CN115335519A - 从固定的生物样品纯化核酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种裂解固定的生物样品的方法,其中所述固定的生物样品包含由所述固定造成的核酸分子与蛋白质分子之间的交联,所述方法包括:(a)裂解所述固定的生物样品,其中裂解涉及用蛋白水解酶消化;(b)加热裂解的样品以逆转交联;(c)添加蛋白水解酶并进行蛋白水解消化;任选地其中在步骤(b)与步骤(c)之间进行一个或多个另外的处理步骤。所提供的核酸具有高产量和质量,并且可以从所述裂解的样品纯化。
Description
技术领域
本发明涉及用于裂解固定的生物样品和/或从固定的生物样品获得纯化的核酸的方法。
背景技术
生物样品的固定允许所述样品的长期保存和存档。固定通常通过沉淀蛋白质或交联蛋白质的化合物例如酸、醇、酮或其他有机物质例如戊二醛、甲醛和/或聚甲醛来实现。此类固定剂在本领域中是公知的。用甲醛(例如以被称为“福尔马林”的35重量%的水溶液的形式使用)固定,然后将固定的材料包埋在石蜡中(被称为“福尔马林固定的石蜡包埋的”(FFPE)材料),是一种广泛使用的固定技术。基于甲醛的固定具有在固定中比较良好地获得组织结构的优点。涉及交联固定剂的固定也被用于固定并因此保存液体样品。一种常用的包含乙醇和甲醛的防腐剂是
固定的生物样品(例如FFPE样品)是研究疾病的宝贵资源。然而,此类样品主要用于组织病理学,并且由于暴露到甲醛和储存导致的DNA的广泛损伤和交联,不太适合于核酸提取和分析。从固定的生物样品提取的DNA的最关键的质量问题是核酸与蛋白质的交联以及彼此之间的交联。这种交联使DNA在反应例如PCR期间不能被酶接近,导致性能非常差并且可能在测试中产生错误结果。因此,核酸(DNA或RNA)从固定的生物样品(固体或液体)的高效释放和纯化是困难的。然而,对于分子水平上的大量研究、特别是对于临床或诊断应用来说,核酸的分析是极为重要的。
从这种固定的生物样品提取核酸例如DNA的方法必须逆转由固定而引入的交联,同时防止对核酸的任何进一步损伤。使DNA去交联的标准方法是用热处理粗裂解液,例如在90℃下1小时或80℃下4小时,并且这些去交联步骤均已被用于溶解固定的生物样品中存在的交联。大量用于FFPE提取的商品化试剂盒和方法在本领域中是可获得的。所有试剂盒均使用热、酶和化学裂解的组合,以便从石蜡中取出组织,消化所述组织并纯化DNA。用于从固定的样品分离/释放核酸的其他方法已在WO 2007/068764、WO 2014/072366、WO2005/075642、WO 2001/46402和US 2005/0014203中描述。大多数可用的试剂盒和方法必须在提取的DNA的总产量和/或质量方面进行权衡(即较高的DNA产量通常伴有片段化,而大部分完整的高分子量DNA通常不被完全去交联,并且在PCR应用中质量较差)。评估提取的核酸的质量的其他重要指标是在PCR和/或NGS应用中的性能。
一个目的是提供一种用于裂解固定的生物样品的方法,所述方法有效地释放所含的核酸例如DNA和/或RNA,特别是DNA。此外,本发明的另一个目的是提供一种用于从固定的生物样品纯化核酸,例如DNA和/或RNA的方法。在实施方式中,本发明的一个目的是避免现有技术方法的缺点。在实施方式中,本发明的方法提供了在后续的核酸分析方法例如PCR和/或下一代测序中至少一个标准例如产量、片段化和/或性能的改进。
发明内容
本发明提供了一种用于裂解固定的生物样品的改进的方法,其中所述固定的生物样品包含核酸分子与蛋白质分子之间的交联。这些交联是由于所使用的固定(例如基于甲醛和/或聚甲醛的固定)而存在。已发现,通过逐步的顺序裂解过程可以显著改善固定的生物样品的裂解和消化,其中将所述固定的生物样品用蛋白水解酶消化,然后加热以逆转交联,然后添加蛋白水解酶以进行另外的蛋白水解消化。实施例显示,在进行交联逆转步骤后进行第二次蛋白水解消化导致重要且出人意料的改进。
根据本发明的第一方面,提供了一种裂解固定的生物样品的方法,其中所述固定的生物样品包含由所述固定引起的核酸分子与蛋白质分子之间的交联,所述方法包括
(a)裂解所述固定的生物样品,其中裂解涉及用蛋白水解酶消化;
(b)加热裂解的样品以逆转交联;
(c)添加蛋白水解酶并进行蛋白水解消化;
任选地其中在步骤(b)与(c)之间进行一个或多个另外的处理步骤。
正如通过实施例所证实的,根据所述第一方面的方法与现有技术方法相比显著改进了核酸例如DNA的释放。所述固定的生物样品可以是固体生物样品(例如固定的组织样品)或液体生物样品(例如固定的含细胞液体样品)。
根据本发明的第二方面,提供了一种从固定的生物样品获得纯化的核酸的方法,其中所述固定的生物样品包含由所述固定引起的核酸分子与蛋白质分子之间的交联,所述方法包括根据所述第一方面的裂解方法的步骤(a)至(c)裂解所述固定的生物样品,其中在所述第一方面的方法的步骤(c)之后,所述方法包括
(d)从所述裂解的样品纯化核酸。
正如在本文中公开的,可以在根据所述第一方面的方法的步骤(b)与(c)之间任选地进行一个或多个另外的处理步骤(例如不同于蛋白水解消化步骤的至少一个另外的酶处理步骤)。根据所述第一方面的逐步裂解/消化程序改进了高质量核酸(例如DNA)从所述固定的生物样品的释放,因此随后可以在根据所述第二方面的方法的步骤(d)中从消化的样品以高质量和/或高产率纯化释放的核酸(例如DNA)。由此提供了一种从固定的生物样品纯化核酸例如DNA的改进的方法。
本发明的第三方面涉及蛋白水解酶例如蛋白酶K优选地在根据本发明的第一或第二方面的方法中的用途,其用于在裂解固定的生物样品后进行蛋白水解消化,其中此类先前的裂解涉及用蛋白水解酶消化所述固定的生物样品并加热裂解的样品以逆转交联。正如本文中公开的,所述固定的生物样品包含由所述固定引起的核酸分子与蛋白质分子之间的交联,根据一个实施方式,固定涉及使用甲醛或聚甲醛。
本发明的第四方面涉及糖基化酶例如DNA糖基化酶、优选为尿嘧啶DNA糖基化酶的用途,其用于进行酶处理,其中所述酶处理在30min或更短时间、20min或更短时间、15min或更短时间或10min或更短时间内完成。此类用途可以在根据本发明的第一或第二方面的方法中进行。在优选实施方式中,所述尿嘧啶糖基化酶是尿嘧啶-N-糖基化酶。
对于本领域技术人员来说,从下面的描述和附图,本申请的其他目的、特点、优点和方面将变得显而易见。然而应该理解,下面的描述、附图和具体实例尽管指明了本申请的优选实施方式,但仅仅是为了说明而提供。
附图说明
图1:展现了在从不同人类FFPE组织提取后的DNA产量,所述组织包括前列腺(图1A)、肺(图1B)、肾(图1C)、脾(图1D)和乳腺癌(图1E)。DNA产量使用QIAxpert(“UV-Vis”,深色阴影柱)和Qubit仪器(“dsDNA(Qubit)”,浅色阴影柱)确定。在使用(“+”)或不使用(“-”)另外的蛋白酶K消化步骤(15min,65℃)的情况下,将使用高Tris裂解组合物(“新GR–高Tris”)与低Tris裂解组合物(“新GR–低Tris”)的提取进行比较。
图2:示出了从人类肾和人类乳腺癌FFPE组织样品提取的DNA的电泳凝胶。提取在使用(“+”)或不使用(“-”)另外的蛋白酶K消化步骤(15min,65℃)的情况下使用高Tris裂解组合物(“高Tris”)或低Tris裂解组合物(“低Tris”)进行。
图3:使用大扩增子(500bp,右侧)或短扩增子(66bp,左侧)通过定量实时PCR测量的从乳腺癌(顶部)或肾FFPE组织(底部)提取的DNA的Cq值。在使用或不使用另外的蛋白酶K消化步骤(15min,65℃)的情况下,将使用高Tris裂解组合物(“新GR–高Tris”)与低Tris裂解组合物(“新GR–低Tris”)的提取进行比较。在深色阴影柱中描绘的结果对应于每个反应混合物相同量的DNA,浅色阴影柱对应于每个反应混合物相同体积的稀释洗脱液。
图4:示出了从各种不同人类组织提取的DNA的NGS结果。示出的是提取的DNA的每个UMI(独特分子标识符,也被称为独特分子索引)的读出的数目。超过10的值表明同一分子被读出超过10次,并且是起始材料中过度扩增/复杂度不足的指示。提取在使用或不使用另外的蛋白酶K消化步骤(“2nd PK”)的情况下使用高Tris裂解组合物(“新GR–高Tris”)或低Tris裂解组合物(“新GR–低Tris”)进行。
图5:展示了在从不同FFPE组织(5A:人类肺癌组织;5B:人类心房组织)提取后的DNA产量。DNA产量使用QIAxpert(“UV-Vis”,深色阴影柱)和Qubit仪器(“dsDNA(Qubit)”,浅色阴影柱)确定。在使用(“15min,65℃PK”)或不使用(“std”)另外的蛋白酶K消化步骤的情况下,将使用高Tris裂解组合物(“新GR–高Tris”)与低Tris裂解组合物(“新GR–低Tris”)的提取进行比较。此外,通过将第一蛋白酶K步骤在56℃下进行过夜,进行了额外的对照(“o/n56℃”)。作为参比,也使用FFPE DNA试剂盒(“QA”)以及Promega Maxwell RSCDNA FFPE试剂盒和Maxwell RSC FFPE Plus DNA试剂盒进行了提取,其中蛋白酶K消化在70℃下进行1h。
图6:示出了从不同FFPE组织(6A:人类肺癌组织;6B:人类心房组织)提取的DNA的电泳凝胶。提取在使用(“+65℃”)或不使用(“std”)另外的蛋白酶K消化步骤(15min,65℃)的情况下使用高Tris裂解组合物(“新GR-高Tris”)或低Tris裂解组合物(“新GR-低Tris”)进行。此外,通过将第一蛋白酶K步骤在56℃下进行过夜,进行了额外的对照(“o/n”)。作为参比,也使用FFPE DNA试剂盒(“QA FFPE”)以及Promega Maxwell RSC DNAFFPE试剂盒和Maxwell RSC FFPE Plus DNA试剂盒进行了提取,其中蛋白酶K消化在70℃下进行1h。
图7:通过定量实时PCR测量的从不同FFPE组织(左:人类肺癌组织;右:人类心房组织)提取的DNA的Cq值。在图7A中使用短扩增子(66bp),在图7B中使用大扩增子(500bp)。在使用或不使用另外的蛋白酶K消化步骤(15min,65℃)的情况下,将使用高Tris裂解组合物(“新GR–高Tris”)与低Tris裂解组合物(“新GR–低Tris”)的提取进行比较。此外,通过将第一蛋白酶K步骤在56℃下进行过夜,进行了额外的对照(“o/n 56℃”)。作为参比,也使用FFPE DNA试剂盒(“QA”)以及Promega Maxwell RSC DNA FFPE试剂盒和MaxwellRSC FFPE Plus DNA试剂盒进行了提取,其中蛋白酶K消化在70℃下进行1h。在深色阴影柱中描绘的结果对应于每个反应混合物相同量的DNA,浅色阴影柱对应于每个反应混合物相同体积的稀释洗脱液。
图8:示出了从人类心房FFPE组织提取的DNA的NGS结果。示出的是提取的DNA的每个UMI(独特分子标识符,也被称为独特分子索引)的读出的数目。超过10的值表明同一分子被读出超过10次,并且是起始材料中过度扩增/复杂度不足的指示。提取在使用或不使用另外的蛋白酶K消化步骤(“2nd PK”)的情况下使用高Tris裂解组合物(“新GR–高Tris”)或低Tris裂解组合物(“新GR–低Tris”)进行。作为参比,也使用FFPE DNA试剂盒(“QAFFPE”)以及Promega Maxwell RSC DNA FFPE试剂盒和Maxwell RSC FFPE Plus DNA试剂盒进行了提取,其中蛋白酶K消化进行1h。
图9:示出了从不同FFPE组织样品提取的DNA的电泳凝胶。左图示出了从FFPE大鼠心脏提取的DNA,而右图示出了从FFPE大鼠肺提取的DNA。相比于DNA FFPE组织参比方案,经由使用稀释的裂解组合物的提取方法提取的DNA的平均尺寸低得多。(“GRstd”=稀释的裂解组合物;“QA std”=参比裂解组合物;L1-L3=如底部所示的DNA梯)。
图10:使用大扩增子(727bp)通过定量实时PCR测量的提取DNA的Cq值。DNA使用稀释的裂解组合物(“片段化的”)和参比方案(“标准”)从大鼠心脏FFPE组织提取。
图11:使用短扩增子(78bp)通过定量实时PCR测量的提取DNA的Cq值。DNA使用稀释的裂解组合物(“片段化的”)和参比方案(“标准”)从大鼠心脏FFPE组织提取。
图12:示出了使用任选地含有添加剂例如亚精胺、精胺、DTT或甘氨酸的高Tris裂解组合物(“GR–高Tris”,“w/o”)或低Tris裂解组合物(“GR–低Tris”,“GR std”)从FFPE组织样品提取的DNA的电泳凝胶。(L1-L3=DNA梯)。
图13:使用短扩增子(110bp)通过定量实时PCR测量的亚硫酸氢盐转化的DNA的Ct值。使用了不同量的DNA:5ng(深色阴影柱)或10ng(浅色阴影柱)。通过提供尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)将亚硫酸氢盐转化的DNA的尿嘧啶核碱基在酶处理步骤中除去。因此较高的Ct值指示较高的UNG活性。对于实施例4的裂解组合物来说,测量了5或10ng DNA在5min UNG消化步骤中与60min UNG消化步骤(“GR FFPE std”)中的比较。进行了不含UNG的其他对照(“w/oUNG”)。
图14:对于人类肾和人类乳腺样品来说,通过UV VIS和Qubit dsDNA BR测量来确定产量(参见实施例5)。展示的是来自于每种条件的2个样品的平均值和标准偏差。
图15:通过向每个反应添加调整到实际洗脱体积的相同体积量来确定在qPCR中的性能。在使用任一方案选项提取后,从洗脱液扩增66bp和500bp的人类18S rRNA基因。展示的是来自于每种条件的2个样品的平均值和标准偏差。
图16:对于人类心脏样品来说,通过UV VIS和Qubit dsDNA BR测量来确定产量(参见实施例5)。展示的是来自于每种条件的2个样品的平均值和标准偏差。
图17:通过向每个反应添加调整到实际洗脱体积的相同体积量来确定在qPCR中的性能。在使用任一方案选项提取后,从洗脱液扩增66bp和500bp的人类18S rRNA基因。展示的是来自于每种条件的2个样品的平均值和标准偏差。
具体实施方式
本发明提供了一种用于裂解固定的生物样品的改进方法,其中所述固定的生物样品包含由所述固定引起的核酸分子与蛋白质分子之间的交联。此外,描述了用于从固定的生物样品获得纯化的核酸例如DNA和/或RNA的改进的方法。
本发明提供了从固定的生物样品例如FFPE组织提取的核酸的产量和/或质量的改进,从而能够例如使用PCR和NGS测序方法更好地分析所述材料。具体来说,发现在去交联步骤(其在第一蛋白水解消化步骤之后进行)之后额外的一轮蛋白水解消化提供了重要改进。
此外,本公开提供了允许控制与固定的生物样品的分析相关的核心参数的方法。具体来说,发现通过在第一步中调整裂解条件,可以控制释放并由此获得的核酸的尺寸。这个重要发现允许优化用于短或长扩增子PCR系统的方法。此外,如本文所公开的调整裂解条件也提高提取期间酶步骤的性能,从而能够例如在过程中使用尿嘧啶-n-糖基化酶来除去由福尔马林交联造成的假象。
因此,本文公开的本发明的不同方面和实施方式为本领域做出了重要贡献。
根据第一方面的方法
根据本发明的第一方面,提供了一种裂解固定的生物样品的方法,其中所述固定的生物样品包含由所述固定引起的核酸分子与蛋白质分子之间的交联,所述方法包括:
(a)裂解所述固定的生物样品,其中裂解涉及用蛋白水解酶消化;
(b)加热裂解的样品以逆转交联;
(c)添加蛋白水解酶并进行蛋白水解消化;
任选地其中在步骤(b)与(c)之间进行一个或多个另外的处理步骤。
现在将详细描述各个步骤和优选实施方式。
步骤(a)
根据所述第一方面的方法在步骤(a)中包括裂解所述固定的生物样品,其中裂解涉及用蛋白水解酶消化。在裂解步骤(a)期间,所述固定的生物样品被降解,使得核酸被释放。
步骤(a)可以使用本领域中已知的裂解和蛋白水解消化条件来进行。通过用蛋白水解酶消化来帮助所述固定的生物样品的裂解是非常有利的,因为它允许降解与核酸交联的蛋白质和肽。正如本文公开和本领域中已知的,所述固定的生物样品中的这种交联由所使用的固定引起,例如在使用交联固定剂时。例如,使用交联固定剂例如含醛固定剂如甲醛,导致蛋白质与核酸之间以及核酸之间的交联。通过进行裂解步骤(a),可以降解核酸交联的蛋白质以及核酸之间的部分交联。
根据一个实施方式,裂解步骤(a)包括制备裂解混合物,其中所述裂解混合物包含(i)所述固定的生物样品,和(ii)包含所述蛋白水解酶的裂解组合物。为了制备步骤(a)中的裂解混合物,这个实施方式涵盖了所述固定的生物样品与裂解组合物组分的任何接触顺序。例如,所述裂解组合物可以被单独制备,然后可以将制备的裂解组合物与所述固定的生物样品接触,反之亦然。因此,可以首先调整所述裂解组合物而不影响所述固定的生物样品。此外,这个实施方式的范围还包括通过将所述固定的生物样品以任何顺序与所述蛋白水解酶和/或用于制备裂解混合物的所述裂解组合物的其他组分接触,来制备所述裂解混合物。
