是mRNAs和所述基因编码的多肽。本发明的方法因而期待Ubc、U1A和Apm1 mRNAs或Ubc、U1A和Apm1多肽的量的测定。
在此所指的术语“Ubc”优选地是指遍在蛋白C,优选的,人类遍在蛋白C。人类Ubc1的核酸序列以及氨基酸序列是本领域公知的,例如,在GenBank登记号No:NM_021009.4(核酸序列,SEQ ID NO:17)和GenBank登记号No:NP_066289.2(氨基酸序列,SEQ ID NO:18)中显示了。
在此所指的术语U1A优选地是指U1小核核糖核酸蛋白多肽A,优选的,人类U1小核核糖核酸蛋白多肽A。人类U1A的核酸序列以及氨基酸序列是本领域公知的,例如,在GenBank登记号No:NM_004596.3(核酸序列,SEQ ID NO:19)和GenBank登记号No:NP_004587.1(氨基酸序列,SEQ ID NO:20)中显示了。
在此所指的术语Apm1优选地是指“ME180细胞中被乳头状瘤病毒DNA整合影响的”或“含有锌指和BTB结构域的7C”(ZBTB7C)。人类Apm1的核酸序列以及氨基酸序列是本领域公知的,例如,在GenBank登记号No:NM_001039360.1(核酸序列,SEQ ID NO:21)和GenBank登记号No:NP_001034449.1(氨基酸序列,SEQ ID NO:22)中显示了。
本发明的方法还期待包含E1转录产物的多核苷酸的量的测定或E1多肽的量的测定。所述多核苷酸和所述多肽是由HPV16基因组编码的。
E1多肽是由含有未剪接的E1 ORF(开放阅读框)的转录产物编码的。E1对于病毒复制是关键的,与SV40大肿瘤抗原享有结构相似性。E1展现了ATP酶、解旋酶和核苷酸结合活性,与细胞的DNA聚合酶α相互作用,将细胞的复制起始机制征募到LCR中的病毒复制起点。E1转录产物的核酸序列在SEQ ID NO:23中示出,E1多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:24中示出。
本发明的方法还期待包含E5转录产物的多核苷酸的量的测定或E5多肽的量的测定。所述多核苷酸和所述多肽由HPV16基因组编码。
E5多肽是从未剪接的E2/E5转录产物表达的(特别地,种类F-J、P,参见附图1),而不是从E1^E4/E5转录产物表达的(种类A-D、Q、R)。在HPV16基因组向宿主基因组的整合后,由于E2区域的破坏,E5多肽和转录产物表达停止。E5是疏水性的膜蛋白,其在细胞内膜和质膜中存在。E5二聚体被认为在感染的早期过程中是重要的,因为它与生长因子受体EGF-或PDGF-受体相互作用,并引起在细胞溶质酪氨酸残基的转-磷酸化之后的它们的配体独立性二聚化,和细胞信号转导蛋白的征募。E5转录产物的核酸序列在SEQ ID NO:25中示出,E5多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:26中示出。
本发明的方法还期待包含全长L1转录产物的多核苷酸的量的测定或全长L1多肽的量的测定。所述多核苷酸和所述多肽由HPV16基因组编码。
如上所述,HPV的L1多肽是衣壳蛋白。在生产性感染的晚期期间,主要的衣壳蛋白,L1多肽在接近上皮的顶部的分化的细胞中表达,与HPV16的L2多肽一起在颗粒层中形成病毒衣壳。全长L1转录产物的核酸序列在SEQ ID NO:27中示出,全长L1多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:28中示出。
基因产物的量的测定,优选地,取决于基因产物的性质,即,基因产物是转录产物还是多肽。
测定受试者的样品中转录产物的量、因而mRNA的量可以通过认为合适的任何方法来进行。
优选的,转录产物的量通过利用特异性检测要分析的转录产物的探针寡核苷酸来测定。
通过特异性的探针寡核苷酸对转录产物或其扩增产物的量的测定,优选地包含与探针寡核苷酸杂交转录产物或其扩增产物(“扩增产物”的说明参见下文)的步骤,所述探针寡核苷酸特异性结合所述转录产物或其扩增产物。本发明的上下文中的探针寡核苷酸优选地是特异于所述转录产物或其扩增产物的单链的核酸分子。技术人员知道的是,探针寡核苷酸包含与目标特异性杂交的核苷酸的片段,从而与目标多核苷酸是互补的。所述核苷酸的片段优选地与目标多核苷酸所包含的序列区域是85%、90%、95%、99%或更优选的100%相同的。
为了容许转录产物或其扩增产物的特异性检测,所述探针寡核苷酸优选地特异性结合要检测的转录产物或扩增产物,但是不与所述样品包含的其他多核苷酸结合。如何选择合适的探针寡核苷酸是本领域已知的。
本发明的探针寡核苷酸可以是标记的或含有其他修饰,包括容许转录产物或其扩增产物的量的测定的酶。标记可以通过本领域公知的各种技术并且取决于要使用的标记物来进行。优先的标记物在本说明书的其它地方描述了。
探针寡核苷酸可以结合到固体表面或在液相中存在。举例来说,探针寡核苷酸结合到提供了固体表面的载体上。优选的,所述载体是微粒或珠子。微粒或珠子的总体大小,优选地,可以在微米或纳米的范围内。所述珠子或颗粒可以用特异性染料,更优选地用特异性荧光染料来染色。优选的,通过用各种染料染色各种载体,载体可以相互区别。通过使用具有特定探针寡核苷酸的特异性染料的载体(因而,靶向特定序列的扩增多核苷酸的核酸),所述载体可以与包含不同染料的其他载体区分。在一个优选的实施方式中,使用商业上获得的Luminex微球体(Luminex Corp.,Austin,Texas,USA)。因而,对于转录产物或其扩增产物的检测,探针被偶联到荧光标记的聚苯乙烯珠子(Luminex悬浮阵列技术),其在合适的、优选的严格条件下与所述扩增产物杂交。此外,所述扩增产物可以通过使用含有与适合的载体连接的特异性寡核苷酸的微阵列、Reverse-Line印迹(RLB)、斑点印迹或相似的技术来鉴定。液相中存在的探针寡核苷酸可以结合到固定的目标核酸分子或扩增的多核苷酸。本领域的技术人员已知的特异性标记物或修饰可以容许目标检测或信号扩增。此外,扩增产物可以通过大小分离,例如,凝胶或毛细血管电泳,通过核苷酸组成,利用例如核磁共振,或通过实时和信号扩增方法,如在此其他地方描述的,来检测。
本领域的技术人员能够选择合适的探针寡核苷酸。对于剪接的转录产物的检测,特别期待的是,通过利用探针寡核苷酸来测定所述选择性剪接的mRNA的量,所述探针寡核苷酸特异性结合所述剪接接点,因而结合由连接相应的特定剪接供体和剪接接受体核苷酸所产生的核酸序列。
因而,用于880^2582剪接的mRNA的测定的探针寡核苷酸优选地包含SEQ ID NO:4中所示的核酸序列。
此外,用于3632^5639剪接的mRNA的测定的探针寡核苷酸优选地包含SEQ ID NO:8所示的核酸序列。
另外,用于880^3358剪接的mRNA的测定的探针寡核苷酸优选地包含SEQ ID NO:11所示的核酸序列。
此外,用于E6*I转录产物的测定,因而226^409剪接的mRNA的测定的探针寡核苷酸优选地包含SEQ ID NO:15所示的核酸序列。
用于在此提及的其他转录产物的测定的优选的探针寡核苷酸在表1中示出。
优选的,转录产物的量的测定包括用特异性扩增所述转录产物的寡核苷酸扩增所述转录产物、并测定由此扩增的转录产物的量的步骤。因而,对于转录产物的量的测定,特别优选的是通过在此其它地方描述的适合的方法扩增转录产物,然后测定扩增产物的量。做为选择,转录产物量的测定通过信号扩增方法和随后扩增的信号的测定来实现,所述信号扩增方法使用特异性结合所述转录产物并容许线性信号扩增的寡核苷酸探针。
如何扩增转录产物是本领域公知的。转录产物的扩增,优选地,是模板依赖性的过程,其引起与初始量相关的、相应核酸分子的量的提高。扩增产物优选地是核酸、DNA或RNA。要理解的是,转录产物的扩增可以包括其他步骤,例如,通过公知的方法的转录产物的逆转录。
如何扩增目标信号是本领域公知的。信号的扩增,优选地,是模板依赖性的过程,其引起相对于初始量、报告物信号的量的提高。报告物信号,优选地,是可见光、荧光、化学发光和萤光。信号扩增的方法是本领域公知的,可以基于tyramide信号扩增、分枝DNA扩增、Dendrimer扩增、挂锁探针和滚环扩增、Invader信号扩增和其他信号扩增方法。
感兴趣的转录产物的扩增可以通过公知的方法进行,优选的通过聚合酶链式反应(PCR)、通过逆转录酶PCR、实时PCR、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)和其他利用聚合酶以及特异性寡核苷酸作为引物的等温扩增方法。PCR方法是本领域公知的。优选的,扩增是通过使用适合的寡核苷酸对。
本发明不局限于任何前述的技术。作为扩增转录产物的示范性的方法,将简要地概括NASBA技术。NASBA是寡核苷酸依赖性的技术,用于在一个温度下核酸的扩增。包含要扩增的转录产物的样品添加到反应混合物,所述反应混合物包含用于扩增所述转录产物的至少两种转录产物特异性寡核苷酸。所述第一寡核苷酸含有T7RNA启动子序列,在模板的3′末端结合它的目标位点。通过逆转录,产生RNA/DNA杂交物。酶RNAse H降解RNA部分。在RNA模板的降解之后,第二寡核苷酸结合单链cDNA的3′-末端,产生含有完整的T7RNA启动子的双链DNA。然后,酶T7RNA聚合酶线性地产生反义RNA。每个新合成的反义RNA分子自己可以作为第二引物的模板,被转变为具有功能性T7启动子的DNA中间物。然而,在这种情况下,寡核苷酸引物按相反的顺序退火,因为新产生的RNA分子在取向上与原始目标是相反的,产生的DNA中间物仅是部分双链的。照这样,从每个RNA目标产生许多RNA拷贝,它们重新进入反应,引起在等温情况下RNA产物的线性合成。在90分钟内获得大约106-109倍的扩增(Compton,J.1991.Nucleic acid sequence-based amplification.Nature350:91-2)。
为了特异性扩增在此提及的剪接的mRNA,用于扩增转录产物的寡核苷酸对优选地应当能够特异性地扩增包含相应的剪接接点的核酸区域。因而,用于扩增的寡核苷酸应当从剪接接点的5′和3′(一个引物3′,一个引物5′)特异性地结合转录产物(或其互补链,特别是通过在此其他地方描述的方法产生的互补DNA或RNA链)。通过使用前述的寡核苷酸产生的扩增产物将包含相应的剪接接点。
因而,用于扩增880^2582剪接的mRNA的优选的寡核苷酸优选地包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中所示的核酸序列。
用于扩增3632^5639剪接的mRNA的优选的寡核苷酸优选地包含SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32中所示的核酸序列。
用于扩增880^3358剪接的mRNA的优选的寡核苷酸优选地包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:33中所示的核酸序列。
用于扩增E6*I转录产物、因而226^409剪接的mRNA的优选的寡核苷酸优选地包含SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:34中所示的核酸序列。
用于扩增在此提及的其他mRNA的优选的寡核苷酸在表3中示出。
本发明中提及的测定多核苷酸或扩增产物的量涉及测量量或浓度,优选半定量地或定量地。优选的,所述测定包括用于定量转录产物的标准化步骤。示范性地,这种标准化过程将对NASBA目标扩增方法来简要地描述。标准化和因此的定量通过向扩增混合物中添加预定量的校准物RNA(Q-RNA)来实现。优选的,所述校准物RNA应当是体外转录的RNA,其可以通过可以特异性扩增要分析的转录产物的相同的寡核苷酸来扩增。然而,所述Q-RNAs应当包含探针寡核苷酸的特异性目标区域(即,不被要分析的转录产物包含的目标区域)。所述特异性目标区域应当容许区分要分析的转录产物的扩增产物和Q-RNA的扩增产物。标准化的原则是使用相同的寡核苷酸对对Q-RNA和要分析的mRNA的竞争性共同扩增(van Gemen et al.1993:Quantification of HIV-1 RNA in plasma using NASBA during HIV-1primary infection.J Virol Methods 43:177-87)。要理解的是,Q-RNA量,优选地,在本发明的情境中需要对要分析的每个mRNA来滴定。对于定量,表达水平可以与利用体外转录的mRNA的标准曲线比较或与适合的参考材料比较。这可以由技术人员不用再费周折地进行。
在本发明的情境中用于扩增转录产物的寡核苷酸应当包含足以特异性结合目标多核苷酸的序列片段的多个核苷酸。优选的,在此所指的寡核苷酸具有15到35个核苷酸之间的长度,更优选的长度在18到30个核苷酸之间,最优选的长度在20-27个核苷酸之间。本发明的情境中的探针寡核苷酸容许在此提及的转录产物和/或所述转录产物的扩增产物的检测(参见在此的其它地方)。通过检测转录产物或其扩增产物,特定转录产物的量可以在具有HPV16的受试者的样品中评估。为了容许转录产物或其扩增产物的特异性检测,探针寡核苷酸必需足够地互补于转录产物或其扩增产物,或互补于所述转录产物或所述扩增产物的部分。特别优选的寡核苷酸具有在此提及的特异性序列和/或性质。
特别地,寡核苷酸可以被生物素化的,以实现扩增产物与链霉抗生物素蛋白表面或荧光共轭物的结合。此外,在本发明的情境中使用的标记物可以是,但不限于,荧光标记物,尤其包括,荧光染料,例如R-藻红素、Cy3、Cy5、荧光素、罗丹明、Alexa或Texas Red。然而,标记物也可以是酶或抗体。设想的是,用作标记物的酶将通过与底物反应产生可检测信号。适合的酶、底物和技术是本领域公知的。用作标记物的抗体可以特异性地识别目标分子,其可以被直接地(例如,本身发荧光的目标分子)或间接地(例如,产生可检测信号的目标分子,例如,酶)检测。此外,寡核苷酸可以含有通用序列,其容许通过与互补的检测探针杂交来检测,所述检测探针可以含有任何前述的标记物或修饰物。本发明的寡核苷酸还可以含有5′-限制性位点,锁核酸分子(LNA)或是肽核酸分子(PNA)的一部分。这样的PNA可以原则上通过肽部分,通过例如抗体来检测。
对于转录产物(或其扩增产物)量的测定还期待的是基于阵列的技术用于测定根据本发明的转录产物量的用途。在此所指的阵列是一种系统,其包括固相支持物,例如,微阵列,具有例如,小的膜、尼龙膜或玻璃载片,含有按规律布置的各种固定的多核苷酸的样品。做为选择,珠子-阵列可以由容许探针寡核苷酸的多路化的不同地荧光标记的微球体或珠子组成。寡核苷酸探针优选地代表基因,即,它们由要呈现的基因的核酸序列组成或包含要呈现的基因的核酸序列。通过使用阵列,可以优选地在单次实验中测定许多转录产物或基因。借助于适合的分析仪,例如,自动读取设备,与阵列中的探针结合的目标的量可以精确地测量。
本说明书中提及的测定肽或多肽的量涉及测量量或浓度,优选半定量地或定量地。测量可以直接或间接地进行。直接测量涉及根据信号测量肽或多肽的量或浓度,所述信号从肽或多肽自身获得并且其强度与样品中存在的肽的分子数量直接相关。这样的信号——有时在此称为强度信号——可以通过例如测量肽或多肽的特定物理或化学性质的强度值来获得。间接测量包括测量从第二成分(即,不是肽或多肽本身的成分)或生物学读出系统,例如,可测量的细胞反应、配体、标记物或酶反应产物获得的信号。
根据本发明,测定肽或多肽的量可以通过用于测定样品中肽量的所有已知的方式来实现。所述方式包括免疫分析设备和方法,其可以在各种夹心、竞争或其他分析形式中利用标记的分子。所述分析将产生信号,所述信号是肽或多肽的存在或缺乏的指示。此外,信号强度可以优选地与样品中存在的多肽量直接或间接(例如,成反比的)相关。进一步适合的方法包括测量特异于所述肽或多肽的物理或化学性质,例如它的准确的分子量或NMR光谱。所述方法包括,优选地,生物传感器、连接到免疫分析的光学设备、生物芯片、分析设备例如质谱仪、NMR分析仪或层析设备。进一步的,方法包括基于微平板的ELISA方法,完全自动化的或机器人的免疫分析(例如在ElecsysTM分析仪上可获得的)、CBA(酶学钴结合分析,例如在Roche-HitachiTM分析仪上可获得的)以及乳胶凝集分析(例如在Roche-HitachiTM分析仪上可获得的)。
