CN101796198A - 用于改进人乳头瘤病毒基因型检测的包含寡核苷酸混合物的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含寡核苷酸混合物的组合物。而且，本发明还涉及所述寡核苷酸混合物用于在受试者样品中诊断不同HPV基因型的用途。进一步包括的是在受试者样品中诊断不同HPV基因型的方法以及实施所述方法的试剂盒。

Description

用于改进人乳头瘤病毒基因型检测的包含寡核苷酸混合物的组合物

发明领域

本发明涉及包含寡核苷酸混合物的组合物。而且，本发明还涉及所述寡核苷酸混合物用于在受试者样品中诊断不同HPV基因型的用途。进一步包括的是在受试者样品中诊断不同HPV基因型的方法以及实施所述方法的试剂盒。

背景技术

宫颈癌(子宫颈癌症)是全球女性当中第二种最常见的癌症，每年有约470,000例新增诊断病例和近250,000例死亡(Parkin，DM等人2001.Eur.J.Cancer 37(Suppl.8)：4-66)。宫颈癌的主要原因是宫颈感染了人乳头瘤病毒(HPV)、特别是高危型HPV基因型。人乳头瘤病毒构成一大组病毒，并且是无被膜的小DNA病毒，几乎排他性地感染皮肤和粘膜细胞。迄今已有近100种不同基因型的人乳头瘤病毒的基因组得到了表征(de Villiers，E.M.，C.Fauquet，T.R.Broker，H.U.Bernard和H.zur Hausen.2004.Classification of papillomaviruses.Virology 324：17-27)，并且据认为存在比这大得多的数目的人乳头瘤病毒(Hazard K，Andersson K，Dillner J，Forslund O.Human papillomavirus subtypes are not uncommon.Virology.2007年5月25；362(1)：6-9)。

已知大约50种HPV基因型感染粘膜。这些粘膜基因型基于其与癌症的流行病学联系而分为三个不同的组：“低危型”人乳头瘤病毒(LR-HPV)、“高危型”人乳头瘤病毒(HR-HPV)和“推定高危型”人乳头瘤病毒(pHR-HPV)。低危型人乳头瘤病毒(包括例如HPV基因型6、11、40、42、43、44和70)主要见于生殖器疣和低级宫颈病变。推定高危型人乳头瘤病毒包括HPV 26、53、66，并未一致地见于宫颈癌。高危型人乳头瘤病毒与罹患癌症的风险相关(Munoz等人2003.N.Engl.J.Med.348：518-527)，并且包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82。HPV 16和18据认为是临床上最相关的，因为这些基因型见于近70％的宫颈癌患者。

感染高危型HPV基因型并不必然导致宫颈癌。然而，若干研究已清楚地表明，感染高危型HPV的女性罹患癌症的风险要比未感染的女性或感染低危型HPV的女性显著更高(Bosch，F.X.，M.M.Manos，N.Munoz，M.Sherman，A.M.Jansen，J.Peto，M.H.Schiffman，V.Moreno，R.Kurman和K.V.Shah.1995.Prevalence of human papillomavirus incervical cancer：a worldwide perspective.International biological study oncervical cancer(IBSCC)Study Group.J Natl Cancer Inst 87：796-802；Bosch，F.X.，A.Lorincz，N.Munoz，C.J.Meijer和K.V.Shah.2002.Thecausal relation between human papillomavirus and cervical cancer.J ClinPathol 55：244-65)。另外，对有和无宫颈异常的女性的跟踪研究已显示，持续高危型HPV感染是宫颈上皮内瘤变(CIN)形成、维持和发展的重要风险因素并且也是必要的(Nobbenhuis，M.A.，J.M.Walboomers，T.J.Helmerhorst，L.Rozendaal，A.J.Remmink，E.K.Risse，H.C.van derLinden，F.J.Voorhorst，P.Kenemans和C.J.Meijer.1999.Relation ofhuman papillomavirus status to cervical lesions and consequences forcervical-cancer screening：a prospective study.Lancet 354：20-5)。

一般从HPV感染发展为癌症非常缓慢，并且可能需要数年。然而，成功预防宫颈癌的关键步骤是高危型HPV基因型感染的早期检测。用于宫颈癌筛选的帕帕尼科拉乌检验(Papanicolaou test)、还常称为巴氏检验(Pap test)或巴氏涂片(Pap Smear)的引入，使得多数工业化国家因宫颈癌引起的死亡率显著下降。对于帕帕尼科拉乌检验，从宫颈获得样品，并通过光学显微镜来筛选指示恶性或癌前细胞的细胞形态学方面的变化。然后，根据所观察到的病变的严重程度对样品进行分类。然而，通过宫颈细胞学进行诊断是一种主观的方法，且质量取决于提供服务的实验室的标准。事实上，表明在不同研究中细胞学的灵敏度从30％到90％不等(与作为黄金标准的阴道镜和组织学相比)。这与通过应用商业试剂盒和标准化方案的HPV DNA检测进行诊断(在所有研究中灵敏度＞90％，平均96％)形成鲜明对比。而且，(细胞学)不能鉴定特定HPV基因型乃至多种HPV基因型的多重感染。然而，特定HPV基因型的鉴定很重要，因为不同的HPV基因型可能对感染患者构成不同的风险。

因此，开发了新检验系统以允许鉴定特定的HPV基因型。这些新检验系统几乎排他性地基于病毒、分子和生物化学标记例如HPV DNA和RNA的检测。

FDA许可的杂交捕获II检验系统(Hybrid Capture II Test System，HC2)(Digene Corp.，USA)据认为是临床实践中HPV DNA检验的黄金标准。虽然此系统可靠、灵敏且易于操作，但它具有若干缺点：a)不进行基因分型，相反，HPV感染仅被归类为“低危型”或“高危型”组，b)不能鉴定多重感染，和c)HPV检测不如基于PCR的方法灵敏(Birner等人2001.Mod.Pathol.14：702-709)。

在过去几年内开发了若干基于PCR的方法，允许更精确地检测HPV感染。大多数这些PCR系统应用与HPV基因组例如L1区中高度保守区域结合的共有或通用引物。然后对扩增的PCR产物进行进一步的分析(例如，序列分析、限制性片段长度多态性(RFLP)分析或杂交)，以鉴定特定的粘膜HPV基因型。

WO 95/22626描述了应用两种引物即GP5+和GP6+来检测和鉴定不同的HPV基因型。与GP5和GP6(WO 91/10675)相比，GP5+和GP6+引物拥有延长的3’末端，改进了人乳头瘤病毒的PCR检测(Jacobs，M.V.，J.M.Walboomers，P.J.Snijders，F.J.Voorhorst，R.H Verheijen，N.Fransen-Daalmeijer和C.J.Meijer.2000.Distribution of 37 mucosotropicHPV types in women with cytologically normal cervical smears：theage-related patterns for high-risk and low-risk types.Int J Cancer87：221-7)。这些引物针对HPV基因组L1区内的保守序列区域。然而，所述引物所针对的HPV序列不是100％保守。最近的数据表明，扩增粘膜HPV基因型能力的差异取决于引物和特定基因型靶序列之间的错配数目和位置(de Roda Husman，A.M.，J.M.Walboomers，A.J.van den Brule，C.J.Meijer和P.J.Snijders.1995.The use of general primers GP5 andGP6 elongated at their 3’ends with adjacent highly conserved sequencesimproves h uman papillomavirus detection by PCR.J Gen Virol 76(Pt4)：1057-62；Qu，W.，G.Jiang，Y.Cruz，C.J.Chang，G.Y.Ho，R.S.Klein和R.D.Burk.1997.PCR detection of human papillomavirus：comparisonbetween MY09/MY11 and GP5+/GP6+primer systems.J Clin Microbiol35：1304-10)。因此，分别导致的选择性过度扩增及扩增不足可能并不反映HPV基因型的真实分布。所以，这可能导致错误评估宫颈样本中不良检测基因型的流行程度(Baay，M.F.，W.G.Quint，J.Koudstaal，H.Hollema，J.M.Duk，M.P.Burger，E.Stolz和P.Herbrink.1996.Comprehensive studyof several general and type-specific primer pairs for detection of humanpapillomavirus DNA by PCR in paraffin-embedded cervical carcinomas.JClin Microbiol 34：745-7)。而且，在诊断某些HPV基因型时，应用GP5+/GP6+PCR可能产生假阴性结果(Kleter，B.，L.J.van Doorn，L.Schrauwen，A.Molijn，S.Sastrowijoto，J.ter Schegget，J.Lindeman，B.terHarmsel，M.Burger和W.Quint.1999.Development and clinicalevaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assayfor detection and identification of anogenital human papillomavirus.J ClinMicrobiol 37：2508-17；Chan，P.K.，T.H.Cheung，A.O.Tam，K.W.Lo，S.F.Yim，M.M.Yu，K.F.To，Y.F.Wong，J.L.Cheung，D.P.Chan，M.Hui和M.Ip.2006.Biases in human papillomavirus genotype prevalenceassessment associated with commonly used consensus primers.Int JCancer 118：243-5)。还有证据表明，GP5+/GP6+PCR检测多重HPV感染的程度比其他共有或广谱PCR更低(Kleter，B.，L.J.van Doorn，L.Schrauwen，A.Molijn，S.Sastrowijoto，J.ter Schegget，J.Lindeman，B.terHarmsel，M.Burger和W.Quint.1999.Development and clinicalevaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assayfor detection and identification of anogenital human papillomavirus.J ClinMicrobiol 37：2508-17；Qu，W.，G.Jiang，Y.Cruz，C.J.Chang，G.Y.Ho，R.S.Klein和R.D.Burk.1997.PCR detection of human papillomavirus：comparison between MY09/MY11 and GP5+/GP6+primer systems.J ClinMicrobiol 35：1304-10)。