所述蛋白水解酶支持所述固定的生物样品的消化并改进所包含的核酸例如DNA和/或RNA的释放。在实施方式中,所述蛋白水解酶是蛋白酶,例如蛋白酶K。蛋白酶可能是切割蛋白质内的肽键的内肽酶和/或是从蛋白质链的末端切掉氨基酸的外肽酶。通常,蛋白酶按照机制进一步分类,例如丝氨酸蛋白酶(例如糜蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和蛋白酶K);半胱氨酸(硫醇)蛋白酶(例如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、组织蛋白酶、寄生虫蛋白酶和细菌毒力因子);天冬氨酸蛋白酶(例如胃蛋白酶、组织蛋白酶、rerun、真菌和病毒蛋白酶);以及金属蛋白酶(例如嗜热菌蛋白酶)。此类蛋白酶可以在本发明的情形中使用。在核心实施方式中,在步骤(a)中使用的蛋白水解酶是丝氨酸蛋白酶。根据一个实施方式,在步骤(a)中使用的蛋白水解酶是枯草杆菌蛋白酶家族的蛋白酶。在步骤(a)中使用的特别适合且优选的丝氨酸蛋白酶是蛋白酶K。蛋白酶K在本领域中常用于消化由于所应用的固定而包含交联的固定的生物样品。蛋白酶K甚至在较高温度和去污剂、变性剂例如尿素和离液剂和盐存在下也有利地保持活性。在本发明的实施例中也使用蛋白酶K。本文为蛋白水解酶或蛋白酶描述的所有公开内容通常都具体适用于并且尤其是指优选实施方式蛋白酶K。正如从列出的实施例中显而易见的,所述蛋白水解酶可以是热稳定蛋白酶。这允许在步骤(a)中通过加热所述裂解混合物来支持裂解和消化,正如也在下文中描述的。适合的热稳定蛋白酶的实例是蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶和内切蛋白酶Lys-C。所述热稳定蛋白酶可以在等于或高于失活温度时失活,所述失活温度可以在85℃-120℃的范围内。不同蛋白酶的适合的失活温度在本领域中针对不同蛋白酶进行了描述。
根据一个实施方式,步骤(a)包括加热以帮助通过所述蛋白水解酶消化。因此,可以将所制备的裂解混合物加热至支持所述固定的生物样品的裂解/消化的适合的高温。所述裂解/消化温度被选择成使所述蛋白水解酶有活性。在实施方式中,步骤(a)中的加热在35-75℃、例如40-70℃或45-65℃范围内的温度下进行。正如在本领域中已知的,加热所述裂解可以增强所述蛋白水解酶的活性,从而在步骤(a)中允许快速且高效的样品裂解和消化。根据一个实施方式,在步骤(a)中用蛋白水解酶消化包括加热到至少30℃、特别是至少35℃、至少40℃、至少45℃、优选地至少50℃的温度。
根据一个实施方式,在步骤(a)中将所述裂解混合物温育至少15min,例如至少20min、至少25或至少30min。在实施方式中,在步骤(a)中将所述裂解混合物温育至少45min或至少50min。有利情况下,步骤(a)可以在短的时间框内进行。根据一个实施方式,步骤(a)在120min或更短时间内完成。步骤(a)可以在100min或更短时间、90min或更短时间或70min或更短时间例如约60min内完成。温育可以在如上所述的高温下进行。此外,优选地通过本文所公开的加热辅助的温育,可以通过搅拌来支持。因此,在步骤(a)中的温育期间可以将所述裂解混合物搅拌。根据一个实施方式,步骤(a)中用蛋白水解酶的裂解和消化包括将所述裂解混合物在35-75℃、例如40-70℃或45-65℃范围内的温度下搅拌并加热15至120min,例如20至100min、30至90min或45至75min。搅拌可以通过任何方法来进行,例如摇动、滚动、倒置等。
本领域技术人员可以选择所述蛋白水解酶在裂解组合物和裂解混合物中的适合浓度,并且适合的浓度在本领域中是已知的。根据一个实施方式,所述步骤(a)的蛋白水解酶以至少0.5mg/mL,例如至少1mg/mL、至少1.5mg/mL或至少2mg/mL的浓度存在于所述裂解混合物和/或裂解组合物中。优选地,所述浓度为至少2.5mg/mL或至少3mg/mL。根据一个实施方式,在步骤(a)中使用的蛋白水解酶是丝氨酸蛋白酶、例如蛋白酶K,其以选自1-10mg/mL,例如1.5-7.5mg/mL、2-7mg/mL、3-6mg/mL或3.5-5mg/mL的浓度存在于所述裂解混合物和/或裂解组合物中。当所述固定的生物样品是固定的固体生物样品例如固定的组织样品时,可以使用这样的浓度。当处理固定的液体生物样品时,也可以在所述裂解混合物中使用这样的浓度。在这种情况下,对所述裂解组合物进行调整以将由所述固定的液体生物样品产生的任何稀释效应考虑在内。例如,可以补偿由所述固定的液体生物样品引起的蛋白水解酶的稀释,以在所述裂解组合物中提供更高浓度的蛋白水解酶。考虑到蛋白水解酶在步骤(a)的裂解混合物中的适合浓度,专业技术人员可以容易地计算出适合的浓度。
正如上文公开的,在核心实施方式中步骤(a)包括制备裂解混合物,其中所述裂解混合物包含(i)所述固定的生物样品,和(ii)包含所述蛋白水解酶的裂解组合物。
在实施方式中,所述裂解混合物以与裂解组合物相同或相近的浓度包含所述裂解组合物的组分(例如允许至多50%,例如至多至40%、至多30%或至多20%或至多10%的偏差)。当提供的固定的生物样品是固体样品例如固定的组织样品时尤其如此。例如,固定的固体生物样品不引起所述裂解组合物中存在的组分的稀释,即所述裂解组合物中存在的化合物的浓度与所述裂解混合物(含有所述固定的固体生物样品)中相同或近似相同。在所述样品是固定的液体生物样品时,所述液体样品稀释了所述裂解组合物的化合物,因此考虑到这种稀释效应,通常在所述裂解组合物中使用更高浓度的化合物。例如,可以在所述裂解组合物中提供更高浓度的化合物和/或可以提供更高体积比率的裂解组合物,以便在步骤(a)的裂解混合物中建立适合的裂解条件。
根据优选实施方式,所述步骤(a)中的裂解组合物具有6.0至9.5、优选地6.5至9.0或7.0至9.0范围内的pH。已发现,相应的pH范围特别适合于根据本公开的方法的裂解步骤(a),正如也在实施例中证实的。在实施方式中,所述pH在例如7.0-8.0的范围内。在其他实施方式中,所述pH在8.0至9.0、例如8.2至8.8的范围内。具体来说,在所述裂解组合物中以及因此在裂解混合物中应用这种碱性pH,与更加酸性的条件相比导致更少的片段化。
根据优选实施方式,所述步骤(a)中的裂解组合物还包含一种或多种、优选地所有下述化合物:
(i)盐;
(ii)去污剂;
(iii)缓冲剂。
在特定实施方式中,所述裂解组合物包含盐、去污剂和缓冲剂。任选地,所述裂解组合物还包含螯合剂例如EDTA。正如在实施例中证实的,已发现所述裂解组合物适合于本公开的方法。下面公开所述裂解组合物的化合物的各个实施方式。
根据优选实施方式,所述裂解组合物包含至少一种反应性化合物,其可以充当甲醛清除剂。具体来说,反应性化合物能够与所述固定剂反应和/或与由所述固定剂引起的交联反应。优选地,在所述步骤(a)的裂解组合物中包含一种或两种反应性化合物。然而,反应性化合物也可以独立地添加到所述裂解混合物,例如以包含所述反应性化合物的溶液或固体的形式。
根据优选实施方式,所述反应性化合物与加热步骤(b)中释放的固定剂或化学组成部分反应,和/或与由所述固定剂诱导的交联、例如由含醛固定剂例如甲醛诱导的交联反应。所述生物样品可以用固定剂例如含醛固定剂如甲醛或甲醛衍生物固定,所述固定剂诱导核酸分子与蛋白质分子之间或蛋白质或核酸分子本身之间的交联。本发明的反应性化合物可以有利地与所述固定剂例如甲醛反应。所述与反应性化合物反应的固定剂或从其衍生的化学组成部分可以在加热步骤(b)期间释放。所述反应性化合物与释放的固定剂反应,这具有从平衡中移除所述释放的固定剂,从而极大地有利于去交联的优点(参见Kawashima等,2014,Clinical Proteomics,2014,Vol.11(4),“从福尔马林固定的石蜡包埋的组织高效提取蛋白质需要较高浓度的三(羟甲基)氨基甲烷”(Efficient extraction ofproteins from formalin-fixed paraffin-embedded tissues requires higherconcentration of tris(hydroxymethyl)aminomethane))。因此,所述反应性化合物起到清除剂的作用,清除所述在去交联步骤(b)中释放的固定剂或从其衍生的化学组成部分。可选地或此外,所述反应性化合物可以与由所述固定剂诱导的交联反应。具体来说,所述反应性化合物可以优选地在步骤(a)和/或步骤(b)中直接分解所述固定的生物样品中包含的固定剂诱导的交联。所述反应性化合物与由所述固定剂诱导的交联的反应优选地在本公开的方法的步骤(b)期间发生。此外,所述反应性化合物可以与在整个可逆交联反应中形成的固定剂诱导的交联反应。例如,含醛固定剂例如甲醛可以导致在两个生物分子例如蛋白质与DNA之间形成缩醛胺基团。所述缩醛胺基团可以在所述生物分子之一的质子化胺基释放下可逆地形成亚胺基。然后所述亚胺基可以与根据本公开的反应性化合物反应,从而与由所述固定剂诱导的交联反应。然后,进一步的转化可以导致在第二生物分子释放下在所述反应性化合物处形成亚胺碱。因此,由所述固定剂诱导的交联被逆转,并且所述固定剂被结合到所述反应性化合物。有利情况下,所述生物分子、特别是核酸被释放。
根据优选实施方式,所述反应性化合物包含亲核基团,优选为胺基。所述反应性化合物可以选自WO 2007/068764 A1中所描述的亲核试剂。已发现,包含亲核基团的反应性化合物特别适合于与在加热步骤(b)中释放的固定剂或化学组成部分和/或与由所述固定剂诱导的交联、特别是由含醛固定剂例如甲醛诱导的交联反应。
根据优选实施方式,所述反应性化合物包含一个或多个伯胺基,任选为一个伯胺基,以及一个或多个羟基,优选为三个羟基。此外,所述反应性化合物可以包含两个伯胺基和任选地一个仲胺基。正如在实施例中证实的,已发现此类反应性化合物特别适合于本发明。具体来说,通过本公开的方法,使用这种反应性化合物,核酸交联被高效地除去,产生特别适合于分析方法例如PCR或NGS的高质量。可以有利地使用的示例性反应性化合物是2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇或其衍生物或亚精胺或其衍生物或其组合。2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇也可被称为三(羟甲基)氨基甲烷或Tris。
根据优选实施方式,所述反应性化合物包含至少两个亲核基团,优选为具有不同亲核强度的亲核基团。在实施例中已发现这种实施方式是有利的,特别是产生具有特别适合于分析方法例如PCR或NGS的高质量的核酸。所述反应性化合物的第一亲核基团可以比第二亲核基团更强。在相应的反应性化合物中,可以存在一种或多种类型的亲核基团。例如,1或2个第一亲核基团和1、2或3个第二亲核基团。根据一个实施方式,所述反应性化合物包含伯胺基作为第一亲核基团和羟基或仲胺基作为第二亲核基团。根据特定实施方式,所述反应性化合物包含伯胺基和羟基,优选地3个羟基。根据另一个实施方式,所述反应性化合物包含伯胺基、优选2个伯胺基,以及仲胺基。根据示例性实施方式,所述反应性化合物选自2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇或其衍生物或亚精胺或其衍生物。
根据一个实施方式,所述反应性化合物包括多胺,优选为天然多胺例如亚精胺。正如在实施例中证实的,发现这种反应性化合物对于改变核酸片段化是有利的,特别是通过增加片段尺寸。
本公开的优选的反应性化合物是2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇,也被称为Tris。Kawashima等,2014描述了Tris通过产生席夫碱、环状半缩醛和环状醛加成物来充当甲醛清除剂。此外,Tris可以作为一种转氨催化剂直接参与交联的分解。此外,Tris具有可以与含醛固定剂例如甲醛形成环状化合物的优点,因此一分子Tris清除一分子含醛固定剂。正如在实施例中证实的,2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇也允许改良核酸片段化,并且还适合于后续的核酸分析方法。例如,使用2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇可以提高PCR和NGS性能。
根据一个实施方式,所述裂解组合物包含超过一种反应性化合物。它可以包含两种反应性化合物,其中任选地所述反应性化合物选自:(i)包含一个或多个伯胺基、优选地1个伯胺基和1、2或3个羟基、优选地3个羟基的反应性化合物,例如2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇,和(ii)包含2个伯胺基和任选地1个仲胺基的反应性化合物,例如亚精胺。
根据一个实施方式,所述裂解混合物包含反应性化合物,其浓度适合于与至少一部分所述固定剂反应,特别是在加热步骤(b)中。根据一个实施方式,所述裂解混合物包含一种或多种反应性化合物,其浓度适合于与至少一部分所述固定剂反应,特别是在加热步骤(b)中。在实施方式中,所述一部分固定剂对应于所述固定的生物样品中存在的至少15%的固定剂,特别是所述固定的生物样品中存在的至少25%、至少35%、至少45%、至少55%、至少65%、至少75%的固定剂。
根据一个实施方式,所述反应性化合物存在于所述裂解组合物和/或裂解混合物中,其在所述裂解组合物和任选地所述裂解混合物中的浓度在1mM至500mM或5-500mM的范围内。
根据一个实施方式,所述裂解混合物和/或裂解组合物包含含有两个伯胺基和优选地一个仲胺基的反应性化合物,例如亚精胺。所述反应性化合物(例如亚精胺)可以以至少0.5mM,例如至少1mM、至少1.5mM或至少2mM的浓度存在。所述浓度可以选自0.25-25mM,例如0.5-20mM、1-15mM、1.25-10mM或1.5-7mM,例如约2.5mM。已发现这种浓度对样品裂解特别有利,产生片段尺寸大的核酸。此外,通过改变所述浓度,可以灵活控制片段尺寸。所述裂解组合物可以包含缓冲剂或也作为缓冲剂的反应性化合物。
根据一个实施方式,所述裂解混合物和/或裂解组合物包含含有一个或多个伯胺基、优选为1个伯胺基和1、2或3个羟基、优选为3个羟基的反应性化合物,例如2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇。在实施方式中,它以至少3mM,例如至少5mM、至少7mM或至少10mM的浓度包含在所述裂解混合物和/或裂解组合物中。适合的浓度可以选自3mM-100mM,特别是5mM-50mM、7mM-30mM、9mM-25mM或优选地10mM-20mM,例如10mM-15mM。这些浓度对样品裂解有利,产生片段尺寸小并且质量高的核酸,特别是用于涉及小片段的扩增的核酸分析方法,例如本文所公开的短扩增子PCR。此外,所述高核酸质量导致NGS性能增强。此类应用也与根据第五方面的方法相结合公开。
根据一个实施方式,所述裂解混合物和/或裂解组合物包含含有一个或多个伯胺基、优选为1个伯胺基和1、2或3个羟基、优选为3个羟基的反应性化合物,例如2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇。在实施方式中,它以至少10mM,例如至少20mM、至少40mM、至少60mM、至少75mM或至少100mM的浓度包含在所述裂解混合物和/或裂解组合物中。所述浓度可以选自10mM-750mM,例如20mM-500mM、30mM-300mM、50mM-250mM或优选地75mM-200mM,例如约100mM至150mM。已发现这种浓度对样品裂解有利,产生质量高的核酸,特别是用于涉及大和/或小片段的扩增的核酸分析方法,特别是本文所公开的大扩增子PCR。它被称为根据第六方面的方法。此外,所述高核酸质量导致NGS性能增强。
根据一个实施方式,所述裂解组合物中包含的反应性化合物另外还是缓冲剂。具体来说,通过这种化合物有利地实现了两种功能,特别是缓冲所述裂解混合物和提供反应性化合物,以与在加热步骤(b)中释放的固定剂或化学组成部分和/或与由所述固定剂诱导的交联、特别是由含醛固定剂例如甲醛诱导的交联反应。这种化合物可以优选地包含一个或多个伯胺基,优选地1个伯胺基,以及1、2或3个羟基,优选为3个羟基,例如2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇。根据一个实施方式,所述裂解混合物和/或裂解组合物包含作为反应性化合物并且也作为缓冲剂的化合物,其浓度选自3-500mM的范围。适合的浓度范围在上文描述。正如本文所公开的,所述反应性化合物的浓度的选择允许控制所述在裂解期间释放的核酸分子的片段尺寸。
任选地,所述裂解组合物包含两种反应性化合物。在这个实施方式中,优选地所述第一反应性化合物选自包含2个伯胺基和优选地1个仲胺基的反应性化合物例如亚精胺,并且所述第二反应性化合物选自包含一个或多个伯胺基、优选地1个伯胺基和1、2或3个羟基、优选地3个羟基的反应性化合物,例如2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇。这些实施方式对样品裂解和获得尺寸增加或片段化更少的核酸特别有利。