多肽量的测定优选地包括利用特异性结合要测定的多肽的抗体。优选的,如果要测定的多肽来自于特异性剪接的HPV转录产物的翻译,则抗体应当特异性结合侧翼于剪接接点的核酸所编码的多肽区域。
优选的,对于E1C多肽(由880^2582剪接的mRNA编码的)的量的测定,抗体应当特异性结合具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的肽。
优选的,对于E6*I多肽(由226^409剪接的mRNA编码的)的量的测定,抗体应当特异性结合具有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的肽。
优选的,对于E1^E4融合多肽(由880^3358剪接的mRNA编码的)的量的测定,抗体应当特异性结合具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的肽。
如在此使用的术语“量”涵盖基因产物的绝对量、所述基因产物的相对量或浓度,以及与之相关的或可以从中衍生的任何值或参数。这样的值或参数包含通过直接测量从所述基因产物获得的所有特定物理或化学性质的强度信号值。此外,涵盖的是通过在本说明书中其它地方说明的间接测量获得的所有值或参数。例如,对于多肽,可以响应于肽,或从特异性结合配体获得的强度信号从生物学读取系统测量响应水平。要理解的是,与前述量或参数相关的值也可以通过所有标准的数学操作来获得。
如在此使用的术语“比较”包括与本说明书中其他地方详述的适合的参考源比较通过计算本发明方法的步骤a)中测定的第一基因产物量和本发明方法的步骤b)中测定的所述第二基因产物量的比例确定的值。要理解的是,如在此使用的比较是指值的比较。本发明方法的步骤d)中提及的比较可以人工地或计算机辅助地进行。对于计算机辅助的比较,确定的量的值可以通过计算机程序与保存在数据库中的适合的参考物相应的值来比较。计算机程序可以进一步评估比较的结果,即,以适合的输出格式自动地提供期望的评估。根据本发明方法的步骤c)中计算的比例与参考比例的比较,有可能区分具有HPV16的受试者中的轻型HPV16感染和重型HPV16感染。因而,选择参考使得比较的值中的差异或相似性容许区分轻型HPV16感染和重型HPV16感染。
因而,如在此使用的,术语“参考”或“参考值”优选地是指一种值,其容许区分轻型和重型HPV16感染。因而,参考可以来自于在具有HPV16感染的受试者的样品中,进行本发明方法的步骤a)和b),并计算本发明方法的步骤a)中测定的第一基因产物量与本发明方法的步骤b)中测定的所述第二基因产物量的比例,所述受试者已知患有重型HPV16感染,例如HSIL或子宫颈癌。并且,参考可以来自于进行本发明方法的步骤a)和b)并计算本发明方法的步骤a)中测量的具有HPV16感染的受试者的样品中第一基因产物的量与本发明方法的步骤b)中测定的具有受试者中HPV16的受试者的样品中所述第二基因产物的量的比例,所述受试者已知显示了轻型HPV16感染(例如,分类为LSIL的形式)。此外,所述参考量优选地限定了阈值。适合的参考比例或阈值可以通过本发明的方法从与测试样品一起,即,同时地或随后地分析的参考样品来确定。要理解的是,参考或阈值的值可以取决于基因产物(转录产物或多肽)的性质,以及取决于样品中基因产物的量如何测定而变化。例如,如果第一和第二基因产物的量的测定包括通过PCR(聚合酶链式反应)扩增基因产物,基因产物的测定的量可以取决于,例如,用于PCR反应的寡核苷酸,因为对于特定基因产物的扩增各种寡核苷酸对的扩增效力是变化的。然而,当计算参考比例时本领域的技术人员考虑到这一点。特别地,本领域技术人员知道,优选地,必需使用相同的手段和方法来测定参考样品中和测试样品中的特定基因产物的量。
充当阈值的优选的参考比例可以来自正常值上限(ULN),即,在受试者(例如,参与临床试验的患者)的群体中发现的生理学量的上限。给定受试者群体的ULN可以通过各种公知的技术来测定。
优选的,本发明的情境中计算的比例是第一基因产物的量与第二基因产物的量的比例。要理解的是,也可以计算第二基因产物与第一基因产物的量的比例。
如果计算第一基因产物的量与第二基因产物的量的比例,优选的,适用以下的:
优选的,测试样品中计算的比例大于参考比例表明重型HPV感染。更优选的,测试样品中计算的比例显著大于参考比例表明重型HPV感染。最优选的,测试样品中计算的比例统计学上显著大于参考比例表明重型HPV感染。表明重型HPV感染的优选的比例在表5中示出。
优选的,测试样品中计算的比例小于参考比例表明轻型HPV感染。更优选的,测试样品中计算的比例显著小于参考比例表明轻型HPV感染。最优选的,所述计算的比例统计学上显著地小于参考比例。表明轻型HPV感染的优选的比例在表5中示出。
特别地,显著大于(或小于)或统计学上显著大于(或小于)参考比例的比例是一定大小的比例,所述大小被认为对于在此所指的区分是显著的。术语“大于”或“显著大于”和“统计学上显著大于”,“小于”、“显著小于”和“统计学上显著小于”是本领域技术人员公知的。因而,比例是否大于(或小于)、显著大于(或小于)或统计学上显著大于(或小于)可以由本领域技术人员使用各种公知的统计评估工具不用再费周折地确定。
优选的,测试样品中第一基因产物的量与第二基因产物的量的比例大于参考比例表明重型HPV感染。优选的,所述第一基因产物是880^2582的基因产物,优选的,880^2582剪接的mRNA的基因产物,优选的所述第二基因产物是3632^5639的基因产物,优选的3632^5639剪接的mRNA的基因产物。
优选的,测试样品中第一基因产物的量与第二基因产物的量的比例小于参考比例表明轻型HPV感染。优选的,所述第一基因产物是880^2582、优选的880^2582的基因产物,优选的所述第二基因产物是3632^5639、优选的3632^5639剪接的mRNA的基因产物。
880^2582为第一基因产物与其他第二基因产物的量的优选的参考比例在表5中概述。
有益地,显示的是,在具有HPV16的受试者的样品中测定在此标明的第一基因产物的量,以及测定受试者的样品中在此标明的第二基因产物的量,计算所述第一基因产物的所述量与所述第二基因产物的所述量的比例,以及与参考比较所述比例,是可靠地区分轻型和重型HPV16感染所需的。特别地,在患有轻型或重型HPV感染的具有HPV的受试者的总共80份样品中计算以下比例(也参见实施例):HPV16的880^2582剪接的mRNA的量与HPV16的3632^5639剪接的mRNA的量的比例,HPV16的880^2582剪接的mRNA的量与HPV16的880^3358剪接的mRNA的量的比例,HPV16的880^2582剪接的mRNA的量与Apm1 mRNAs的量的比例,HPV16的880^2582剪接的mRNA的量与Ubc mRNA的量的比例,HPV16的880^2582剪接的mRNA的量与U1A mRNA的量的比例,HPV16的880^2582剪接的mRNA的量与HPV16的3632^5639剪接的mRNA的量的比例,HPV16的880^2582剪接的mRNA的量与HPV16的E1 mRNA的量的比例,HPV16的880^2582剪接的mRNA的量与HPV16的E1 mRNA的量的比例,HPV16的880^2582剪接的mRNA的量与HPV16的E5 mRNA的量的比例,HPV16的880^2582剪接的mRNA的量与HPV16的L1mRNA的量的比例,HPV16的880^2582剪接的mRNA的量与HPV16的226^409剪接的mRNA的量的比例。显示的是,计算的比例显示了在从轻型HPV16感染(特别是NIL/M)到重型HPV16感染特别是子宫颈癌症的进展中的高度显著性的差异。特别地,观察到的是,测定剪接的转录产物的表达水平而不是测定含有转录产物的全长ORF的量,是HPV相关疾病的阶段的指示(如p值所表明的)。此外,本发明的方法容许以相比现有技术中的提高的特异性和敏感性区分轻型和重型HPV感染。
在US20070154884中,测定了E6和/或E7的表达水平以及E2和/或L1的表达水平以及E6和/或E7与L1和/或E2的比例,其中大于2的比例是HPV诱导的细胞转化和肿瘤形成风险的指示。类似地,WO/2001/073135以及WO/2003/057914描述了通过检测人类乳头状瘤病毒的E6、E7或E6/E7区域的转录产物的存在或缺乏以及L1、L2或L1/L2区域的转录产物的存在或缺乏来确定人类乳头状瘤病毒感染的发展的方法,其中E6、E7或E6/E7区域的转录产物的缺乏以及L1、L2或L1/L2区域的转录产物的缺乏意味着没有人类乳头状瘤病毒感染;E6、E7或E6/E7区域的转录产物的存在以及L1、L2或L1/L2区域的转录产物的存在意味着早期阶段人类乳头状瘤病毒感染,E6、E7或E6/E7区域的转录产物的存在以及L1、L2或L1/L2区域的转录产物的缺乏意味着晚期阶段人类乳头状瘤病毒感染。
根据本发明中呈现的数据,可能的是根据测定剪接的转录产物的表达水平,而不是测定含有全长ORF的转录产物的量进行临床上有用的HPV相关疾病的评估,对于HPV相关疾病的阶段是更为指示性的(表6,p值所表明的)。优选的,在两个基因产物的指示性比例中,至少一种是剪接的转录产物880^2582;最优选的,两种基因产物都来源于剪接的转录产物。这种方法是技术上简单的,在优选的实施方式中,可以进行高通量形式的自动化。此外,在利用本发明方法获得的结果的基础上,在发生与HPV基因表达模式方面疾病相关分子改变相关的高级别病变或子宫颈癌的风险的基础上,定义了用于患者分类的新的方案(图8,实施例8)。
因而,本发明方法是特别有益的,因为它容许轻型和重型HPV感染之间快速、可靠、便宜的区分。特别地,所述方法容许鉴定处于提高的风险中、因而需要癌症治疗的受试者,和/或对癌症检查、特别是对阴道镜以及组织学检查和潜在的治疗敏感的受试者。此外,所述方法容许鉴定仅遭受轻型HPV感染的那些受试者,他们不需要额外的密集检查和治疗。不使用本发明的方法,所述受试者可能已经过度地检查和治疗(引起不良副作用的提高的风险和提高的护理成本)。
除非另有说明,对于前述方法作出的定义加以必要的变更适用于以下的。
此外,本发明涉及区分带有HPV16的受试者中(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染的方法,包括步骤
a)测定所述受试者的样品中第一基因产物的量,所述第一基因产物是E6*II的基因产物,
b)测定所述受试者的样品中第二基因产物的量,所述第二基因产物选自由Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、880^3358的基因产物和E5的基因产物构成的组,
c)计算步骤a)中测定的所述第一基因产物的量与步骤b)中测定的所述第二基因产物的量的比例,
d)与参考比例比较步骤c)中计算的所述比例,和
e)区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染。
前述的方法优选地设想以下比例的计算:E6*II(优选的,HPV16的226^526剪接的mRNA)的基因产物与Apm1(优选的,Amp1 mRNA)的基因产物的量的比例,或E6*II(优选的,HPV16的226^526剪接的mRNA)的基因产物的量与Ubc(优选的,Ubc mRNA)的基因产物的量的比例,或E6*II(优选的,HPV16的226^526剪接的mRNA)的基因产物的量与E5(优选的,未剪接的E5 mRNA)的基因产物的量的比例,或E6*II(优选的,HPV16的226^526剪接的mRNA)基因产物的量与880^2709(优选的,880^2709剪接的mRNA)的基因产物的量的比例,或E6*II(优选的,HPV16的226^526剪接的mRNA)的基因产物的量与880^3358(优选的,880^3358剪接的mRNA)的基因产物的量的比例。
如在此使用的,术语“E6*II的基因产物”优选地是指HPV16的226^526剪接的mRNA,或所述226^526剪接的mRNA编码的HPV16的E6*II多肽。优选的,mRNA种类C、H、M(请参见附图1)包含226^526剪接接点。
E6*II多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:36中示出。编码所述E6*II多肽的核酸序列在SEQ ID NO:37中示出。
226^526剪接的mRNA,优选的,包含通过将226供体核苷酸连接到526接受体核苷酸产生的核酸。因而,226^526剪接的mRNA,优选的,包含所述核酸序列。因而,所述剪接的mRNA包含SEQ IDNO:38中所示的核酸序列。因而,HPV16的E6*II多肽优选地包含SEQ ID NO:39中示出的氨基酸序列。
利用目标扩增方法,例如,PCR或NASBA,通过利用结合226供体核苷酸的5′和526接受体核苷酸的3′的E6*II特异性寡核苷酸引物(比较附图1),E6*I的基因产物的量可以与E6*II的基因产物的检测同时地检测。因而,在本发明中描述的E6*II寡核苷酸引物也能够退火,并扩增E6*I转录产物的产生的263核苷酸长片段。通过E6*II引物扩增的E6*I转录产物片段可以通过E6*I特异性寡核苷酸探针来检测。
多肽E7是翻译自选择性剪接的E6*I mRNA(种类B、G、L,参见附图1),以及可能来自选择性剪接的E6*II mRNA(种类C、H、M,参见附图1),它们都使用了nt 226处的剪接供体位点和分别的nt 409或nt 526处的剪接受体位点。还认为的是,E7通过渗漏的扫描翻译自全长E6/E7 mRNA。E7是核蛋白,其促进感染的细胞中G1到S期发展。它通过与成视网膜细胞瘤肿瘤抑制物蛋白(pRB)结合起作用,并支持它的遍在化,随后是降解。在E7结合时,pRB介导的E2F转录因子抑制作用停止,释放的E2F诱导几种蛋白质的表达,所述蛋白质刺激进入细胞周期的S期,并引起细胞复制。此外,E7抑制周期蛋白(cyclin)依赖性激酶抑制物p21和p27的功能,刺激S期基因周期蛋白A 和周期蛋白E。编码E7多肽的多核苷酸的核酸序列在SEQ ID NO:40中示出。E7多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:41中示出。
多肽E6*I可以翻译自选择性剪接的E6*I mRNA(种类B、G、L,参见附图1),而多肽E6*II可以翻译自选择性剪接的E6*II mRNA(种类C、H、M,参见附图1)。认为的是,E6*I可以作为HPV LCR的反式激活物起作用。迄今为止没有给E6*II多肽分配功能。E6*I多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中示出。E6*II多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:36中示出。
优选的,对于E6*II多肽(由226^526编码的)剪接的mRNA的量的测定,抗体应当特异性结合具有SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的肽。
此外,用于226^526剪接的mRNA、因而E6*II mRNA的量测定的探针寡核苷酸,优选地,包含SEQ ID NO:38所示的核酸序列。
用于226^526剪接的mRNA的扩增的优选的寡核苷酸,优选地,包含SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:42中所示的核酸序列。
用于前述方法的情境中提及的其他多肽的量测定的优选的抗体,用于其他mRNA的量测定的优选的探针寡核苷酸,以及用于其他mRNA的扩增的优选的寡核苷酸在此其他地方描述了(表1,表3,表7)。
