JP5826752B2 - 細胞学用培地に固定された組織サンプルから核酸またはタンパク質を回収するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本願は、米国仮特許出願第61/242,258号(2009年9月14日出願)および米国仮特許出願第61/253,300号(2009年10月20日出願)からの優先権を主張し、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。「Compositions And Methods For Recovery Of Nucleic Acids Or Proteins From Tissue Samples Fixed In Cytology Media」を表題とする米国非仮特許出願(2010年9月14日に本願と同時に出願)もまた、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
固定された生物学的サンプルからの核酸またはタンパク質の回収を改善する組成物、方法およびキットについて記載する。
組織学、病理学および細胞生物学の分野において、固定は、生物学的サンプルを変質から保護する化学的処理である。固定は、進行中の任意の生化学的反応を停止させ、かつ、処置サンプルの機械的強度または安定性をも増大させ得る。固定の目的は、生物学的物質のサンプルを可能な限り自然に近い状態で保存することである。固定されたサンプルは、試験または分析に使用される。
本願は、細胞学用培地に固定された生物学的サンプルを溶解させるのに使用できる溶解組成物を提供する。細胞学用培地は、沈降固定剤もしくは架橋固定剤のいずれかまたはその両方を含み得る。
[本発明1001]
少なくとも2つのアミンを含む、固定された生物学的サンプルを溶解するための組成物。
[本発明1002]
アミンの少なくとも1つが、メチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ヘキサメチレンテトラミン、アニリンおよびアミノ酸からなる群より選択される、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
アミンの少なくとも1つがバッファー剤である、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
バッファー剤が、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(「TRIS」)、N-トリス-(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(「TAPS」)、3-[N-トリス-(ヒドロキシメチル)-メチル-アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(「TAPSO」);N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸(「TES」);N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-グリシン(「TRICINE」);ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス-(ヒドロキシメチル)メタン(「bis-TRIS」);および1,3-ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパン(「bis-TRIS PROPANE」)からなる群より選択される、本発明1003の組成物。
[本発明1005]
バッファー剤がTRISである、本発明1003の組成物。
[本発明1006]
アミンの少なくとも1つがジアゾアミンである、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
少なくとも1つの界面活性剤をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1008]
界面活性剤が、ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート、Nonidet P-40、Igepal CA-630、デオキシコール酸塩、Triton X-100、ドデシル硫酸ナトリウムおよびポリソルベートサーファクタントからなる群より選択される、本発明1006の組成物。
[本発明1009]
pHが7以上である、本発明1001の組成物。
[本発明1010]
少なくとも1つのDNA結合磁性ビーズをさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1011]
150 mM Tris-HCl;
300 mM ジエタノールアミン;
3% Brij-58;
0.09%アジ化ナトリウム;
を含み、およそ9.4のpHを有する、本発明1001の組成物。
[本発明1012]
界面活性剤、アミンおよびバッファー剤を含む、固定された生物学的サンプルを溶解するための組成物。
[本発明1013]
界面活性剤が、ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート、Nonidet P-40、Igepal CA-630、デオキシコール酸塩、Triton X-100、ドデシル硫酸ナトリウムおよびポリソルベートサーファクタントからなる群より選択される、本発明1012の組成物。
[本発明1014]
界面活性剤がTriton X-100である、本発明1012の組成物。
[本発明1015]
アミンが、メチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ヘキサメチレンテトラミン、アニリンおよびアミノ酸からなる群より選択される、本発明1012の組成物。
[本発明1016]
アミンがジエタノールアミンである、本発明1012の組成物。
[本発明1017]