另外，在临床样品的分析中为减小假阴性结果，控制DNA的完整性是重要的步骤。按照惯例，GP5+/6+PCR主要应用于这样的样品，其已经通过外部β-珠蛋白(b-珠蛋白)PCR由引物例如BGCO3和BGCO5进行了预筛选，随后通过凝胶电泳对PCR产物进行了分析(de Roda Husman，A.M.，J.M.Walboomers，A.J.van den Brule，C.J.Meijer和P.J.Snijders.1995。已经描述了MY09/11或PGMY09/11PCR的HPV PCR中的内部DNA质量对照(Gravitt，P.E.，C.L.Peyton，T.Q.Alessi，C.M.Wheeler，F.Coutlee，A.Hildesheim，M.H.Schiffman，D.R.Scott和R.J.Apple.2000.Improved amplification of genital human papillomaviruses.J ClinMicrobiol 38：357-61)。然而，作者描述b-珠蛋白引物即GH20和PC04的应用会降低HPV的分析灵敏度。尽管如此，不并发HPV扩增灵敏度削弱的内部DNA质量对照由于若干原因是值得期望的：除了赢得时间和降低成本，内部DNA质量对照还能够解释因PCR准备中的错误所致的HPVPCR失败。

与DNA质量对照相比，包含外源对照多核苷酸(内部PCR对照，IC)的整合PCR对照能够筛选因样品中存在抑制剂所致或因PCR准备中的错误所致的PCR失败。最近的研究已证明，8％的粗制宫颈DNA样品中含有定量HPV 16扩增的抑制剂(Lefevre J，Hankins C，Pourreaux K，VoyerH，Coutlee F；Canadian Women′s HIV Study Group.Prevalence ofselective inhibition of HPV-16 DNA amplification in cervicovaginallavages.J Med Virol.2004年1月；72(1)：132-7)。另一研究已证明，截然不同的引物对并不等同地受PCR抑制剂的影响(Bezold等人，Detection ofherpes simplex virus and varicella-zoster virus in clinical swabs：frequentinhibition of PCR as determined by internal controls，Mol Diagn.2000年12月；5(4)：279-84)。所以，HPV PCR抑制剂的筛选是必不可少的。

因此，本发明的潜在技术问题可视为提供有效可靠地检测和诊断不同人乳头瘤病毒(HPV)基因型、特别是高危型和推定高危型基因型而无上文所述缺点的手段和方法。该技术问题通过权利要求书和下文所表征的实施方案解决。

发明内容

从而，本发明涉及包含寡核苷酸混合物的组合物，其中所述寡核苷酸混合物包含(a)具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中所示核酸序列的寡核苷酸，或(b)能够特异性地扩增通过(a)中的寡核苷酸所扩增的多核苷酸的寡核苷酸。

如本文所指的术语“寡核苷酸混合物”是指不同寡核苷酸分子物质的混合物。另外，该混合物可以包含除寡核苷酸之外的其他组分，例如用于扩增粘膜HPV基因型多核苷酸的组分，优选是通过聚合酶链式反应(PCR)扩增。此类组分可以是但不限于：水性缓冲液、水溶性镁盐、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)和脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)及DNA聚合酶，例如来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的热稳定DNA聚合酶。

如本文所用的术语“寡核苷酸”是指寡核苷酸分子物质，其中所有分子的该分子物质具有特定的核酸序列。优选术语“寡核苷酸”是指用于DNA扩增技术如PCR的引物。寡核苷酸应包含足以特异性结合靶多核苷酸序列段的许多核苷酸。优选如本文所指的寡核苷酸具有15至30个核苷酸的长度，更优选18至28个核苷酸的长度，最优选23-25个核苷酸的长度。优选寡核苷酸的序列不是简并的。优选寡核苷酸是单链的寡聚脱氧核苷酸。然而，由于自身互补性，寡核苷酸可以在某些条件下是部分双链(取决于例如寡核苷酸的序列、盐浓度和温度)。特别优选的寡核苷酸具有上文所述的特定序列和/或性能。

优选本发明的寡核苷酸用作为起始分子，用于合成与待通过适当的多核苷酸扩增技术、优选通过PCR拷贝的核酸链充分互补的多核苷酸。本发明的寡核苷酸混合物应含有至少一种正向和至少一种反向寡核苷酸。正向和反向寡核苷酸还常称为正向和逆向寡核苷酸，或5’和3’寡核苷酸。应理解，例如由于寡核苷酸序列和靶多核苷酸序列段之间的错配，合成的多核苷酸可能与拷贝的靶序列并非100％互补。

优选根据本发明的寡核苷酸靶向HPV基因组两个特定L1共有区域之一。在多种已知的粘膜HPV基因型之间，这些特定区域高度(但不是100％)保守，并在例如WO 95/22626中公开，特此将其全文并入作为参考。本领域众所周知，GP5+寡核苷酸(序列如SEQ ID NO：1中所示)和GP6+寡核苷酸(序列如SEQ ID NO：2中所示)靶向这些区域。粘膜HPV与WO 95/22626中GP5+和GP6+寡核苷酸的比对可见表1(实施例1)。为了靶向如上文所述的多种人乳头瘤病毒保守的两个L1区域之一，本发明的寡核苷酸应与所述区域互补。然而，应理解所述寡核苷酸并不必要与所述区域100％互补，即，可存在一些错配。寡核苷酸与靶序列杂交的能力可通过Tm(解链温度)评估。Tm是50％的双链核酸链解离为单链的温度。除序列之外，Tm还取决于环境条件(例如盐浓度)，并且可凭经验确定或通过适宜的计算机软件估算(Le Novère，MELTING，computing the melting temperature ofnucleic acid duplex.Bioinformatics.2001 Dec；17(12)：1226-7)。一般Tm越高，双链结构越稳定。

本发明的寡核苷酸可以进行标记，或含有其他允许检测和/或分析扩增产物和/或结合载体的修饰。标记可通过本领域熟知的多种技术进行，并取决于待用的标记。特别地，寡核苷酸可以生物素化，以使扩增产物能够与链亲和素表面或荧光缀合物结合。而且，待用的标记在本发明的上下文中可以是但不限于荧光标记，其中包括荧光染料如R-藻红蛋白、Cy3、Cy5、荧光素、罗丹明、Alexa或德克萨斯红。然而，标记也可以是酶或抗体。设想待用作为标记的酶将通过与底物反应生成可检测的信号。适宜的酶、底物和技术在本领域众所周知。待用作为标记的抗体可以特异性地识别能够直接(例如，本身发荧光的靶分子)或间接(例如，生成可检测信号的靶分子，如酶)予以检测的靶分子。本发明的寡核苷酸还可以含有5’限制性位点、锁核酸分子(LNA)，或者是肽核苷酸分子(PNA)的一部分。此类PNA原则上可借助于肽部分通过例如抗体检测。

优选本发明的寡核苷酸混合物应包含具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中所示核酸序列的寡核苷酸。

而且，本发明还涉及包含寡核苷酸混合物的组合物，其中所述寡核苷酸混合物包含的寡核苷酸能够特异性地扩增通过具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中所示核酸序列的寡核苷酸所扩增的多核苷酸。应理解寡核苷酸混合物包含反向和正向寡核苷酸，优选一种以上的反向寡核苷酸和一种以上的正向寡核苷酸，更优选三种反向寡核苷酸和九种正向寡核苷酸。寡核苷酸混合物中所含的寡核苷酸的序列可通过与待检测的粘膜人乳头瘤病毒L1区域的两个保守序列进行比较/比对来确定(表1，参见实施例)。比对后，可通过如下标准来确定寡核苷酸的序列：1)在一个寡核苷酸中，相对于待检测的任何HPV基因型的保守序列至多三个错配，因此，要么没有错配、一个错配、两个错配，要么三个错配，其中优选错配靠近寡核苷酸的5’末端，且其中带有三个错配的寡核苷酸在所述寡核苷酸的3’末端和最靠近相应寡核苷酸3’末端的错配之间具有至少五个完美匹配的核苷酸，或者2)在相应的寡核苷酸对中，即在正向和反向寡核苷酸中，至多五个错配，因此，要么没有错配、有一个错配、两个错配、三个错配、四个错配、要么五个错配(例如，如果正向引物中有四个错配，则对应的反向引物中的错配数一定不得超过一个错配)，其中带有四个错配的寡核苷酸在所述寡核苷酸的3’末端和最靠近相应寡核苷酸3’末端的错配之间具有至少八个完美匹配的核苷酸。

本发明同样涵盖的是包含寡核苷酸混合物的组合物，其中所述寡核苷酸具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中所示的核酸序列，且其中一个或多个、优选两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个所述寡核苷酸已被缺失、替换和/或加入。优选地，可以加入到本发明的组合物中和/或可以替换本发明的任一寡核苷酸(具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中所示的核酸序列)的寡核苷酸的序列，可以通过应用如上文所定义的标准来确定。从而，所述寡核苷酸可以具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21或22中所示的核酸序列。因此，根据本发明的组合物还可以包含寡核苷酸混合物，其中所述寡核苷酸混合物包含(a)具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、17、18、19、20、21和22中所示核酸序列的寡核苷酸，或(b)能够特异性地扩增通过(a)中的寡核苷酸所扩增的多核苷酸的寡核苷酸。

本发明寡核苷酸在寡核苷酸混合物中的量和/或浓度可以是任何认为适当的量或浓度。寡核苷酸混合物可以包含不同数目的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸(有关可以在本发明的实施方案中应用的正向和反向寡核苷酸的列表，敬请参见实施例1)。例如，寡核苷酸混合物可以包含用于扩增HPV DNA或RNA的三种正向寡核苷酸和九种反向寡核苷酸。因此，本发明个体寡核苷酸的量和/或浓度可以有别，因而含有所述寡核苷酸的溶液就所述寡核苷酸而言可以不是等摩尔的。适合于扩增多核苷酸的溶液中的寡核苷酸的优选浓度可见实施例。各正向寡核苷酸特别优选的浓度为0.2μM，而各反向寡核苷酸为0.4μM。而且，应理解本领域技术人员能够调整本发明寡核苷酸的浓度，以便优化HPV特异性多核苷酸的扩增，从而优化诊断的灵敏度和特异性，而无需过度劳动。

优选本发明的组合物所包含的寡核苷酸混合物允许检测多种粘膜HPV基因型，特别是高危型HPV基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82；推定高危型HPV型26、53和66以及低危型HPV型6、11和70。