如在此使用的,术语“880^2709的基因产物”优选地涵盖HPV16的880^2709剪接的mRNA以及由所述880^2709剪接的mRNA编码的HPV16的E2多肽。
E2多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:79中示出。编码所述E2多肽的核酸序列在SEQ ID NO:80中示出。
880^2709剪接的mRNA,优选地,包含通过将880供体核苷酸连接到2709接受体核苷酸产生的核酸序列。因而,880^2709剪接的mRNA,优选地,包含具有所述剪接接点的所述核酸序列。优选的,所述剪接的mRNA包含SEQ ID NO:81中所示的核酸序列。
优选的,测定第一基因产物的量与第二基因产物的量的比例。对于所述比例,测试样品中计算的比例大于参考比例,优选地,表明重型HPV感染。更优选的,测试样品中计算的比值显著大于参考比值表明重型HPV感染。最优选的,所述计算的比例统计学上显著大于参考比例。表明重型HPV感染的优选的比例在表5中示出。
优选的,测试样品中(第一基因产物的量与第二基因产物的量的)计算的比值小于参考比值表明轻型HPV感染。更优选的,测试样品中计算的比值显著小于参考比值表明轻型HPV感染。最优选的,所述计算的比值统计学上显著地小于参考比值。表明轻型HPV感染的优选的比值在表5中示出。
有益地,显示的是,在具有HPV16的受试者的样品中测定在此标明的第一基因产物的量,以及测定受试者的样品中在此标明的第二基因产物的量,计算所述第一基因产物的所述量与所述第二基因产物的所述量的比值,以及与参考比较所述比值,是可靠地区分轻型和重型HPV16感染所需的。特别地,在患有轻型或重型HPV感染的具有HPV的受试者的总共80份样品中计算以下比值(也参见实施例):HPV16的226^526剪接的mRNA的量与Apm1 mRNAs的量的比例,HPV16的226^526剪接的mRNA的量与Ubc mRNAs的量的比例,HPV16的226^526剪接的mRNA的量与U1A mRNAs的量的比例,HPV16的226^526剪接的mRNA的量与HPV16的880^3358剪接的mRNA的量的比例,HPV16的226^526剪接的mRNA的量与HPV16的880^2709剪接的mRNA的量的比例,以及HPV16的226^526剪接的mRNA的量与HPV16的E5 mRNA的量的比例。显示的是,计算的比值显示了在从轻型HPV16感染到重型HPV16感染的进展中的高度显著性的差异。此外,本发明的方法容许以相比现有技术中的提高的特异性和敏感性区分轻型和重型HPV感染。
在US20070154884中,测定了E6和/或E7的表达水平以及E2和/或L1的表达水平以及E6和/或E7与L1和/或E2的比值,其中大于2的比值是HPV诱导的细胞转化和肿瘤形成风险的指示。
根据本发明方法中呈现的数据,与第二基因产物,例如Ubc转录产物相比,测定226^526剪接的转录产物的表达水平,而不是测定含有E6或E7全长ORF的转录产物的量,对基于HPV的疾病的阶段是更为指示性的(表6,如p值所表明的)。令人惊讶地,发现的是,与E6*I和含有E6或E7全长ORF的转录产物相比,226^526(E6*II)剪接的转录产物的表达在癌症发展期间更强地上调(附图4)。因此,226^526剪接的转录产物的基因表达的测定对于区分轻型和重型HPV16感染是更为有益的。优选的,E6*II表达的测定与如前述的第二基因产物相比较。此外,本发明描述了E6*II与第二基因产物例如880^3358、880^2709或含有E5全长ORF的转录产物组合用于分析HPV的整合状态的适用性(附图6)。特别地,这些组合相比本领域已知的其他组合在检测整合状态方面是更可靠的。
此外,本发明涉及区分带有HPV16的受试者中(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染的方法,包括步骤
a)计算第一比例,所述计算包括步骤
a1)测定所述受试者的样品中第一基因产物的量,所述第一基因产物是880^2582的基因产物,
a2)测定所述受试者的样品中第二基因产物的量,所述第二基因产物选自由3632^5639的基因产物、880^3358的基因产物、Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、E1的基因产物、E5的基因产物、L1的基因产物和E6*I的基因产物构成的组,以及
a3)计算步骤a1)中测定的所述第一基因产物的量与步骤a2)中测定的所述第二基因产物的量的第一比例,
b)计算第二比例,所述计算包括步骤
b1)测定所述受试者的样品中第三基因产物的量,所述第一基因产物是E6*II的基因产物,
b2)测定所述受试者的样品中第四基因产物的量,所述第四基因产物选自由Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、880^3358的基因产物、880^2709的基因产物和E5的基因产物构成的组,以及
b3)计算步骤b1)中测定的所述第三基因产物的量与步骤b2)中测定的所述第四基因产物的量的第二比例,以及
c)与第一参考比例比较步骤a)中测定的所述第一比例,以及与第二参考比例比较步骤b)中测定的所述第二比例,以及
d)区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染。
优选的,所述第二基因产物是3632^5639的基因产物,优选的所述第四基因产物是880^3358的基因产物。
本发明的情境中各种基因产物的优选的参考比例在此其它地方阐述了(表5)。
优选的,计算第一基因产物与第二基因产物的量的比例以及第三基因产物与第四基因产物的量的比例。
优选的,(i)第一比例大于所述第一参考比例,和/或(ii)第二比例大于所述第二参考比例是重型HPV16感染的指示。因而,如果所述第一或所述第二比例或两者大于相应的参考比例,优选的,指示了重型HPV16。
优选的,(i)第一比例小于所述第一参考比例,和(ii)第二比例小于所述第二参考比例是轻型HPV16感染的指示。因而,如果所述第一比例和所述第二比例两者小于相应的参考比例,优选的,指示了轻型HPV16感染。
在本发明的情境中发现的是,计算第一比例(如前述方法的步骤a)中)和第二比例(如前述方法的步骤b)中),并且与参考比例比较所述第一和所述第二比例,容许可靠地区分重型和轻型HPV16感染。特别地,发现的是,计算所述第一比例和与参考比例比较所述第一比例,容许鉴定包含游离形式的HPV16基因组(参见下文)、但遭遇重型HPV感染(或处于其风险中)的受试者。一般地,仅包含游离形式的HPV16基因组的受试者被认为是相比具有整合形式HPV16基因组的受试者处于更低的患上HSIL或癌症的风险下(术语“游离形式”和“整合形式”的解释在此参见下文)。然而,有证据的是,仅包含游离形式的HPV16基因组的某些受试者遭遇重型HPV16感染,或处在遭受重型HPV16感染的提高的风险中(Vinokurova,S.,N.Wentzensen,I.Kraus,R.Klaes,C.Driesch,P.Melsheimer,F.Kisseljov,M.Durst,A.Schneider,and M.von Knebel Doeberitz.2008.Type-dependent integration frequency of human papillomavirus genomesin cervical lesions.Cancer Res 68:307-13,Pett,M.,and N.Coleman.2007.Integration of high-risk human papillomavirus:a key event incervical carcinogenesis?J Pathol 212:356-67)。通过如上所述计算第一比例,具有游离形式的HPV16基因组、遭受重型HPV16感染(或处于其风险中)的那些受试者可以被可靠地鉴定。优选的,第一比例大于相应的第一参考比例的受试者包含游离形式的HPV16基因组,但是遭遇重型HPV16感染(或处于其风险中)。优选的,第一比例小于参考比例表明所述受试者不患有重型HPV16感染(如果第二比例也小于相应的参考比例,因而,如果所述受试者不包含整合形式的HPV16基因组,参见下文)。
此外,发现的是,计算第二比例和与第二参考比例比较所述第二比例,容许可靠地鉴定包含整合形式的HPV16基因组的那些受试者。特别地,第二比例大于第二参考比例表明受试者包含整合形式的HPV16基因组,而第二比例小于第二参考比例表明所述受试者不包含整合形式的HPV16基因组。
因而,第一比例和/或第二参考比例大于相应的参考比例,优选的,表明所述受试者患有重型HPV16感染(或处于其风险中),而第一比例和第二参考比例小于相应的参考比例,优选的,表明所述受试者患有轻型HPV16感染。因而,第一比例和第二比例的计算显著地提高了诊断的特异性和敏感性。
此外,在本发明的上下文中显示的是,单独的880^2582基因产物的测定容许鉴定包含游离形式HPV16并且患有重型HPV16感染(或处于患有的风险中)的那些受试者。HPV相关疾病的这种临床上有用的评估是仅基于含有HPV 880^2582的RNA转录产物表达的简单的阳性/阴性测定,不需要表达水平的精确定量测量或两种转录产物的表达水平中差异的测定(见下)。
因而,本发明涉及区分带有HPV16的受试者中(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染的方法,包括步骤
a1)测定所述受试者的样品中880^2582的基因产物的量,
a2)与参考比较步骤a1)中测定的量,
b)评估所述受试者的样品中HPV16基因组的整合状态,和
c)区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染。
优选的,前述方法的步骤a1)和a2)容许鉴定包含游离形式的HPV16基因组、但是患有重型HPV16感染(或处于其风险中)的受试者。优选的,前述方法的步骤b)中的评估容许鉴定包含或不包含整合形式的HPV16基因组的受试者。包含整合形式的HPV16基因组的受试者,优选的,患有重型HPV16感染(或处于其提高的风险中)(Vinokurova,S.,N.Wentzensen,I.Kraus,R.Klaes,C.Driesch,P.Melsheimer,F.Kisseljov,M.Durst,A.Schneider,and M.von KnebelDoeberitz.2008.Type-dependent integration frequency of humanpapillomavirus genomes in cervical lesions.Cancer Res 68:307-13,Pett,M.,and N.Coleman.2007.Integration of high-risk humanpapillomavirus:a key event in cervical carcinogenesis?J Pathol212:356-67)。如果880^2582的基因产物的量小于参考,不包含整合形式的HPV16基因组的受试者,优选地,不患有重型HPV16感染(和不处于其提高的风险中)。
前述方法包含评估受试者的样品中HPV16基因组的整合状态的步骤。本领域已知的是,HPV16基因组可以在宿主细胞中以整合形式、以游离形式或两者存在。术语“整合的”和“游离的”是技术人员理解的。如果HPV16基因组被宿主细胞的染色体DNA稳定地包含,HPV16基因组优选地在宿主细胞中以整合形式存在。如果基因组在所述宿主细胞中复制而不整合到宿主细胞的染色体DNA中,HPV16基因组优选地以游离形式在宿主细胞中存在(Vinokurova,S.,N.Wentzensen,I.Kraus,R.Klaes,C.Driesch,P.Melsheimer,F.Kisseljov,M.Durst,A.Schneider,and M.von Knebel Doeberitz.2008.Type-dependent integration frequency of human papillomavirus genomesin cervical lesions.Cancer Res 68:307-13)。
如在此使用的,用语“评估HPV16基因组的整合状态”优选地是指评估HPV16的基因组是否以整合形式存在,因而,所述基因组是否整合到宿主细胞的染色体DNA中。要理解的是,如果HPV16基因组整合到受试者的基因组中,不是所述受试者的全部细胞都具有整合到其基因组中的HPV16基因组。优选的,仅受到HPV16感染影响的细胞可能包含整合形式的HPV16基因组。优选的,所述细胞在所述受试者的泌尿生殖道或口咽道中存在。要理解的是,术语“整合形式”还涵盖HPV16的部分向宿主细胞的染色体DNA中的整合。优选的,HPV16基因组的早期区域,包括E6、E7和E1 N-末端的部分的基因,被整合到宿主基因组中。要理解的是,HPV16基因组的晚期区域,包括E4、E5和L1基因可以整合到宿主基因组中,然而,最优选的,由于基因组重排是转录无活性的。此外,已知的是,E2基因通常在整合期间丧失或转录失活(Pett,M.,and N.Coleman.2007.Integration ofhigh-risk human papillomavirus:a key event in cervical carcinogenesis?JPathol 212:356-67)。
如何评估HPV16基因组的整合状态是本领域公知的。优选的,整合状态在受试者的样品中测定。测定整合状态的优选的方法是(i)检测病毒-宿主融合转录产物、特别是转录活性的病毒整合体的方法,例如,通过乳头状瘤病毒癌基因转录产物的扩增(APOT-分析)和RNA原位杂交(ISH);以及(ii)不考虑其转录状态检测整合的病毒DNA的方法,例如,Southern印迹、定量的实时PCR、限制位点PCR和DNA ISH(Pett,M.,and N.Coleman.2007.Integration of high-riskhuman papillomavirus:a key event in cervical carcinogenesis?J Pathol212:356-67)。
因而,如在此使用的,术语“参考量”是指一种量,其容许区分带有HPV16的受试者中轻型和重型HPV感染。因而,参考可以是来自(i)已知患有轻型HPV感染(ii)已知患有重型HPV感染的受试者。对于(i)和(ii),参考优选地来自仅包含游离形式HPV的受试者。此外,880^2582的基因产物的参考量可以限定阈值量,从而880^2582的基因产物的量小于相应的阈值将是受试者患有轻型HPV感染的指示(如果所述受试者不包含整合形式的HPV16基因组,参见其他地方),而880^2582的基因产物的量大于阈值量将是受试者患有重型HPV16感染的指示。对个体受试者适用的参考量可以取决于各种生理参数而变化,例如,年龄、性别或亚群,以及取决于用于测定在此提及的转录产物或多肽的手段。合适的参考量可以通过本发明方法从与测试样品一起,即,同时地或随后地分析的参考样品中测定。
优选的,880^2582的基因产物的量大于参考量和/或整合形式的HPV16基因组的存在表明重型HPV16感染。
优选的,880^2582的基因产物的量小于参考量,以及HPV16基因组的整合形式的缺乏(因而,HPV16基因组不整合到染色体DNA中)表明轻型HPV16感染。
在本发明的上下文中,显示的是,880^2582的基因产物的存在表明重型HPV16感染,其中与HPV16基因组的整合形式的缺乏一起,880^2582的基因产物的缺乏表明轻型HPV16感染(也参见下一段落)。因而,所述参考量,优选地,是检测极限。因而,880^2582的基因产物的量大于检测极限和/或整合形式的HPV16基因组的存在,优选地,表明重型HPV16感染。优选的,880^2582的基因产物的量小于检测极限以及HPV16基因组的整合形式的缺乏(因而,HPV16基因组不整合到染色体DNA中)表明轻型HPV16感染。本领域的技术人员知道如何测定检测极限。如在此使用的,术语“检测极限”优选地是指如实施例中描述的用于测定880^2582的分析的检测极限。