バッファー剤が、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(「TRIS」)、N-トリス-(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(「TAPS」)、3-[N-トリス-(ヒドロキシメチル)-メチル-アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(「TAPSO」);N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸(「TES」);N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-グリシン(「TRICINE」);ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス-(ヒドロキシメチル)メタン(「bis-TRIS」);1,3-ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパン(「bis-TRIS PROPANE」);炭酸塩・重炭酸塩;グリシン;リン酸塩;4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(「HEPES」);N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン(「Bicine」);および3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(「MOPS」)からなる群より選択される、本発明1012の組成物。
[本発明1018]
バッファー剤がTRISである、本発明1012の組成物。
[本発明1019]
防腐剤をさらに含む、本発明1012の組成物。
[本発明1020]
防腐剤が、アジ化ナトリウム、ゲンタマイシン(gentomycin)、2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン、5-クロロ-2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オンおよび1,2-ベンゾイソチアゾリン-3-オンからなる群より選択される、本発明1012の組成物。
[本発明1021]
防腐剤がアジ化ナトリウムである、本発明1012の組成物。
[本発明1022]
pHが7以上である、本発明1012の組成物。
[本発明1023]
少なくとも1つのDNA結合磁性ビーズをさらに含む、本発明1012の組成物。
[本発明1024]
150 mM Tris-HCl;
300 mM ジエタノールアミン;
3% Brij-58;
0.09%アジ化ナトリウム;
を含み、およそpH9.4のpHを有する、本発明1012の組成物。
[本発明1025]
固定された生物学的サンプルを本発明1001〜1024のいずれかの組成物を用いて処置する工程を含む、固定された生物学的サンプルを溶解させる方法。
[本発明1026]
固定された生物学的サンプルが架橋固定剤で固定されている、本発明1025の方法。
[本発明1027]
架橋固定剤がアルデヒドを含む、本発明1026の方法。
[本発明1028]
アルデヒドが、ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドからなる群より選択される、本発明1027の方法。
[本発明1029]
固定された生物学的サンプルが、アルコールを含む固定剤で固定されている、本発明1025の方法。
[本発明1030]
アルコールが、メタノールおよびエタノールからなる群より選択される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
固定剤が、SUREPATHおよびPRESERVECYTからなる群より選択される、本発明1025の方法。
[本発明1032]
固定された生物学的サンプルが頸部サンプルである、本発明1025〜本発明1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
固定された生物学的サンプルの成分を単離する方法であって:
a.本発明1024〜本発明1032のいずれかの方法により、固定された生物学的サンプルを溶解させる工程;および
b.溶解産物から成分を単離する工程、
を含む、前記方法。
[本発明1034]
成分が核酸分子である、本発明1033の方法。
[本発明1035]
核酸分子が特定配列を含む、本発明1034の方法。
[本発明1036]
核酸分子が、該核酸分子の特定配列に核酸プローブをハイブリダイズさせる工程を含む方法により単離される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
核酸プローブが、固相に結合させるのに適したものであるかまたは固相に結合されている、本発明1036の方法。
[本発明1038]
固相が磁性ビーズである、本発明1037の方法。
[本発明1039]
核酸分子の特定配列に核酸プローブをハイブリダイズさせることにより、該核酸分子と該核酸プローブの間でDNA:RNAハイブリッドが形成される、本発明1036の方法。
[本発明1040]
DNA:RNAハイブリッドがDNA:RNAハイブリッド結合抗体に結合される、本発明1039の方法。
[本発明1041]
DNA:RNAハイブリッド結合抗体が、固相に結合されているかまたは固相に結合させるのに適したものである、本発明1040の方法。
[本発明1042]
固相が磁性ビーズである、本発明1041の方法。
[本発明1043]
核酸分子がウイルス核酸分子である、本発明1034〜本発明1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
固定された生物学的サンプルを溶解させるための、本発明1001〜本発明1024のいずれかの組成物の使用。
本願は、様々な固定物質で固定された生物学的サンプルから様々な成分を抽出する共通プロトコルにおいて有用でありかつ高スループットの自動化に適した試薬および方法に関する。