有利地，在本发明的研究中发现，包含寡核苷酸混合物的组合物是足够检测从而是诊断受试者样品中粘膜HPV基因型所必需的，其中所述寡核苷酸混合物包含(a)具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中所示核酸序列的寡核苷酸，或(b)能够特异性地扩增通过(a)中的寡核苷酸所扩增的多核苷酸的寡核苷酸。尤其是，表明应用包含寡核苷酸混合物的组合物比现有技术更为可靠，因为能够以比现有技术更高的灵敏度在样品中同时检测大量粘膜HPV基因型，其中所述寡核苷酸混合物包含具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中所示核酸序列的寡核苷酸(即针对HPV基因组L1区域中相对保守的序列的寡核苷酸)(参见实施例)。在本发明的研究中，检测到HPV型6、11、16、18、26、30、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、67、68(亚型A和B)、69、70、73、82(包括IS39和MM4)。应用本发明的组合物时，甚至有可能再现地检测已知通过GP5+/GP6+HPV检测系统不良检测的HPV基因型，例如HPV 30、39、42、44、51、52、53、68、73和82。应理解，应用所述组合物时，还可以检测到额外的HPV基因型(除检验的基因型之外)。而且，本发明的组合物中包括外源对照多核苷酸(允许筛选HPV PCR抑制剂)，以及用于扩增内源对照多核苷酸(例如样品中早已包含的DNA)的寡核苷酸。令人惊讶地，应用外源对照多核苷酸以及用于扩增内源多核苷酸的寡核苷酸并不显著影响HPV基因型的检测。这特别有益于同时监测HPV感染和DNA质量，并可以防止假阴性结果。与传统的外部DNA质量对照相比，这些途径的时间及成本强度更低，允许筛选PCR抑制剂，由此监测HPV PCR的失败。应用GP5+/GP6+寡核苷酸时，现有技术并未教导有效地同时扩增(在单管中)粘膜HPV基因型、外源对照多核苷酸以及内源对照核苷酸。因此，如果应用根据本发明的组合物和方法，将会非常有益于卫生系统，因其允许早期、更加可靠且成本效率更高地诊断不同HPV基因型、特别是高危型基因型的单一感染以及多重感染。

HPV的病毒载量据认为在宫颈癌的形成中起着重要作用(Snijders，P.J.，C.J.Hogewoning，A.T.Hesselink，J.Berkhof，F.J.Voorhorst，M.C.Bleeker和C.J.Meijer.2006.Determination of viral load thresholds incervical scrapings to rule out CIN 3 in HPV 16，18，31 and 33-positivewomen with normal cytology.Int J Cancer 119：1102-7)。有利地，本发明的组合物不仅允许检测如本文所述的多种HPV基因型，而且所述组合物还允许确定样品中多种HPV基因型的病毒载量。尤其是，利用本发明的组合物所扩增的扩增产物通过评估多种杂交信号来定量。表明所观察到的杂交信号的强度与HPV感染的严重程度、从而与病毒载量相关。例如，定级为HSIL(高级鳞状上皮内病变)即更严重形式HPV感染的样品杂交信号的强度中位数大约是定级为NILM(无上皮内病变；轻微形式的HPV感染，参见实施例以及图3和图4)的样品强度中位数的10倍。因此，本发明的组合物还允许区分轻微和严重形式的HPV感染，从而评估HPV感染的严重程度。当本发明的组合物还包含用于扩增内源对照多核苷酸(关于术语内源对照的解释，参见下文)的寡核苷酸时，诊断的灵敏度和特异性甚至能够更为增强。特别地，组合物中包括特异性地扩增人β珠蛋白基因的寡核苷酸(所述寡核苷酸的序列示于SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)。表明在具有高病毒载量(指示更严重形式的HPV感染)的样品中内源对照基因的扩增受到抑制。因此，在具有大量病毒DNA的样品中，观察到HPV杂交信号强度增加(与具有低病毒载量的样品杂交信号相比)，而内源对照杂交信号强度减小(与具有低病毒载量的样品杂交信号相比)。因而，通过计算所扩增的HPV多核苷酸的量与内源对照DNA扩增产物的量之间的比值，能够确定多种HPV基因型、优选高危型HPV基因型感染的严重程度。

本发明的组合物优选还包含用于扩增内源对照多核苷酸序列的寡核苷酸。

如本文所指的术语“用于扩增内源对照多核苷酸序列的寡核苷酸”是指特异性地扩增样品所包含的内源对照多核苷酸序列的寡核苷酸。本领域技术人员公知，此类寡核苷酸能够作为阳性对照包括在PCR反应混合物中，以便评估例如模板核酸从而评估样品的质量。术语“样品”在本申请别处详细说明。而且，在设置PCR反应时发生的错误可以通过应用特异性地扩增内源对照多核苷酸序列的寡核苷酸来评估。内源对照多核苷酸的有效扩增优选说明扩增反应的成功和DNA足够的质量，而无效扩增优选说明扩增反应由于样品不当或PCR设置中的错误而不成功。在后一种情况下，可能不得不重复PCR反应，例如利用新鲜获得的样品和/或新鲜纯化的DNA或RNA进行。因而，应用特异性地扩增内源对照多核苷酸序列的寡核苷酸可以防止假阴性结果。

优选特异性地扩增内源对照多核苷酸序列的寡核苷酸扩增至少一种人多核苷酸序列，因为在本发明的上下文中，待分析的样品是由人获得的样品(参见下文)。内源对照多核苷酸序列是受试者样品中早已存在的内源多核苷酸的序列或序列段。内源对照多核苷酸序列优选为选自下组的多核苷酸序列：β-珠蛋白、GAPDH、肌动蛋白和泛素C。内源对照多核苷酸可以是“单拷贝”的人基因组多核苷酸，即，在单倍体人基因组中仅存在一次的序列，或者寡核苷酸还可以针对多拷贝区域。用于扩增内源对照多核苷酸序列的适宜寡核苷酸的实例是允许例如通过PCR扩增人β-珠蛋白核酸序列的一部分的寡核苷酸。优选扩增的多核苷酸内源对照序列并不比扩增的如上文所述多种HPV基因型L1区域多核苷酸序列显著更短或更长，更优选扩增的多核苷酸内源对照序列具有150-300bp的长度，最优选180-220bp。应理解，应用扩增内源对照多核苷酸序列的寡核苷酸优选并不显著影响在同一测定中(例如同一管或容器中)进行的其他PCR扩增的扩增效率，例如，应当避免引物二聚体以及引物中发夹结构的形成。技术人员知晓如何来确定应用扩增内源对照多核苷酸的寡核苷酸是否显著影响在同一测定中进行的多核苷酸扩增的扩增效率(例如，通过利用根据本发明的、含有用于扩增内源对照多核苷酸序列的寡核苷酸或不含所述寡核苷酸的组合物进行扩增反应，并通过定量如此获得的扩增产物)。

最优选用于扩增内源对照多核苷酸序列的寡核苷酸具有如SEQ IDNO：13和/或SEQ ID NO：14中所示的核酸序列。

而且，本发明的组合物优选还包含外源对照多核苷酸。

如本文所用的术语“外源对照多核苷酸”是指并非天然存在于受试者的样品中，从而对于所述样品而言是外来的多核苷酸。术语“样品”在本申请别处详细说明(参见下文)。外源对照多核苷酸添加至从而包含在本发明的组合物中，并作为HPV特异性多核苷酸扩增效率的对照。优选外源对照多核苷酸能够通过根据本发明的寡核苷酸混合物(例如通过具有如SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中所示核酸序列的寡核苷酸)扩增，例如同时扩增。优选外源对照多核苷酸的核酸序列包含一个与HPV序列无关的内部多核苷酸区域，和两个能够被具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中所示核酸序列的寡核苷酸所靶向的外部多核苷酸区域(一个区域在内部多核苷酸区域的5’端，而一个区域在内部多核苷酸区域的3’端)。所述外部区域应在利用本发明的寡核苷酸混合物时允许扩增该外源对照多核苷酸序列。内部多核苷酸区域优选可以具有任何序列，条件是其能够与扩增的HPV特异性多核苷酸、与扩增的内源对照多核苷酸区分开(即，其并不与扩增的HPV和内源对照多核苷酸显示出显著的序列相似性而可能干扰这些多核苷酸的检测)。技术人员能够确定所述内部多核苷酸区域的序列。优选外源对照多核苷酸并不比扩增的如本说明书所述的HPV多核苷酸序列显著更短或更长，更优选扩增的多核苷酸外源对照序列具有100-180bp的长度，最优选120-160bp。优选外源对照多核苷酸的扩增并不影响HPV基因型的类型特异性检测。优选外源对照多核苷酸能够通过应用特异于该外源对照多核苷酸序列的寡核苷酸探针检测。更优选外源对照多核苷酸能够通过应用特异于该外源对照多核苷酸序列中内部多核苷酸序列的寡核苷酸探针，从而通过应用并不靶向外部多核苷酸区域(如上文所述)或者扩增的HPV多核苷酸或内源对照多核苷酸的任何序列的寡核苷酸来检测。外源对照多核苷酸可以通过任何认为适当的方法来制备，例如，其可以是合成的多核苷酸，例如化学合成的多核苷酸。而且，所述外源对照多核苷酸可以存在于质粒中。制备外源对照多核苷酸的方法示于实施例。当临床样品中存在PCR抑制剂时，以及当设置PCR反应期间发生了可能造成以其他方式将无法检测的假阴性结果的错误时，应用外源对照多核苷酸特别有益。外源对照多核苷酸的有效扩增优选说明HPV扩增反应的成功，而无效扩增优选说明HPV扩增反应例如由于抑制剂和/或PCR准备中的错误而不成功。因而，外源对照多核苷酸的有效扩增更优选地说明从应用本发明寡核苷酸混合物的扩增反应中获得的结果可以允许可靠地诊断不同的HPV基因型。应理解，外源多核苷酸序列以允许有效扩增HPV特异性多核苷酸而不显著减小现存HPV感染诊断灵敏度的量包含在本发明的组合物中。外源对照多核苷酸在本发明组合物中的优选浓度能够由技术人员确定而无需过度实验，例如通过利用多种系列稀释的外源对照多核苷酸进行扩增反应。