有益地,显示的是,测定880^2582的基因产物的量,与参考量比较所述量,以及评估HPV16基因组的整合状态,是可靠地区分被HPV16感染的受试者中轻型的和更为重型的HPV16感染所需的。特别地,880^2582剪接的mRNA的量在具有细胞学定义的病变(LSIL到HSIL,子宫颈癌症)的患者的包含子宫颈脱落细胞的样品中测定。另外,880^2582剪接的mRNA在各种子宫颈癌症细胞系中找到,包括SiHa、CasKi、MRI-H196和MRI-H186。此外,整合状态通过测定通常在具有整合的HPV基因组的细胞中不存在的转录产物的量来评估(例如,不存在880^3358表明HPV基因组是被染色体整合的,以及没有E1^E4表达)。显示的是,相对于编码E1^E4的880^3358转录产物、编码E2的880^2709转录产物或编码E5的E5全长转录产物的检测,编码E6*II的转录产物的检测是整合状态的指示。因而,通过测定编码E6*II的转录产物与例如编码E1^E4、E2或E5的转录产物的比例,相比通过使用已知的转录产物组合,例如与E2和/或E5和/或L1相比的E6和/或E7,可以更精确地预测整合状态(附图6,表5)。
本发明方法,如果应用,是有益的,因为该方法容许评估患者中HPV感染的严重度,在所述患者中HPV基因组不整合到受HPV影响的细胞的染色体DNA中。在现有技术中,HPV基因组向宿主的染色体DNA中的整合,已知与更坏的预后相关,被认为在子宫颈癌症的发展中起到关键作用。然而,存在几个报道,如果HPV基因组不整合到宿主的染色体DNA中,也可能发生子宫颈癌症。用于区分不包含整合形式HPV基因组的受试者中轻型和重型HPV16感染的可靠的基于HPV标志物的方法在本领域中没有描述。
在本发明方法的优选的实施方式,整合状态的评估包括步骤
b1)在受试者的样品中,测定E6*II的第一基因产物以及第二基因产物的量,所述第二基因产物选自由880^3358的基因产物、880^2709的基因产物和E5的基因产物构成的组,
b2)计算第一基因产物的量与第二基因产物的量的比例(优选的,第一基因产物的量与第二基因产物的量的比例),和
b3)与参考比例比较所述比例。
测定基因产物的量和计算参考比例的优选方法,以及优选的参考比例在本文其它地方描述了(表5)。
优选的,用于评估整合状态要测定的比例是E6*II的基因产物的量与880^3358的基因产物的量的比例。
优选的,E6*II的第一基因产物的量与第二基因产物的量,优选的880^3358的量的比例大于参考比例,表明HPV的基因组以整合形式存在。
优选的,E6*II的第一基因产物的量与第二基因产物的量,优选的880^3358的量的比例小于参考比例,表明HPV的基因组不以整合形式存在。
因而,(i)880^2582的基因产物的量大于参考量和/或(ii)E6*II的基因产物的量与880^3358的基因产物的量的比例大于参考比例表明重型HPV16感染。
优选的,(i)880^2582的基因产物的量小于参考量和(ii)E6*II的基因产物的量与880^3358的基因产物的量的比例小于参考比例(表明HPV16基因组的整合形式的缺乏)表明轻型的HPV16感染。
有益地,在本发明的研究中显示的是,HPV16基因组的整合状态可以通过b1)测定受试者的样品中E6*II的基因产物和第二基因产物(优选的880^3358)的量,b2)计算E6*II的基因产物的量与第二基因产物的量的比例(优选的E6*II的基因产物的量与第二基因产物的量的比例),和b3)与参考比例比较所述比例来评估。通过进行前述的步骤的整合状态的评估是有益的,因为880^2582的基因产物的量的测定(参见步骤a1)和整合状态的评估可以通过在单个反应中定量880^2582、3632^5639、E6*II和880^3358的基因产物来同时地进行。
在本发明的前述方法的再更优选的实施方式中,步骤a1)进一步包括测定进一步的基因产物的量,所述进一步的基因产物选自由基因产物3632^5639、880^3358的基因产物、Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、E1的基因产物、E5的基因产物、L1的基因产物和E6*I的基因产物构成的组,以及计算880^2582的基因产物的量与所述进一步的基因产物的量的比例。在步骤a2)中,因而,测定的比例与参考比例比较(代之以比较880^2582的量与参考量)。优选的参考比例在本文其他地方描述了。
优选的,所述进一步的基因产物是3632^5639的基因产物。
优选的,880^2582的基因产物的量与所述进一步的基因产物的量的计算的比例是880^2582的基因产物的量与所述进一步的基因产物的量的比例。
优选的,880^2582的所述基因产物的量与所述进一步的基因产物的量的比例大于参考比例和/或整合形式的HPV16基因组的存在表明重型HPV16感染。
更优选的,880^2582的所述基因产物的量与所述进一步的基因产物的量的比例大于参考比例和/或整合形式的HPV16基因组的存在表明重型HPV16感染。
最优选的,(i)880^2582的所述基因产物的量与所述进一步的基因产物的量的比例大于参考比例和/或(ii)E6*II的基因产物的量与880^3358的基因产物的量的比例小于参考比例(表明整合形式HPV16基因组的缺乏)表明轻型HPV16感染。
优选的,880^2582的基因产物的量与所述进一步的基因产物的量的比例小于参考比例以及整合形式HPV16基因组的缺乏(因而,HPV16基因组不整合到染色体DNA中)表明轻型HPV16感染。
更优选的,880^2582的基因产物的量与所述进一步的基因产物的量的比例小于参考比例以及E6*II的基因产物的量与880^3358的基因产物的量的比例小于参考比例(表明整合形式的HPV16基因组的缺乏)表明轻型的HPV16感染。
还期待的是对其他HPV基因型进行本发明的方法(不是HPV16,因而对其他HPV基因型感染的受试者),特别是对HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45。要理解的是,相应于在此描述的HPV16的基因产物,测定那些基因产物的量。
除了HPV16之外,高风险的HPV类型是公知的,贡献了所有子宫颈癌症的~45%。已经展现的是,整合在所有高风险HPV类型的癌发生中起到重要作用。然而,对于高风险HPV16型和种系发生相关的31和33型,整合较低频繁地发生,表明了发展的第二模式,例如,E1C介导的LCR的增量调节。但是对于这些HPV型引起的大比例子宫颈癌症,以及其他型,包括HPV18和45引起的非常高比例的子宫颈癌症,整合是子宫颈癌症的发展中的关键事件(Vinokurova,S.,N.Wentzensen,I.Kraus,R.Klaes,C.Driesch,P.Melsheimer,F.Kisseljov,M.Durst,A.Schneider,and M.von Knebel Doeberitz.2008.Type-dependent integration frequency of human papillomavirus genomesin cervical lesions.Cancer Res 68:307-13)。通过在此描述的转录产物分析的整合测量,因而容许容易地鉴定具有整合的HPV基因组的那些女性。在优选的实施方式中,整合通过定量HPV 18、31、33、35和45型的E6*I的基因产物,并将它与E1^E4的第二基因产物比较来测量。对于18、31、33、35、45型HPV,编码E6*I的转录产物的相应的剪接供体位点分别位于nt 233、210、231、232和230,对于18、31、33、35与45型PV,剪接接受体位点分别位于nt 416、413、509、415和413。对于18、31、33和45型HPV,编码E1^E4的转录产物的相应的剪接供体位点分别位于nt 929、877、894和929,对于18、31、33和45型HPV剪接接受体位点分别位于nt 3432、3295、3351和3421。本领域的技术人员知道如何测定HPV35的编码E1^E4的转录产物的剪接接点,例如通过PCR扩增cDNA和随后的测序。
上文提及的各种HPV基因型的基因组的序列具有以下的GenBank登记编号:
此外,本发明涉及区分带有HPV16的受试者中(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染的方法,包括步骤
a)测定所述受试者的样品中880^2582的基因产物的量,
b)与参考量比较步骤a1)中测定的量,
c)区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,
其中所述受试者不包含整合形式的HPV16基因组。
优选的,880^2582的基因产物的量大于参考量表明所述受试者中的重型HPV16感染。
优选的,880^2582的基因产物的量小于参考量表明所述受试者中的轻型HPV16感染。
在优选的实施方式中,步骤a)进一步包括测定进一步的基因产物的量,所述进一步的基因产物选自由3632^5639的基因产物、880^3358的基因产物、Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、E1的基因产物、E5的基因产物、L1的基因产物和E6*I的基因产物(也参见上文)并计算880^2582的基因产物的量与进一步的基因产物,优选的3632^5639的基因产物的量的比例。在步骤b)中,因而,测定的比例与参考比例相比较(代之以比较880^2582的基因产物的量与参考量)。
优选的,880^2582的基因产物的量与进一步的基因产物的量的计算的比例是880^2582的基因产物的量与进一步的基因产物的量的比例。
优选的,880^2582的基因产物的量与进一步的基因产物的量的比例大于参考比例表明所述受试者中的重型HPV16感染。
优选的,880^2582的基因产物的量与进一步的基因产物的量的比例小于参考比例表明所述受试者中的轻型HPV16感染。
优选的参考比例在本文其他地方描述了。
除了HPV16之外,已知其他高风险HPV类型导致子宫颈癌症(Munoz,N.,F.X.Bosch,S.de Sanjose,R.Herrero,X.Castellsague,K.V.Shah,P.J.Snijders,and C.J.Meijer.2003.Epidemiologicclassification of human papillomavirus types associated with cervicalcancer.N.Engl.J.Med.348:518-527)。在那些之中,对HPV类型18、31、33、35和45,它们的致癌潜力的最强证据是已知的。对于HPV16,在由这些类型引起的宫颈癌的所有病例中没有发现整合(Vinokurova,S.,N.Wentzensen,I.Kraus,R.Klaes,C.Driesch,P.Melsheimer,F.Kisseljov,M.Durst,A.Schneider,and M.von KnebelDoeberitz.2008.Type-dependent integration frequency of humanpapillomavirus genomes in cervical lesions.Cancer Res 68:307-13),表明HPV16样880^2582转录产物或相应的HPV16样E1C(病毒E1蛋白的C-末端部分)多肽也在这些HPV类型中存在。本领域的技术人员知道如何测定其他高风险HPV类型的剪接接点,例如,通过通过PCR扩增cDNA和随后的测序。因而,测定相应的E1C转录产物的量,以及任选的,评估整合状态,容许区分相应hrHPV基因型,特别是HPV18、31、33、35和45的轻型和重型hrHPV感染。
并且,本发明涉及区分带有HPV16的受试者中(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染的方法,包括步骤
a)测定所述受试者的样品中第一基因产物的量,所述第一基因产物是p16INK4A的基因产物,
b)测定所述受试者的样品中第二基因产物的量,所述第二基因产物是880^3358的基因产物,
c)计算步骤a)中测定的所述第一基因产物的量与步骤b)中测定的所述第二基因产物的量的比例,
d)与参考比例比较步骤c)中计算的所述比例,和
e)区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染。
p16INK4A是宿主细胞的基因组包含的基因。因而,所述基因不由HPV16的基因组编码。因而,本发明方法期待测定p16INK4A mRNA或p16INK4A多肽的量。
在此所指的术语“p16INK4A”优选地是指周期蛋白依赖性激酶抑制物2A同种型1。人类p16INK4A的核酸序列以及氨基酸序列是本领域公知的,例如,在GenBank登记号No:NM_000077.3(核酸序列,SEQID NO:75和GenBank登记号NP_000068.1(氨基酸序列,SEQ ID NO:76中显示了。
由E7介导的p16INK4A过量表达被认为是转化hrHPV感染重要的标志物。已经发现p16INK4A的免疫染色与子宫颈细胞学和组织学样本中上皮内或侵入性肿瘤形成相关(Dallenbach-Hellweg,G.,M.J.Trunk,and M.von Knebel Doeberitz.2004.Traditional and new molecularmethods for early detection of cervical cancer.Arkh Patol 66:35-9)。
一旦通过进行任何前述方法在受试者中诊断了重型HPV16感染,可以启动癌症疗法或其他的癌症检查。
因而,本发明涉及鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的带有HPV16的受试者的方法,包括步骤,
a)测定所述受试者的样品中第一基因产物的量,所述第一基因产物是880^2582的基因产物,
b)测定所述受试者的样品中第二基因产物的量,所述第二基因产物选自由3632^5639的基因产物、880^3358的基因产物、Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、E1的基因产物、E5的基因产物、L1的基因产物和E6*I的基因产物构成的组,
c)计算步骤a)中测定的所述第一基因产物的量与步骤b)中测定的所述第二基因产物的量的比例,
d)与参考比例比较步骤c)中计算的比例,和
e)鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者。
此外,本发明涉及鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的带有HPV16的受试者的方法,包括步骤,
a)测定所述受试者的样品中第一基因产物的量,所述第一基因产物是E6*II的基因产物,
b)测定所述受试者的样品中第二基因产物的量,所述第二基因产物选自由Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、880^3358的基因产物、880^2709的基因产物和E5的基因产物构成的组,
c)计算步骤a)中测定的所述第一基因产物的量与步骤b)中测定的所述第二基因产物的量的比例,
d)与参考比例比较步骤c)中计算的所述比例,和
e)鉴定对癌症治疗敏感的受试者。
此外,本发明涉及鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的带有HPV16的受试者的方法,包括步骤,