この下記実施例は、アルデヒド固定された臨床頸部サンプルから単離したHPV DNAの収量およびシグナル感度に対する様々な溶解液の影響を示す。
この実施例は、Trisおよびジエタノールアミンの両方を含む溶解液の高い効果に対するTris濃度の変化の影響を示す。
この実施例は、TRISおよびジエタノールアミンの両方を含む溶解液中の核酸に対する感度・効果に対するpHの変化の影響を示す。
この実施例は、Trisおよびジエタノールアミンの両方を含む溶解液を用いた核酸の単離の感度および効果に対するアミン濃度の変化の影響を示す。
この実施例は、界面活性剤および各アミンの相対的な寄与を示す。分析は、実施例1と実質的に同じように行ったが、ただし、溶解液は、(1)3% (v/v) Brij-58;(2)150 mM Tris-HCl;(3)150 mMジエタノールアミン;(4)Brij-58および150 mM Tris-HCl;(5)Brij-58および150 mMジエタノールアミン;(6)150 mM Trisおよび150 mMジエタノールアミン;ならびに(7)Brij-58および150 mM Trisおよび150 mMジエタノールアミン、を使用した。対照(CTL)は、バッファーのみを含むものとした。典型的には、1.5 mLのサンプルを、25μlのプロテイナーゼK(10 mg/mlストック)および60μlの1.5% (v/v) AxpH(商標) DNA親和性磁性ビーズと共に、1 mLの溶解バッファーに加え、溶解させる。結果を図5および表7に示す。表7における網掛けのセルは、1.00より大きいRLU/COを有する複製物を示している。
この実施例は、本願で開示する組成物および方法が、架橋固定剤または沈降固定剤のいずれを用いて保存された生物学的サンプルに対して使用できることを示す。
Claims (28)
- 界面活性剤、ジエタノールアミンおよびトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)を含む、固定された生物学的サンプルを溶解するための組成物であって、pHが8以上である、前記組成物。
- 界面活性剤が、ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート、Nonidet P-40、Igepal CA-630、デオキシコール酸塩、Triton X-100、ドデシル硫酸ナトリウムおよびポリソルベートサーファクタントからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
- 界面活性剤がTriton X-100である、請求項1記載の組成物。
- 防腐剤をさらに含む、請求項1記載の組成物。
- 防腐剤が、アジ化ナトリウム、ゲンタマイシン(gentomycin)、2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン、5-クロロ-2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オンおよび1,2-ベンゾイソチアゾリン-3-オンからなる群より選択される、請求項4記載の組成物。
- 防腐剤がアジ化ナトリウムである、請求項4記載の組成物。
- 少なくとも1つのDNA結合磁性ビーズをさらに含む、請求項1記載の組成物。
- 150 mM Tris-HCl;
300 mM ジエタノールアミン;
3% Brij-58;
0.09%アジ化ナトリウム;
を含み、8.5以上のpHを有する、請求項1記載の組成物。 - 固定された生物学的サンプルを請求項1〜8のいずれか記載の組成物を用いて処置する工程を含む、固定された生物学的サンプルを溶解させる方法。
- 固定された生物学的サンプルが架橋固定剤で固定されている、請求項9記載の方法。
- 架橋固定剤がアルデヒドを含む、請求項10記載の方法。
- アルデヒドが、ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
- 固定された生物学的サンプルが、アルコールを含む固定剤で固定されている、請求項9記載の方法。
- アルコールが、メタノールおよびエタノールからなる群より選択される、請求項13記載の方法。
- 固定された生物学的サンプルが、SUREPATH(登録商標)およびPRESERVCYT(登録商標)からなる群より選択される固定剤により固定される、請求項9記載の方法。
- 固定された生物学的サンプルが頸部サンプルである、請求項9〜請求項15のいずれか記載の方法。
- 固定された生物学的サンプルの成分を単離する方法であって:
a.請求項9〜請求項16のいずれか記載の方法により、固定された生物学的サンプルを溶解させる工程;および
b.溶解産物から成分を単離する工程、
を含む、前記方法。 - 成分が核酸分子である、請求項17記載の方法。
- 核酸分子が特定配列を含む、請求項18記載の方法。
- 核酸分子が、該核酸分子の特定配列に核酸プローブをハイブリダイズさせる工程を含む方法により単離される、請求項19記載の方法。
- 核酸プローブが、固相に結合させるのに適したものであるかまたは固相に結合されている、請求項20記載の方法。
- 固相が磁性ビーズである、請求項21記載の方法。
- 核酸分子の特定配列に核酸プローブをハイブリダイズさせることにより、該核酸分子と該核酸プローブの間でDNA:RNAハイブリッドが形成される、請求項20記載の方法。
- DNA:RNAハイブリッドがDNA:RNAハイブリッド結合抗体に結合される、請求項23記載の方法。
- DNA:RNAハイブリッド結合抗体が、固相に結合されているかまたは固相に結合させるのに適したものである、請求項24記載の方法。
- 固相が磁性ビーズである、請求項25記載の方法。
- 核酸分子がウイルス核酸分子である、請求項18〜請求項26のいずれか記載の方法。
- 固定された生物学的サンプルを溶解させるための、請求項1〜請求項8のいずれか記載の組成物の使用。
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