最优选外源对照多核苷酸具有如SEQ ID NO：15中所示的核酸序列。

此外，本发明涉及本发明的组合物用于在受试者样品中诊断不同HPV基因型的用途，其中该组合物还可以包含用于扩增作为DNA质量对照的内源多核苷酸和/或作为内部PCR对照的外源多核苷酸的寡核苷酸。

术语“不同的HPV基因型”是指至少一种HPV基因型，例如至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或更多种基因型。在本发明的上下文中可以诊断的HPV基因型优选为α属粘膜HPV基因型6、11、13、16、18、26、30、31、32、33、34、35、39、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、62c、64、66、67、68(亚型A和B)、69、70、7172、73、74、81、82(包括IS39和MM4)、83、84、85c、86c、87c、89c/Cp6108、90c、97、102和106；α属皮肤HPV基因型2、3、7、10、27、28、29、40、57、77、91c和94，更优选6、11、13、16、18、26、30、31、32、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、66、67、68(亚型A和B)、69、70、72、73、82(包括IS39和MM4)、89c/Cp6108，最优选推定高危型HPV基因型26、53、66以及高危型HPV基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82。优选不同的HPV基因型同时诊断。不同HPV基因型的诊断和/或确定通过鉴定扩增的多核苷酸进行，所述多核苷酸通过应用根据本发明的组合物(如本说明书别处所述)获得的并且特异于不同HPV基因型。优选HPV基因型特异性多核苷酸的扩增和/或不同HPV基因型的确定同时进行，更优选在同一容器中(从而在同一溶液中)进行。

而且，本发明涉及在受试者样品中诊断不同HPV基因型的方法，包括步骤：

a)使怀疑含有不同HPV基因型的受试者样品与本发明的组合物在允许多核苷酸扩增的条件下接触；和

b)基于步骤a)中获得的扩增多核苷酸来确定不同的HPV基因型。

本发明的方法优选为体外方法。而且，其可以包括除上文明确述及的那些之外的步骤。例如，更多步骤可以涉及样品预处理或评价通过该方法获得的结果。本发明的方法还可以用于监测或确认至少一种HPV基因型的感染。该方法可人工进行或辅以自动化操作。优选步骤(a)和/或(b)可以完全或部分地辅以自动化操作，例如，通过适宜的机器人和传感设备进行步骤(b)中的确定。

如本文所用的术语“诊断”是指评估受试者罹患或将罹患本说明书述及的疾病、感染或病情、优选罹患不同HPV基因型感染的概率。如本领域技术人员将会理解的那样，这样的评估通常并非旨在对于待诊受试者100％正确。然而，该术语要求统计学显著份额的受试者能够被正确地诊断为罹患所述疾病或病情。份额是否统计学显著能够由本领域技术人员利用多种众所周知的统计学评价工具来确定而无需过度劳动，例如确定置信区间、p值确定、斯氏t检验、曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)等等。细节见Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley & Sons，NewYork 1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。P值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.001。优选本发明考虑的概率使得诊断对于给定组或群中至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的受试者是正确的。

如本文所用的术语“受试者”是指人，不管其年龄、性别或亚群如何。然而，本发明考虑受试者可能罹患如本说明书别处详细说明的HPV感染。而且，根据本发明述及的受试者优选是怀疑含有一种或多种不同的HPV基因型、优选不同的粘膜HPV基因型、更优选不同的高危型HPV基因型的受试者，或者是尚未形成与HPV感染相关的症状的受试者，即症状上健康的受试者。受试者可能怀疑含有至少一种HPV基因型，例如由于阳性巴氏检验或由于与含有不同HPV基因型的受试者的性接触。受试者可以是男性或女性。优选受试者为女性。

在本上下文中，术语“含有HPV基因型”应指HPV基因型感染。

技术人员理解如本文所用的术语“在允许多核苷酸扩增的条件下”。术语多核苷酸扩增是指导致核酸分子的量相对于其初始量增加的模板依赖性过程。根据本发明，目的多核苷酸的扩增应允许通过任何认为适当的和/或例如下文所述的方法来检测之。目的多核苷酸的扩增可以通过众所周知的方法利用聚合酶和特定的寡核苷酸作为引物进行，优选通过聚合酶链式反应(PCR)，但也可以通过反转录酶PCR、实时PCR、基于核酸序列的扩增(NASBA)以及等温扩增方法。PCR方法在本领域众所周知。在本发明的上下文中，优选的PCR实施方案描述在实施例中。而且，实施PCR所需的组分描述在上文。本领域技术人员知晓如何优化PCR方案，以便扩增足够量的相应扩增产物，例如通过调整dNTP、模板、寡核苷酸或模板浓度，通过应用不同的热稳定DNA聚合酶，或通过调整PCR循环程序(通过调整例如退火温度、变温速率)。应理解，PCR扩增在防止模板或整个反应混合物中的任何其他组分污染可能造成假阳性结果的条件下进行。就此而言，术语“污染”为人充分理解。本领域技术人员知晓如何采取措施防止样品污染。

术语“样品”是指体液样品、分离的细胞样品、或来自组织或器官的样品、或由外体表或内体表获得的灌洗液/清洗液样品。样品含有多核苷酸，优选样品含有DNA。样品可通过众所周知的技术获得，并且优选包括来自泌尿生殖道、肛周区、肛管、口腔、上呼吸消化道和表皮的刮片或活检组织。此类样品可通过应用刷、(棉)签、刮铲、清洗液/灌洗液、活检钻孔器、用针或手术器械进行腔室穿刺而获得。优选刮片含有粘膜细胞。然而，血液、血浆、血清、尿液、唾液、泪液、粪便样品也涵盖在本发明的方法中。组织或器官样品可以通过例如活检或其他手术操作而由任何组织或器官获得。分离的细胞可以通过分离技术如过滤、离心或细胞分选而由体液或组织或器官获得。优选细胞、组织或器官样品由作为α属HPV基因型、更优选粘膜HPV基因型已知或可疑的靶标的那些细胞、组织或器官获得，从而可以含有HPV特异性多核苷酸。应理解，样品可以进一步加工，以便实施本发明的方法。特别是，可以通过本领域已知的方法和手段从获得的样品中提取和/或纯化多核苷酸如DNA或RNA，优选DNA(例如参见实施例)。因而，术语样品也可以指从如上文所述的任何样品中纯化和/或提取的多核苷酸，优选DNA。

术语“基于扩增的多核苷酸确定不同的HPV基因型”涉及鉴定特异于多种个体HPV基因型(如本申请别处详细说明的那样)的扩增多核苷酸。优选这将通过检测特异于待检HPV基因型的扩增多核苷酸的存在或不存在来实现。基于确定结果，能够做出诊断。如果存在特异于个体HPV基因型的扩增多核苷酸，则能够诊断相应HPV基因型的感染。如果没有特异于某个HPV基因型的多核苷酸的扩增产物(从而如果不存在扩增的多核苷酸的话)，则能够诊断相应HPV基因型“无感染”。如果在受试者样品中确定到一种或一种以上的高危型HPV基因型，则所述受试者处于形成宫颈癌或其他HR-HPV相关癌症的风险中；如果在受试者样品中仅检测到低危型HPV基因型或未检测到HPV基因型，则所述受试者优选不处于形成宫颈癌或其他HR-HPV相关癌症的风险中。就此而言，其他HR-HPV相关癌症可以是但不限于：食道癌、口腔癌、咽癌、阴茎癌、肛周癌、外阴癌、喉癌、喉疣状癌、扁桃体癌和阴道癌。可以根据诊断起始适宜的治疗。可以通过本发明的方法来监测治疗的成功，即染病或患病细胞或组织的移除。

基于扩增的多核苷酸确定不同的HPV基因型可通过任何本领域已知的和认为适当的方法来进行。所述确定基于个体扩增多核苷酸的检测和/或鉴定。由于扩增的多核苷酸中的基因型特异性序列差异，不同HPV基因型的检测/鉴定是行得通的。这允许区分不同扩增的个体多核苷酸。因此，通过本领域已知的允许鉴定扩增产物的方法和手段能够评估扩增多核苷酸从而评估不同HPV基因型的存在或不存在。这可以例如通过测序扩增产物并通过将所得序列与已知的HPV序列进行比较来进行。而且，产物可以通过凝胶电泳或通过RFLP(限制性片段长度多态性)分析来鉴定。而且，扩增的多核苷酸能够通过包括与互补于该扩增多核苷酸中个体基因型序列的多核苷酸或寡核苷酸杂交的方法来确定。此类多核苷酸和寡核苷酸描述在实施例或例如Schmitt等人，Bead-Based Multiplex Genotyping ofHuman Papillomaviruses.2006.J.Clin.Microbiol.44(2)：504-512(特此将其全文并入作为参考)或van den Brule等人，GP5+/6+PCR followed byreverse line blot analysis enables rapid and high-throughput identificationof human papillomavirus genotypes.2002.J Clin Microbiol 40：779-87中。杂交和发生杂交事件的检测可以通过任何方法在任何认为适当的条件下进行，例如通过Southern印迹测定，斑点印迹测定，或通过基于膜的反向线性印迹(membrane-based reverse line blot)(Melchers等人，Prevalence ofgenital HPV infections in a regularly screened population in TheNetherlands in relation to cervical cytology.1988.J Med Viroi 25：11-6；vanden Brule等人，GP5+/6+PCR followed by reverse line blot analysisenables rapid and high-throughput identification of human papillomavirusgenotypes.2002.J Clin Microbiol 40：779-87；Melchers等人，Optimizationof human papillomavirus genotype detection in cervical scrapes by amodified filter in situ hybridization test.1989.J Clin Microbiol 27：106-10)。检测和鉴定HPV基因型特异性扩增产物的特别优选的方法是如Schmitt等人(同前)所述的改良的多重HPV基因分型(MPG)测定法：HPV基因型特异性探针偶联于荧光标记的聚苯乙烯珠(Luminex悬浮阵列技术)，其与扩增产物在适宜的优选严谨条件下杂交。而且，扩增产物可以通过应用含有连接于适宜载体的HPV基因型特异性寡核苷酸的DNA芯片来鉴定。另外，内源对照多核苷酸和/或外源对照多核苷酸的扩增可以通过上述方法来确定。