a1)测定所述受试者的样品中880^2582的基因产物的量,
a2)与参考量比较步骤a1)中测定的量,
b)评估所述受试者的样品中HPV16基因组的整合状态,和
c)鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者。
此外,本发明涉及鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的带有HPV16的受试者的方法,包括步骤,
a)测定所述受试者的样品中880^2582的基因产物的量,
b)与参考量比较步骤a1)中测定的量,
c)鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者,
其中所述受试者不包含整合形式的HPV16基因组。
此外,本发明涉及鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的带有HPV16的受试者的方法,
a)计算第一比例,所述第一比例的计算包括步骤
a1)测定所述受试者的样品中第一基因产物的量,所述第一基因产物是880^2582的基因产物,
a2)测定所述受试者的样品中第二基因产物的量,所述第二基因产物选自由3632^5639的基因产物、880^3358的基因产物、Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、E1的基因产物、E5的基因产物、L1的基因产物和E6*I的基因产物构成的组,以及
a3)计算步骤a1)中测定的所述第一基因产物的量与步骤a2)中测定的所述第二基因产物的量的第一比例,
b)计算第二比例,所述计算包括步骤
b1)测定所述受试者的样品中第三基因产物的量,所述第一基因产物是E6*II的基因产物,
b2)测定所述受试者的样品中第四基因产物的量,所述第四基因产物选自由Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、880^3358的基因产物、880^2709的基因产物和E5的基因产物构成的组,以及
b3)计算步骤b1)中测定的所述第三基因产物的量与步骤b2)中测定的所述第四基因产物的量的第二比例,以及
c)与第一参考比例比较步骤a)中测定的所述第一比例,以及与第二参考比例比较步骤b)中测定的所述第二比例,以及
d)鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者。
如在此使用的术语“鉴定”是指评估受试者是否将对癌症治疗敏感,或评估受试者是否对癌症检查敏感。本领域技术人员将理解的是,这样的评估通常不期望是对所有(即,100%)的被鉴定受试者是正确的。然而,该术语需要的是可以鉴定受试者的统计学上显著的部分(即,在群组研究中)。部分是否是统计学上显著的可以由本领域的技术人员使用各种公知的统计评价工具,例如,置信区间的确定,p-值测定,student T测试,Mann-Whitney测试,等等来不用再费周折地确定。细节在Dowdy and Wearden,Statistics for Research,John Wiley &Sons,New York 1983中。优先的置信区间是至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。p值优选地是0.1、0.05、0.01、0.005或0.001。更优选的,群体的受试者的至少60%、至少70%、至少80%或至少90%可以通过本发明的方法适当地鉴定。
适合的癌症治疗是本领域公知的。优选的,术语“癌症治疗”包括目的在于治疗重型HPV16感染、优选的HSIL、CIN2/3和子宫颈癌症的任何治疗。优选的,所述癌症治疗选自conisation、环体电外科切除操作(LEEP)、包括子宫颈切除术和子宫切除的手术以及化学治疗和放射化学疗法。优选的,术语“癌症检查”选自阴道镜检查和阴道镜定向的活检并随后组织化学分析。
此外,本发明涉及包含探针寡核苷酸混合物的组合物,其中所述探针寡核苷酸混合物包含特异性地检测在此定义的第一转录产物的探针寡核苷酸,以及特异性地检测在此定义的第二转录产物的探针寡核苷酸。优选的,所述组合物包含两种探针寡核苷酸。优选的探针寡核苷酸的优选的核酸序列在文本其他地方描述了(表1)。
此外,本发明涉及包含寡核苷酸混合物的组合物,所述寡核苷酸混合物包含特异性地扩增第一基因产物、优选的本发明方法的转录产物的寡核苷酸,以及特异性地扩增本发明的方法的至少一种第二基因产物,优选的转录产物的寡核苷酸(表3)。
此外,本发明涉及包含第一组合物和第二组合物的组合物,所述第一组合物包含探针寡核苷酸混合物,所述第二组合物包含寡核苷酸混合物,所述寡核苷酸混合物包含特异性地扩增本发明的方法的第一基因产物、优选的转录产物的寡核苷酸,以及特异性地扩增本发明的方法的至少一种第二基因产物、优选的转录产物的寡核苷酸(表1、3)。
此外,本发明涉及组合物,其包含(i)特异性结合第一多肽所包含的肽的抗体(优选的,结合由侧翼于在此提及的剪接接点的核酸所编码的第一多肽的区域的抗体),(ii)特异性结合第二多肽所包含的肽的抗体(优选的,结合由侧翼于在此提及的剪接接点的核酸所编码的第一多肽的区域的抗体)
此外,本发明涉及区分带有HPV16的受试者(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或用于鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者的设备:
a)包含寡核苷酸混合物的组合物,所述寡核苷酸混合物包含特异性地扩增本发明方法的第一基因产物、优选的转录产物的寡核苷酸,以及特异性地扩增本发明的方法的至少一种第二基因产物,优选的转录产物的寡核苷酸,
b)包含探针寡核苷酸混合物的组合物,或
c)包含探针寡核苷酸混合物的组合物,以及包含寡核苷酸混合物的组合物,所述寡核苷酸混合物包含特异性地扩增本发明的方法的第一基因产物、优选的转录产物的寡核苷酸,以及特异性地扩增本发明的方法的至少一种第二基因产物、优选的转录产物的寡核苷酸。
此外,本发明涉及区分带有HPV16的受试者(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或用于鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者的设备,包含测定受试者的样品中第一基因产物的量的装置,测定受试者的样品中第二基因产物的量的装置,计算所述第一基因产物的量与所述第二基因产物的量的比例的装置,以及与参考比例比较所述计算的比例的装置,从而它区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或从而鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者。
此外,本发明涉及区分带有HPV16的受试者(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或用于鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者的设备,包括测定受试者的样品中880^2582的基因产物的量的装置,与参考量比较所述装置测量的量的装置,以及评估所述受试者的样品中HPV16基因组的整合状态的装置,从而它区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或从而鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者。
此外,本发明涉及区分带有HPV16的受试者(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或用于鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者的设备,包括测定受试者的样品中880^2582的基因产物的量的装置,与参考量比较所述装置测定的量的装置,以及评估所述受试者的样品中HPV16基因组的整合状态的装置,从而它区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或从而鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者。
此外,本发明涉及区分带有HPV16的受试者(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或用于鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者的设备,所述受试者不包含整合形式的HPV16基因组,其中所述设备包含测定受试者的样品中880^2582的基因产物的量的装置,与参考量比较所述装置测定的量的装置,从而它区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或从而鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者。
如在此使用的术语“设备”是指装置的系统,其至少包含可操作地相互连接的前述的装置,以容许区分轻型和重型HPV16感染,或鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者。优选的用于测定基因产物的量的装置、计算比例的装置和进行比较的装置在上文中与本发明的方法一起公开了。如何以操作方式连接所述装置将取决于包括在设备中的装置的类型。例如,当应用自动地测定基因产物的量的装置时,所述自动地运行的装置获得的数据由例如计算机程序处理以获得期望的结果。优选的,在这样的情况下所述装置由单个设备包含。因而所述设备可以包括分析单元,用于应用的样品中基因产物的量的测量,以及计算机装置,用于处理用来评估的产生的数据。用于检测的优选的装置在上文与本发明的方法相关的实施方式中一起公开了。在这样的情况下,所述装置可操作地连接,由于指令和解释是人工给出的,系统的用户将量测定的结果和其诊断或预后值结合在一起。在这样的实施方式中所述装置可以表现为分离的设备,优选的,作为试剂盒包装在一起。本领域的技术人员将不用再费周折地知道如何连接所述装置。优选的设备是不需要专业医师的特别知识就可以应用的那些,例如,仅仅需要加载样品的测试条或电子设备。结果可以作为需要临床医师解释的原始数据输出来给出。优选的,然而,设备的输出是不需要临床医师解释的处理的、即评估了的原始数据。进一步优选的设备包括分析单元/设备(例如,生物传感器、阵列、固相支持物,其连接到特异性识别要测定量的所述多肽、mRNA、扩增的基因产物的配体,等离子体表面共振设备、NMR谱仪、质谱仪,等等)或在上文根据本发明的方法提及的评估单元/设备。
此外,本发明涉及适应于进行本发明的方法的试剂盒,所述试剂盒包括进行所述方法的说明,以及
a)包含寡核苷酸混合物的组合物,所述寡核苷酸混合物包含特异性地扩增本发明方法的第一基因产物、优选的转录产物的寡核苷酸,以及特异性地扩增本发明的方法的至少一种第二基因产物,优选的转录产物的寡核苷酸,
b)包含探针寡核苷酸混合物的组合物,或
c)包含探针寡核苷酸混合物的组合物,以及包含寡核苷酸混合物的组合物,所述寡核苷酸混合物包含特异性地扩增本发明的方法的第一基因产物、优选的转录产物的寡核苷酸,以及特异性地扩增本发明的方法的至少一种第二基因产物、优选的转录产物的寡核苷酸。
此外,本发明涉及适应于进行本发明方法的试剂盒,所述试剂盒包含进行所述方法的说明,以及测定受试者的样品中第一基因产物的量的装置,测定受试者的样品中第二基因产物的量的装置,计算所述第一基因产物量与所述第二基因产物的量的比例的装置,以及与参考比例比较所述计算的比例的装置,从而它区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或从而鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者。
此外,本发明涉及适应于进行本发明方法的试剂盒,所述试剂盒包含进行所述方法的说明,以及用于测定受试者样品中880^2582的基因产物的量的装置、与参考量比较所述装置测定的量的装置、以及评估所述受试者的样品中HPV16基因组的整合状态的装置,从而它区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或从而鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者。
此外,本发明涉及适应于进行本发明方法的试剂盒,所述试剂盒包含进行所述方法的说明,以及用于测定受试者样品中880^2582的基因产物的量的装置、与参考量比较所述装置测定的量的装置、以及评估所述受试者的样品中HPV16基因组的整合状态的装置,从而它区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或从而鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者。
此外,本发明涉及适应于进行本发明方法的试剂盒,所述受试者不包含整合形式的HPV16基因组,所述试剂盒包含进行所述方法的说明,以及用于测定受试者的样品中880^2582的基因产物的量的装置,以及与参考量比较所述装置测定的量的装置,从而它区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,或从而鉴定对癌症治疗敏感的和/或对癌症检查敏感的受试者。
如在此使用的术语“试剂盒”是指本发明的前述化合物、装置或试剂的集合,其可以或可以不包装在一起。试剂盒的成分可以由独立的小瓶(即,作为独立部分的试剂盒)包含或在单个小瓶中提供。此外,要理解的是,本发明的试剂盒被用于进行上文中提及的方法。优选的,设想的是,所有的成分以用于进行上文提及的方法的待用形式来提供。进一步的,所述试剂盒优选地含有用于进行所述方法的说明。说明可以通过纸质或电子形式的用户手册来提供。例如,所述手册可以包含解释在使用本发明的试剂盒进行前述方法时获得的结果的说明。
本说明书中引用的所有参考文献,对于它们的全部公开内容以及在本说明书中特别提及的公开内容,在此通过引用来合并。
附图显示了:
附图1:HPV16的基因组组织、开放阅读框和转录产物种类。ORF在矩形的它们的适当的阅读框中显示(附图的顶部)。矩形的上左侧端的第一个数字相应于第一个ATG的核苷酸(nt)位置。每个ORF的终止密码子的最后的nt的位置打印在矩形的右上角。位于基因组标尺下方的是剪接的mRNA种类的表。外显子用黑色矩形说明,而内含子用之间的黑色发线标明。线下方打印的数字表明5′和3′剪接接点位置。转录产物种类O的启动子没有画出。编码全长E1蛋白的转录产物没有描绘。E6和E1的可能的截短的基因产物用星号(*)标明,E1和E4蛋白的融合产物表示为E1^E4。修改自Zheng,Z.M.,and C.C.Baker.2006.Papillomavirus genome structure,expression,andpost-transcriptional regulation.Front Biosci 11:2286-302。
附图2:wt/q-RNA比例对Q-RNA量的依赖性。每次NASBA反应1,000到100,000拷贝数的Q-RNA掺进E6*I wt-RNA稀释度系列,通过NASBA扩增,使用Luminex杂交来检测。用点线显示的截断值如下计算:对于每个探针,在杂交混合物中不添加扩增子的反应中的MFI值被认为是背景值。杂交的扩增子的净MFI值通过从总体MFI值减去1.1倍的中值背景值来计算。高于3MFI的净MFI值被定义为阳性反应。标明了两个杂交反应的标准误差。为了曲线斜率的更好的可视化,添加数据点之间的线。