根据一个实施方式,所述裂解组合物包含一定浓度的所述反应性化合物,导致在所述裂解混合物中的浓度适合于与至少一部分所述固定剂反应,特别是在加热步骤(b)中。根据一个实施方式,上文公开的所述反应性化合物在裂解混合物中的浓度对应于所述反应性化合物在裂解组合物中的浓度,特别是在所述固定的生物样品是固定的固体生物样品例如固定的组织样品的情况下。根据一个实施方式,所述裂解组合物包含浓度选自0.25-500mM的范围的所述反应性化合物,其中所述固定的生物样品是固定的固体生物样品,特别是固定的组织样品。正如在实施例中证实的,已发现反应性化合物例如2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇和/或亚精胺的这种浓度对所述固定的组织样品的裂解是有利的,特别是通过允许改变核酸尺寸/片段化和获得高质量的核酸,特别是适合于核酸分析方法例如PCR、NGS。
在所述固定的生物样品是固定的液体生物样品的情况下,对所述反应性化合物在所述裂解组合物中的浓度进行调整,以在所述裂解混合物中建立上文公开的浓度。可选地或此外,可以将较高体积比的裂解组合物添加到固定的液体生物样品,以便在所述裂解混合物中建立所述反应性化合物的如上所公开的浓度。根据一个实施方式,所述裂解组合物包含一定浓度的所述反应性化合物,其适合于在所述裂解混合物中以选自0.25-500mM范围的浓度存在,其中所述固定的生物样品是固定的液体生物样品。所述反应性化合物浓度的相应调整完全在专业技术人员的能力之内。
根据一个实施方式,所述裂解组合物和/或裂解混合物具有选自6.0至9.5的范围的pH,并且所述裂解组合物还包含特别是与固定剂反应和/或与由所述固定剂诱导的交联反应的反应性化合物,其中所述反应性化合物包含亲核基团,特别是伯胺基。示例性的反应性试剂是2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇或其衍生物和亚精胺或其衍生物。根据一个实施方式,所述反应性化合物以5-50mM、优选地10-20mM的浓度包含在所述裂解混合物和/或裂解组合物中,并且所述裂解组合物具有6.0至9.5、优选的7.0至8.0范围内的pH。根据另一个实施方式,所述反应性化合物以60-250mM、优选地75-200mM的浓度包含在所述裂解混合物和/或裂解组合物中,并且所述裂解组合物具有7.0至9.5、优选地8.0至9.0范围内的pH。这些实施方式是特别有利的,因为它们允许改进核酸例如DNA从所述固定的生物样品的释放。通过提供中性或微碱性pH和这种反应性化合物,所述固定的生物样品的固定剂通过与所述反应性化合物反应经反应平衡被有利地除去,允许释放与在酸性条件下相比片段化更少的核酸。
根据优选实施方式,所述裂解组合物包含盐。盐支持裂解。所述盐优选地通过裂解组合物提供到所述裂解混合物。所述盐优选地可以是单价或二价盐。优选地,所述盐是离液或非离液盐。根据优选实施方式,所述盐是非缓冲盐。也可以使用盐的混合物。具体的盐可以选自碱金属盐,任选为碱金属卤化物。根据优选实施方式,所述盐是氯化物盐,其任选地选自氯化钠、氯化钾、氯化锂和氯化铯,其中优选地所述盐是氯化钠。正如实施例所证实的,已发现这些盐是适合的。
所述盐在裂解组合物中的浓度取决于从其中释放核酸的固定的生物样品的类型,并且可以由专业技术人员灵活地调整。根据优选实施方式,所述盐以至少15mM、特别是至少30mM、至少50mM、优选地至少100mM的浓度存在于所述裂解组合物和/或裂解混合物中。所述裂解组合物和/或裂解混合物中适合的盐浓度范围可以选自15-500mM,特别是30-440mM、50-300mM或优选地100-250mM,例如约150mM。根据一个实施方式,所述盐以低于500mM,特别是低于400mM、低于300mM或优选地低于250mM,例如低于200mM的浓度存在于所述裂解组合物和/或裂解混合物中。正如在实施例中证实的,发现这些盐浓度对样品裂解有利。例如,通过使用这种盐浓度,使用DNA糖基化酶例如尿嘧啶DNA糖基化酶、优选为尿嘧啶-N-糖基化酶的消化有利地在30min或更短时间、20min或更短时间、15min或更短时间或10min或更短时间内完成。正如上文公开的,在提供固定的固体生物样品时,所述裂解混合物中的盐浓度对应于或约等于裂解组合物中的盐浓度,而固定的液体生物样品稀释所述浓度,使得它在所述裂解混合物中比在裂解组合物中更低。因此,对于固定的液体生物样品来说,可以调整盐浓度以在所述裂解混合物中建立上文公开的浓度,特别是通过在所述裂解组合物中提供更高的盐浓度和/或提供更高体积比的所述裂解组合物。
根据优选实施方式,所述裂解组合物包含去污剂。去污剂支持所述样品的裂解并溶解蛋白质聚集体。所述去污剂优选地通过裂解组合物提供到所述裂解混合物。
根据优选实施方式,所述去污剂是离子型或非离子型去污剂。示例性去污剂为专业技术人员所知。根据一个实施方式,所述去污剂是离子型去污剂,优选为阴离子型去污剂。当所述固定的生物样品是固定的固体生物样品例如固定的组织样品时,这是特别适合的。具体来说,去污剂可以是脂肪醇的硫酸盐或磺酸盐,例如十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠或十二烷基苯磺酸,优选地所述去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。也可以使用去污剂的混合物。
根据优选实施方式,所述去污剂以至少0.01%、至少0.02%、优选地至少0.03%的浓度存在于所述裂解组合物和/或裂解混合物中。去污剂在所述裂解组合物和/或裂解混合物中的适合的浓度范围可以选自0.01-3.0%、0.02-2.75%,优选为0.03-2.5%或0.04%至2.0%。在实施方式中,所述浓度在0.03-1%的范围内。正如上文公开的,当提供固定的固体生物样品时,所述裂解混合物中的去污剂浓度对应于在所述裂解组合物中的浓度,而固定的液体生物样品稀释所述浓度,使得它在所述裂解混合物中比在裂解组合物中更低。因此,对于固定的液体生物样品来说,可以调整去污剂浓度以在所述裂解混合物中建立上文所公开的浓度,特别是通过在所述裂解组合物中提供更高的去污剂浓度和/或提供更高体积比的所述裂解组合物。
根据一个实施方式,所述裂解组合物包含缓冲剂。优选地,所述缓冲剂选自2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇(也被称为Tris)、MOPS、HEPES、磷酸盐和硼酸盐,优选地选自Tris。所述缓冲剂优选地由所述裂解组合物提供给裂解混合物。所述缓冲剂有利地便于维持pH。正如上文公开的,提供适合的pH对根据本公开的方法特别有利,并且适合的pH范围如上所公开。也可以使用缓冲剂的混合物。
根据优选实施方式,所述反应性化合物是缓冲剂,或者所述裂解组合物或裂解混合物包含缓冲剂,任选地其中所述缓冲剂具有5.0至10.5,任选地选自5.5至10.0、6.0至10.0、6.5至10.0、7.0至9.8或7.2至9.8范围内的pKa值。
根据一个实施方式,所述缓冲剂另外还是反应性化合物,其能够与固定剂反应和/或与由所述固定剂诱导的交联反应,任选地它包含亲核基团例如伯胺基。例如,所述缓冲剂可以是2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇或其衍生物。在这种实施方式中,上文为反应性化合物公开的浓度对应于所述缓冲剂的浓度。
根据一个实施方式,所述裂解组合物包含螯合剂。所述螯合剂可以有利地防止核酸酶降解靶核酸例如DNA。根据优选实施方式,所述裂解组合物还包含螯合剂,任选地其中所述螯合剂是氨基多羧酸,优选为乙二胺四乙酸(EDTA)。根据一个实施方式,所述螯合剂适合于螯合二价阳离子。适合的螯合剂包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和N,N-双(羧甲基)甘氨酸(NTA)。根据优选实施方式,使用EDTA。当在本文中使用时,术语“EDTA”尤其是指EDTA化合物例如K2EDTA、K3EDTA或Na2EDTA的EDTA部分。使用螯合剂例如EDTA具有抑制核酸酶例如DNA酶和RNA酶的有利效果。
所述螯合剂可以以0.05mM至5mM例如0.075mM至2mM、0.1mM至1.5mM的浓度用于所述裂解混合物和/或裂解组合物中。所述螯合剂在裂解组合物中的适合浓度可以取决于所应用的样品类型(固定的固体或液体生物样品),并且可以由专业技术人员考虑上文为裂解混合物所公开的浓度容易地发现。
根据一个实施方式,通过添加反应性化合物制备了所述裂解组合物,其中所述反应性化合物选自:
-包含伯胺基和至少一个羟基、优选地3个羟基的反应性化合物,特别是2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇,和/或
-包含至少一个伯胺基、优选地两个伯胺基以及仲胺基的反应性化合物,特别是亚精胺。
这个实施方式对于独立于裂解组合物的其他化合物灵活地改变所述反应性化合物的类型和浓度来说有利。正如在实施例中证实的,通过添加至少一种所述反应性化合物,可以改变核酸尺寸/片段化,以例如优化用于核酸分析方法的核酸。例如,可以提高核酸的片段尺寸,使所述核酸高度适合于本文所公开的大核酸的扩增,例如大扩增子PCR。
根据一个实施方式,所述裂解组合物是水性的,并包含:
-包含伯胺的反应性化合物,优选地它选自2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇和亚精胺或其组合;和
-作为蛋白酶的蛋白水解酶,优选为丝氨酸蛋白酶,更优选为蛋白酶K;
任选地所述裂解组合物还包含
-去污剂,优选为阴离子型去污剂,更优选地所述去污剂是十二烷基硫酸钠;
-盐,优选为单价盐,更优选地所述盐是氯化钠;
-任选的螯合剂,优选为氨基多羧酸,更优选为EDTA。
根据一个实施方式,所述裂解组合物是水性的,并包含:
(i)包含伯胺的反应性化合物,优选为2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇,其中所述反应性化合物以下述浓度包含在所述裂解混合物和/或裂解组合物中:(aa)至少3mM,特别是至少5mM、至少7mM、至少9mM或优选地至少10mM,例如3-100mM,特别是5-50mM、7-30mM、9-25mM或优选地10-20mM;或(bb)至少10mM,特别是至少20mM、至少40mM、至少60mM或优选地至少75mM,例如10-1000mM,特别是20-500mM、40-300mM、60-250mM或优选地75-200mM,例如约100mM至150mM;
或
(ii)包含两个伯胺基和优选地一个仲胺基的反应性化合物,其中所述反应性化合物以下述浓度包含在所述裂解混合物和/或裂解组合物中:至少0.25mM,特别是至少0.5mM、至少1mM、至少1.25mM或优选地至少1.5mM,例如0.25-25mM,特别是0.5-12.5mM、1-10mM、1.25-7.5mM或优选地1.5-5mM,例如约2.5mM;
和
(iii)蛋白酶,任选为丝氨酸蛋白酶,优选为蛋白酶K;
-任选地其中所述裂解组合物还包含:
(iv)去污剂,优选为阴离子型去污剂,更优选地所述去污剂是十二烷基硫酸钠;
(v)盐,优选为单价盐,更优选地所述盐是氯化钠;和/或优选地(vi)螯合剂,优选为氨基多羧酸,更优选为EDTA。
正如实施例中所证实和本文已公开的,发现这种裂解组合物的特点的组合对样品裂解有利。
根据一个实施方式,所述裂解组合物包含反应性化合物,其是2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇,其中所述反应性化合物以5-50mM、优选地10-20mM的浓度包含在所述裂解混合物和/或裂解组合物中;其中所述裂解组合物具有6.0至9.5、优选地7.0至8.0范围内的pH。正如实施例中所证实的,已发现这个实施方式是有利的。具体来说,使用这种裂解组合物得到高质量的核酸,其适合于涉及小核酸的扩增的核酸分析方法。因此,在使用这个实施方式的裂解组合物的一个实施方式中,通过扩增小于500nt的核酸来分析核酸,这可以被称为短扩增子PCR。细节也在本文中别处公开,参见相应的公开内容。
根据一个实施方式,所述裂解组合物包含反应性化合物,其是2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇,其中所述反应性化合物以60-250mM、优选地75-200mM的浓度包含在所述裂解混合物和/或裂解组合物中;任选地其中所述裂解组合物具有7.0至9.5、例如8.0至9.0范围内的pH。正如实施例中证实的,也已发现这个实施方式是高度有利的。具体来说,使用这种裂解组合物获得了高质量的核酸,其适合于涉及小和/或大核酸分子的扩增的核酸分析方法。短和长扩增子PCR的细节在别处公开。
根据一个实施方式,所述裂解组合物包含反应性化合物,其是亚精胺,其中所述反应性化合物以0.5-12.5mM、优选地1.5-5mM的浓度包含在所述裂解混合物和/或裂解组合物中;并且其中所述裂解组合物还包含2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇,其以5-50mM、优选地10-20mM的浓度包含在所述裂解混合物和/或裂解组合物中。正如实施例中所证实的,已发现这个实施方式是高度有利的。具体来说,使用这种裂解组合物获得了高质量的核酸,其尺寸大并显示出较少的片段化。
根据一个实施方式,通过将裂解溶液与所述蛋白水解酶合并来制备所述裂解组合物。任选地,添加其他化合物来制备所述裂解组合物,特别是本文所公开的其他反应性化合物。此外,制备所述裂解组合物还可以包括添加水。
根据一个实施方式,在步骤(a)中与裂解溶液合并的蛋白水解酶通过包含所述蛋白水解酶的溶液来提供。适合的浓度在别处公开。所述蛋白水解酶也可以包含在所述裂解溶液中。
正如本文中公开的,所述裂解组合物可以通过将裂解溶液与所述蛋白水解酶和任选的水或稀释缓冲液合并来制备。
根据一个实施方式,所述裂解溶液包含盐、去污剂和缓冲剂。此外,所述裂解溶液特别地包含反应性化合物。所述化合物的详情已在上文公开,参见所述反应性化合物的公开内容。所述反应性化合物、去污剂和盐的适合的浓度范围在本文中已为所述裂解混合物和裂解组合物公开。所述裂解溶液包含一定浓度的所述反应性化合物、去污剂和盐,所述浓度适合于建立起本文为所述裂解混合物和/或裂解组合物所公开的浓度。
根据优选实施方式,所述裂解溶液包含反应性化合物。反应性化合物在本文中已被公开并参见相应的公开内容。根据特定实施方式,所述裂解溶液包含含有一个或多个伯胺基、任选地1个伯胺基以及一个或多个羟基、优选地3个羟基的反应性化合物。根据特定实施方式,所述裂解溶液包含2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇或其衍生物。
根据特定实施方式,所述反应性化合物以至少5mM、特别是至少10mM、至少20mM或至少30mM的浓度存在于所述裂解溶液中。所述裂解溶液可以包含5-500mM,特别是10-250mM、20-100mM或30-75mM,例如约53mM的反应性化合物。在所述裂解溶液中具有所述浓度的特别适合的反应性化合物是包含一个或多个伯胺基、任选地1个伯胺基以及一个或多个羟基、优选地3个羟基的反应性化合物,例如2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇或其衍生物。根据优选实施方式,所述反应性化合物是缓冲剂。
根据一个实施方式,所述反应性化合物包含两个伯胺基和优选地一个仲胺基,例如亚精胺,任选地其中所述反应性化合物存在于所述裂解溶液中,足以在所述裂解组合物和/或裂解混合物中建立起至少0.25mM,特别是至少0.5mM、至少1mM、至少1.25mM或优选地至少1.5mM的浓度。根据一个实施方式,所述裂解溶液包含本文所公开的反应性化合物,特别是也作为缓冲剂的反应性化合物,任选地其中所述反应性化合物包含一个或多个伯胺基、优选地1个伯胺基,以及1、2或3个羟基,优选地3个羟基,例如2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇,任选地其中所述反应性化合物以至少5mM,特别是至少10mM、至少20mM或至少30mM的浓度存在于所述裂解溶液中。可选地,所述裂解溶液包含所述浓度的缓冲剂,其中所述缓冲剂不是反应性化合物。包含两个伯胺基和优选地一个仲胺基的其他反应性化合物可以被添加到所述裂解组合物或包含在所述裂解溶液中,任选地其中这种反应性化合物存在于所述裂解溶液中,足以在所述裂解组合物和/或裂解混合物中建立起至少0.25mM,特别是至少0.5mM、至少1mM、至少1.25mM或优选地至少1.5mM的浓度。正如在实施例中所证实的,已发现上文所公开的浓度的包含两个伯胺基和优选地一个仲胺基的反应性化合物对于裂解所述固定的生物样品和获得大片段尺寸的核酸来说是有利的。
根据优选实施方式,所述裂解溶液包含盐,特别是本文所公开的盐。具体来说,所述盐可以是氯化物盐,例如氯化钠、氯化钾、氯化锂和氯化铯,优选为氯化钠。根据一个实施方式,所述盐以至少50mM,例如至少75mM、至少100mM、至少200mM、至少300mM或至少500mM的浓度存在于所述裂解溶液中。根据一个实施方式,所述裂解溶液包含75-2000mM,特别是100-1500mM、200-1200mM、300-1000mM或400-800mM,例如约500至700mM的盐。与所述盐相关的优点已在上文公开,并在此引用相应的公开内容。