技术人员理解在本发明方法的上下文中使用的术语“接触”。优选该术语涉及使本发明的组合物与样品进行物理接触，由此使得样品与组合物相互作用。接触可以进一步包括裂解样品中存在的细胞和/或提取或纯化DNA或RNA。

如上文所阐释的那样，本发明的组合物还允许评估样品中的病毒载量。因此，前述方法优选还包括通过确定不同HPV基因型的不同扩增多核苷酸的量来评估所述不同HPV基因型的病毒载量的步骤。

从而，本发明还涉及在受试者样品中诊断不同的HPV基因型和评估不同HPV基因型的病毒载量的方法，包括步骤：

a)使怀疑含有不同HPV基因型的受试者样品与根据本发明的组合物在允许多核苷酸扩增的条件下接触；

b)基于步骤a)中扩增的多核苷酸来确定不同的HPV基因型；和

c)基于步骤a)中获得的不同扩增多核苷酸的量来评估步骤b)中确定的不同HPV基因型的病毒载量。

优选仅评估样品中存在的HPV基因型(从而是检测的基因型)的病毒载量。更优选地，仅仅评估存在于样品中的高危基因型的病毒载量。

如本文所用的术语“病毒载量”优选是指受试者样品中HPV DNA的量。样品中存在的特定HPV基因型病毒载量的评估优选通过确定特异于不同HPV基因型的扩增多核苷酸的量来实现。用于确定多核苷酸的量的方法在本领域众所周知，并且描述于例如实施例中。用于确定多核苷酸的量的优选方法有实时PCR、实时RT-PCR、实时NASBA，或信号扩增方法，包括杂交捕获II、bDNA、滚环扩增(RCA)和树状聚体(dendrimer)。

通过确定病毒载量，能够评估HPV感染的严重程度。

因此，本发明涉及在受试者样品中诊断不同的HPV基因型和评估不同HPV基因型的HPV感染严重程度的方法。优选所述方法包括步骤：

a)使怀疑含有不同HPV基因型的受试者样品与根据本发明的组合物在允许(HPV)多核苷酸扩增的条件下接触；

b)基于步骤a)中获得的扩增多核苷酸来确定不同的HPV基因型；和

c)确定步骤a)中获得的在步骤b)中所确定的HPV基因型的扩增多核苷酸的量；

d)将步骤c)中确定的量与参照量进行比较；和

e)评估HPV感染的严重程度。

优选只有在受试者样品中检测到至少一种HPV基因型时才进行步骤c)至e)。更优选只有在受试者样品中检测到至少一种高危型HPV基因型时才进行步骤c)至e)。甚至更优选如果在受试者样品中检测到高危型HPV型16、18、31、33、35、45中至少之一，则进行步骤c)至e)。最优选如果在受试者样品中检测到HPV16和/或HPV18，则进行步骤c)至e)。

如本文所用，短语“评估HPV感染的严重程度”优选是指区分严重形式的HPV16感染和轻微形式的HPV16感染。如本领域技术人员将会理解的那样，这样的评估通常并非旨在对于待诊受试者100％正确。然而，该术语要求统计学显著份额的受试者能够被正确地评估。份额是否统计学显著能够由本领域技术人员利用多种众所周知的统计学评价工具来确定而无需过度劳动，例如确定置信区间、p值确定、斯氏t检验、曼-惠特尼检验等等。细节见Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley &Sons，New York 1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。P值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.001。优选本发明考虑的概率使得评估对于给定组或群中至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的受试者是正确的。

如本文所指的“轻微形式的HPV感染”优选是指这种形式的HPV感染，其在组织学上归类为正常宫颈组织或CIN1(微小或轻度宫颈发育不良)，或在细胞学上归类为NIL/M(上皮内病变或恶性肿瘤阴性)或LSIL(低级鳞状上皮内病变)。因而，轻微形式的HPV感染优选涵盖良性宫颈病变。

如本文所指的“严重形式的HPV感染”优选是指这种形式的HPV感染，其在组织学上归类为CIN2(中度宫颈上皮发育不良)或CIN3(重度宫颈发育不良)或癌变(原位或浸润)。从而，术语“严重形式的HPV16感染”优选是指这种形式的HPV16感染，其在细胞学上归类为HSIL(高级鳞状上皮内病变)或癌变。因而，严重形式的HPV感染优选涵盖恶性宫颈病变。

如本文所用的术语“比较”包括将本发明方法步骤a)中获得的扩增多核苷酸的量与本说明书别处详细说明的适宜参照源的量进行比较。应理解，如本文所用的比较是指对应参数或值的比较。优选将测试样品的扩增多核苷酸的信号强度与参照样品相同类型的信号强度进行比较。本发明前述方法步骤(d)中述及的比较可以人工或计算机辅助进行。对于计算机辅助的比较，可以通过计算机程序将所确定的量的值与储存在数据库中的对应于适宜参照的值进行比较。计算机程序可以进一步评价比较结果，即以适宜的输出形式自动提供期望的评估。基于步骤c)中确定的量与参照量之间的比较，评估由之获得测试样品的受试者的HPV感染严重程度是行得通的。因此，应选择参照量从而比较量的差异或相似性，优选允许评估患者是否患有轻微形式或严重形式的HPV感染(术语“轻微形式”和“严重形式”的解释可见本文别处)。

从而，如本文所用的术语“参照量”是指允许评估受试者HPV感染严重程度、优选高危型基因型感染严重程度的量。从而，参照可以来自(i)已知患有严重形式HPV感染的受试者，或者(ii)已知患有轻微形式HPV感染的受试者。而且，本发明的参照量可以定义阈值量，由此扩增多核苷酸量大于阈值将指示受试者患有严重形式的HPV感染；而低于阈值量的量将是受试者患有轻微形式HPV感染的指标。适宜的参照量可以通过本发明的方法根据参照样品来确定，所述参考样品将同时或随后与测试样品一起分析。优选对所确定的测试样品以及参照样品的量进行标准化。

优选HPV基因型扩增多核苷酸量大于参照量指示受试者患有严重形式的所述基因型的HPV感染。

优选，扩增多核苷酸量低于参照量指示受试者患有轻微形式的HPV感染。

在本发明前述方法的一个优选的实施方案中，HPV感染严重程度的评估包括步骤：

i)确定步骤a)中获得的扩增HPV多核苷酸的量，

ii)确定扩增的内源对照多核苷酸的量，

iii)计算步骤i)中确定的所述扩增HPV多核苷酸的量与步骤ii)中确定的所述扩增内源对照多核苷酸量之间的比值，

iv)将步骤iii)中计算的比值与参照比值进行比较，和

v)评估HPV感染的严重程度。

优选(iii)中计算的比值是扩增的HPV多核苷酸量(步骤i)中确定的)与扩增的内源对照多核苷酸量(步骤ii)中确定的)之间的比值。优选地，扩增的HPV多核苷酸量与扩增的内源对照多核苷酸量之间的比值大于参照比值指示分析其样品的受试者患有严重形式的HPV感染。优选地，扩增的HPV多核苷酸量与扩增的内源对照多核苷酸量之间的比值低于参照比值指示受试者患有轻微形式的HPV感染。

有利地，在本发明的研究中表明，计算扩增的HPV多核苷酸量与扩增的内源对照多核苷酸之间的比值，并将所述比值与参照比值进行比较，既增强了评估HPV感染严重性的灵敏度，又增强了其特异性(参见实施例8，以及图3和图4)。尤其是，表明在高HPV数量的存在下(指示更严重形式的HPV感染)，内源对照多核苷酸的扩增减小。因而，样品中病毒载量增加导致扩增的HPV多核苷酸量增加，而扩增的内源对照多核苷酸量降低。

而且，本发明涉及根据本发明的组合物用于在受试者样品中诊断多种HPV基因型，评估多种HPV基因型的病毒载量和/或多种HPV基因型感染的严重程度的用途。

最后，本发明涵盖用于实施本发明任一上述方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含根据本发明的组合物。

如本文所用的术语“试剂盒”是指前述手段的集合，例如用于使样品在允许多核苷酸扩增的条件下接触以及用于基于扩增的多核苷酸来确定不同HPV基因型的手段，所述手段优选分开地或在单个容器内提供。容器还优选包含用于实施本发明方法的说明书。试剂盒的组分优选以“即用型”方式提供，例如，相应地调整浓度。

本说明书引述的所有参考文献就其全部公开内容以及本说明书中特别提及的公开内容而言特此并入作为参考。

附图说明

附图显示了：

图1.HPV共扩增对HPV PCR灵敏度的影响。于100ng人胎盘(HP)-DNA中稀释的HPV 16、39、66和82质粒以具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12和16的寡核苷酸进行扩增，这些其后分别被称为含(白色)和不含(黑色)b-珠蛋白引物的广谱通用引物PCR(BSGP5+/6+PCR)。虚线为阳性截断值。HPV：人乳头瘤病毒，PCR：聚合酶链式反应，MFI：中位数荧光强度。

图2.BSGP5+/6+PCR对具有不同量背景DNA的HPV 82扩增的分析灵敏度。HPV 82质粒于100至1,000ng人胎盘(HP)-DNA中的系列稀释液分别在存在(白色)和不存在(黑色)b-珠蛋白引物下进行扩增。虚线为阳性截断值。HPV：人乳头瘤病毒，MFI：中位数荧光强度；+bg：同时β珠蛋白扩增；-bg：无β珠蛋白扩增；HP：人胎盘。

图3.宫颈脱落细胞中的HPV 16病毒载量。从73份细胞学上诊断为“无上皮内病变或恶性肿瘤”(NIL/M)的样品、16份“无明确诊断意义的非典型鳞状细胞”(ASCUS)样品、6份“低级鳞状上皮内病变”(LSIL)样品、6份高级鳞状上皮内病变(HSIL)样品和59份鳞状细胞癌(SCC)样品中提取的HPV DNA通过BSGP5+/6+PCR进行扩增，且产物如本文所述进行杂交。中位数荧光强度(MFI)给出的HPV16阳性反应的杂交强度显示为以细胞学诊断分组的箱图。HPV16值示为红色，而HPV16与β珠蛋白信号的比值为灰色。箱内的线代表中位数，且箱由第一四分位数和第三四分位数定界。触须线显示了10百分位数和90百分位数。异常值单独显示为圆形。图中加入了来自系列宫颈癌病例的59份HPV 16 DNA阳性样品，以覆盖完整的宫颈异常谱。