附图3:利用SiHa总RNA的E7 NASBA的检测极限。SiHa总RNA的稀释度系列利用每个NASBA反应10,000个Q-RNA分子进行E7 NASBA-Luminex分析。标明了两个杂交反应的平均和标准误差。为了曲线斜率的更好的可视化,添加数据点之间的线。
附图4:E6*I和*II对比E6 f1表达的图案。转录产物E6*I(A)和*II(B)对比E6 f1的比例在y轴上标绘,细胞学病变级别以及病变的组在x轴中显示。点线代表了中值。
附图5:E6*II表达与细胞转录产物的标准化。E6*II对比细胞转录产物的比例在y轴上标绘,细胞学病变级别以及病变的组在x轴中显示。点线代表了中值。
附图6:E6*II对比880^3358和E6 f1对比E5 f1表达的图案。E6*II对比880^3358(左侧)和E6 f1对比E5 f1(右侧)的比例在y轴上标绘,细胞学病变级别和病变的组在x轴中显示。点线代表了中值。
附图7:相比作为金标准的细胞学,Biomérieux HPV试剂盒和DKFZ NASBA-Luminex分析的性能。
附图8:患者分类的方案。
以下实施例应该仅仅说明本发明。无论如何,它们不应当解释为限制本发明的范围。
实施例1:分析设计
在当前的研究中,开发了检测和定量子宫颈中剪接的和未剪接的RNA序列的新的过程。对于它们在不同级别的子宫颈病变中的诊断可能性表征了这些RNA模式。因而,开发了检测10种剪接的(226^409(E6*I)、226^526(E6*II)、226^3358(E6*III)、226^2709(E6*IV)、880^2582、880^2709、880^3358、1302^3358、1302^5639、3632^5639)(在Zheng,Z.M.,and C.C.Baker.2006.Papillomavirus genomestructure,expression,and post-transcriptional regulation.Front Biosci11:2286-302中综述,附图1)和5种全长ORF HPV16 RNA序列(E6,E7,E1,E5,L1)以及2种细胞持家的(遍在蛋白C,U1A)转录产物的新的分析。
NASBA利用了三种酶,禽类成髓细胞血症病毒逆转录酶(AMV-RT)、RNase H和t7 RNA聚合酶的同时反应的等温目标扩增。步骤在特定的温度(41℃)下在一个反应试管中进行。测试的特征是,第一寡核苷酸引物(P1)含有T7RNA聚合酶启动子序列。在反应期间,AMV-RT产生目标RNA的单个DNA拷贝。RNase H降解DNA/RNA杂交物的RNA部分,第二引物(P2)与剩余的DNA链退火。为了稍后利用Luminex检测,第二引物含有5′通用序列。AMV-RT的DNA依赖性DNA聚合酶活性延伸P2,产生原始目标RNA的带有完整T7RNA聚合酶启动子的dsDNA拷贝。这种T7启动子被T7RNA聚合酶识别,其启动大量反义RNA扩增子的转录作用。
根据厂家的说明书使用NucliSens Basic试剂盒(BioMerieux Ltd.,France)。简要地,2.5μL RNA模板添加到5μl反应混合物中,所述反应混合物含有80mM的KCl、0.2μmoles的每种引物和没有酶的1×Reagent Sphere,混合物加热到65℃2分钟,之后置于41℃下另外2分钟。然后,2.5μL集中的酶添加到每个反应中,扩增反应在41℃孵育90分钟。
反义RNA可以通过与联结到Luminex珠子的寡核苷酸探针杂交来特异性地检测(表1)。在生物素标记的检测探针与被掺入到反义RNA中的P2的通用部分退火时,发生Strep-PE的染色以及在Luminex分析仪中测量。
NASBA产生的RNA扩增子利用珠子偶联的寡核苷酸探针(表1)来检测。RNA特异性探针如近来描述地偶联(Schmitt,M.,I.G.Bravo,P.J.Snijders,L.Gissmann,M.Pawlita,and T.Waterboer.2006.Bead-based multiplex genotyping of human papillomaviruses.J ClinMicrobiol 44:504-12)。所有溶液和缓冲液保证是无DNase/RNase的。对于NASBA反应,1到0.1μl转移到PCR平板。使用多通道的吸移管,添加每次分选由33μl 1.5M TMAC、75mM Tris-HCl、pH 8.0、6mM EDTA、pH 8.0、1.5g/L sarkosyl、16μl TE缓冲液、0.2μmolar5′-生物素化的decorator探针组成的49μl杂交溶液以及2,000个杂交探针偶联的珠子的混合物。完整混合物在95℃变性5分钟,立即置于冰上1分钟。杂交平板转移到加热块摇动器上,在41℃进行杂交30分钟。每个反应孔的内容物通过使用多通道吸移管转移到洗涤平板。随后,反应孔用100μl的洗涤缓冲液(1×PBS,0.02%Tween)在洗涤站上洗涤。珠子在含有1/1000稀释的Strep-PE的50μl检测溶液(2M TMAC、75mM Tris-HCl、pH 8.0、6mM EDTA、pH 8.0、1.5g/L sarkosyl)中在RT在摇动器上重悬浮20分钟。珠子用100μl洗涤缓冲液洗涤两次,在摇动器上在100μl洗涤缓冲液中重悬浮2分钟。用Luminex 100分析仪进行分析。
为了从全长RNA序列中辨别剪接的,使用剪接位点特异性Luminex探针而不是特异性引物。由于不同HPV型的剪接位点之间的高度同源性,采用其他的型特异性下游探针。
表1.NASBA-Luminex实验中使用的寡核苷酸杂交探针的概述。
af1,含有全长ORF的RNA序列
实施例2:定量NASBA的开发
NASBA分析中定量和内部性能对照需要向NASBA混合物添加已知浓度的体外转录的校准物RNA(Q-RNA)。野生型(wt-)和Q-RNA之间的仅有差异,杂交探针结合区域,容许利用Luminex技术辨别和定量扩增子。Wt-和Q-RNA转变成cDNA,用容许两种RNA的竞争性扩增的相同引物来共同扩增。在扩增的结束时两种扩增子的比例反映了在扩增开始时存在的两种目标wt和Q的比例。未知样品中存在的wt-mRNA使用外部标准曲线来定量。这种标准曲线通过在恒定量的Q-RNA中体外转录的RNA的10倍稀释度系列来形成。体外转录的wt-RNA预计展现了类似于wt-mRNA的NASBA性质。
Q-RNA模板通过融合-PCR来产生,克隆到Bluescript M13-KS载体中,用合适的限制性内切酶来线性化。使用T3RNA聚合酶,Q-RNA进行体外转录,用DNaseI处理来除去质粒DNA。每个NASBA反应的校准物RNA分子的输入水平进行优化,通过将限定量的Q-RNA加入wt-RNA的连续稀释系列中,随后NASBA-Luminex分析用于wt-RNA的精确定量。为了获得标准曲线,计算wt-对比Q-RNA比例,针对wt-RNA拷贝数来标绘。没有测试高于每个分析106个拷贝的输入量,因为它们被认为是临床上不相关的。对E6*I NASBA-Luminex分析示范性地显示了这种开发(附图2)。
对每个NASBA目标确定最佳的Q-RNA浓度,在表2中概述。一般地,所有NASBA标准曲线显示了4到5logs的宽动态范围,是多项式而不是线性形状的。由于多项式曲线的扁平的中间部分,未知样品中RNA浓度的内插在这个部分是不精确的。尽管如此,所有NASBA分析容许10倍RNA拷贝数差异的可靠的辨别。除了定量之外,在wt-NASBA中同时的阴性结果,Q-RNA NASBA的部分或完全失败,表明了NASBA抑制物,例如,乙醇的存在(数据未显示)。
合起来,定量性NASBA-Luminex分析能够定量样品中存在的wt-RNA量中4到5个量级的10倍差异。
表2.定量性NASBA-Luminex分析的检测极限(DL)和Q-RNA量
实施例3:NASBA反应的敏感性
来自HPV16的各种剪接和全长的RNA以及细胞转录产物的检测需要设计与剪接位点的上下游退火的剪接位点特异性杂交探针,以及转录产物特异性引物(表1和表3)。NASBA引物的小心的设计看起来对于最佳的敏感性是关键的。对于U1A持家转录产物的检测,描述了证实的敏感性引物序列(US专利5876937)。
使用连续稀释的体外转录的wt-RNA,从来自HPV16的RNA目标、具有优化的Q-RNA量输入的细胞转录产物(指表2),在NASBA-Luminex反应中测试了寡核苷酸引物。检测极限被定义为显示阳性结果的最低RNA量。对于不同的日期进行的三个独立的分析,标明了最高的检测极限(表2)。
所有NASBA目标的检测极限从每个NASBA反应25到2,500个拷贝数。仅有的例外是细胞p16INK4A的检测需要25,000个RNA拷贝。此外,SiHa总RNA进行纯化,连续稀释,和用E6*I、E6*II、E7 f1、U1A和Ubc NASBA测试,随后Luminex杂交。少至0.3SiHa细胞当量可以使用E6*I和E7特异性NASBA引物检测,而E6*II、Ubc和U1A NASBA引物检测3个细胞(附图3,如对E7 f1示范性地显示的)。总体上,定量的NASBA反应看起来对于病毒和细胞转录产物的检测是高敏感性的。
表3.NASBA-Luminex实验中使用的寡核苷酸引物
a P1引物的5′末端含有由以下25个核苷酸组成的T7RNA聚合酶启动子序列:5′-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G-3′;
b P2引物含有5′通用序列(5′-ata tac tac gga tgg cct g-3′),其是与decorator探针和与目标RNA序列相同的核苷酸的3′片段的杂交所需的;
c已经公开了P1和P2 U1A引物(Greijer,A.E.,C.A.Dekkers,andJ.M.Middeldorp.2000.Human cytomegalovirus virions differentiallyincorporate viral and host cell RNA during the assembly process.J Virol74:9078-82.)。
实施例4:不同级别的病变中的HPV16RNA模式
不同级别的子宫颈病变中,HPV16全长和剪接的以及细胞p16INK4A、Apm1和持家RNA序列的表达通过对表2中列出的目标的singleplex定量NASBA-Luminex分析来分析。与Dr.C.Clavel(Reims,France)合作,获得了从保存在PreservCytTM介质中的子宫颈脱落细胞纯化的RNA样品。组由具有正常的(NIL/M,n=25)、LSIL(n=24)、HSIL(n=24)和CxCa(n=7)细胞学的HPV16 DNA阳性涂片组成。这个横向研究目的是鉴定对于低级或高级子宫颈病变的存在为预测性的转录产物或转录产物模式。
持家转录产物的分析主要用于测定RNA完整性。总共78个样品是U1A和Ubc同时阳性的,一个样品是同时阴性的,仅一个样品U1A为不明确阳性,是Ubc阴性的(数据未显示)。由于U1A和Ubc RNA双重阴性样品(两种Q-RNA都是阳性的)含有65ng/μl的总RNA,这种RNA被解释为降解的。
不同的病变类型中单个转录产物的发生率
剪接的转录产物880^2582几乎仅在病变中检出,它的发生率从LSIL(30%)到CxCa(57%)逐渐地提高。
E6*I在70%的NIL/M、75%的LSIL、83%的HSIL和100%的CxCa病例中检出,因而在所有组中比E6*II更常检出(57%的NIL/M、55%的LSIL、75%的HSIL和86%的CxCa病例)。E6*II NASBA引物也能退火并扩增263核苷酸长E6*I转录产物,产生更大的RNA扩增子。尽管是更大的大小,E6*II引物在LSIL和HSIL中扩增E6*I(这个组合缩写为*I(*II))和鉴定E6*I的稍微更高的发生率方面是更有效的。
与在所有病变类型中高度普遍的含有L1全长的转录产物相比,编码L1蛋白的剪接的转录产物3632^5639在LSIL中是最丰富的(60%),在CxCa以及NIL/M中较不常见(分别42和39%)。
虽然含有E7全长的转录产物已经在几乎所有的NIL/M病例中存在,p16INK4A转录产物在这个阶段是相当稀有的,但是在HSIL到CxCa中是高度普遍的。
表4.不同的细胞学组中转录产物的发生率(%)
1*I(*II),通过E6*II引物扩增的和通过E6*I探针检测的E6*I转录产物。
单个转录产物的表达水平
在增量调节的转录产物中,早期癌基因转录产物E6*I、*I(*II)、E6*II、E6全长和E7全长显示了在NIL/M和CxCa之间在它们的表达中高度显著的增量调节(数据未显示)。为了分析剪接的对比全长E6转录产物的比例是否在癌发生期间相对改变,E6*I和E6*II表达与E6全长表达相关联。与E6*I相比,仅E6*II对比E6全长比例的中值在从LSIL向CxCa的发展期间提高(附图4)。
此外,编码可能的LCR转录激活物的转录产物880^2582相比在NIL/M中,在高级的病变(HSIL,CxCa)中高度显著地更经常地表达。
细胞的标志物转录产物p16INK4A显示了在高级别对比低级别病变中显著的增量调节(p<0.05)。
反之,转录产物,例如,编码病毒衣壳形成和释放所需的蛋白质的880^3358、3632^5639和L1全长的表达,虽然频繁地存在,在从LSIL到CxCa的发展期间减量调节了(数据未显示)。这种减量调节对于880^3358表达是特别强的,其从LSIL到CxCa病变高度显著地降低。L1全长表达从NIL/M到LSIL高度显著地增量调节(p<0.01),表明在具有正常细胞学的感染中的低病毒活性。在所有的CxCa中可检测的L1全长序列,与LSIL相比在高级别病变中它们的表达倾向于减量调节(p>0.05)。
定量的表达数据确认了在癌症发展期间早期癌基因转录产物的已知的增量调节。与癌基因转录产物相比,L1全长和880^3358(E1^E4)RNA在发展期间减量调节。此外,880^2582转录产物几乎仅在子宫颈病变中检出。
实施例5:转录产物对模式
宫颈涂片中定量的转录产物分析的限制(实施例4)是这些样品可能含有可变量的HPV感染的细胞的事实。总RNA的标准化校正了细胞总数和RNA质量中的变异,但是不校正HPV感染的细胞的部分。然而,HPV感染的细胞的量,可能对总体HPV RNA浓度有强的影响。为了标准化不同量的HPV感染的细胞,进行了HPV转录产物的成对的模式分析。假定两种或更多种转录产物的模式在给定病变组的大部分HPV阳性细胞中是类似的,这将与分析100个还是1,000个细胞无关。
转录产物对的表达水平的比例与病变组相关:高级对比低级病变(CxCa/HSIL对比LSIL/NIL/M)。对于感兴趣的转录产物双重阴性的样品从分析中排除。使用Wilcoxon秩和检验评估相关性。在各组之间转录产物对表达水平比例的差异的显著性被分选(sort)和在表5中概述。
从正常的(NIL/M)到CxCa的发展期间显示了统计学上显著的和统计学上高度显著的差异的转录产物比转录产物比例在表5中呈现。一般地,如通过NASBA-Luminex测试所测定的,相比仅利用全长转录产物的比例(现有技术的),含有至少一种剪接的转录产物的比例总是更显著的(表6)。
表6.本领域已知的和来自本发明的HPV转录产物标记物组合,通过NASBA-Luminex分析来分析的它们的显著性
awilcoxon秩和检验,低于0.05的p值被认为是统计学上显著的,低于0.01的p值被认为是高度显著的。
有限量的病毒转录产物,例如,E6*II、*I(*II)和880^2582,用细胞转录产物(Apm1、U1A、Ubc)或用剪接的病毒转录产物(880^3358、3632^5639)标准化的,容许相对任何低级的病变,单独的LSIL、或单独的NIL/M,高级的CxCa/HSIL病变的高度显著的辨别力(p<0.01)。这些比例在高级病变中由880^2582和E6*II的显著增量调节所驱动。与HSIL/CxCa相比,对比880^3358,LSIL显示了高度显著地更小的E6*II的表达。