根据优选实施方式,所述裂解溶液包含去污剂,特别是本文所公开的去污剂。具体来说,所述去污剂可以选自非离子型和离子型去污剂,优选为阴离子型。具体来说,所述去污剂可以是阴离子型去污剂,例如脂肪醇的硫酸盐或磺酸盐,例如十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠或十二烷基苯磺酸,优选为十二烷基硫酸钠。根据一个实施方式,所述去污剂在所述裂解溶液中具有至少0.01%,特别是至少0.03%、至少0.05%、至少0.07%或至少0.1%的浓度。根据一个实施方式,所述裂解溶液包含0.01-3%,特别是0.03-2.5%、0.05-2%、0.07-1%或至少0.1-0.5%的去污剂。与所述去污剂相关的优点已在上文公开,并在此引用相应的公开内容。
根据特定实施方式,所述裂解溶液包含:
-浓度为至少5mM,特别是至少10mM、至少20mM或至少30mM,例如5-500mM,特别是10-250mM、20-100mM或30-75mM例如约53mM的反应性化合物,特别是包含一个或多个伯胺基、任选地1个伯胺基和一个或多个羟基、优选地3个羟基的反应性化合物,例如2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇或其衍生物;
-浓度为至少50mM,任选地至少75mM、至少100mM、至少200mM、至少300mM或至少400mM,例如75-2000mM,特别是100-1500mM、200-1200mM、300-1000mM或400-800mM,例如约600mM的盐,任选地其中所述盐是氯化物盐,例如氯化钠、氯化钾、氯化锂和氯化铯,优选为氯化钠;和
-在所述裂解溶液中浓度为至少0.01%,特别是至少0.03%、至少0.05%、至少0.07%或至少0.1%,例如0.01-4%,特别是0.03-3%、0.05-2%、0.07-1%或至少0.1-0.5%,例如约0.2%的去污剂,任选为阴离子型去污剂,例如脂肪醇的硫酸盐或磺酸盐,例如十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠或十二烷基苯磺酸,优选为十二烷基硫酸钠。
正如在其中应用了相应裂解溶液的实施例中已证实的,这种实施方式对所述固定的生物样品的裂解有利。
任选地,所述裂解溶液还包含螯合剂。根据一个实施方式,所述裂解溶液还包含螯合剂,特别是EDTA,其中在所述裂解溶液中所述螯合剂具有至少0.25mM,特别是至少0.5mM、至少1mM或至少1.5mM的浓度。根据一个实施方式,所述螯合剂在所述裂解溶液中具有0.25-25mM,特别是0.5-15mM、1-10mM或1.5-5mM,例如2.7mM的浓度。正如本文所公开的,所述螯合剂有利地支持核酸酶例如DNA酶的失活。
步骤(b)
步骤(b)包括加热裂解的样品以逆转交联。
进行加热步骤(b)是有利的,因为它允许逆转由固定剂诱导的交联,例如甲醛诱导的交联。这些交联通常存在于蛋白质本身、蛋白质与核酸以及核酸本身之间。所述交联逆转反应是温度依赖性的,并且高温引起更快的逆转反应(参见Kennedy-Darling等,Anal.Chem.,2014,Vol.86(12),pp:5678-5681,“测量甲醛蛋白质-DNA交联逆转速率”(Measuring the Formaldehyde Protein–DNA Cross-Link Reversal Rate))。至少80℃的温度特别适合于逆转由大量固定剂例如甲醛诱导的交联。此外,本领域中描述了在蛋白水解消化步骤后加热可以除去在步骤(a)的蛋白水解消化后剩余的核酸的化学修饰。例如,描述了在蛋白水解消化步骤后可能存在的核碱基的羟甲基基团,可以通过升高温度来去除(参见例如Masuda等,Nucleic Acid Research,1999,Vol.27(22),pp:4436-4443;“来自于福尔马林固定的样品的RNA的化学修饰的分析和此类样品的分子生物学应用的优化”(Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples andoptimization of molecular biology applications for such samples)。
加热步骤(b)也可用于失活存在于所述裂解混合物中的蛋白水解酶。在希望在步骤(b)与步骤(c)之间进行一个或多个不同于蛋白水解酶消化步骤的酶处理的情况下,在加热步骤(b)中失活所述蛋白水解酶可能是有利的。在一个实施方式中,加热步骤(b)失活存在于所述裂解混合物中的蛋白水解酶。在本领域中为不同蛋白酶描述了适合的失活条件例如最低失活温度和温育时间,因此可以被专业技术人员容易地获得。
在本领域中也描述了适合于逆转固定剂诱导的交联的温育温度和温育时间。根据一个实施方式,步骤(b)包括将所述裂解的样品加热到至少80℃、例如至少85℃或至少90℃的温度。根据一个实施方式,步骤(b)包括将所述裂解的样品加热至少15min、至少20min或至少25min,以便逆转交联。在优选实施方式中,步骤(b)包括将所述裂解的样品加热至少30min、至少45min或至少50min。根据一个实施方式,步骤(b)包括将所述裂解的样品在适合于逆转由固定剂诱导的交联的温度下加热至多120min,任选地至多100min。在实施方式中,步骤(b)包括加热至多80min或至多70min。
根据优选实施方式,将所述裂解的样品在80-120℃、例如80℃至110℃或85-100℃范围内的温度下加热30-120min,例如45-90min或50-70min。因此,步骤(b)可以包括将所述裂解的样品在80-110℃、例如85-100℃范围内的温度下加热30-120min。此外,步骤(b)可以包括将所述裂解的样品在80-110℃、例如85-100℃范围内的温度下加热45-90min。此外,步骤(b)可以包括将所述裂解的样品在80-110℃、例如85-100℃范围内的温度下加热50-70min。
在实施方式中,在步骤(b)完成后,至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的一开始存在于所述固定的生物样品中的固定剂诱导的交联被逆转。
正如本文中所公开的,任选地可以在所述步骤之间进行一个或多个另外的处理步骤,并且在优选实施方式中在步骤(b)与步骤(c)之间进行。
步骤(c)
步骤(c)包括添加蛋白水解酶并进行蛋白水解消化。因此,根据所述第一方面的方法包括在去交联步骤(b)后进行至少一个另外的蛋白水解消化步骤。因此,所述方法包括首先裂解所述固定的生物样品,其中裂解涉及用蛋白水解酶消化(步骤(a)),然后加热裂解的样品以逆转交联(步骤(b)),然后添加蛋白水解酶并进行蛋白水解消化(步骤(c))。发现这种步骤的顺序在裂解所述固定的生物样品以高产率释放高质量核酸方面特别有效。正如本文中所公开的,在步骤(b)与(c)之间可以任选地进行一个或多个另外的处理步骤。
正如实施例所证实的,进行步骤(c)显著改进了在整个裂解程序中核酸的释放。释放的核酸例如DNA和(或RNA)具有高质量,并且在纯化后特别适合于扩增反应。令人吃惊的是,在步骤(c)中进行额外的蛋白水解消化提高了核酸产量,正如在实施例中基于DNA所证实的。不希望受到理论限制,假定在所述固定的生物样品中产生的交联(例如由甲醛或其他基于醛的固定剂引起的)可以导致蛋白质与核酸的特别持久的结合或可能屏蔽蛋白质以免于步骤(a)中进行的蛋白水解消化的空间效应。在逆转交联的加热步骤(b)后,这些结合被充分减弱,使得在步骤(c)中进行的所述额外的蛋白水解消化步骤能够有效除去它们。正如在实施例中所示,进行步骤(c)令人吃惊地提高产量,并且此外允许释放并由此获得平均尺寸更长的核酸例如DNA。这种质量提高对于释放的核酸的后续分析是有益的,因为它也导致更好的PCR结果,特别是使用大扩增子(500bp)时。实施例的结果表明,当在去交联步骤(b)后进行所述额外的蛋白水解消化步骤(c)时,使得更大量的以前不可接近的长DNA链可以被后续的PCR反应接近。这些在实施例中证实的在DNA产量和可接近性方面的改进,也导致所述释放的DNA在下游分析过程例如扩增和测序中的性能提高。由于步骤(a)、(b)和(c)的顺序进行而通过根据第一方面的方法实现的交联和蛋白质的高效去除是高度有利的,并且也导致NGS性能提高。
因此,根据所述第一方面的方法所教导的进行步骤(c),引起释放的核酸例如特别是DNA的质量和产量的重要且惊人的提高。
在步骤(c)中使用的蛋白水解酶优选为蛋白酶,例如蛋白酶K。可以在步骤(c)中使用的适合的蛋白酶已经与步骤(a)相结合公开了,并参见也适用于此的相应公开内容。根据一个实施方式,步骤(c)包括添加适合于降解与所述核酸结合的蛋白质和/或肽和/或降解由所述固定剂诱导的交联、特别是所述核酸与蛋白质或肽之间的交联的蛋白水解酶。根据一个实施方式,所添加的蛋白水解酶是蛋白酶。本文已公开了适合于步骤(a)的蛋白酶,并且同样的蛋白酶可用于步骤(c)中。如上所述,在步骤(c)中优选地添加丝氨酸蛋白酶,特别是蛋白酶K。
本公开的方法的步骤(c)中的蛋白水解消化优选地在适合于通过所述蛋白水解酶降解蛋白质和肽的温度下进行。优选地,步骤(c)包括加热所述裂解的样品以帮助所述蛋白水解酶消化。在实施方式中,步骤(c)中的加热在35-75℃、例如40-70℃或50-70℃范围内的温度下进行。在实施方式中,所述温度在55-68℃的范围内,例如60℃或65℃。正如本领域中已知的,所使用的加热装置的加热温度也可以被设定到更高温度,其中在加热过程(升温)中在蛋白水解反应混合物中达到优选的温育温度,从而在随后最终在所述蛋白水解反应混合物中达到更高温度之前协助所述蛋白水解酶消化。然后这种更高的温度也可以失活所述蛋白水解酶,因为在所述加热过程中在达到该失活温度之前蛋白水解消化已完成。
为了在步骤(c)中允许高效的蛋白水解消化,可以将所述裂解的样品在所述蛋白水解酶存在下温育。温育优选地进行至少5min,例如至少10min或至少15min。正如本文中公开的,用于所述蛋白水解消化的温育可以在35-75℃之间的高温下进行。在温育期间可以对所述样品进行搅拌。根据一个实施方式,步骤(c)包括在至少35℃,例如至少40℃、至少45℃、至少50℃或至少55℃的温度下加热至少5min。搅拌可以通过任何方法例如摇动、滚动、倒置等进行。
根据一个实施方式,步骤(c)包括将所述裂解组合物加热到选自45℃至75℃、例如50℃至75℃或55℃至70℃范围内的温度5-60min,例如10-45min、10-30min或10-25min。根据一个实施方式,步骤(c)在30min或更短时间、任选地20min或更短时间内完成。正如实施例所证实的,短的温育时间例如15min(例如65℃)在步骤(c)中是可行的,并允许包含在所述固定的生物样品中的核酸的产量和质量的显著提高。此外,这种短的温育时间能够快速完成步骤(c),总体支持了所述第一方面的方法不仅高度有效而且快速。
根据一个实施方式,所述步骤(c)中用于蛋白水解消化的温育以及因此进行步骤(c)的时间长度短于所述步骤(a)中的温育以及因此进行步骤(a)的时间长度。此外,在步骤(c)中用于帮助蛋白水解消化的温度可能比步骤(a)中更高。
在步骤(c)的蛋白水解反应混合物中添加的蛋白水解酶的量和所述蛋白水解酶的浓度可以由本领域技术人员确定和选择。在一个实施方式中,所述蛋白水解反应混合物中所述蛋白水解酶的浓度为至少0.5mg/mL,优选为至少1mg/mL。适合的浓度范围包括但不限于0.5-10mg/mL、0.75-7.5mg/mL、1-5mg/mL或1至3mg/ml。此类浓度已在实施例中应用。根据一个实施方式,所述蛋白水解酶在步骤(c)中以溶液的形式添加。所述溶液可以包含浓度为1mg/mL直至溶解度极限,例如浓度为5-40mg/mL、7.5-35mg/mL或10-30mg/mL,例如20mg/mL的蛋白水解酶。
实施例显示步骤(c)有利地支持所述固定的生物样品的裂解。具体来说,以更高的产量和更高的质量获得核酸,它们高度适合于核酸分析方法例如本文所公开的PCR或NGS。
步骤(b)与步骤(c)之间的任选的另外的处理步骤
任选地,在步骤(b)与(c)之间可以进行一个或多个另外的处理步骤。可以进行所述另外的处理步骤以进一步改进所述方法,例如以便除去不想要的分子。非限制性实例是在DNA是感兴趣的靶核酸的情况下除去RNA(例如通过进行RNA酶消化)或在RNA是感兴趣的靶核酸的情况下除去DNA(例如通过进行DNA酶消化)。此外,可以进行脂肪酶处理。这在例如处理脂肪生物样品的情况下可能是有利的。此外,可以进行处理步骤以除去因生物样品的固定而存在的假象例如尿嘧啶核碱基。这允许提供特别适合于扩增和测序的核酸例如DNA。
根据一个实施方式,所述根据第一方面的方法包括在步骤(b)与步骤(c)之间进行不同于蛋白水解消化步骤的至少一个酶处理步骤。根据一个实施方式,所述至少一个酶处理步骤涉及使用糖基化酶、核酸酶、脂肪酶中的一者或多者或上述酶的组合。
根据一个实施方式,所述至少一个酶处理步骤涉及使用DNA糖基化酶例如尿嘧啶DNA糖基化酶。如果进行这样的步骤,优选地在步骤(b)与步骤(c)之间进行尿嘧啶-N-糖基化酶处理。根据一个实施方式,所述方法包括通过向所述裂解的样品添加糖基化酶并加热来进行酶处理步骤。使用糖基化酶例如尿嘧啶糖基化酶具有重要优点。固定的生物样品例如福尔马林固定且石蜡包埋的(FFPE)组织样品可以在DNA中具有不可重复的序列假象。特别地,已报告了C:G>T:A碱基替换作为从固定的生物样品回收的DNA中的主要类型的序列假象。这是基于胞嘧啶脱氨成尿嘧啶和后续的PCR扩增,导致C:G>T:A碱基替换(参见例如Do等,Oncotarget,2012,Vol.3(5):pp.546-558,“通过用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理显著减少来自于从福尔马林固定的癌活检组织分离的DNA的序列假象”(Dramatic reduction ofsequence artifacts from DNA isolated from formalin-fixed cancer biopsies bytreatment with uracil-DNA glycosylase))。这可以通过在步骤(b)之后和步骤(c)之前用DNA糖基化酶、特别是尿嘧啶-DNA糖基化酶处理所述裂解的样品来有利地避免。所述酶除去假的尿嘧啶,导致形成脱碱基位点。这进而可以诱导链的断裂和/或在随后的聚合步骤中阻断DNA聚合酶。结果,消除了可能的假象(C:G>T:A碱基替换)。这允许提高释放的DNA的质量,以用于后续的测序应用。根据一个实施方式,所述糖基化酶处理在有助于糖基化酶活性的高温下进行。适合的是例如45-55℃范围内的温度,例如50℃。在实施方式中,所述糖基化酶处理步骤在30min或更短时间、20min或更短时间、15min或更短时间或10min或更短时间内完成,任选地其中所述糖基化酶是尿嘧啶-N-糖基化酶。
根据一个实施方式,当进行所述酶处理步骤时,所述样品包含适合于进行所述酶处理步骤的盐浓度,特别是包含糖基化酶、优选为DNA糖基化酶、更优选为尿嘧啶DNA糖基化酶例如尿嘧啶-N-糖基化酶;和/或核酸酶,优选为核糖核酸酶,更优选为核糖核酸酶A的酶处理步骤。
根据一个实施方式,所述方法包括在进行所述至少一个酶处理步骤之前稀释裂解和去交联的样品。所述样品可以例如通过添加水或其他稀释溶液来稀释。稀释对于调整适合于在步骤(b)与步骤(c)之间进行至少一种酶处理的条件来说可能是有利的。例如,稀释可能对建立起适合于进行所需酶处理步骤的盐浓度来说是有利的。在一个实施方式中,所述为进行酶处理步骤而产生的酶处理混合物中的盐浓度为≤500mM,例如≤300mM或≤250mM。在实施方式中,所述盐浓度为≤200mM、≤150mM或≤100mM。任选地通过裂解和交联的样品的稀释所实现的调整足够低的盐浓度,确保了所述酶处理不受所述盐的负面影响。适合的盐浓度取决于所打算的酶处理,并且可以由专业技术人员确定。例如,已发现在所述酶处理混合物中提供例如低于150mM或低于100mM的低盐浓度特别适合于使用尿嘧啶DNA糖基化酶的酶处理。具体来说,发现这些低盐条件允许减少处理时间。例如,所述处理时间可以减少到少于30min,例如少于25min、少于20min,优选地少于15min或少于10min。适合的时间长度包括2-25min、2-20min、3-15min和5-10min。正如实施例所证实的,尿嘧啶-N-糖基化酶消化可以在5min内完成。这是有利的,因为所述方法可以更快地进行,允许更高的样品通量。
根据一个实施方式,在步骤(b)与步骤(c)之间进行至少一个核酸酶处理步骤,任选地其中所述核酸酶是核糖核酸酶,例如核糖核酸酶A。核糖核酸酶的使用允许降解RNA,从而允许提供不含RNA污染的释放的DNA。
根据一个实施方式,进行至少一个,优选地两个下述酶处理步骤:
-向所述样品添加糖基化酶,优选为DNA糖基化酶,更优选为尿嘧啶DNA糖基化酶;和/或
-向所述样品添加核酸酶,任选地其中所述核酸酶是核糖核酸酶,例如核糖核酸酶A。
根据第二方面的方法
根据本发明的第二方面,提供了一种用于从固定的生物样品获得纯化的核酸的方法,所述方法包括根据第一方面的裂解方法的步骤(a)至(c)裂解所述固定的生物样品,其中所述方法在所述第一方面的方法的步骤(c)之后包括
(d)从所述裂解的样品纯化核酸。
正如本文公开的,根据某些实施方式,所述根据第一方面的方法包括在步骤(b)与(c)之间进行一个或多个另外的处理步骤,例如核酸酶消化步骤和/或尿嘧啶-N-糖基化酶处理。
所述根据第二方面的方法有利地从固定的生物样品提供纯化的核酸,其中所述核酸具有高产量和质量。纯化的核酸的高质量和产量是有利的,因为它改进了所分离的核酸的后续分析,例如所述纯化的核酸的扩增和/或测序。测序可以通过下一代测序来进行。正如在实施例中证实的,所述根据第二方面的方法提供了特别适合于下一代测序应用的纯核酸。正如本文公开的,所述方法可以被调整以控制纯化的核酸的尺寸。这可以如本文所述通过选择在步骤(a)中使用的裂解缓冲液来实现。由此,可以调整并控制片段化程度。这允许提供为短或长PCR系统优化的核酸。所述核酸可以是DNA或RNA,并且在某些实施方式中,所述核酸是DNA分子。
步骤(a)、(b)和(c)以及步骤(b)与步骤(c)之间的一个或多个任选的处理步骤的特点已在上文结合根据第一方面的方法进行了公开,应该指出相应的公开内容也适用于所述根据第二方面的方法。
在一个实施方式中,在步骤(c)与步骤(d)之间进行至少一个中间处理步骤。在另一个实施方式中,在步骤(c)与步骤(d)之间不进行另外的处理步骤。
步骤(d)
所述根据第二方面的方法包括步骤(d)从所述裂解的样品纯化核酸。在步骤(d)中,可以使用任何适合的纯化方法,因为所述根据第一方面的裂解方法使得所述裂解混合物中的核酸可接近。用于从裂解的样品纯化核酸的适合的技术在本领域中是已知的,因此不需任何详细描述。在步骤(d)中可以使用可商购的纯化试剂盒。
根据优选实施方式,步骤(d)包括
-将包含在所述裂解的样品中的核酸结合到固相,
-任选地清洗结合到固相的核酸;和
-从所述固相洗脱所述核酸。
根据一个实施方式,步骤(d)包括将所述包含释放的核酸的裂解的样品(在步骤(c)后获得的)与结合组合物(例如结合缓冲液)接触,以便为所述靶核酸与固相的结合建立结合条件。所述得到的建立起适合的结合条件的混合物在本文中也被称为结合混合物。根据一个实施方式,所述结合组合物包含离液剂例如离液盐。利用离液剂/离液盐以便促进靶核酸与固相的结合的纯化方法在本领域中是公知的,因此不需要详细描述。离液盐包括但不限于包括胍、碘化物、高氯酸盐和硫氰酸盐的盐,并且所述离液盐可以选自盐酸胍、硫氰酸胍(GTC)、异硫氰酸胍(GITC)、硫氰酸钠、碘化钠、高氯酸钠、三氯乙酸钠、三氟乙酸钠。此外,所述结合组合物和/或结合混合物可以包含尿素和/或非离液盐。此外,所述结合组合物和/或结合混合物可以包含去污剂(例如离子型或非离子型去污剂);并任选地包含脂族醇,例如优选地包含1-5或2-3个碳原子的烷醇。乙醇或异丙醇被常用作用于核酸纯化的醇,以促进与固相的结合。然后可以将所述核酸和结合组合物的混合物施加到固相,或者可以将固相添加到所述混合物。所述固相可以具有二氧化硅表面。所述固相可以包含用于与靶核酸结合的未改性的含硅表面。当在本文中使用时,术语“二氧化硅表面”包括包含二氧化硅和/或其他硅氧化物、硅藻土、玻璃、硅胶、沸石、膨润土、烷基二氧化硅、硅酸铝和硼硅酸盐或由其组成的表面。可以与本发明相结合使用的示例性固相包括但不限于包含未改性二氧化硅表面的固相,包括但不限于二氧化硅粒子、二氧化硅纤维、玻璃材料例如玻璃粉、玻璃纤维、玻璃粒子或可控孔玻璃、二氧化硅、玻璃或颗粒形式的二氧化硅例如粉末、珠子或熔块。根据本公开,优选地使用基于柱的固相或使用粒子、特别是磁性粒子。根据一个实施方式,所述固相被包含在柱中。所述柱优选地包含具有未改性的含硅表面的固相,所述表面用于核酸结合,特别是用于DNA结合。
可以在步骤(d)中使用的其他核酸纯化技术涉及靶核酸与具有阴离子交换表面的固相的结合。同样地,所述固相可以以柱或珠子的形式提供。此类方法在本领域中是已知的,因此不需详细描述。
可以将所述带有结合的核酸的固相与剩余的样品分开,并且可以清洗所述结合的核酸。此外,可以将所述核酸洗脱。洗脱溶液对于专业技术人员来说是公知的,并且不需在此进一步定义。
在步骤(d)中也可以使用其他核酸纯化方法,例如基于沉淀的纯化方法。此类方法在本领域中是已知的,并且可以涉及醇类的使用。
然后可以对按照根据本公开的第二方面的方法获得的靶核酸进一步处理,并例如用于本文所公开的核酸分析方法。正如本文所公开的,所述基于根据第一方面的裂解方法的根据第二方面的方法提供了从固定的生物样品例如FFPE组织提取的靶核酸的产量和质量的提高。正如实施例所示,所提供的纯化的核酸与现有技术方法相比更好地适合于后续PCR和NGS分析。
所述靶核酸可以是DNA和/或RNA。在一个实施方式中,所述被结合的靶核酸包含DNA或基本上由DNA组成。正如本文所公开的,所述根据第二方面的方法提供了
根据第一和第二方面的方法的其他实施方式
核酸
“核酸”可以是DNA和/或RNA。因此,DNA和RNA可以在所述根据第一方面的方法中从所述固定的生物样品释放,或在所述根据第二方面的方法中纯化。此外,所述核酸可以是DNA或RNA。正如本文中公开的,通过进行核酸酶处理(例如在所述根据第一方面的方法期间)以便破坏非靶核酸,可以主要获得DNA(或RNA),和/或可以在所述根据第二方面的方法的步骤(d)进行靶核酸选择性纯化。这允许获得没有或具有少量非靶(例如RNA)污染的靶核酸(例如DNA)。
根据优选实施方式,所述核酸包含DNA或基本上由DNA组成。正如在实施例中证实的,DNA可以非常高效地从所述固定的生物样品释放并随后被纯化。
固定的生物样品
术语“固定的生物样品”具体来说是指已用固定剂保存的任何生物材料。所述固定的生物样品包含由所述固定引起的核酸分子与蛋白质分子之间的交联。所使用的固定剂是交联固定剂。此类固定的生物样品包括但不限于甲醛固定的组织或器官、储存在液体细胞学保存介质中的组织样品和储存在液体细胞学保存材料中的固定的含细胞样品(例如宫颈或妇科拭子或含细胞体液)。
在一个实施方式中,所述用于固定生物样品的交联固定剂是含醛固定剂,例如甲醛和/或聚甲醛。交联固定剂包括但不限于醛类化合物(例如甲醛、聚甲醛和戊二醛)、四氧化锇、重铬酸钾、铬酸和高锰酸钾。在这个实施方式中还包括已知随时间流逝释放交联化合物例如甲醛的固定剂。甲醛是公知的交联反应分子,其通过例如经亚甲基桥交联氨基来固定生物样品。根据一个实施方式,所述生物样品使用甲醛和/或聚甲醛来固定。正如本领域中已知的,甲醛可用作固体和液体生物样品的固定剂。
根据优选实施方式,所述固定的生物样品是固定的固体生物样品,特别是固定的组织样品。示例性的固定的固体生物样品包括但不限于组织,包括但不限于肝、脾、肾、肺、肠、胸腺、结肠、扁桃体、睾丸、皮肤、脑、心脏、肌肉和胰腺组织。此外,固定的生物样品可以是固定的含细胞样品,例如含细胞体液和源自于它们的样品、吸出物、细胞培养物、细菌、微生物、病毒、植物、真菌、活检样品、骨髓样品、拭子样品、粪便、皮肤碎片和生物体。
根据一个实施方式,所述固定的生物样品是固定的组织样品,其中所述组织样品是动物组织,优选为哺乳动物组织样品,特别是人类组织样品。所述组织可以通过尸检、活检或手术获得。
根据优选实施方式,所述固定的生物样品是固定的液体生物样品。示例性的固定的液体生物样品包括但不限于固定的体液样品例如血液、血清、血浆、尿液、唾液、泪液、汗液、粪便、粘液、乳汁、骨髓和脑脊液。
在一个实施方式中,所述固定的生物样品是在液体细胞学保存介质中的生物样品。所述液体细胞学保存介质包含交联固定剂,例如含醛固定剂如甲醛。尽管所述液体细胞学保存介质可用于细胞学目的,但它可能抑制核酸从所述固定的生物样品的高效分离。在液体细胞学保存介质中常用的示例性含醛固定剂包括但不限于甲醛、乙二醛、戊二醛、甘油醛、丙烯醛或其他脂族醛类。一种常用的包含固定剂的液体细胞学保存介质是其是在临床背景中最常用的保存介质之一(例如用于保存拭子)。介质具有接近37%的甲醛含量,并且也含有甲醇、乙醇和异丙醇。所述高甲醛含量使它成为有用的固定剂,但对随后从这种固定的生物样品提取靶核酸例如DNA和将它们用于后续分析提出了挑战。根据本发明的方法可以有利地用于此类困难的固定样品。根据一个实施方式,所述固定的液体生物样品是中的生物样品。
在一个实施方式中,所述固定的生物样品是固体含细胞生物样品。所述固定的生物样品可以被包埋在非反应性包埋物质例如石蜡中。根据一个实施方式,所述固定的生物样品被包埋在包埋材料例如石蜡中。根据一个实施方式,所述固定的生物样品是已使用交联固定剂(例如甲醛)固定并包埋在包埋材料、优选为石蜡中的固定的组织样品(例如FFPE样品)。正如本领域中公开的,包埋材料包括但不限于石蜡、矿物油、非水溶性蜡、火棉胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、琼脂、明胶或其他介质。
根据特定实施方式,所述固定的生物样品是FFPE样品。
当处理已被包埋在包埋材料例如石蜡中的固定的样品时,在本公开的范围内包括在步骤(a)之前除去所述包埋材料的步骤。根据一个实施方式,在接触步骤(a)之前对所述固定的生物样品进行处理,以便从所述固定的生物样品除去任何包埋材料(例如石蜡)。从所述生物样品除去包埋材料(例如石蜡)可以通过本领域中已知的用于生物样品脱石蜡的任何方法来进行。例如,这可以通过将所述样品与疏水性有机溶剂例如二甲苯接触来实现,以便溶出包埋材料例如石蜡。适合的脱石蜡方法被描述在例如WO 2012/085261、WO 2011/104027、WO 2011/157683和WO 2007/068764以及GeneReadTM DNA FFPE手册(QIAGEN,2014年3月)和DNA FFPE组织手册(QIAGEN,2012年6月)中,使用QIAGEN补充方案“使用DNA FFPE组织试剂盒和脱石蜡溶液从FFPE组织纯化基因组DNA”(Purificationof genomic DNA from FFPE tissue using theDNA FFPE Tissue Kit andDeparaffinization Solution)。
核酸分析
根据优选实施方式,所述根据第二方面的方法包括
(e)分析所纯化的核酸。
所述核酸分析方法可以是可用于分析核酸以便例如扩增、鉴定、检测和/或定量核酸的任何化学和/或生物技术方法。优选地,所述核酸分析方法包括允许检测富集的核酸中包含的核酸的存在、不存在和/或量的检测反应。优选地,所述步骤(e)包括至少一个靶核酸的扩增。相应的分析方法在现有技术中是公知的,并且也常用于医学、诊断和/或预后领域,以便分析包含或疑似包含在所述纯化的核酸中的核酸或特定核酸。
根据优选实施方式,将所述在步骤(d)中获得的纯化的核酸用于包含扩增的核酸分析方法中。这种方法优选地涉及酶扩增,例如基于聚合酶的扩增。在特定实施方式中,进行聚合酶链(PCR)反应以扩增所述富集的核酸。
根据特定实施方式,所述方法还包括使用大扩增子PCR和/或短扩增子PCR来扩增核酸。根据一个实施方式,所述大扩增子PCR用于尺寸为至少500bp的核酸分子。所述短扩增子PCR用于尺寸小于500bp,例如优选地≤300bp、≤200bp或≤150的核酸分子。在实施方式中,所述短扩增子PCR小于100bp。
在实施方式中,将包含至少10mM,特别是至少20mM、至少40mM、至少60mM或优选地至少75mM的反应性化合物,任选为包含伯胺的反应性化合物,优选为2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇的裂解组合物用于大扩增子PCR。正如本文所公开的,提供包含至少3mM,特别是至少5mM、至少7mM、至少9mM或优选地至少10mM的反应性化合物,任选为包含伯胺的反应性化合物,优选为2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇的裂解组合物用于短扩增子PCR,可能是特别有利的。因此,通过选择裂解组合物的适合的条件,特别是通过选择适合的反应性化合物和反应性化合物浓度,可以调整所得到的核酸以适合于某些核酸分析方法。详细情况在本文中别处描述。
根据一个实施方式,所述方法还包括分析所述核酸,其中分析包括执行下一代测序方法。下一代测序有利地允许以高通量形式确定核酸的序列。然而,来自于固定的生物样品的核酸通常伴有在下一代测序中有害的假象。本发明的方法有利地提供了高质量核酸,其正如实施例所证实的特别适合于下一代测序。在实施方式中,根据本公开进行下一代测序可以涉及:i.将独特分子标识符序列附连到所述核酸,其中每个核酸分子包含不同的独特分子标识符序列;ii.扩增带有附连的独特分子标识符序列的核酸;以及iii.对所述核酸进行测序。这种方法有利地允许对得到的每个独特分子标识符序列的读出值低,特别是低于20,例如低于15、低于12、优选为10或更低的核酸进行测序。
其他适合的核酸分析方法可以选自或涉及下述一者或多者:扩增反应,聚合酶链反应(PCR),等温扩增,反转录聚合酶链反应(RT-PCR),反转录扩增,实时定量聚合酶链反应(qPCR),DNA或RNA测序,反转录,LAMP(环介导等温扩增)、RPA(重组酶聚合酶扩增)、tHDA(解旋酶依赖性扩增)、NEAR(切口酶扩增反应)和其他类型的扩增。
根据第三方面的用途
本发明的第三方面涉及蛋白水解酶、优选为蛋白酶例如蛋白酶K的用途,其用于在裂解固定的生物样品后进行蛋白水解消化,所述样品包含由固定引起的核酸分子与蛋白质分子之间的交联,其中所述先前的裂解涉及用蛋白水解酶消化并加热裂解的样品以逆转交联,优选地用于根据本发明的第一或第二方面的方法中。所述根据第一和第二方面的方法的详细情况也公开在提及它的权利要求1至22中。
根据优选实施方式,所述蛋白水解酶是蛋白酶,特别是丝氨酸蛋白酶例如蛋白酶K。适合的蛋白水解酶和消化条件已在上文结合第一方面的方法,特别是结合提及它的步骤(a)和步骤(c)进行了公开,所述公开内容也适用于这里。此外,用于逆转交联的适合的加热条件和实施方式已在上文结合根据第一方面的方法,特别是结合步骤(b)进行了公开。参见也适用于这里的相应的公开内容。
根据第四方面的用途
第四方面涉及糖基化酶、优选为DNA糖基化酶、更优选为尿嘧啶DNA糖基化酶例如尿嘧啶-N-糖基化酶用于进行酶处理的用途,其中所述酶处理在30min或更短时间、20min或更短时间、15min或更短时间或10min或更短时间内完成。优选地,此类用途是在根据本发明的第一或第二方面的方法中,更优选地在步骤(b)与步骤(c)之间。
正如本文所公开的,这种糖基化酶处理允许除去由生物样品的固定引起(例如由福尔马林交联引起)的假象。用于进行这种酶处理的适合的糖基化酶已在本文中结合根据第一方面的方法进行了公开,使用糖基化酶进行酶处理的适合条件例如适合的温度和温育时间以及反应混合物内的适合条件也是如此。参见相应的公开内容。用于进行这种糖基化酶处理的适合条件在本领域中也是已知的。此外,本公开公开了与这种糖基化酶处理相容的适合的裂解/消化组合物,从而允许在过程中使用糖基化酶例如尿嘧啶-N-糖基化酶来除去由固定剂诱导的交联引起的假象。
根据第五方面的方法
根据本发明的第五方面,提供了一种用于处理生物样品的方法,其中所述固定的生物样品包含由所述固定引起核酸分子与蛋白质分子的之间的交联,所述方法包括
(a)裂解所述固定的生物样品,其中裂解涉及用蛋白水解酶消化,其中裂解包括制备裂解混合物,其中所述裂解混合物包含:(i)所述固定的生物样品,和(ii)包含蛋白水解酶和优选地反应性化合物、更优选地选自Tris和亚精胺的反应性化合物的裂解组合物;
(b)加热裂解的样品以逆转交联;
(c)任选地添加蛋白水解酶并进行蛋白水解消化;
(d)从所述裂解的样品纯化核酸;和
(e)分析所纯化的核酸,其中分析包括扩增尺寸小于500nt,例如≤300nt、≤200nt、≤150nt或≤100nt的核酸分子。
与步骤(a)至(e)有关的详细情况已结合根据第一和第二方面的方法进行了公开,并参见也适用于此的上述公开内容。正如本文所公开的,可以在步骤(b)与(c)之间任选地进行一个或多个另外的处理步骤,并且这对制备用于分析步骤(e)的核酸来说可能是有利的。
所述纯化的核酸可以是DNA或RNA。RNA优选地在步骤(e)中的扩增之前被反转录成cDNA。如果所述核酸是双链分子例如双链DNA分子(这是优选的情况),则上述关于以“nt”为单位的尺寸(长度)的说明是指“bp”。因此,如果双链DNA分子具有150nt的尺寸,则所述双链DNA分子具有150bp的尺寸。
具体来说,尺寸小的核酸可以通过所述第五方面的方法来纯化和扩增。所述根据第五方面的方法特别适合于在基于扩增的分析方法例如PCR中分析尺寸小的核酸分子。正如在实施例中证实的,使用所述根据第五方面的方法纯化的核酸的短扩增子PCR产生低的Ct值。
根据一个实施方式,反应性化合物(例如福尔马林清除剂,优选地选自Tris和亚精胺)以3-100mM、5-50mM或10-25mM范围内的浓度存在于步骤(a)中使用的裂解混合物和/或裂解组合物中。步骤(a)中使用的裂解组合物/裂解混合物中的这种例如3-100mM、优选地5-50mM、更优选地10-20mM的较低浓度的反应性化合物(其可以是福尔马林清除剂例如Tris或亚精胺),提供了尺寸特别适合于进行短扩增子扩增反应的核酸片段。这是出人意料的,因为现有技术认为较高程度的片段化对后续的扩增反应不利。然而,实施例令人吃惊地显示,当使用短扩增子PCR时,纯化的DNA的片段化以非常显著的量提高下游PCR的性能。不希望受到理论限制,假设这种效应是由于核酸(例如DNA)在被高度片段化时可接近性更高,可能是因为这些断裂发生在所述固定的生物样品中存在交联的位点处。由于这些交联位点对PCR是抑制性的,因此如在根据第五方面的方法中所应用的在裂解程序中除去这些交联位点提高所述PCR反应的效率。
具体来说,所述裂解混合物包含本文所公开的反应性化合物。实例结合根据第一方面的方法进行了公开,并且参见也适用于此的相应公开内容。在一个实施方式中,所述反应性化合物包含伯胺,并且优选为2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇或其衍生物。步骤(a)的其他特点在上文结合根据第一方面的方法进行了公开,并参见相应的公开内容。
在步骤(a)中使用的裂解组合物还可以包含:
(i)盐;和
(ii)去污剂。
用于步骤(a)中使用的裂解组合物的适合的盐和去污剂以及适合的浓度已结合根据第一方面的方法的步骤(a)进行了公开,并参见相应的公开内容。
在根据第五方面的方法的步骤(a)中使用的裂解组合物和/或裂解混合物可以具有6.0至9.5、优选地7.0至8.0范围内的pH。
有利情况下通过进行方法的步骤(a)和(b)以及任选但优选的步骤(c)而释放的核酸,在步骤(d)中进行纯化。步骤(b)、(c)和(d)的其他详细情况和实施方式在本文中、特别是结合根据第一和第二方面的方法进行了公开,并参见也适用于此的相应公开内容。优选地,在根据第五方面的方法中进行步骤(c)。正如结合根据第一方面的方法所公开的,在步骤(b)与步骤(c)之间可以进行一个或多个另外的处理步骤,例如核酸酶消化和/或涉及使用糖基化酶例如尿嘧啶-N-糖基化酶的酶处理步骤。详细情况在上文结合根据第一方面的方法进行了描述,并参见也适用于此的相应公开内容。
根据第六方面的方法
根据本发明的第六方面,提供了一种用于处理生物样品的方法,其中所述固定的生物样品包含由所述固定引起的核酸分子与蛋白质分子之间的交联,所述方法包括
(a)裂解所述固定的生物样品,其中裂解涉及用蛋白水解酶消化,其中裂解包括制备裂解混合物,其中所述裂解混合物包含:(i)所述固定的生物样品,和(ii)包含蛋白水解酶和优选地反应性化合物,更优选地选自Tris和亚精胺的反应性化合物的裂解组合物;
(b)加热裂解的样品以逆转交联;
(c)任选地,添加蛋白水解酶并进行蛋白水解消化;
(d)从所述裂解的样品纯化核酸;和
(e)分析所纯化的核酸,其中分析包括扩增尺寸为至少500nt和/或尺寸小于500nt的核酸分子。
与步骤(a)至(e)有关的详细情况已结合根据第一和第二方面的方法进行了公开,并参见也适用于此的上述公开内容。正如本文所公开的,可以在步骤(b)与(c)之间任选地进行一个或多个另外的处理步骤,并且这对制备用于分析步骤(e)的核酸来说可能是有利的。
所述纯化的核酸可以是DNA或RNA。RNA优选地在步骤(e)中的扩增之前被反转录成cDNA。如果所述核酸是双链分子例如双链DNA分子(这是优选的情况),则上述关于以“nt”为单位的尺寸(长度)的说明是指“bp”。因此,如果双链DNA分子具有500nt的尺寸,则所述双链DNA分子具有500bp的尺寸。
正如实施例所证实的,所述根据第六方面的方法特别适合于在基于扩增的分析方法例如PCR中分析尺寸短例如小于500nt和/或尺寸为至少500nt的核酸。具体来说,使用所述第六方面的方法可以获得并扩增具有小或大尺寸的核酸。不受理论限制,据信至少10mM,特别是至少20mM、至少40mM、至少60mM或优选地至少75mM的反应性化合物(例如Tris或亚精胺)浓度在分离具有短尺寸和大尺寸的核酸中非常有效,因此获得具有短尺寸和大尺寸的更高质量的更多的一种和/或多种核酸。
在实施方式中,所述裂解混合物和/或裂解组合物包含10-1000mM,特别是20-500mM、50-300mM、75-250mM或优选地85-200mM,例如约100-150mM的反应性化合物。具体来说,所述裂解混合物包含本文所公开的反应性化合物,例如Tris或亚精胺。适合的反应性化合物结合根据第一方面的方法进行了公开,并且参见也适用于此的相应公开内容。所述反应性化合物可以包含伯胺,并且优选为2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇或其衍生物。
所述在步骤(a)中使用的裂解组合物还可以包含:
(i)盐;和
(ii)去污剂。
用于步骤(a)中使用的裂解组合物的适合的盐和去污剂以及适合的浓度已结合根据第一方面的方法的步骤(a)进行了公开,并参见相应的公开内容。
这可以通过在所述裂解混合物和/或裂解组合物中提供6.0至9.5、例如7.0至9.0或8.0至9.0的pH,得到进一步支持。
有利情况下通过进行方法的步骤(a)和(b)以及任选但优选的步骤(c)而释放的核酸,在步骤(d)中进行纯化。步骤(b)、(c)和(d)的其他详细情况和实施方式在本文中、特别是结合根据第一和第二方面的方法进行了公开,并参见也适用于此的相应公开内容。优选地,在根据第六方面的方法中进行步骤(c)。正如结合根据第一方面的方法所公开的,在步骤(b)与步骤(c)之间可以进行一个或多个另外的处理步骤,例如核酸酶消化和/或涉及使用糖基化酶例如尿嘧啶-N-糖基化酶的酶处理步骤。详细情况在上文结合根据第一方面的方法进行了描述,并参见也适用于此的相应公开内容。
在步骤(e)中,通过包括扩增核酸的方法来分析所述核酸。这种扩增方法已在本文中公开并在此参考。具体来说,可以使用聚合酶来扩增核酸。根据一个实施方式,所述核酸使用PCR来扩增,特别是在其中扩增短核酸分子的PCR(也被称为短扩增子PCR)和/或在其中扩增大核酸分子的PCR(也被称为大扩增子PCR)。有利情况下,使用这种方法可以扩增短和大的核酸分子。通过改变裂解组合物/裂解混合物中反应性化合物(例如选自Tris和亚精胺)的浓度,人们可以控制片段尺寸。根据一个实施方式,步骤(e)分析包括扩增尺寸为至少500nt,例如至少550nt、至少600nt、至少650nt或至少700nt的核酸分子。
本发明不限于本文描述的示例性方法和材料,并且与本文中描述的相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实施方式的实践或试验。数值范围包括定义所述范围的数字。本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方式的限制,其可以通过参考整个说明书来阅读。
当在本说明书和权利要求书中使用时,单数形式包括复数的情况,除非上下文另有明确规定。术语“包括”、“具有”、“包含”及其变化形式被同义地使用,并且应该被解释为非限制性的。可能存在其他组分和步骤。在整个本说明书中,当组合物被描述为包含组分或材料时,除非另有描述,否则另外设想了在某些实施方式中所述组合物也基本上由所叙述的组分或材料的任何组合组成或者由所述组合组成。提及“本公开”和“本发明”等包括本文教导的单个或多个方面,等等。本文教导的各个方面被术语“发明”涵盖。
优选地选择并组合本文描述的优选实施方式,并且由优选实施方式的相应组合所产生的特定主题内容也属于本公开。
实施例
下述实施例仅仅出于说明的目的,而不应以任何方式被解释为限制本发明。它们证实了通过在第一蛋白酶消化步骤和交联去除步骤后进行额外的蛋白酶消化步骤,可以有利地改进从固定的样品的DNA提取。这个第二蛋白酶消化步骤改进所述提取过程并提供高质量的纯DNA。DNA可以以高产量、良好的片段尺寸和对下游PCR扩增(例如短和大扩增子PCR)更好的适合性而被纯化。所述纯化的DNA也对下一代测序(NGS)应用非常有利,因为可以获得特别低的每UMI(=独特分子标识符,也被称为独特分子索引)读出值。
此外,实施例显示,通过裂解组合物的调整可以改变DNA片段的尺寸。此外,尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)处理步骤如果进行的话,其所需的处理时间与现有技术方法相比显著减少。
在全部实施例中,从FFPE组织样品提取DNA。在将所述FFPE组织样品脱石蜡后,将所述样品裂解。对所述裂解组合物(对应于样品+裂解溶液)中的样品材料进行蛋白酶K消化步骤,然后是使用加热的交联去除步骤。然后,可以对所述裂解的样品进行酶处理例如RNA酶和/或UNG处理。然后进行(第二)蛋白酶K消化步骤,其除去仍然与所述DNA交联的蛋白质和肽。随后,从消化的样品纯化DNA,例如通过将所述DNA结合到固相,然后进行清洗循环和结合的DNA的洗脱。然后所述纯化的DNA可随时用于进一步使用和分析。
1.实施例1:进行额外的蛋白酶消化步骤带来的改进
1.1.DNA产量、片段化程度和对下游PCR性能的影响得以改进(a)材料和方法
FFPE组织样品
在本实施例中使用了各种不同的人类FFPE组织样品,包括前列腺、肺、肾、脾和乳腺癌。使用Leica旋转切片机从FFPE块切下10μm切片,每次制备使用2个或3个10μm切片。
提取方案
按照下述方案从FFPE组织提取DNA:
1.FFPE组织样品制备
-将400μL脱石蜡溶液(DPS)添加到所述FFPE组织样品并涡旋振荡。
-将样品在56℃温育3min。
2.FFPE组织样品的裂解
-使用裂解溶液例如裂解缓冲液来辅助裂解。优选地,所述裂解溶液包含去污剂、盐和缓冲剂,并在本实施例中使用这种裂解缓冲液。作为去污剂,可以使用阴离子型去污剂例如SDS。所述盐可以是非缓冲盐例如碱金属盐。可以使用氯化物盐例如NaCl或KCl。所述裂解缓冲液的pH可以在6.0-9.5,例如7.0至9.0的范围内。可以使用Tris作为缓冲剂。所述裂解溶液可以任选地包含螯合剂例如EDTA,以抑制核酸酶例如DNA酶。在实施方式中,所述裂解溶液是包含至少0.1%(w/v)去污剂、至少300mM或至少500mM盐和缓冲剂的裂解缓冲液。所使用的裂解缓冲液可以包含0.1-0.5%(w/v)去污剂(例如阴离子型去污剂例如SDS)、400-800mM盐(例如碱金属卤化物,例如KCl或NaCl)和缓冲剂(例如Tris)。此类裂解缓冲液在本领域中是已知的。在本实施例中,使用可商购的裂解缓冲液(FTB,QIAGEN)。在本实施例中,所述裂解组合物通过将所述裂解缓冲液、蛋白酶K(在包含20mg/ml蛋白酶K的溶液中)和水混合来制备。在一个实施方式中,将Tris添加到所述裂解组合物(被称为“高Tris”;不添加Tris的裂解组合物被称为“低Tris”)。正如本文中描述的,Tris可以充当甲醛清除剂,并且可以支持交联的消解。
-制备如下定义的裂解组合物,并添加到按照步骤1处理的FFPE样品:
-将样品在恒温摇床中在56℃温育1h并摇动,用于蛋白酶消化(使用蛋白酶K)。
-然后在不摇动的情况下将样品在90℃温育1h,以逆转交联。这个加热步骤也使所述蛋白酶失活。
3.尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)消化
-从作为裂解液的水性相顶上除去蓝色DPS相,或者将下层透明相转移到新的试管。
-使用115μL水和35μL UNG(1U/μL)将样品进一步稀释,用于使用尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)消化。
-然后将样品在不摇动情况下在50℃温育5min。
4.RNA酶A消化
-每个样品添加4μL RNA酶A。
-将样品混合并在室温温育2min。
5.额外的(第二)蛋白酶消化步骤
-添加20μL蛋白酶K。
-将样品混合并在恒温摇床中,在65℃和450rpm下温育15min。
然后从消化的样品纯化核酸例如DNA。在这里,可以使用任何适合的纯化方法,因为通过上述消化/预处理方案所述核酸已变得可良好地接近。
6.DNA的纯化
-分别添加250μL缓冲液AL(QIAGEN)和96-100%乙醇,并将样品混合。
-添加500μL缓冲液AW1(QIAGEN),然后离心并舍弃穿流液。
-添加500μL缓冲液AW2(QIAGEN),然后离心并舍弃穿流液。
-添加500μL 96-100%乙醇,然后离心并舍弃穿流液,并全速干转。
-向膜施加30μL或50μL洗脱缓冲液ATE(QIAGEN),然后离心。提取并纯化的DNA在得到的穿流液中。
对照
为了比较,执行上述方案,区别在于省略额所述额外的蛋白酶K消化步骤(参见上述步骤5.)。
b)DNA产量的分析
在这组实验中,使用QIAxpert和Qubit仪器确定了使用上文公开的方案的提取物的DNA产量。使用任一仪器得到的DNA产量示出在图1A-1E(UV-Vis=QIAxpert;dsDNA(Qubit)=Qubit)中。
实施例1.1证实了在高温下的交联去除步骤后进行额外的蛋白酶消化步骤提高了DNA产量。此外,得到了具有较大平均尺寸的DNA片段,其对获得适合于大扩增子PCR内的下游PCR的DNA特别有利。
当使用UV-Vis和通过荧光测定(Qubit)测量时,与没有额外的蛋白酶K消化步骤的对照方案相比,所述第二蛋白酶消化步骤导致更高的产量(参见图1A-1E)。对所有测试的FFPE组织样品和裂解溶液均获得了更高的DNA产量。通常,在本领域中认为在初始蛋白酶消化步骤后样品中的蛋白质消化基本上完成,正如通过常规的FFPE提取方法所进行的(例如1h蛋白酶K,56℃)。因此,在加热辅助的交联去除步骤后进行第二蛋白酶消化步骤显著改善结果,这是非常令人吃惊的。不希望受到理论限制,假定在固定的生物样品中存在的交联可以导致蛋白质与核酸(例如DNA)的特别持久的结合,这可能在第一蛋白酶消化步骤期间潜在地保护所述蛋白质。此外,空间效应可能使蛋白质在初始蛋白酶消化步骤期间不可被蛋白酶接近。在高温(例如至少85℃或至少90℃)下的交联逆转步骤后,这些结合被弱化和/或所述样品被充分变性,使得剩余的蛋白质变得可接近,并且可以在第二蛋白酶消化步骤期间被高效去除。
图1A-1E进一步显示了对于某些FFPE组织类型来说,测试的高Tris裂解组合物与低Tris裂解组合物相比导致更高的DNA产量(参见前列腺、肺;图1A和1B)。另一方面,对于肾组织来说,低Tris裂解组合物与高Tris裂解组合物相比导致更高的DNA产量(参见图1C),而对于脾和乳腺癌组织来说,没有观察到差异(参见图1D和1E)。因此,根据所使用的组织类型改变裂解组合物中的Tris浓度可以有利地用于进一步提高DNA产量。
所述额外的蛋白酶K消化步骤有利地提高DNA产量,并因此改进了DNA从各种不同FFPE组织样品类型的提取。
(c)提取的DNA的片段化程度的分析
在这个实验中,使用凝胶电泳分析了片段化程度。作为样品材料,使用了上述从人类肾和乳腺癌FFPE组织提取的DNA。得到的结果示出在图2中。
图2中的凝胶电泳显示,额外的蛋白酶消化步骤导致DNA片段的平均尺寸的增加(条带迁移;参见使用“+2.PK裂解15’65℃”的样品)。对于两种FFPE组织类型并且在高Tris和低Tris两种裂解溶液中,均观察到这种增加。这个结果是令人吃惊且出人意料的。因为提取的DNA的片段尺寸的增加对下游PCR应用可能是有利的,因此在热辅助交联去除步骤后的额外蛋白酶消化改进了DNA提取。
(d)对下游PCR性能的影响
在本实施例中,通过PCR分析了提取的DNA,以确定PCR性能是否受到由额外的蛋白酶K步骤引起的DNA尺寸增加的影响。进行了定量实时PCR并确定Cq值。“Cq”值可以与“Ct”值互换使用。Cq值与提取的DNA的原始相对量成反比。进行了具有66bp片段的短扩增子PCR和具有500bp片段的大扩增子PCR两者。得到的结果示出在图3中(深色阴影柱对应于每个反应混合物相同量的DNA,浅色阴影柱对应于每个反应混合物相同体积的稀释洗脱液)。
如图3中所示,使用额外的蛋白酶K消化步骤提取的DNA总体上降低Cq值并因此提高PCR性能。对于两种测试的FFPE组织类型(人类乳腺癌和肾组织)和两种裂解溶液(高和低Tris)均观察到这种提高。因此,提取的DNA的质量提高也导致更好的PCR结果,特别是使用大扩增子(500bp)时。这个结果表明,通过在去交联步骤后进行第二蛋白酶消化,使得更大量的以前不可接近的长DNA链变得可以被PCR反应接近。
(e)其他结论
所述交联去除步骤后额外的蛋白酶消化步骤增强了DNA从各种不同FFPE组织样品的提取。具体来说,DNA以更高的产量和更大的片段尺寸以及对短和大扩增子的PCR扩增来说更高的质量被提取。因此,所述额外的蛋白酶消化步骤对于从固定的生物样品例如FFPE样品以及固定的液体样品提取DNA都是非常有利的。正如所示,可以在去交联步骤与第二蛋白酶步骤之间进行一个或多个另外的酶消化步骤。1.2.下一代测序(NGS)性能被增强
实施例1.2证实了通过进行根据本公开的额外的蛋白酶消化步骤,改进了DNA从FFPE组织样品的提取。正如提到的,可以使用蛋白酶K作为蛋白酶。通过将实施例1.1的提取的DNA用于NGS,测量到非常高的NGS性能。具体来说,对于所有测试的组织样品来说,测量到低于10的低的每UMI读出值。
(a)材料和方法
将如实施例1.1中所述从包括前列腺、肺、肾和乳腺癌的人类FFPE组织样品提取的DNA用于NGS性能分析。
样品制备和测序工作流程
将提取的DNA用作测序文库的模板。遵照QIAseqTM Targeted DNA Panel手册(QIAGEN,05/2017),使用用于Illumina Instruments方案的QIAseqTM Targeted Panel。作为QIAGEN targeted DNA Panel,使用了具有UMI技术的人类肺癌Panel。所述UMI技术基于将独特分子标识符(UMI)序列(也被称为独特分子索引)整合到单基因特异性、基于引物的靶向富集过程中,其克服了DNA聚合酶和扩增过程的偏差/假象:
-具有不同UMI的序列读出代表了不同的原始分子。
-具有相同UMI的序列读出是来自于一个原始分子的PCR复制的结果。
来自于PCR扩增和测序过程的错误也可能出现在最终读出中,导致测序结果中的假阳性变体。通过调用独特UMI内所有读出的变体而不是在原始读出水平上挑取变体,可以大大减少这些假象变体。
(b)在NGS中的性能
正如上文讨论的,在扩增之前双链DNA的每个分子带有UMI条形码标签。这允许将在NGS中检测到的真正独特的分子与PCR扩增子区分开。
在图4中,对于提取的DNA,将每个UMI检测到的读出作图。每个UMI的读出值超过10表明同一分子被读出超过10次,并且表明起始材料中过多的过度扩增/复杂度不足。
如图4中所示,根据本公开的提取方法对所有样品显示出非常高的NGS性能,因为测量到低于10的低的每个UMI的读出值。这证实了本公开的方法有利于从各种不同的FFPE样品类型提取DNA。此外,额外的/第二蛋白酶K步骤提高了NGS性能,特别是对于前列腺、肾以及某些情况下也对于肺和乳腺癌组织来说(对于高Tris裂解组合物,参见图4“GR-高Tris”)。
总体来说,当使用根据本公开的纯化方法时,NGS性能非常高。2.实施例2:使用本公开的方法与现有技术方法的DNA提取的比较
实施例2进一步证实了通过使用根据本公开的额外蛋白酶K消化步骤改进了DNA从FFPE组织样品的提取。与实施例1.1一致,获得了高DNA产量。此外,测量到更大的片段尺寸和更好的PCR性能。重要的是,与现有技术方法相比NGS性能显著提高。
(a)材料和方法
FFPE组织样品
在本实施例中使用人类心房FFPE组织。使用Leica旋转切片机从FFPE块切下10μm切片,并且每次制备使用两个10μm切片。
提取方案
在本实施例中遵照实施例1.1的提取方案。
对照
与实施例1.1一致,在用于比较的对照中省略了所述额外的蛋白酶K消化步骤(参见上述步骤5.)。此外,通过将第一蛋白酶K步骤在56℃进行过夜并省略额外的蛋白酶K消化步骤,进行了用于比较的额外对照(“o/n 56℃”)。
参比方案
作为参比方案(即现有技术方法),遵照RSC DNA FFPE试剂盒技术手册(Promega,Revised 11/17)以及RSC FFPE Plus DNA试剂盒技术手册(Promega,Revised 12/19)。此外,作为参比方案,遵照DNA FFPE组织手册(QIAGEN,2012年6月),使用了关于“使用DNA FFPE组织试剂盒和脱石蜡溶液从FFPE组织纯化基因组DNA”的QIAGEN补充方案。
b)DNA产量的分析
在这组实验中,使用QIAxpert和Qubit仪器确定提取物的DNA产量。使用任一仪器为人类肺癌组织和人类心房得到的DNA产量分别示出在图5A和5B中(UV-Vis=QIAxpert;dsDNA(Qubit)=Qubit)。
正如使用UV-Vis和通过荧光测定(Qubit)所测量的,在交联步骤后在65℃下进行额外的蛋白酶K消化步骤与没有所述额外蛋白酶K消化步骤的对照方案相比导致更高的产量(参见图5A和5B)。对两种测试的FFPE组织类型和两种裂解组合物(高和低Tris),均获得更高的产量。重要的是,所述第一蛋白酶K步骤进行更长时间例如在56℃过夜的对照样品(参见“o/n 56℃”)中,不导致更高的产量。事实上,在去交联步骤后进行第二蛋白酶K步骤与o/n 56℃对照相比导致更高的产量,证实了重要的不是蛋白质消化时间本身,而是在根据本公开的方法中所进行的步骤的具体顺序,其中第二蛋白酶消化步骤在去交联步骤之后进行。
图5A和5B进一步显示,对于两种测试的组织类型来说,低Tris裂解组合物产生甚至更高的DNA产量。因此,对于这些组织类型来说,低Tris裂解组合物(例如其中裂解组合物中的Tris浓度低于50mM、低于30mM、低于25mM,任选地在1mM至20mM的范围内)可用于进一步提高产量。获得了比参比方案明显更高的产量。
(c)提取的DNA的片段化程度的分析
使用凝胶电泳分析片段化程度。作为样品材料,使用了上述从人类肺癌和心房FFPE组织提取的DNA。得到的结果分别示出在图6A和6B中。
图6A和6B中的凝胶电泳显示额外的蛋白酶K消化步骤导致DNA片段的平均尺寸增加(条带迁移;参见使用“+2.PK裂解15’65℃”的样品)。对于两种FFPE组织类型并且在使用的两种裂解组合物中均观察到这种增加。与关于更高产量的讨论相一致,这个结果是令人吃惊且出人意料的。与参比方案相比,通过进行根据本公开的第二蛋白酶K步骤获得了总体更大的片段尺寸。更大的片段尺寸可能对下游PCR性能有利。
(d)对下游PCR性能的影响
在本实施例中,通过PCR分析了提取的DNA,以确定PCR性能是否受到由额外的蛋白酶K步骤引起的DNA尺寸增加的影响。与以前相同,进行定量实时PCR并确定Cq值。进行了使用66bp片段的短扩增子PCR和使用500bp片段的大扩增子PCR两者。对短和大扩增子得到的结果分别示出在图7A和7B中(深色阴影柱对应于每个反应混合物相同量的DNA,浅色阴影柱对应于每个反应混合物相同体积的稀释洗脱液)。
如图7A和7B中所示,使用额外的蛋白酶消化步骤提取的DNA总体降低了Cq值并因此提高PCR性能,特别是对于使用500bp片段的大扩增子PCR来说。与参比方案相比,根据本公开的使用额外的/第二蛋白酶消化步骤的方法产生总体低的Cq值,特别是对于短扩增子来说。其中进行56℃过夜蛋白酶K消化步骤的对照样品的性能,总体上也被根据本公开的使用额外的/第二蛋白酶消化步骤的方法超越。所述结果表明,通过在去交联后进行额外的蛋白酶消化,更大量的以前不可接近的长DNA链已变得可以被PCR反应接近。此外,所述结果表明,为了实现更好的PCR性能,重要的不是消化时间的总量,而是在根据本公开的方法中所进行的步骤的顺序。
(e)在NGS中的性能
在本实施例中,研究了所述提取的DNA用于NGS分析的性能。使用上述提取方案(对于所使用的裂解组合物参见实施例1.1),使用/不使用额外的蛋白酶消化步骤(使用蛋白酶K作为蛋白酶),从人类心房FFPE组织样品提取DNA。
将提取的DNA用作测序文库的模板。遵照实施例1.2中描述的样品制备和测序流程,并如上所述确定每个UMI的读出值。
结果
在扩增之前使每个双链DNA分子带上独特分子标识符(UMI)条形码标签。这允许将在NGS中检测到的真正独特的分子与PCR扩增子区分开。在图8中,对所述提取的DNA检测到的每个UMI的读出值作图。每个UMI的读出值超过10表明同一分子被读出超过10次,并且是过多过度扩增/起始材料中的复杂度不足的指示。
如图8中所示,根据本公开的提取方法与FFPE DNA试剂盒(“QA FFPE”)以及来自于Promega的Maxwell RSC DNA FFPE或Maxwell RSC FFPE Plus DNA试剂盒相比显示出更好的性能。所有那些试剂盒均具有远远超过10的UMI值。通过根据本公开的方法提取的DNA的所述值均为低于10的值。额外的蛋白酶K温育步骤导致甚至更低的每个UMI的读出值。
总的来说,NGS性能被根据本公开的提取方法显著提高,所述提取方法可以快速进行并提供出色的结果。
(e)结论
这个实施例证实了在第一蛋白酶消化步骤和去交联步骤后进行额外的蛋白酶消化步骤提高了纯化的核酸的质量,正如基于DNA所示。具体来说,所述额外的蛋白酶消化步骤与现有技术方法相比提高了产量和片段尺寸,改进了PCR性能,并且重要的是显著增强了NGS性能。正如上文讨论的,这些结果是非常令人吃惊且出人意料的。此外,通过将根据本公开的包括额外的/第二蛋白酶消化步骤的方法与第一56℃过夜蛋白酶K消化步骤相比,显示出更好的性能的原因不是总消化时间,而是在根据本公开的方法中进行的步骤的具体顺序。
3.实施例3:使用稀释的裂解组合物对DNA提取的影响
实施例3证实裂解组合物影响DNA从FFPE组织样品的提取。裂解组合物的稀释允许在交联去除步骤中控制DNA的片段化。此外,所述实施例显示通过控制片段化可以获得更短的DNA片段,这在使用短扩增子PCR时提高下游PCR的性能。
(a)材料和方法
FFPE组织样品
为了在DNA提取方案的框架中分析裂解组合物的影响,使用了两种不同的FFPE组织样品:心脏组织和肺组织,两者均来自于大鼠。使用旋转切片机从FFPE块切下10μm切片,并且每次制备使用一个10μm切片。
提取方案
使用如实施例1.1中所描述的提取方案并进行了下述修改:
-在步骤2中,裂解组合物通过将25μL裂解缓冲液(FTB,QIAGEN)、20μL蛋白酶K和55μL水合并来制备(对应于上文实施例1.1中使用的“低Tris”缓冲液)。
-在步骤3中,将UNG用水代替,并且温育在50℃下进行60min。
-省略了步骤5(即没有第二蛋白酶K消化步骤)。
参比方案
作为参比方案,遵照DNA FFPE组织手册(QIAGEN,2012年6月),使用了关于“使用DNA FFPE组织试剂盒和脱石蜡溶液从FFPE组织纯化基因组DNA”的QIAGEN补充方案。对于裂解来说,将180μL缓冲液ATL(QIAGEN)与20μL蛋白酶K混合。
(b)片段化程度可以通过在交联去除步骤中选择裂解溶液来控制
在第一组实验中,通过凝胶电泳分析从FFPE组织样品提取的DNA(参见图9)。由此,提取的DNA的尺寸分布被可视化,并且可以得出关于片段化程度的结论。
如图9中所示,使用利用稀释的裂解组合物的提取方法观察到更大的DNA片段化(参见如图9中所示,“GR std”=稀释的裂解组合物;“QA std”=参比裂解组合物;L1-L3=DNA梯)。所述用于裂解和交联去除的稀释的裂解组合物(参见“GR std”)在进一步稀释2.5倍后,用于使裂解液中的尿嘧啶-N-糖基化酶具有活性。已发现与参比方案(参见“QA std”)相比,这导致提取的DNA的平均尺寸更小。对于大鼠心脏和大鼠肺两种FFPE组织样品来说,均获得平均尺寸较小的提取的DNA。
总体来说,观察到使用稀释的裂解组合物的提取方法导致DNA的更大片段化。因此,裂解溶液中存在的化合物的稀释允许控制片段化程度。这些化合物具体来说包括Tris。
(c)下游PCR的性能受到提取的DNA的片段化的影响
在这组实验中,分析了DNA片段化对PCR扩增的影响。一个具体目的是研究提取的DNA在通过PCR扩增的适合性方面的质量。作为样品材料,使用了上述从FFPE组织样品提取的DNA。如前所述,进行定量实时PCR并确定Cq值。得到的Cq值被作图在图10和11中。
通常认为,分子量以及因此平均长度较低的DNA(更片段化的DNA)对于下游分析来说不太可靠。如图10中所示,当使用通过使用稀释的裂解组合物的提取方法获得的更片段化的DNA时,使用长扩增子(727bp)的PCR的性能略微更差。这通过与参比方案(“标准”;Cq值为约23.2)相比更高的Cq值(“片段化”;约23.6)反映出来。这是由于下述事实,即当DNA更加片段化时,具有扩增大PCR产物所需的最小长度的可用片段更少。
然而,令人吃惊的是,当使用短扩增子PCR(78bp)时,通过所述稀释的裂解组合物获得的更加片段化的DNA以非常显著的量提高下游PCR的性能(参见图11)。尽管参比方案(“标准”)具有约23的Cq值,但从稀释的裂解组合物得到的DNA样品(“片段化”)具有约21.5的降低的Cq值。这是出人意料的。不希望在理论上受到限制,推测这种效应是由于DNA在更片段化时更易接近,可能是因为这些断裂发生在存在交联的位点处。由于此类交联位点对PCR是抑制性的,因此除去这些位点似乎提高PCR反应的效率。
(d)其他结论
使用利用稀释的裂解组合物的提取方法导致更高的DNA片段化以及因此更小的平均DNA尺寸。这可能是由于用于辅助裂解的化合物例如特别是去污剂、盐和任选的螯合剂的浓度较低。尽管片段尺寸较小,但所述提取的DNA在使用短扩增子PCR时在下游PCR中表现出提高的性能。就此而言,获得了更高质量的DNA样品。
4.实施例4:裂解溶液中的添加剂对提取的DNA和UNG温育的影响
实施例4证实了向裂解组合物添加某些化合物可以被有利地用于控制从FFPE组织样品提取的DNA的片段化程度。因此,可以对提取方案进行调整以针对下游PCR中使用的短或长片段对其进行优化。此外,实施例4证实了本公开的方法有利地允许减少处理时间。具体来说,可以将尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)处理步骤的温育时间从60min减少到仅仅5min。
FFPE组织样品
在本实施例中,使用了来自于大鼠肾和大鼠肺的FFPE组织样品。使用Leica旋转切片机从FFPE块切下10μm切片,并且每次制备使用两个10μm切片。
提取方案
遵照上文实施例1.1的提取方案,但不进行步骤5(即没有第二蛋白酶K消化步骤)。对于FFPE组织样品的裂解来说,通过与裂解缓冲液(FTB,QIAGEN)混合制备了下述裂解组合物:
参比方案
作为参比方案,遵照GeneReadTM DNA FFPE手册(QIAGEN,March 2014),其包括60min UNG处理步骤。
(a)片段化程度可以通过裂解组合物中的添加剂控制
通过提取的DNA样品的凝胶电泳来分析片段化。结果示出在图12中。
正如可以通过图12中的条带迁移看出的,对于大鼠肾和肺FFPE组织来说,Tris对片段化具有最强影响(参见“GR–高Tris”与“GR–低Tris”相比)。具体来说,较高的Tris浓度增加DNA片段的平均尺寸,而低Tris浓度减小平均尺寸。此外,亚精胺添加影响DNA片段的尺寸。与低Tris裂解组合物(参见“GR std”)相比,向低Tris裂解组合物添加亚精胺增加片段尺寸(参见“Gr–低Tris+亚精胺”)。如图12中所示,片段化程度通过向系统添加某些化合物(添加剂)得以控制。对片段化显示出影响的化合物包括Tris和亚精胺。在本实施例中,DTT、甘氨酸和精胺不以相同的方式影响片段化。Tris对片段化具有最强影响。
(b)通过提供适合的裂解溶液可以减少UNG的温育时间
使用亚硫酸氢盐转化的DNA试验测试了UNG活性。在亚硫酸氢盐转化的DNA中,DNA的胞嘧啶核碱基被尿嘧啶核碱基交换。所述尿嘧啶核碱基被UNG切割。结果,DNA被部分降解,减少了可回收的DNA的量。
工作流程
含有亚硫酸氢盐转化的DNA的裂解组合物如上所公开的来制备,区别在于将2.5μL水用2.5μL浓度为830ng/μL的亚硫酸氢盐转化的gDNA代替。然后,将所述混合物用115μL水稀释并添加35μL UNG。然后将样品在50℃温育5min。随后,如实施例1.1中所解释的将DNA纯化(参见6.DNA的纯化)。
对照
作为对照,如GeneReadTM DNA FFPE流程中所进行的将样品在50℃温育60min。作为其他对照,未进行UNG消化(“w/o UNG”)。
结果
UNG活性测试的结果示出在图13中。具体来说,使用110bp的扩增子尺寸和引物序列中的摆动碱基(以便确保引物退火)通过定量实时PCR对5ng(深色阴影柱)或10ng(浅色阴影柱)提取的DNA进行分析。如前所述确定Ct值。由于UNG消化亚硫酸氢盐转化的DNA,因此预期具有更少量的回收的DNA并因此获得更高Ct值。
如图13中所示,总体来说UNG消化获得了良好结果,例外的是具有较高Tris浓度和额外的甘氨酸的样品以及具有低Tris浓度和额外的DTT的样品。它们相对而言具有略微更低的Ct值。然而,它们与没有UNG消化的对照相比仍具有明显更高的Ct值。重要的是,所述裂解溶液样品仅仅温育5min,与此相比对照样品(“GR FFPE std”)被温育60min。但测量到可比的Ct值,证实了相近的UNG活性。因此,通过提供根据本公开的裂解组合物,UNG消化时间可以被成功地减少到5min。实现了处理时间的显著减少。
(c)结论
从如上所述实施例3的稀释的低盐裂解组合物开始,并任选地添加添加剂例如Tris或亚精胺,可以针对在下游PCR中使用的短或长片段对提取方案进行优化。此外,通过提供本公开的裂解组合物可以减少处理时间,因为UNG消化时间从60min减少到5min而没有损失活性。
5.总体结论
正如在实施例中证实的,在去交联步骤后进行额外的蛋白酶消化显著提高从固定的生物样品例如特别是FFPE样品纯化的DNA的性能。结果表明,尽管进行了第一蛋白酶消化步骤和交联去除步骤,但核酸例如DNA表现出仍含有蛋白质交联或类似的与蛋白质相关的DNA修饰,这妨碍了下游过程(例如PCR扩增或NGS)。通过在去交联后进行额外的蛋白酶消化步骤,它们被除去,这提高了DNA的质量,允许增强的下游处理和分析。针对各种不同的参比方案确认了所述改进,证实了本公开的方法导致与现有技术方法相比的显著改进。此外,通过对延长的第一蛋白酶消化(过夜)与本公开的在去交联后使用第二蛋白酶消化步骤的方法的性能进行比较,显示了重要的不是总消化时间,而是步骤的特定顺序。通过进行第一蛋白酶消化步骤,然后是加热步骤以除去交联,然后是额外的/第二蛋白酶消化步骤,实现了重要的改进。这种步骤顺序允许获得高质量的核酸(例如DNA),同时允许在短时间内完成工作流程。因此,所述方法非常快,同时在获得高质量DNA方面非常有效。
DNA产量和可接近性的提高也反映在提高的NGS性能中。此外,具有可调节的尺寸修饰的本公开的方法在所有变化形式中均工作良好。此外,可以将UNG温育时间从60min减少到5min,证实了处理时间可以被显著减少。在所有情况下,根据本发明的方法与包括传统的FFPE试剂盒在内的现有技术方法相比显示出益处。根据本公开的方法相比而言是快得多且更方便的工作流程,并且仍可提供更好的UMI值。
6.实施例5:使用EZ1 Advanced XL仪器从不同FFPE组织样品分离DNA
将EZ1 Advanced XL仪器用于结合/清洗/洗脱步骤,从约2mm3的不同FFPE组织分别分离DNA。所述EZ1 Advanced XL仪器是一种用于核酸自动纯化的机器人工作站。
在使用机器人仪器处理样品之前,如下所述进行脱石蜡、裂解和交联去除:
>300μl脱石蜡溶液(DPS),涡旋振荡,离心
>在56℃下3min
>冷却至室温
>主混合物:每个样品55μl无RNA酶水,25μl缓冲液FTB
(QIAGEN)和20μl蛋白酶K
>涡旋振荡并离心样品
>在56℃、1000rpm下1h
>在90℃下1h
>除去上层
>115μl无RNA酶水
>35μl无RNA酶水
>在50℃下5min
>离心
>2μl RNA酶A,在RT下2min
将这个方案的性能与在结合前包括第二蛋白酶K步骤的根据本公开的改良方案进行比较:
>20μl PK,涡旋振荡,在65℃450rpm下15min
对于人类肾和人类乳腺样品来说,通过UV VIS和Qubit dsDNA BR测量来确定产量。图14示出了结果。通过向每个反应添加调整到实际洗脱体积的相同的体积量,确定分离的DNA在qPCR中的性能。从在用任一方案选项提取后获得洗脱液扩增66bp和500bp的人类18SrRNA基因。图15示出了结果。
使用约2mm3的人类心脏样品重复所述实验。再次通过UV VIS和Qubit dsDNA BR测量确定产量,图16示出了结果。再次通过向每个反应添加调整到实际洗脱体积的相同的体积量,确定分离的DNA在qPCR中的性能。从在用任一方案选项提取后获得洗脱液扩增66bp和500bp的人类18S rRNA基因。图17示出了结果。
实施例5在UV VIS和Qubit dsDNA测量以及qPCR的基础上证实,根据本发明的教导包含第二蛋白水解消化导致核酸产量的提高,并因此改进了在qPCR中的性能。
Claims (31)
1.一种裂解固定的生物样品的方法,其中所述固定的生物样品包含由所述固定造成的核酸分子与蛋白质分子之间的交联,所述方法包括:
(a)裂解所述固定的生物样品,其中裂解涉及用蛋白水解酶消化;
(b)加热裂解的样品以逆转交联;
(c)添加蛋白水解酶并进行蛋白水解消化;
任选地其中在步骤(b)与步骤(c)之间进行一个或多个另外的处理步骤。
2.一种从固定的生物样品获得纯化的核酸的方法,所述方法包括按照根据权利要求1所述的裂解方法裂解所述固定的生物样品,其中所述方法在步骤(c)之后包括:
(d)从所述裂解的样品纯化核酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中裂解步骤(a)包括制备裂解混合物,其中所述裂解混合物包含
(i)所述固定的生物样品,和
(ii)包含所述蛋白水解酶的裂解组合物。
4.根据权利要求3所述的方法,其中步骤(a)具有一个或多个下述特征:
(i)所述蛋白水解酶是蛋白酶,任选为丝氨酸蛋白酶例如蛋白酶K;
(ii)将所述裂解混合物加热以帮助所述蛋白水解酶消化,任选地其中加热在35-75℃、任选地40-70℃范围内的温度下进行;
(iii)将所述裂解混合物温育至少30min,例如至少45min或至少50min,任选地其中温育在35-75℃之间的高温下进行和/或其中将所述样品在温育期间搅拌;和/或
(iv)步骤(a)在120min或更短时间,任选地在100min或更短时间、90min或更短时间或70min或更短时间内完成。
5.根据权利要求1至4中的一项或多项所述的方法,其中步骤(b)具有一个或多个下述特征:
(i)步骤(b)包括将所述裂解的样品加热到至少80℃、任选地至少85℃或至少90℃的温度;
(ii)将所述裂解的样品加热以逆转交联至少30min、至少45min或至少50min;和/或
(iii)将所述裂解的样品在80-110℃、例如85-100℃范围内的温度下加热30-120min,例如45-90min或50-70min。
6.根据权利要求1至5中的一项或多项所述的方法,其中步骤(c)具有一个或多个下述特征:
(i)所述蛋白水解酶是蛋白酶,任选为丝氨酸蛋白酶例如蛋白酶K;
(ii)步骤(c)包括加热以帮助所述蛋白水解酶消化,任选地其中加热在35-75℃、例如40-70℃或50-70℃范围内的温度下进行;
(iii)步骤(c)包括温育至少5min,例如至少10min或至少15min,任选地其中温育在35-75℃之间的高温下进行和/或其中将所述样品在温育期间搅拌;
(iv)步骤(c)中的温育短于步骤(a)中的温育,和/或其中步骤(c)中的温育温度高于步骤(a)中的温育温度;和/或
(v)步骤(c)在30min或更短时间、任选地20min或更短时间内完成。
7.根据权利要求1至6中的一项或多项所述的方法,所述方法包括在步骤(b)与步骤(c)之间进行不同于蛋白水解消化步骤的至少一个酶处理步骤。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述至少一个酶处理步骤涉及使用糖基化酶、核酸酶、脂肪酶中的一者或多者或上述酶的组合。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其中所述至少一个酶处理步骤涉及使用DNA糖基化酶,例如尿嘧啶DNA糖基化酶,优选为尿嘧啶-N-糖基化酶。
10.根据权利要求9所述的方法,其中糖基化酶处理步骤在高温下进行,和/或其中所述糖基化酶处理步骤在30min或更短时间、20min或更短时间、15min或更短时间或10min或更短时间内完成,任选地其中所述糖基化酶是尿嘧啶-N-糖基化酶。
11.根据权利要求7至10中的一项或多项所述的方法,所述方法包括在步骤(c)之前稀释从步骤(b)获得的样品,用于进行所述至少一个酶处理步骤。
12.根据权利要求7至11中的任一项所述的方法,其中在所述酶处理步骤期间,所述酶处理混合物中的盐浓度具有一个或多个下述特征:
(i)所述盐浓度≤500mM,并且任选地选自≤300mM、≤250mM、≤200mM、≤150mM和≤100mM;
(ii)所述盐浓度在10mM至500mM的范围内,例如在15mM至300mM、15mM至200mM或15至150mM的范围内,
任选地其中所述至少一个酶处理步骤涉及使用DNA糖基化酶,例如尿嘧啶DNA糖基化酶。
13.根据权利要求3至12中的一项或多项所述的方法,其中步骤(a)中的裂解组合物具有6.0至9.5、优选地6.5至9.0或7.0至9.0范围内的pH。
14.根据权利要求3至13中的一项或多项所述的方法,其中步骤(a)中的裂解组合物还包含一种或多种、优选地所有下述化合物:
(i)盐;
(ii)去污剂;
(iii)缓冲剂。
15.根据权利要求1至14中的一项或多项所述的方法,其中所述裂解组合物包含具有一个或多个下述特征的反应性化合物:
(i)所述反应性化合物与在加热步骤(b)中释放的固定剂或化学组成部分和/或与由所述固定剂诱导的交联反应,任选地其中所述固定剂是含醛固定剂例如甲醛;
(ii)所述反应性化合物包含亲核基团,优选为胺基;
(iii)所述反应性化合物包含
-一个或多个伯胺基,任选为一个伯胺基,和一个或多个羟基,优选为三个羟基;或
-两个伯胺基和任选地一个仲胺基;和/或
(iv)所述反应性化合物是2-氨基-2-(羟甲基)丙-1,3-二醇或其衍生物或亚精胺或其衍生物或其组合。
16.根据权利要求14或15所述的方法,其具有一个或多个下述特征:
(i)所述反应性化合物以1mM至500mM、例如5mM至500mM范围内的浓度存在于所述裂解组合物和/或裂解混合物中;
(ii)对优选地选自Tris或亚精胺的所述反应性化合物的浓度进行选择,以控制释放的核酸分子的长度,其中所述裂解组合物和/或裂解混合物中较低浓度的反应性化合物导致所述释放的核酸分子的较高程度的片段化。
17.根据权利要求14至16中的一项或多项所述的方法,其中所述裂解组合物具有一个或多个下述特征:
(a)所述盐具有一个或多个下述特征:
(i)所述盐是单价或二价盐,
(ii)所述盐是离液或非离液盐,
(iii)所述盐是非缓冲盐,
(iv)所述盐是碱金属盐,任选为碱金属卤化物,和/或
(v)所述盐是氯化物盐,任选地选自氯化钠、氯化钾、氯化锂和氯化铯,其中优选地所述盐是氯化钠;
(b)所述去污剂具有一个或多个下述特征:
(i)所述去污剂是离子型或非离子型去污剂,
(ii)所述去污剂是阴离子型去污剂,和/或
(iii)所述去污剂是脂肪醇的硫酸盐或磺酸盐,例如十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠或十二烷基苯磺酸,优选地所述去污剂是十二烷基硫酸钠;
(c)所述裂解组合物包含根据权利要求15所述的反应性化合物,其是缓冲剂,或者所述裂解组合物包含缓冲剂,任选地其中所述缓冲剂具有5.0至10.5范围内的pKa值,任选地所述pKa值选自5.5至10.0、6.0至10.0、6.5至10.0、7.0至9.8或7.2至9.8,任选地其中所述缓冲剂是Tris;
和/或
(d)任选地,所述裂解组合物包含螯合剂,其中优选地所述螯合剂是氨基多羧酸,更优选为乙二胺四乙酸(EDTA)。
18.根据权利要求17所述的方法,其中在所述裂解组合物和/或裂解混合物中
(a)所述盐以至少15mM、至少50mM、至少75mM或至少100mM的浓度存在,任选地其中所述盐浓度在15mM-500mM,例如50mM至350mM、75mM至300mM、100mM至250mM或125mM至200mM的范围内;和/或
(b)所述去污剂以至少0.01%、至少0.02%、至少0.03%或至少0.04%的浓度存在于所述裂解组合物和/或裂解混合物中,任选地其中所述去污剂浓度在0.01-3.0%,例如0.02-2.75%、0.03至2.5%或0.04至2.0%的范围内。
19.根据权利要求3至18中的一项或多项所述的方法,其中所述裂解组合物通过将裂解溶液与所述蛋白水解酶合并来制备,任选地其中制备所述裂解组合物还包括添加水或稀释缓冲液。
20.根据权利要求19所述的方法,其具有一个或多个下述特征:
(i)所述裂解溶液包含反应性化合物,任选地其中
-所述反应性化合物是如权利要求15中所定义的反应性化合物,和/或
-所述反应性化合物以至少5mM、特别是至少10mM、至少20mM或至少30mM的浓度存在于所述裂解溶液中;
(ii)所述裂解溶液包含作为缓冲剂的反应性化合物,或者所述裂解溶液还包含缓冲剂;
(iii)所述裂解溶液包含如权利要求15中所定义的反应性化合物,任选地其中
-所述反应性化合物包含一个或多个伯胺基、优选地一个伯胺基,和一个、两个或三个羟基、优选地三个羟基,任选地其中所述反应性化合物以至少10mM,例如至少20mM、至少40mM、至少60mM或至少75mM的浓度存在于所述裂解溶液中;或
-所述反应性化合物包含两个伯胺基和优选地一个仲胺基,任选地其中所述反应性化合物以至少0.25mM、特别是至少0.5mM、至少1mM、至少1.25mM或优选地至少1.5mM的浓度存在于所述裂解溶液中;
(iv)所述裂解溶液包含盐,任选地其中
-所述盐是如权利要求17a)中所定义的盐;
-所述盐以至少50mM,任选地至少75mM、至少100mM、至少150mM、至少200mM或至少250mM的浓度存在于所述裂解溶液中;
(v)所述裂解溶液包含去污剂,任选地其中
-所述去污剂是如权利要求17b)中所定义的去污剂;
-所述去污剂是离子型或非离子型去污剂,优选为阴离子型去污剂;
-所述去污剂以至少0.01%、至少0.01%、至少0.02%、至少0.03%或至少0.04%的浓度存在于所述裂解溶液中,任选地其中所述去污剂浓度在0.01-3.0%,例如0.02-2.75%、0.03至2.5%或0.04至2.0%的范围内。
21.根据权利要求1至20中的一项或多项所述的方法,其具有一个或多个下述特征:
(i)所述核酸包含DNA或基本上由DNA组成;
(ii)所述固定的生物样品是含细胞样品;
(iii)所述固定的生物样品是固定的固体生物样品,特别是固定的组织样品;
(iv)所述固定的生物样品是固定的液体生物样品;
(v)所述固定的生物样品是使用交联固定剂、任选为含醛固定剂例如甲醛和/或聚甲醛固定的样品;和/或
(vi)所述固定的生物样品是FFPE样品。
22.根据权利要求2至21中的一项或多项所述的方法,其中步骤(d)包括将核酸与固相结合;任选地清洗结合到固相的核酸;并从所述固相洗脱所述核酸;
和/或
其中所述方法还包括(e)分析所纯化的核酸,其中分析任选地包括下述一者或多者:
(i)扩增所述核酸,优选地使用聚合酶扩增所述核酸;
(ii)使用大扩增子PCR和/或短扩增子PCR扩增所述核酸,任选地其中所述大扩增子PCR用于尺寸为至少500nt的核酸分子,所述短扩增子PCR用于尺寸小于500nt、优选地≤300nt、≤200nt或≤150nt的核酸分子;和/或
(iii)执行下一代测序方法,所述方法任选地包括
(aa)将独特分子标识符序列附连到所述核酸,其中每个核酸分子包含不同的独特分子标识符序列;
(bb)扩增带有附连的独特分子标识符序列的核酸;和
(cc)对所述核酸进行测序。
23.根据权利要求1至22中的一项或多项所述的方法,其中所述方法包括
(a)裂解所述固定的生物样品,其中裂解涉及用蛋白水解酶消化,其中裂解步骤(a)包括制备裂解混合物,其中所述裂解混合物包含
(i)所述固定的生物样品,和
(ii)包含所述蛋白水解酶的裂解组合物,
并且其中将所述裂解混合物在35-75℃之间的高温下温育至少30min,任选地其中步骤(a)在120min或更短时间内完成;
(b)将所述裂解的样品加热以逆转交联,其中将所述裂解的样品在80-110℃、例如85-100℃范围内的温度下加热30-120min,例如45-90min或50-70min;
(c)添加蛋白水解酶并进行蛋白水解消化,其中步骤(c)包括在35-75℃、例如40-70℃或50-70℃之间的高温下温育至少5min,例如至少10min或至少15min,
其中步骤(c)中的温育短于步骤(a)中的温育,和/或其中步骤(c)中的温育温度高于步骤(a)中的温育温度。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述固定的生物样品是固定的固体生物样品,任选为FFPE样品,并且其中所述方法包括在步骤(b)与步骤(c)之间进行不同于蛋白水解消化步骤的至少一个酶处理步骤,其中所述至少一个酶处理步骤涉及使用糖基化酶、核酸酶、脂肪酶中的一者或多者或上述酶的组合。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述至少一个酶处理步骤涉及使用DNA糖基化酶,例如尿嘧啶DNA糖基化酶,优选为尿嘧啶-N-糖基化酶,其中所述DNA糖基化酶处理步骤在高温下进行并在30min或更短时间、20min或更短时间、15min或更短时间或10min或更短时间内完成,任选地其中所述方法包括在步骤(c)之前稀释从步骤(b)获得的样品,用于进行所述DNA糖基化酶处理步骤。
26.根据权利要求24或25所述的方法,其中在步骤(b)与步骤(c)之间进行至少一个核酸酶处理步骤,其中所述核酸酶是核糖核酸酶,例如核糖核酸酶A。
27.根据权利要求24至26中的任一项所述的方法,其中在步骤(b)与步骤(c)之间进行的不同于蛋白水解消化步骤的酶处理步骤包括:
-添加DNA糖基化酶,更优选为尿嘧啶DNA糖基化酶;和
-添加核糖核酸酶,例如核糖核酸酶A。
28.根据权利要求23至27中的一项或多项所述的方法,其中
-步骤(a)的特征在于所述蛋白水解酶是蛋白酶例如蛋白酶K,步骤(a)在120min或更短时间、任选地100min或更短时间、90min或更短时间或70min或更短时间内完成,并且加热在35-75℃、任选地40-70℃范围内的温度下进行;并且
-步骤(c)的特征在于所述蛋白水解酶是蛋白酶例如蛋白酶K,步骤(c)在30min或更短时间、任选地20min或更短时间内完成,并且加热在35-75℃、任选地40-70℃或50-70℃范围内的温度下进行;并且
其中步骤(c)中的温育短于步骤(a)中的温育,并且其中步骤(c)中的温育温度高于步骤(a)中的温育温度。
29.根据权利要求28所述的方法,其中在步骤(a)和步骤(c)中,将所述样品在温育期间搅拌。
30.根据权利要求2至29中的一项或多项所述的方法,所述方法包括按照权利要求23至29中的一项或多项中所定义的、优选地权利要求26至29中的一项或多项中所定义的裂解方法裂解所述固定的生物样品,
其中在步骤(c)之后,所述方法包括
(d)从所述裂解的样品纯化DNA,其中步骤(d)包括
-将DNA与固相结合;
-任选地清洗结合到固相的DNA;和
-从所述固相洗脱所述DNA;
并且其中所述方法还包括
(e)分析所纯化的DNA,其中分析包括下述一者或多者:
(i)扩增所述DNA,优选地使用聚合酶扩增所述DNA;
(ii)使用大扩增子PCR和/或短扩增子PCR扩增所述DNA,任选地其中所述大扩增子PCR用于尺寸为至少500nt的DNA分子,并且所述短扩增子PCR用于尺寸小于500nt、优选地≤300nt、≤200nt或≤150nt的DNA分子;和/或
(iii)执行下一代测序方法。
31.根据权利要求30所述的方法,其中步骤(e)包括执行下一代测序方法,所述测序方法包括
(aa)将独特分子标识符序列附连到所述DNA分子,其中每个DNA分子包含不同的独特分子标识符序列;
(bb)扩增带有附连的独特分子标识符序列的DNA分子;以及
(cc)对所述DNA分子进行测序。
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