图4：宫颈脱落细胞中的HPV病毒载量。从846份细胞学上诊断为“无上皮内病变或恶性肿瘤”(NIL/M)的样品、86份“无明确诊断意义的非典型鳞状细胞”(ASCUS)样品、29份“低级鳞状上皮内病变”(LSIL)样品、13份高级鳞状上皮内病变(HSIL)样品和83份鳞状细胞癌(SCC)样品中提取的HPV DNA通过BSGP5+/6+进行扩增，且产物通过MPG进行杂交。标准化杂交强度以最大化每种HPV型的MFI。显示了单独的HPV16、其他高危型(18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82)一起、以及低危型(6、11、26、30、53、66、67、42、43、44、70)一起的最大MFI中位数百分比。

实施例

如下实施例将仅仅是举例说明本发明。无论如何，其不应阐释为限制本发明的范围。

实施例1

HPV序列比对和HPV引物设计

从美国国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸序列数据库(GenBank)获得大约50个完整测序的HPV基因型(即高危型HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82；推定HR HPV 26、53和66；以及LR HPV 6、7、11、13、30、32、34、40、42、43、44、54、55、61、62c、64、67、69、70、72、74、81、83、84、85c、86c、87c、90、97、102、106)的L1区域核苷酸序列，并用T-COFFEE(Notredame，C.，D.G.Higgins和J.Heringa.2000.T-Coffee：A novel method for fast andaccurate multiple sequence alignment.J Mol Biol 302：205-17)进行比对。BSGP5+/6+引物设计标准如下：优选寡核苷酸库而不是在引物序列中添加简并碱基位点，以避免引物序列中的合成差异。所有引物与GP5+/6+靶向相同的区域。任何HPV型应当：I)与至少一个引物具有不超过3个错配，或者II)两引物中的总错配数小于或等于5个错配。在I)与任一引物3个错配的情况下，离3’末端最近的错配应该跟在至少5个完美匹配的核苷酸后面。在II)的情况下，显出与引物序列4个错配的引物在第一个错配与其3’末端之间呈现出至少8个完美的匹配。

HPV序列与GP5+/GP6+引物结合区域的比对示于表1。而且，表1a列出了具有如SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中所示核酸序列的寡核苷酸的名称、取向(正向或反向)和核酸序列。表1a中还包括GP5+寡核苷酸(SEQ ID NO：1，正向)和GP6+寡核苷酸(SEQ ID NO：2，反向)的序列。表1a中所列的寡核苷酸(正向和反向)满足上文所定义的标准。表1b列出了满足所述标准且已经成功用来特异性地扩增不同HPV基因型多核苷酸的额外寡核苷酸的核酸序列。

表1.BSGP5+/6+和GP5+/6+序列比对。HPV序列与GP5+/GP6+引物结合区域的比对示于左侧。同源核苷酸显示为点，而错配以大写字母表示为相应序列中的核苷酸改变。右侧是与最佳拟合BSGP5+/6+引物的比对，新的错配以小写字母表示(见下页)。

表1a：用来检测HPV基因型的寡核苷酸的名称、取向、序列标识号和核酸序列(bio：生物素化)

寡核苷酸名称	取向/方向	SEQ ID NO	序列
				GP5+	正向	SEQ ID NO：1	TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC

寡核苷酸名称	取向/方向	SEQ ID NO	序列
				BSGP5+-2	正向	SEQ ID NO：3	TTT GTT ACT GTT GTI GAT ACT AC
BSGP5+-3	正向	SEQ ID NO：4	TTT GTT ACT GTT GTI GAT ACC AC
				BSGP5+-4	正向	SEQ ID NO：5	TTT GTT ACT TGT GTI GAT ACT AC
BSGP5+-5	正向	SEQ ID NO：6	TTT TTA ACT GTT GTI GAT ACT AC
				BSGP5+-6	正向	SEQ ID NO：7	TTT GTT ACT GTG GTA GAC ACT AC
BSGP5+-7	正向	SEQ ID NO：8	TTT GTT ACA GTI GTA GAC ACT AC
				BSGP5+-9	正向	SEQ ID NO：9	TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACC AC
BSGP5+-10	正向	SEQ ID NO：10	TTT GTT ACC GTA GTI GAT ACA AC
				bio-GP6+	反向	SEQ ID NO：2	GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C
bio-BSGP6+-b	反向	SEQ ID NO：11	GAA AAA TAA ATT GTA AAT CAT ACT C
				bio-BSGP6+-c	反向	SEQ ID NO：12	GAA AAA TAA ATT GCA ATT CAT ATT C

(序列中的I代表肌苷)

表1b：用来检测HPV基因型的寡核苷酸的名称、取向、序列标识号和核酸序列(bio：生物素化)

寡核苷酸名称	取向/方向	SEQ ID NO	序列
				BSGP5+-8	正向	SEQ ID NO：16	TTT GTT ACA GTI GTA GAT ACC AC
BSGP5+-18	正向	SEQ ID NO：17	TTT GTT ACC GTG GTI GAT ACC AC
				bio-BSGP6+-d	反向	SEQ ID NO：18	GAAAAACAAACTGTAGATCATATTC
bio-BSGP6+-e	反向	SEQ ID NO：19	GAAAAATAAATTGTAAATCAAATTC
				bio-BSGP6+-f	反向	SEQ ID NO：20	GAAAAATAAACTGTAAATCAAACTC
bio-BSGP6+-g	反向	SEQ ID NO：21	GAAAAATAAACTGCAAATCAAATTC

寡核苷酸名称	取向/方向	SEQ ID NO	序列
				bio-BSGP6+-h	反向	SEQ ID NO：22	GAAAAACAAACTGTAATTCATATTC

(序列中的I代表肌苷)

实施例2

开发新的b-珠蛋白引物用于扩增内源对照多核苷酸

由Primer3(Rozen等人，2000.Primer3 on the WWW for generalusers and for biologist programmers.Methods Mol Biol 132：365-86)利用b-珠蛋白基因(AY260740)作为参照序列设计了20至22个核苷酸长的不同组的b-珠蛋白引物(Tm：45-50℃)，以扩增200至240个核苷酸长的片段。

尚未描述过GP5+/6+PCR的内部DNA质量对照。相反，不同的外部b-珠蛋白PCR起控制DNA完整性的作用，但不能由此控制HPV PCR的表现以及HPV PCR反应本身中DNA的存在及完整性。为弥补该限制，在BSGP5+/6+PCR以及标准GP5+/6+PCR中整合了新的b-珠蛋白引物。

为评估GP5+/6+或BSGP5+/6+PCR共扩增DNA质量对照b-珠蛋白的能力，针对于100ng人胎盘(HP)-DNA背景中10倍稀释的含HPV 16、18、31及33基因组DNA的质粒，就CO3/5引物组(de Roda Husman，A.M.，J.M.Walboomers，A.J.van den Brule，C.J.Meijer和P.J.Snijders.1995.The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3′ends withadjacent highly conserved sequences improves human papillomavirusdetection by PCR.J Gen Virol 76(Pt 4)：1057-62)以及7个新设计的引物对(MS1-7fw及MS1-7bw)以多种组合进行了测试。通过琼脂糖凝胶电泳观察b-珠蛋白和HPV PCR产物。CO_3/5引物未能成功共扩增b-珠蛋白基因。有三种组合的新设计引物成功扩增出了期望的PCR片段。进一步针对从含HP DNA的人宫颈癌细胞细胞系SiHa和CasKi以及临床样本中分离的DNA就这些引物组进行了测试。在这些条件下，MS3fw/bw引物扩增出在凝胶中可见的PCR片段。通过MPG测定中包括的特异性探针实现了b-珠蛋白PCR产物的多路检测。

扩增内源b-珠蛋白对照多核苷酸序列表现最好的寡核苷酸序列如下：

MS3fw：AAT ATA TGT GTG CTT ATT TG(SEQ ID NO：13)

MS3bw：AGA TTA GGG AAA GTA TTA GA(SEQ ID NO：14)。

实施例3

通过GP5+/6+和BSGP5+/6+PCR扩增克隆的HPV DNA

GP5+/6+PCR如之前WO 95/22626以及de Roda Husman，A.M.，J.M.Walboomers，A.J.van den Brule，C.J.Meijer和P.J.Snijders.1995The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3′ends withadjacent highly conserved sequences improves human papillomavirusdetection by PCR.J Gen Virol 76(Pt 4)：1057-62中所述以少许改动进行。简言之，10μL从宫颈刮片中提取的DNA或1μL HPV质粒稀释液在含50mM KCl、0.8g/L NonidetTM P40、10mM Tris HCl，pH 8.8(10×PCR缓冲液，MBI Fermentas GmbH，St.Leon Roth，德国)、200μM各种脱氧核苷三磷酸(dNTP)、3.5mM MgCl₂(Biozym Scientific GmbH，HessischOldendorf，德国)、1U DNA AmpliTaq聚合酶(Roche Applied Biosystems，Mannheim，德国)和500nM各种GP5+及5’生物素化GP6+引物(MWG-Biotech AG，Ebersberg，德国)的50μL体系中扩增。在整合b-珠蛋白/GP5+/6+PCR的情况下，每种PCR混合物中加入100nM各种新的b-珠蛋白引物MS3fw及5’生物素化MS3bw。94℃4min的变性步骤之后接着40个循环的PCR热循环仪(Gene Amp PCR System 2400，Perkin-Elmer，Wellesley，MA)或Mastercycler(Eppendorf，德国)扩增。每个循环包括94℃20s的变性步骤，38℃30s的退火步骤，以及71℃80s的延伸步骤。末次延伸步骤再延长4min。Mastercycler的变温速率如最近所述调整(Snijders，P.J.，A.J.van den Brule，M.V.Jacobs，R.P.Pol和C.J.Meijer.2005.HPV DNA detection and typing in cerical scrapes.Methods MolMed 119：101-14)：从94℃到38℃是1.8℃/s，从38℃到71℃是2.0℃/s，而从71℃到94℃是2.8℃/s。每个PCR实验以阳性和若干阴性PCR对照进行。

对于广谱BSGP5+/6+PCR测定，向GP5+/6+PCR反应中加入如SEQID NO：3、4、5、6、7、8、9、11、12和16中所示的另外8个正向引物和另外2个5’生物素化反向引物。应用200nM每种正向引物(包括GP5+)、400nM每种反向引物(包括GP6+)和300nM每种b-珠蛋白引物MS3fw和5’生物素化MS3bw。在其他方面，PCR缓冲液、试剂和扩增特征与上文所述的那些完全相同。

测定了BSGP5+/6+引物对HPV 6、11、16、18、26、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68(ME180)、70、73和82质粒克隆的分析灵敏度(表2)。质粒制备物应用

ND-1000(NanoDrop Technologies，Wilmington，特拉华州，美国)或日立(Hitachi)U-1100分光光度计(Hitachi，Ltd.，东京，日本)来定量。各HPV型的拷贝数基于各质粒的分子量来确定。在100ng/μL人胎盘(HP-)DNA中在30μL的总体积中制备10倍终点系列稀释液。每种稀释液独立测定两到三份重复。

分别在BSGP5+/6+和GP5+/6+PCR中均整合了b-珠蛋白引物之后，利用PCR(至少一式两份进行)以及MPG(应用于HP-DNA中10倍系列稀释的、含24种HPV型基因组DNA的质粒)比较了两种引物组的分析灵敏度(表2)。尽管存在b-珠蛋白共扩增，BSGP5+/6+引物组扩增出分析的所有HPV基因型，对于分析的所有HPV型在10和1,000拷贝之间灵敏度达到可再现的水平。标准GP5+/6+引物在扩增HPV的能力方面显示出较为截然不同的差异，检测极限在10和1,000,000拷贝之间。这种差异独立于b-珠蛋白共扩增(见下段)。对于HPV 11、16、18、31、33、43、58和59，两种PCR引物组显示出相同的分析灵敏度。对于HPV 6、35、42、45、52、70和73，BSGP5+/6+引物组要比GP5+/6+灵敏至少10倍；对于HPV26、39、56、68(ME180)和51，灵敏100倍；而对于HPV 44、53和82，至少灵敏1,000倍。这些结果表明，对于这些克隆的HPV基因型而言，新BSGP5+/6+引物的灵敏度提高。

上文所述的实验结果示于表2。

为了进一步优化多种HPV基因型的扩增，利用表1a和1b的寡核苷酸以不同组合所进行的额外实验得到了类似于表2所列那些的检测极限。与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12和16的寡核苷酸相比，应用包含具有例如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12所示序列的寡核苷酸的寡核苷酸混合物，甚至使亚型HPV68(X67161)的检测提高10倍，而其他型的检测灵敏度不变。

表2.以100ng HP DNA中的HPV质粒拷贝数给出的不同PCR的HPV型检测极限：传统GP5+/6+PCR，以及两者均整合了b-珠蛋白PCR的GP5+/6+PCR和BSGP5+/6+PCR。

^a BSGP5+/6+与GP5+/6+检测极限之比，两者均与b-珠蛋白共扩增。

^b一种系列稀释，显示了一式四份PCR中最不灵敏的检测极限。

^c两种独立的系列稀释，显示了每种系列稀释至少两个PCR中最不灵敏的检测极限。

实施例4

通过b-珠蛋白特异性寡核苷酸扩增内源对照多核苷酸

接下来，优化b-珠蛋白引物浓度以分别整合在BSGP5+/6+和GP5+/6+PCR中，而不同时发生HPV PCR竞争。为此，针对处于HP-DNA背景中的固定量的HPV 16测试了不同量的MS3fw/bw b-珠蛋白引物。在GP5+/6+PCR中应用100nM的b-珠蛋白引物浓度，而在BSGP5+/6+PCR中应用300nM，以达到相似的b-珠蛋白信号强度(数据未显示)。相应的HPV+b-珠蛋白PCR达到了低于10ng HP-DNA(大约1,700个基因组当量)的检测极限。

为研究b-珠蛋白共扩增对HPV扩增的影响，于恒量100ng HP-DNA中系列稀释的HPV 16、39、66和82分别通过有和无b-珠蛋白共扩增的BSGP5+/6+PCR一式两份进行扩增。与b-珠蛋白共扩增无关，HPV检测极限完全相同，且HPV信号强度显示出高的强健性(图1)。在GP5+/6+PCR中，b-珠蛋白共扩增也并不影响HPV检测极限(数据未显示)。

为研究HP-DNA量增加对HPV检测极限的影响，在100至1,000ngHP-DNA背景中系列稀释的HPV 82(10至1,000个拷贝数)通过有和无b-珠蛋白共扩增的BSGP5+/6+PCR一式两份进行研究。与100ng HP-DNA相比，处于1,000ng HP-DNA中的100个拷贝的HPV 82的扩增得到的信号要弱4倍。当存在333至1,000ng HP-DNA时，HPV 82的检测极限从10拷贝升至100拷贝(图2)。与无b-珠蛋白引物的BSGP5+/6+PCR相比，b-珠蛋白共扩增并不改变HPV 82的检测极限，并且当应用100至1,000ng背景HP-DNA时显示出一致的HPV信号强度。总的来说，BSGP5+/6+PCR检测HPV 82的能力与背景HP-DNA的量成反比，且独立于b-珠蛋白共扩增。

上文所述的实验结果示于图2。

实施例5

以临床样品评价BSGP5+/6+PCR

为进行DNA分离，在PreservCyt^TM溶液(Cytyc Corp.，Boxborough，MA，美国)中用细胞刷(cytobrush)(Cervex-Brush，Rovers Medical DevicesB.V.，5347KV，荷兰)收集的2.0ml(来自总计20ml)宫颈刮片通过罗氏高纯度PCR模板制备试剂盒按照制造商的说明进行纯化。DNA洗脱在0.2ml洗脱缓冲液(10mM Tris，pH 8.5)中，并贮存在-20℃备用。在DNA提取之前，刮片于4℃保存2个月。

为验证分析结果，我们针对两个不同组的1112份宫颈涂片就整合b-珠蛋白PCR的BSGP5+/6+与无b-珠蛋白PCR的GP5+/6+进行了比较。组1包括总计95位癌症患者，而组2包括1017位来自普通人群的女性。为避免实验差异，两种PCR方法均在同一PCR操作中进行，并在同一板上通过多路HPV基因分型(MPG)分析26种HPV型。在1112份宫颈样本中，排除了27份，有24份是因为其呈BSGP5+/6+b-珠蛋白扩增阴性，且两种PCR方法均呈HPV阴性。其余3份样品通过GP5+/6+PCR强烈分型为HPV 16或31阳性，排除掉是因为BSGP5+/6+PCR不能成功扩增β-珠蛋白或HPV。

1085份临床样品(包括93份来自癌症患者的宫颈涂片和992份来自普通人群的宫颈涂片)中HPV流行程度的概况示于表3。对于每种PCR方法而言，1085份样品针对26种HPV型分型总共得到了28210个分型结果。应用5的净MFI作为截断值，639个分型结果一致地呈阳性(2.2％)，28,378个分型结果一致地呈阴性(96.9％)，而278个分型结果不一致(0.9％)，得到0.815的κ值。导致1085份临床样品中有858份被完全相同地分型(79.1％)，而且，与b-珠蛋白共扩增无关，通过BSGP5+/6+PCR，46.0％的总体HPV流行程度相对于GP5+/6+PCR的41.4％增加。

与GP5+/6+PCR相比，BSGP5+/6+PCR不能成功检出66例感染，但鉴定出212例额外的感染。表3显示了在特定HPV型检出率方面的绝对差别。虽然有些HPV型仅通过一种或另一种方法更好地系统检出，但其他HPV型通过两种PCR方法显示出微弱的差异，伴有额外微弱的阳性(低于15的净MFI)。对于HPV 6、26和67未见到检出差异。在本研究中未检出HPV 69。HPV 11、16、18、33、35、43、45、56、59和70观察到微弱的检出差异。通过BSGP5+/6+PCR系统提高了HPV 30、39、42、44、51、52、53、68(ME180)、73和82的检出，导致与GP5+/6+PCR相比，这些型的检出要频繁发生1.2至9.5倍。这些型的额外检出在至少50％的病例中产生高于15净MFI的值(表3)，并见于单一以及多重感染。在这些额外反应中，同样是强BSGP5+/6+PCR信号(高于本研究中所观察到的最大HPV探针信号(signalmax)的三分之一)未被GP5+/6+PCR检出：在单一以及多重感染中，BSGP5+/6+PCR额外检出HPV 82(信号高于signal_max的三分之一)；HPV 30和68(ME180)(信号高于signal_max的二分之一)；以及HPV 44和53(信号等于signal_max)。值得一提的是，仅BSGP5+/6+PCR检出了LR HPV 44。GP5+/6+PCR表现出更佳的HPV型31和66检出；分别显示出要频繁发生1.4和1.2倍的检出。在GP5+/6+PCR额外检出的13例HPV 31感染中，7例显示出GP5+/6+PCR临界信号(净MFI低于15)。其余的6个反应(中位数净MFI为48)见于伴有至少之一如下HPV16、51、52、53、58和59强感染的多重感染。由GP5+/6+PCR独自检出的HPV 66感染，显示出均低于12净MFI的临界值。

在比较两种PCR方法检测作为多重感染一部分的特定基因型的能力时，观察到它们之间显著的差异。GP5+/6+PCR在HPV阳性样品中检出的多重感染的总体比例是449例中的156例(34.7％)，而BSGP5+/6+PCR为499例中的192例(38.5％)(表4)。在普通人群中(n＝992)，BSGP5+/6+PCR发现的多重感染的比例为16.8％，而GP5+/6+PCR发现14.1％的多重阳性。与普通人群相比，应用BSGP5+/6+PCR时癌症患者中(n＝93)的多重感染显著更频繁(26.9％，p＝0.007)，而应用GP5+/6+PCR时流行程度并不显著改变(17.2％，p＝0.084％)。

上文所述的实验结果示于表3和4。

表3.在1085份临床样品中通过BSGP5+/6+或GP5+/6+PCR接着是MPG来检测HPV基因型

^a关于序列登录号参见表1。

^b应用截断值＞5净MFI，给定HPV型的阳性反应数(高于15净MFI以及低于15净MFI)；在总计42份HPV-18阳性样品中，36份均由两种方法检出，且另有三份低于15净MFI值的反应分别由BSGP5+/6+和GP5+/6+PCR检出。HPV-69无阳性反应。

^crBS/GP＝双阳性反应的BSGP5+/6+信号与GP5+/6+信号之比。

表4.通过BSGP5+/6+和GP5+/6+PCR在从1085份脱落宫颈细胞样品中提取的DNA中发现的HPV阴性、单一及多重感染的数目。

^a HPV阴性(0)、单一感染(1)至八重感染(8)。

实施例6

优化BSGP5+/6+PCR对HPV 31的灵敏度

为研究BSGP5+/6+引物对HPV 31灵敏度明显较低的原因，我们使BSGP5+/6+PCR中标准GP5+和GP6+引物的浓度分别由最初的200nM增至500nM和400nM增至600nM。对所有13份先前BSGP5+/6+PCR呈HPV 31阴性的多重感染临床样品进行了重新分析。比较最初与改良的BSGP5+/6+PCR，13份先前漏检的HPV 31反应中检出了7份。还优化了HPV 66的扩增，结果在8份先前BSGP5+/6+PCR阴性感染中检出3份。最初BSGP5+/6+PCR对HPV型提高的检测并不因这种改良而改变(数据未显示)。

实施例7

开发外源对照多核苷酸

应用两个延长引物来生成外源对照多核苷酸(SEQ ID NO：15，图3)，所述引物含有3’末端、中心部分和5’末端，其中3’末端与非人非HPV序列的预定DNA——此处为鼠多瘤病毒VP1——互补；中心部分几乎分别与GP5+和GP6+完全相同，但与每个引物显示出两个错配；而5’末端拥有XbaI和EcoRI的限制性酶切位点。PCR反应以Phusion聚合酶和如下方案进行：98℃30s；35个循环的98℃30s、68℃30s、72℃30s；和最终72℃延伸10分钟。不包括限制性酶位点的长144bp的所述片段被克隆到pBluescript KS(-)中，并通过测序控制。在转化电感受态DH5α细胞之后，通过应用Qiagen质粒迷你试剂盒按照制造商的方案来提取质粒DNA。

质粒制备物应用

ND-1000(NanoDrop Technologies，Wilmington，特拉华州，美国)或日立U-1100分光光度计(日立有限公司，东京，日本)来定量。拷贝数基于质粒的分子量来确定。在100ng/μL人胎盘(HP)DNA中在30μL的总体积中制备10倍终点系列稀释液。

通过BSGP5+/6+PCR以及随后应用MPG通过特异性寡核苷酸探针检测，检出不到1,000个拷贝的外源对照多核苷酸。未观察到与其他寡核苷酸探针的交叉反应。为控制PCR抑制剂，可将内部对照以低浓度掺合在PCR主混合物中，由此避免与HPV扩增竞争。

实施例8

评估HPV高危型基因型感染的严重程度

HPV的病毒载量据认为在宫颈癌的形成中起着重要作用。与低病毒载量相比，大病毒载量据认为与更差的预后相关。分析了本发明的组合物是否也能够评估HPV感染的严重程度。

来自宫颈样本(包括NIL/M、ASCUS、LSIL、HSIL和SCC)的HPVDNA通过本发明的组合物(具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12和16的寡核苷酸)进行了扩增。还包括特异性地扩增β珠蛋白基因的寡核苷酸(具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的寡核苷酸)。扩增产物如本文别处所述进行杂交。结果示于图3和图4。

除了细胞学异常的HPV DNA流行程度增加，还观察到HPV16杂交信号强度的增加。MFI值由NILM中位数143增至HSIL的1283以及癌症病例的1242。而且，HPV16与β-珠蛋白的MFI值之比由NILM到HSIL增加，并在宫颈癌患者中再次稍有下降(图3)。

对于除HPV16之外的HPV型，观察到与MFI值与细胞学异常之间类似的相关性。由于MPG中应用的HPV探针表现出不同的杂交强度，HPV信号必须针对相应HPV型的最大MFI标准化。由于每个细胞学群组中发现的其他HPV DNA型阳性反应有限，计算了HPV16单独的、以及其他高危型合起来的、还有低危型合起来的MFI中位数百分比。HPV16的MFI中位数百分比由NILM(35)到HSIL(74)增加，并在SCC(72)中再次稍有下降。合并的其他高危型显示出类似的趋势，但是值更低。相反，低危型最大MFI值的中位数百分比在LSIL(37)中最高，并在HSIL(3)以及SCC(12)群组中下降(图4)。

HPV16MFI与β-珠蛋白MFI之比随宫颈病变等级增加而增加。对于其他高危型观察到类似但是更弱的增加。整合了β-珠蛋白扩增的BSGP5+/6+PCR评估病毒载量的能力，能够由以下事实来解释：高级病变中的高病毒载量引起HPV与β-珠蛋白扩增的竞争。当HPV的扩增由于DNA聚合酶和dNTP的量有限而在所有PCR循环完成之前达到饱和时，低亲和力引物介导的β-珠蛋白基因的扩增在后面的PCR循环中减少。因而，BS-MPG提供了定量评估宫颈涂片中的病毒载量的手段，并且能够用于快速评估宫颈发育不良的等级。

序列表

<110>德国癌症研究中心

 

<120>用于改进人乳头瘤病毒基因型检测的包含寡核苷酸混合物的组合物

 

<130>DK64844PC

 

<160>22

 

<170>PatentIn版本3.4

 

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<400>1

tttgttactg tggtagatac tac                                         23

 

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<400>2

gaaaaataaa ctgtaaatca tattc                                       25

 

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

<220>

<221>modified_base

<222>(15)..(15)

<223>a是肌苷

 

<400>3

tttgttactg ttgtagatac tac                                        23

 

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<220>

<221>modified_base

<222>(15)..(15)

<223>a是肌苷

 

<400>4

tttgttactg ttgtagatac cac                                        23

 

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<220>

<221>modified_base

<222>(15)..(15)

<223>a是肌苷

 

<400>5

tttgttactt gtgtagatac tac                                         23

 

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<220>

<221>modified_base

<222>(15)..(15)

<223>a是肌苷

 

<400>6

tttttaactg ttgtagatac tac                                         23

 

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<400>7

tttgttactg tggtagacac tac                                         23

 

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<220>

<221>modified_base

<222>(12)..(12)

<223>a是肌苷

 

<400>8

tttgttacag tagtagacac tac                                           23

 

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<400>9

tttgttactg tggtagatac cac                                           23

 

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<220>

<221>modified_base

<222>(15)..(15)

<223>a是肌苷

 

<400>10

tttgttaccg tagtagatac aac                                           23

 

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

<400>11

gaaaaataaa ttgtaaatca tactc                                        25

 

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<400>12

gaaaaataaa ttgcaattca tattc                                        25

 

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸(用于扩增对照多核苷酸序列)

 

<400>13

aatatatgtg tgcttatttg                                              20

 

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸(用于扩增对照多核苷酸序列)

 

<400>14

agattaggga aagtattaga                                              20

 

<210>15

<211>144

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>多核苷酸(额外的/内部多核苷酸)

 

<400>15

tttgttacag ttgtagatac taccaattag caaggccaag ctggataagg acggaatgta   60

tccagttgaa atctggcatc cagatccagc aaaaaatgag aacacaaggt actttggcag  120

aatatgattt acagtttatt tttc                                         144

 

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<220>

<221>modified_base

<222>(12)..(12)

<223>a是肌苷

 

<400>16

tttgttacag tagtagatac cac                                          23

 

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<220>

<221>modified_base

<222>(15)..(15)

<223>a是肌苷

<400>17

tttgttaccg tggtagatac cac                                  23

 

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<400>18

gaaaaacaaa ctgtagatca tattc                                25

 

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<400>19

gaaaaataaa ttgtaaatca aattc                                25

 

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<400>20

gaaaaataaa ctgtaaatca aactc                                25

 

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<400>21

gaaaaataaa ctgcaaatca aattc                                25

 

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物/寡核苷酸

 

<400>22

gaaaaacaaa ctgtaattca tattc                                25

Claims (10)

1.包含寡核苷酸混合物的组合物，其中所述寡核苷酸混合物包含：

(a)具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中所示核酸序列的寡核苷酸；或

(b)能够特异性地扩增通过(a)的寡核苷酸所扩增的多核苷酸的寡核苷酸。

2.权利要求1的组合物，其中所述寡核苷酸混合物还包含用于扩增内源对照多核苷酸的寡核苷酸。

3.权利要求1或2的组合物，其中所述寡核苷酸混合物包含外源对照多核苷酸。

4.诊断组合物，其包含权利要求1至3中任一项的组合物。

5.权利要求1至3中任一项的组合物用于在受试者样品中诊断不同HPV基因型的用途。

6.权利要求5的用途，其中同时诊断不同的HPV基因型。

7.权利要求5或6的用途，其中所述HPV基因型是选自下组的高危型HPV基因型：HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82。

8.用于在受试者样品中诊断不同HPV基因型的方法，包括步骤：

a)使怀疑含有不同HPV基因型的受试者样品与权利要求1至3中任一项的组合物在允许多核苷酸扩增的条件下接触；和

b)基于步骤a)中获得的扩增多核苷酸来确定不同的HPV基因型。

9.权利要求8的方法，其中所述HPV基因型是高危型基因型。

10.试剂盒，其优选适合于实施权利要求8或9的方法，包含权利要求1至3中任一项的组合物。

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