根据文献,p16INK4A表达看起来在CxCa和HSIL中增量调节,当与880^3358标准化时,容许CxCa/HSIL和LSIL/NIL/M之间的高度显著的辨别。
细胞的转录产物,包括Apm1,持家转录产物U1A和Ubc,在正常化特别是E6*II表达方面被证明是重要的。产生的标准化在高级和低级病变之间是高度显著地不同的,并且独立于使用的细胞转录产物(附图5)。
合起来,剪接的转录产物的分析,而不是全长转录产物的分析,提供细胞学组之间更为显著的差异。在剪接的转录产物中,E6*II和880^2582展现了在组之间的强烈差异,可以通过各种细胞的和病毒的转录产物来标准化。此外,880^2582的表达与特别是高级病变的存在强烈地相关。因而,880^2582可能在癌症发展期间起到迄今为止未知的作用,使得它成为高级和癌性病变的新的HPV标志候选物。
实施例6:整合状态的分析
HPV16的整合已知是癌发生期间的重要因素。在大多数病例中,肿瘤细胞中存在的整合在E1/E2/E5区域内发生,导致病毒DNA的分裂。E6/E7/E1内的早期序列可能不在整合期间被破坏,因而早期转录产物对比880^3358、880^2709或E5 f1的比例可以用于评估病毒整合事件。
E6*II对比880^3358的中值表达在高级病变中与低级病变相比是最显著提高的。这一发现与已知的高级别病变中高HPV16整合发生率有良好的一致性(附图6)。使用E6*II对比880^3358的1.5的截断值,总共可以预测6个CxCa和5个HSIL病例含有整合的HPV16基因组。这些中的至少3个(27%)可能仅含有整合体,因为880^3358表达在这些病例中是缺乏的,而另外8个还可能含有游离DNA。其他早期转录产物,例如,E6*I以及E6 f1、E7 f1和E1 f1与880^3358、880^2709或E5 f1相比较,容许较低程度地预测转录活性整合物的存在(对于E6*II对比880^3358和E6 f1对比E5示范性地描述了,附图6)。
总之,与含有880^3358或880^2709的RNA序列相比较的E6*IIRNA序列的检测和定量看起来高度适合于HPV16整合状态的评估,特别是仅涉及整合的基因组时。此外,E6*II对比880^3358比例或E6*II对比880^2709比例相比其他含有全长转录产物的比例是更好的。
实施例7:用于HPV相关病变的复杂的分子诊断的不同HPV转录产物标志物的组合
来自实施例5和6的数据表明,子宫颈的高级病变可以伴随不同的、但特征性的转录模式而存在。
因而,发现的是,与商业上可获得的Biomérieux HPV试剂盒相比,(i)880^2582对比3632^5639和(ii)E6*II对比880^3358的组合显著地提高了预测高级或低级病变存在的敏感性和特异性。使用这种组合,总共7个CxCa病例(100%)、15个HSIL(63%)被正确地鉴定为高级的(CxCa/HSIL),14个LSIL(70%)和21(91%)正常样本被正确地鉴定为低级的(LSIL/NIL/M)。与PreTect HPVProofer相比,NASBA-Luminex分析区分高级和低级病变的特异性从23%大大提高到83%(附图7)。获得的HPV Proofer数据与早先的报道相符,确认了大部分的NIL/M样品对于E6/E7 mRNA是阳性的,潜在地导致健康个体的过度治疗。
总起来,这项研究提供了用于子宫颈病变分级的诊断性HPV16RNA模式存在的证据。对于20种分析的转录产物,仅4个含有病毒剪接位点的转录产物和1个持家转录产物(用于RNA质量控制)就足以用于诊断应用。做为选择,更短的寡核苷酸或检测特异性表位的剪接位点特异性抗体可以用于检测相应的基因产物(表7)。
表7.剪接位点特异性肽和抗体。
实施例8:利用本发明的患者管理
一名35岁的女性在常规的子宫颈癌症前兆筛选计划期间咨询了她的妇科医生。Pap测试表明低级病变(LSIL)的存在,而随后的HPV基因分型分析显示了HPV16的存在。谨慎的医师建议如上所述的RNA分布测试。结果表明存在含有880^2582的mRNA和因此的高级病变。医师建议1年后跟踪。一年后,该女性再次通过Pap测试来测试,这次,表明了高级病变(HSIL)的存在,该女性被建议治疗。
另一名37岁的女性在常规的子宫颈癌症前兆筛选计划期间咨询了她的妇科医生。Pap测试表明高级病变(HSIL)的存在,随后的HPV基因分型分析显示了HPV16的存在。医师建议如上所述的RNA分布测试。结果表明存在低级的病变或正常的细胞学。医师提议安排确认低级病变的阴道镜检查。
来自35岁女性的实施例描述了如上所述的RNA分布测试可以预测将来的高级病变发生。37岁女性的实施例描述了以下事实:Pap测试经常是不准确的,导致诊断为HSIL阳性的女性的过度治疗。使用如上所述的RNA分布测试,可以降低对阴道镜检查和治疗的不必要的诊治。
在优选的实施方式中,妇女的初步筛选通过Pap测试和/或hrHPVDNA基因分型分析来进行。HrHPV阳性妇女随后通过定量本发明的基因产物的hrHPV RNA测试来分析。在第一个步骤中,E1C和来自第二基因例如3632^5639的基因产物被评估(指标1,根据实施例7)。高级结果的患者被提议治疗。指标1为阴性的患者,例如通过E6*II的基因产物对比例如880^3358的表达的评估来分析HPV的整合(根据实施例7的指标2)。指标2为阳性的妇女被提议治疗。指标1和2为阴性的患者进行跟踪(附图8)。
Claims (1)
1.特异性检测880^2582的基因产物的试剂在制备诊断组合物中的用途,所述诊断组合物用于区分带有HPV16的患者中(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染,所述患者不包含整合形式的HPV16基因组;其中所述特异性检测880^2582的基因产物的试剂是特异性检测所述转录产物的探针寡核苷酸。
2. 权利要求1的用途,其中所述880^2582的基因产物是包含880^2582接点的剪接的转录产物。
3. 权利要求1的用途,其中所述诊断组合物进一步包含特异性扩增所述转录产物的寡核苷酸。
4. 权利要求1的用途,其中所述试剂是特异性识别作为880^2582的基因产物的多肽的试剂。
5.权利要求3的用途,其中所述诊断组合物含有至少一种允许测定所述特异性扩增的转录产物的量的寡核苷酸。
6. 权利要求1-5中任一项的用途,其中所述诊断组合物进一步含有特异性识别第二基因产物的试剂,所述第二基因产物选自由3632^5639的基因产物、880^3358的基因产物、Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、E1的基因产物、E5的基因产物、L1的基因产物和E6*I的基因产物构成的组。
7.权利要求1-5中任一项的用途,其中所述特异性检测880^2582的基因产物的试剂也能够测定所述基因产物的量。
8. 特异性检测E6*II的基因产物的第一试剂和特异性识别第二基因产物的第二试剂在制备用于区分带有HPV16的患者中(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染的诊断组合物中的用途,其中所述第二基因产物选自由Apm1的基因产物、Ubc的基因产物、U1A的基因产物、880^3358的基因产物、880^2709的基因产物和E5的基因产物构成的组。
9. 权利要求8的用途,其中所述基因产物是多肽,其中所述特异性检测第一多肽的和所述第二多肽的试剂是分别特异性检测所述第一多肽和所述第二多肽的抗体。
10.权利要求8的用途,其中所述第一试剂也能够测定E6*II的所述基因产物的量和/或其中所述第二试剂能够测定Apm1、Ubc、U1A、880^3358、880^2709和/或E5的所述基因产物的量。
11. 一种包含探针寡核苷酸混合物的组合物,其中所述探针寡核苷酸混合物包含特异性检测根据权利要求8的第一基因产物的探针寡核苷酸,以及特异性检测根据权利要求8的第二基因产物的探针寡核苷酸,其中所述第一和第二基因产物是转录产物。
12. 一种用于区分带有HPV16的患者中(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染的设备,包含用于测定880^2582的基因产物的量的装置,以及用于与参考量比较所述量的装置,容许区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染;其中所述特异性检测880^2582的基因产物的试剂是特异性地检测所述转录产物的探针寡核苷酸。
13. 一种试剂盒,包括测定880^2582的基因产物的量的装置,以及与参考量比较所述量的装置,容许区分(i)重型HPV16感染和(ii)轻型HPV16感染;其中所述特异性检测880^2582的基因产物的试剂是特异性地检测所述转录产物的探针寡核苷酸。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP08168608A EP2184368A1 (en) | 2008-11-07 | 2008-11-07 | Diagnostic transcript and splice patterns of HPV16 in different cervical lesions |
EP08168608.1 | 2008-11-07 | ||
PCT/EP2009/064811 WO2010052317A1 (en) | 2008-11-07 | 2009-11-09 | Diagnostic transcript and splice patterns of hpv16 in different cervical lesions |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102272329A CN102272329A (zh) | 2011-12-07 |
CN102272329B true CN102272329B (zh) | 2014-07-30 |
Family
ID=40601388
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200980154825.6A Expired - Fee Related CN102272329B (zh) | 2008-11-07 | 2009-11-09 | 在不同的子宫颈病变中hpv16的诊断性转录产物和剪接模式 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9803253B2 (zh) |
EP (2) | EP2184368A1 (zh) |
JP (2) | JP5823868B2 (zh) |
CN (1) | CN102272329B (zh) |
CA (1) | CA2742917C (zh) |
WO (1) | WO2010052317A1 (zh) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7601497B2 (en) | 2000-06-15 | 2009-10-13 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method |
US7439016B1 (en) | 2000-06-15 | 2008-10-21 | Digene Corporation | Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method |
CN102203293A (zh) | 2008-10-27 | 2011-09-28 | 奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司 | 快速结果杂交捕获测定和系统 |
US8642261B2 (en) * | 2008-10-31 | 2014-02-04 | Trovagene, Inc. | Genetic marker for detection of human papillomavirus |
EP2184368A1 (en) | 2008-11-07 | 2010-05-12 | DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum | Diagnostic transcript and splice patterns of HPV16 in different cervical lesions |
WO2010127228A1 (en) | 2009-05-01 | 2010-11-04 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | A non-target amplification method for detection of rna splice-forms in a sample |
JP5826752B2 (ja) | 2009-09-14 | 2015-12-02 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 細胞学用培地に固定された組織サンプルから核酸またはタンパク質を回収するための組成物および方法 |
AU2011203450B2 (en) | 2010-01-04 | 2016-01-07 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Methods, compositions, and kits for recovery of nucleic acids or proteins from fixed tissue samples |
AU2011210734B2 (en) | 2010-01-29 | 2017-02-09 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
WO2011094528A2 (en) | 2010-01-29 | 2011-08-04 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Method of determining and confirming the presence of an hpv in a sample |
US20130165334A1 (en) * | 2010-03-04 | 2013-06-27 | Andrew A. Bieberich | Integrated assay that combines flow-cytometry and multiplexed hpv genotype identification |
EP2566986B1 (en) * | 2010-05-05 | 2018-10-24 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Diagnostic transcript and splice patterns of hr-hpv in different cervical lesions |
CA2799200A1 (en) | 2010-05-19 | 2011-11-24 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
EP2576840B1 (en) | 2010-05-25 | 2018-10-17 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes |
WO2011151333A1 (en) * | 2010-06-02 | 2011-12-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Papillomavirus l2 c-terminal peptides for vaccination |
US9885092B2 (en) | 2011-02-24 | 2018-02-06 | Qiagen Gaithersburg Inc. | Materials and methods for detection of HPV nucleic acids |
WO2012136712A1 (en) * | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Means and methods for quantifying nucleic acids |
EP2551353A1 (en) | 2011-07-25 | 2013-01-30 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Means and methods for predicting the risk of mortality of patients with HPV positive oropharyngeal squamous cell cancer |
EP2773745B1 (en) | 2011-11-03 | 2019-04-10 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | Materials and method for immobilizing, isolating, and concentrating cells using carboxylated surfaces |
WO2016005789A1 (en) * | 2014-07-07 | 2016-01-14 | Institut Pasteur | Broad range gene and genotype papillomavirus transcriptome as a biomarker of papillomavirus- associated cancer stages |
EP3715477A1 (en) * | 2019-03-28 | 2020-09-30 | Institut Pasteur | Composition of primers for detecting high grade squamous intraepithelial lesion |
CN115873991B (zh) * | 2022-11-02 | 2024-03-01 | 中创科瑞(北京)生物科技有限公司 | 嵌段crRNA、使crRNA能够开关控制与Cas12a结合的功能及其功能验证方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU705377B2 (en) | 1995-07-03 | 1999-05-20 | Akzo Nobel N.V. | A method for determining the integrity of nucleic acid |
JP2002508190A (ja) | 1997-12-12 | 2002-03-19 | ダイジーン・コーポレーション | 万能収集媒質 |
US20020132227A1 (en) | 2000-03-28 | 2002-09-19 | Biosearch International Pty. Ltd. | Approaches for HPV detection and staging by targeting the E6 gene region of the viral genome |
CN100422342C (zh) | 2002-01-07 | 2008-10-01 | 诺奇普公司 | 检测人乳头瘤病毒mRNA的方法 |
EP2184368A1 (en) | 2008-11-07 | 2010-05-12 | DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum | Diagnostic transcript and splice patterns of HPV16 in different cervical lesions |
EP2551353A1 (en) * | 2011-07-25 | 2013-01-30 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Means and methods for predicting the risk of mortality of patients with HPV positive oropharyngeal squamous cell cancer |
-
2008
- 2008-11-07 EP EP08168608A patent/EP2184368A1/en not_active Withdrawn
-
2009
- 2009-11-09 CN CN200980154825.6A patent/CN102272329B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-11-09 US US13/128,201 patent/US9803253B2/en active Active
- 2009-11-09 EP EP09748784.7A patent/EP2352845B1/en not_active Not-in-force
- 2009-11-09 CA CA2742917A patent/CA2742917C/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-11-09 WO PCT/EP2009/064811 patent/WO2010052317A1/en active Application Filing
- 2009-11-09 JP JP2011535121A patent/JP5823868B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-10-08 JP JP2015200302A patent/JP2016013139A/ja active Pending
Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
an investigation of biopsies from 190 cervical cones.《BRITISH JOURNAL OF CANCER》.2004,全文. * |
Analysis of HPV16 e6*I-II transcripts in cervical samples;Zerbini et al;《Journal of clinical virology》;20061231;全文 * |
Human papillomavirus type 16 expresses a variety of alternatively spliced mrnas putatively encoding the e2 protein;SHERMAN et al;《VIROLOGY》;19921231;全文 * |
KRAUS ET AL.Human papillomavirus oncogenic expression in the dysplastic portion * |
Molden et al.PreTectTM HPV-Proofer:real-time detection and typing of E6/E7 mRNA from carcinogenic humanpapillomavirues.《Journal of virological methods》.2007,全文. * |
Quantitation of human papillomavirus 16 E6 and E7 DNA and RNA in residual material from thinprep papanicolaous tests using real-time polymerase chain reaction analysis;wang johanning et al;《CANCER》;20021231;全文 * |
SHERMAN et al.Human papillomavirus type 16 expresses a variety of alternatively spliced mrnas putatively encoding the e2 protein.《VIROLOGY》.1992,全文. |
wang johanning et al.Quantitation of human papillomavirus 16 E6 and E7 DNA and RNA in residual material from thinprep papanicolaous tests using real-time polymerase chain reaction analysis.《CANCER》.2002,全文. |
Zerbini et al.Analysis of HPV16 e6*I-II transcripts in cervical samples.《Journal of clinical virology》.2006,全文. |
ZHENG AND BAKER.Papillpmavirus genome structure,expression,and post-transcriptional regulation.《FRONTIERS IN BIOSCIENCE》.2006,全文. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2012507999A (ja) | 2012-04-05 |
CN102272329A (zh) | 2011-12-07 |
EP2352845B1 (en) | 2017-03-01 |
EP2184368A1 (en) | 2010-05-12 |
CA2742917A1 (en) | 2010-05-14 |
US20120040334A1 (en) | 2012-02-16 |
WO2010052317A1 (en) | 2010-05-14 |
EP2352845A1 (en) | 2011-08-10 |
CA2742917C (en) | 2018-02-20 |
JP2016013139A (ja) | 2016-01-28 |
JP5823868B2 (ja) | 2015-11-25 |
US9803253B2 (en) | 2017-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102272329B (zh) | 在不同的子宫颈病变中hpv16的诊断性转录产物和剪接模式 | |
Wang‐Johanning et al. | Quantitation of human papillomavirus 16 E6 and E7 DNA and RNA in residual material from ThinPrep Papanicolaou tests using real‐time polymerase chain reaction analysis | |
KR20070105992A (ko) | 생물학적 시료에서 사람 유두종 바이러스를 검출하기 위한시스템, 방법 및 조성물 | |
JP2001526045A (ja) | ヒトパピローマウイルス関連疾患の評価 | |
EP3187596B1 (en) | Method for detecting and typing high-risk human papillomaviruses | |
Brink et al. | HPV testing in cervical screening | |
US10731228B2 (en) | Diagnostic transcript and splice patterns of HR-HPV in different cervical lesions | |
CN101796198A (zh) | 用于改进人乳头瘤病毒基因型检测的包含寡核苷酸混合物的组合物 | |
US20130029319A1 (en) | Means and methods for predicting the risk of mortality of patients with hpv positive oropharyngeal squamous cell cancer | |
KR101402204B1 (ko) | 리퀴드 비드 어레이와 다중중합효소연쇄반응법을 이용한 종양원성 인유두종바이러스 검출 방법 | |
Lee et al. | Comparison of human papillomavirus detection and typing by hybrid capture 2, linear array, DNA chip, and cycle sequencing in cervical swab samples | |
Alberizzi et al. | Evaluation of the HPV typing INNO-LiPA EXTRA assay on formalin-fixed paraffin-embedded cervical biopsy samples | |
Park et al. | Comparison of the analytical and clinical performances of Abbott RealTime High Risk HPV, Hybrid Capture 2, and DNA Chip assays in gynecology patients | |
Marijan et al. | Genital human papillomavirus infection in women from the Zagreb region | |
Melo et al. | Potential diagnostic techniques for cervical cancer prevention-Review | |
Piana et al. | Molecular methods for the detection of human papillomavirus infection: new insights into their role in diagnostics and epidemiological surveillance | |
Lorincz et al. | Advances in DNA Methylation Testing For Triage and Followup of Cervical Precancer | |
Bicskei et al. | A comparison of the Linear Array and the Automated INNO-LiPA HPV Genotyping Systems on Pathological Specimens | |
Feng et al. | Human Papillomavirus and its role in cervical carcinoma | |
Mzibri | Recent Advances in Human Papillomavirus Detection and Genotyping |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140730 Termination date: 20211109 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |