TWI462930B - 福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法 - Google Patents

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Description

福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法
本發明係關於一種核酸分離方法，特別是關於一種自福馬林固定石蠟包埋樣本中取得核酸之核酸分離方法。
福馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，簡稱FFPE)是目前最廣泛採用的保存病理樣本之方法。尤其對於臨床病理診斷與病理機制研究而言，福馬林固定石蠟包埋方法及組織樣本更是不可或缺的必要工具之一。由於生物組織樣本離體後，容易腐化難長久保存，而福馬林固定石蠟包埋組織則提供了一完善的解決方法：經由適當的福馬林固定石蠟包埋，樣本得以充分保有其組織原貌，供長期保存；更可經由完善的歸檔，建構病理樣本資料庫，病理研究人員可回溯取得組織樣本的狀態，取得更充分的病理分析資訊。
一般而言，福馬林固定石蠟包埋組織較常應用於臨床的病理切片，以各種組織染色方法加以處理，藉由直觀的顯微鏡觀察方法，診察其組織型態與特殊生物分子(例如：蛋白質、核酸、骨質…等)的表現情況，從中獲得大量資訊，精確診斷或探究病理機制。然而，福馬林固定石蠟包埋組織除了能提供上述資訊外，福馬林固定石蠟包埋組織中更保存了另一種藏有豐富珍貴資訊的生物分子一「核酸」。在取得核酸後，配合進行聚合酶連鎖反應(PCR)、反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription-PCR或RT-PCR)、量化即時聚合酶連鎖反應(quantitative real time-PCR或Q-RT-PCR)、微晶片分析(microarray)、 免疫沉澱(immuno-precipitation)分析等各種分子生物學或免疫學技術之分析，測定病理組織中的基因表現，可更深入研究特定疾病的病理機轉與對應之基因調控機制，對病理學之研究助益甚深。
此外，近年來隨著基因體研究的發展，延伸開發出「藥學基因學」(Pharmacogenomics)的領域。簡言之，由於每一個體之間，其基因上的微小差異卻可能造成各個體對藥物的代謝反應歧異，並導致截然不同的臨床症狀。因此，將個體之基因材料(核酸)，應用至藥物測試與藥物作用機制研究，期望可針對各病患精確地偵測其對於藥物的反應，有助於更準確地確立治療方針。亦即，利用福馬林固定石蠟包埋組織中的材料，可將臨床徵狀與個體之分子、基因表現的診察結果連結加以連結，提供更多且更精準的診斷資訊。
由此可見，福馬林固定石蠟包埋組織不僅在傳統的病理分析上扮演著重要角色，其亦具備了長期彙集保存之優勢，可系統性地提供豐富基因資訊，更是未來醫藥研究的有力工具。因此，如何妥善且完整地從福馬林固定石蠟包埋組織中分離出核酸，便成了首要達成的目標。
因此，為了自福馬林固定石蠟包埋組織中取得生物組織，在進行實際的核酸萃取步驟之前，首要步驟便是移除包埋材料(石蠟)，此步驟通常稱為「脫蠟」(Deparaffinization)。然而，目前對於福馬林固定石蠟包埋組織之處理方式，多數採取之前處理方法中均包含習知之有機溶劑脫蠟方法(參見第1圖之脫蠟方法流程示意圖)，簡述如下：步驟1' ：二甲苯脫蠟：以純二甲苯(Xylene)溶液或系列濃度(通常為70%至100%體積百分比)之二甲苯溶液，浸潤福馬林固定石蠟包埋組織，並多次置換二甲苯溶液(如採用系列濃度二甲苯溶液處理時，係依序由最高濃度至較低濃度處理)，以充分溶解石蠟，即可取得原包埋於石蠟中的生物組織。步驟2' ：乙醇置換：使用乙醇(100%體積百分比)浸潤生物組織，並視需求增加置換的次數，以盡可能移除二甲苯溶液。步驟3' ：沖洗或復水(Rehydration)：係以乙醇或系列濃度乙醇(通常為70%至100%體積百分比，溶於純水)浸潤生物組織，以更進一步置換殘留的二甲苯溶液，可選用 直接以100%乙醇置換，或依序由最高濃度至較低濃度進行多次置換，藉此充分洗去殘餘的二甲苯溶液，以執行後續核酸萃取與供核酸分析使用；此外，亦可根據使用者特定之需求與目的，將脫蠟後的組織回溶至水相溶液供後續使用。
於前述過程中，由於脫蠟後的組織係分散於溶液中，每次的置換與分離之程序均須依賴離心方法，使組織聚集於試管底，再將需要置換的溶液吸出排除。因此在繁瑣的置換、離心與液體吸取過程中，生物組織流失的風險相對提高，不利於核酸分離的完整度與效果；此外，一般福馬林固定石蠟包埋組織的採樣量通常很少，前述的繁複程序所造成的不利影響更加顯著。
再者，對於後續分析而言，經由此脫蠟方法對於福馬林固定石蠟包埋組織進行萃取前置處理，係攸關處理後之組織樣本品質(例如石蠟殘留或有機溶劑殘留可能干擾後續分離萃取與檢測效果之缺失)，更連帶影響核酸品質之優劣(例如：萃取效果、核酸濃度、純度等)。
因此，根據上述傳統方法，欲由福馬林固定石蠟包埋組織取得核酸，需要經過繁雜步驟，程序冗長費時，且必須使用毒性有機溶劑，對人體與環境造成危害。此外，隨著基因檢驗方法進展快速，對於核酸品質的要求益加提昇；另一方面，隨著自動化設備檢測之需求與日俱增，為了達成快速檢測甚至高通量之篩檢效果，核酸萃取的效率也成為本領域技術發展的重要目標。
美國專利申請案公開第20070026432號說明書，提出了一種自福馬林固定石蠟包埋組織中萃取核酸的方法，其可快速自福馬林固定石蠟包埋組織中萃取獲得核酸，供後續分析使用。然而，實務上，此方法因未充分將包埋組織用的石蠟溶出或分離，又石蠟於其融點溫度附近便開始產生固化(通常低於60度左右即產生)，逐漸凝結成膠狀或固態石蠟，因此，此方法在操作流程各步驟之溶液對於溫度相對敏感，亦即須保持一定的溫度，避免石蠟凝出；否則石蠟便有可能因溫度降低而凝結成固態而懸浮或是沉降於溶液中，干擾操作。尤其，當使用者欲應用此核酸萃取技術至自動化設備時，此現象十分不利，理由在於：由於現有之萃取核酸自動化設備均配置了大量的管路組件與移液組 件，因此對於萃取步驟中的溶液品質要求相對較高，才得以使管路流暢運作，而前述方法可能引起的石蠟凝結現象所造成的非液態成分，則會造成管路阻塞，干擾自動化設備運作，嚴重者則可能加速設備的耗損；並且連帶影響產品之萃取與純化品質等問題，因此勢必須以額外的步驟與設備(例如離心分離、過濾器或濾網等)對此缺失加以處理，故十分不利於自動化。
由此可見，如何兼顧「簡化福馬林固定石蠟包埋組織樣本的前處理流程」、「萃取之核酸品質」與「自動化應用」等需求，已成為本技術領域亟欲達成的目標。
為解決上述先前技術之缺失，本發明提供了一種福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，係自一福馬林固定石蠟包埋樣本分離出核酸，此福馬林固定石蠟包埋樣本中包含一石蠟材料及一生物性組織樣本，此方法包含以下步驟：(1)加入一可溶解此石蠟材料之第一溶液與一可裂解生物性組織樣本之第二溶液至福馬林固定石蠟包埋樣本，均勻混合第一溶液、第二溶液與福馬林固定石蠟包埋樣本之後，取得一第一混合液；(2)以50至80℃範圍內之溫度加熱第一混合液30至90分鐘之後，再以80至95℃範圍內之溫度加熱第一混合液30至90分鐘；使第一混合液產生分層現象，形成一水相層與一油相層；(3)取出前述水相層內之一水相層液；以及(4)自水相層液中，以分離出一核酸。
根據本發明提供之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，其中自水相層液中，分離出核酸的方法包含：有機溶劑萃取分離方法、層析管柱分離方法與磁性分離方法。
根據前述本發明提供之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，其中，第一溶液係一油相溶液，用以溶解福馬林固定石蠟包埋樣本之石蠟材料，此油相溶液之成分包含二甲苯、6-溴己基乙酸酯、檸檬油精。而第二溶液 係一水相溶液，用以裂解福馬林固定石蠟包埋樣本之生物性組織樣本，其成分包含至少一緩衝液、至少一界面活性劑與至少一金屬螯合劑；且其成分可進一步包含一蛋白質水解酵素。
根據上述本發明之精神，本發明之首要目的，係提供一種福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，係可廣泛套用之各種脫蠟試劑，且當配合使用組織裂解液時，可直接將福馬林固定石蠟包埋樣本中的石蠟充分溶解，並且同時裂解生物性組織樣本，並進行後續的核酸分離程序，可增進核酸分離的回收率，達成簡易又有效率地取得核酸之目標，且本發明對於較小型體積的福馬林固定石蠟包埋樣本之核酸分離效果尤佳。
本發明之再一目的，係使用油相溶液(脫蠟試劑)，配合使用水相溶液(組織裂解液)，均勻混合後，使生物性組織樣本中的核酸充分地溶入水相層中，而石蠟則溶入油相中；並藉由油水兩相分離之特性，使混合液分為油相層及水相層，便能能簡易且有效地自水相層之水相層液進一步分離核酸，增加核酸回收率及分離效能，並同時避免石蠟殘留之缺失。
本發明之又一目的，係提供一種福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，無須使用繁複的離心步驟，且可同時簡化脫蠟處理程序與分離核酸效能，十分適用於各種現有之核酸分離方法，並十分適合應用於自動化核酸分離設備與操作程序。
1' ‧‧‧步驟1'
2' ‧‧‧步驟2'
3' ‧‧‧步驟3'
10‧‧‧油相溶液、第一溶液
20‧‧‧水相溶液、第二溶液
30‧‧‧裂解液、第三溶液
11‧‧‧第一混合物
12‧‧‧第二混合物
100‧‧‧FFPE組織樣本、福馬林固定石蠟包埋樣本
101‧‧‧核酸
102‧‧‧生物性組織樣本
103‧‧‧石蠟材料
121‧‧‧油相層
122‧‧‧水相層
122' ‧‧‧水相層液
S1‧‧‧步驟S1
S2‧‧‧步驟S2
S3‧‧‧步驟S3
S3' ‧‧‧步驟S3'
8‧‧‧樣品8
8' ‧‧‧樣品8'
1000‧‧‧樣品1000
E‧‧‧空管E
第1圖 係一流程示意圖，示意傳統脫蠟方法之流程。
第2A圖 係一流程示意圖；示意本發明之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法之操作步驟S1與S2。
第2B圖 係一流程示意圖；示意本發明之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法之操作步驟S3與S3' 。
第3A圖 係一數據長條圖，呈現本發明之對照例1及實施例2至4所得之 DNA分離效果之比較結果。
第3B圖 係一數據長條圖，呈現本發明之對照例1及實施例2至4所得之對於不同體積之生物性組織樣本核酸分離效果之比較。
第4圖 係一數據長條圖，呈現本發明之實施例5、7與對照例6、8所得之對於不同體積之生物性組織樣本核酸分離效果之比較。
第5圖 係一照片圖，呈現本發明之對照例8取得之混合液樣品之液體狀態，同時對照實施本發明之實施例7所述方法所得之水相層液之液體狀態。
為使本發明之目的、技術特徵及優點，能更為相關技術領域人員所了解並得以實施本發明，在此配合所附圖式，於後續之說明書闡明本發明之技術特徵與實施方式，並列舉較佳實施例進一步說明。以下文中所對照之圖式，係表達與本發明特徵有關之示意，並未亦不需要依據實際情形完整繪製，合先敘明。
本發明係關於一種福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，此方法中所使用之福馬林固定石蠟包埋樣本之製備原理、及生物材料組織之核酸分離與萃取技術之原理、特性、設備、基本操作流程，已為相關技術領域具有通常知識者所能明瞭，故下文不再作完整描述。
本發明所揭露之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法(以下簡稱「本發明之方法」)係利用油相溶液與水相溶液之物理及化學特性，將福馬林固定石蠟包埋樣本液體化之後，取得均質化狀態之檢體溶液，接著進一步使檢體溶液分層成為油相層與水相層，並自水相層取得其中的水相層液，從中分離出或萃取出核酸。本發明之方法相較於傳統採用繁複置換步驟之脫蠟方法(如第1圖所示)，係一更加有效率、簡易且適合自動化之方法，而本發明之方法之優點，係隨具體實施之態樣詳述於後。
本發明記載之「油相溶液」係泛指親油性的液體或溶液；「水相溶液」係泛指親水性的液體或溶液。將油相溶液與水相溶液兩者混合後，通常 會形成「液-液互不相溶」的兩相，又稱作「油水兩相不相溶」之現象，此特性可應用於分離水溶性分子與疏水性(hydrophobic)分子，但往往涉及繁複的「油相溶液」與「水相溶液」的摻合或置換程序。
基於前述原理，針對福馬林固定石蠟包埋樣本而言，活體中生物組織原處之環境(如人體組織)及其本身為富含水性溶液的環境，是故以往為了長期保存生物組織樣本，往往在取得組織後，先以固定液(例如：福馬林溶液)對進行固定(Fixation)與脫水(dehydration)，接著於脫水完全後，使用疏水性的包埋材料(embedding medium)例如石蠟材料，將組織包埋，以長久保存供後續使用，即本發明所述之「福馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，簡稱FFPE)樣本」；然而，關於FFPE組織樣本之製備已為本領域技術人員所習知之技術，不再詳述。同時，為簡潔表明具體實施方式，以下將「福馬林固定石蠟包埋樣本」簡稱為「FFPE組織樣本」。
此外，本發明所指之「FFPE組織樣本」係泛指經由含甲醛或甲醛衍生物之組織固定液浸泡並固定後，再經由石蠟材料包埋所得之生物性組織樣本。亦即本發明對於FFPE組織樣本來源所使用的固定液「福馬林」(Formalin)溶液的範疇不加以嚴格限制。原因在於，一般而言，福馬林是甲醛(Formaldehyde)的水溶液，甲醛含量通常為35%至40%(最常用的是37%)。而直接用於固定組織的固定液通常是含有約10%福馬林之中性溶液，即福馬林與水為1：9之比例所製得之福馬林溶液，其含濃度4.1%至4.5%之甲醛；亦可視需求加入添加物至固定液中，例如：各種系統之生理緩衝液、酸鹼液(調節pH值使用)或甲醇(濃度常為10%至15%，用以防止聚合)等。因此，經由前述所得之甲醛及由甲醛所衍生之系列固定液，例如多聚甲醛(paraformaldehyde)所固定之組織樣本，均涵蓋於本發明所指之FFPE組織樣本的範圍內。且同樣地，本發明亦不限制石蠟包埋材料之種類，凡是以石蠟系列之包埋材料之所得之FFPE組織樣本，無論其包埋程序與石蠟種類，均屬本發明所指之FFPE組織樣本之範圍內。
根據前述FFPE組織樣本之製備原理，如欲對FFPE組織樣本中 的生物性組織進行分析，勢必須先行克服石蠟材料的障礙。針對此問題，以往採用的脫蠟方法(請同時參考第1圖)主要是利用有機溶劑，例如甲苯(toluene)、二甲苯(xylene)等，將石蠟材料溶解，並歷經多次置換有機溶劑後，才能充分移除石蠟；其後再以系列的「油相溶液與水相溶液互相摻合與置換」繁複步驟，使用酒精溶劑(例如乙醇或異丙醇)將前述之有機溶劑洗去即所謂「沖洗」；或進一步置換為水性溶劑，即所謂「復水」(rehydration)步驟，方可取得供核酸分離與萃取使用的生物性組織，且生物性組織可能在繁複的操作中流失，顯著影響了後續分離核酸的回收率。
為了解決上述既有方法之缺點，本發明提出一種福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，可簡易且有效地自一FFPE組織樣本分離出核酸。請同時參見第2A與2B圖，係此方法流程示意圖，同時說明本發明之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法如後。
FFPE組織樣本100中至少包含一石蠟材料103及一生物性組織樣本(target tissue)102，此生物性組織樣本中含有核酸101。而經由本發明之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法所得之核酸101，可供使用者作為後續純化與分析之材料等應用，對於分離後的核酸101應用方式，本發明亦不加以限制，例如：聚合酶連鎖反應(PCR)、反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription-PCR或RT-PCR)、量化即時聚合酶連鎖反應(quantitative real time-PCR或Q-RT-PCR)、微晶片分析(microarray)、免疫沉澱(immuno-precipitation)分析等各種分子生物學或免疫學技術之分析。
關於FFPE組織樣本100之體積大小，舉病理組織為例，影響病理組織之FFPE組織樣本100體積大小的因素包括：生物性組織樣本102之取樣困難度、取樣之病灶組織型態(例如發炎區或非發炎區)、及分析目標之特定組織型態(如上皮組織、結締組織、肌肉組織等特定組織位置)等因素，所得樣本通常都相當小量而稀少，因此取樣時常採用微量取樣的方式進行(如針刺採樣)，因此取得的FFPE組織樣本100之體積通常都較小，因此其中相對應所含 有的核酸量通常也較少，而根據本發明實施例可知，本發明對於小體積的生物性組織樣本102帶來的效益尤其明顯(詳見後述實施例之說明)，因此，本發明對於FFPE組織樣本100之體積不加以限制，亦即可適用於常態性的生物性組織樣本102，亦適用於小體積的微量生物性組織樣本102。
本發明所採用的大型、中型、小型FFPE組織樣本100的定義係根據取得之FFPE組織樣本的「體積」而定，而此體積大小係取決於取得之FFPE組織樣本之「組織表面積」及「組織厚度」。一般常用於取得一FFPE組織樣本100的方法常採用切片(sectioning)方式，從FFPE組織樣本蠟塊取得部分的蠟塊切片，即為本發明用於分離核酸之FFPE組織樣本100。由於一般生物性組織的蠟塊大小差異不大，而切片厚度通常介於5-20 μm(即0.005-0.02 mm)。因此，若無特別指定，本發明所指之大型FFPE組織樣本100係指切片後，面積介於2.5-4 mm2 ，厚度介於5-20 μm之樣本，其體積介於0.0125-0.08 mm3 ；中型FFPE組織樣本係指面積介於1.5-2.5 mm2 ，厚度介於5-20 μm之樣本，其體積介於0.0075-0.050 mm3 ；小型FFPE組織樣本係指面積介於0.2-1.5 mm2 ，厚度介於5-20 μm之樣本，其體積介於0.001-0.03 mm3 。然而，需要強調的是，本領域技術人員可瞭解，由於生物組織取樣時的方法與需求相當多元，前述本發明對於樣本面積或體積之限定，係為利於具體說明本發明之特徵與優勢，並非用以限定本案發明之實施態樣。換言之，本發明亦不排除體積範圍落於前述體積範圍之外的樣本，亦即大於或小於前述指定體積範圍之FFPE組織樣本。其中，針對大於前述指定體積範圍FFPE組織樣本而言，只要實施時，充分確認採用的溶劑量足以融溶(capacity)FFPE組織樣本所含有的石蠟即可適用；對於小於前述指定體積範圍的FFPE組織樣本，只要經估計其核酸含量或回收率可獲得足量核酸(即在核酸濃度偵測設備的靈敏度範圍內)即可適用；因此，根據前述前提，無論大型、中型或小型FFPE組織樣本，均涵蓋於本發明所述之FFPE組織樣本。
首先，請參考第2A圖，係本案發明步驟S1與S2之示意圖。先行提供一FFPE組織樣本100置於微量離心管中(或其他功能相同的容器)，接 著執行步驟S1，係將一油相溶液10(亦稱第一溶液)與一水相溶液20(亦稱第二溶液)加入至前述之FFPE組織樣本100進行混合。前述混合過程中，由於油相溶液10可溶解石蠟材料103，且水相溶液20可裂解生物性組織樣本102，因此，油相溶液10與水相溶液20加入後，便開始將FFPE組織樣本100溶融；而前述之油相溶液10、水相溶液20與溶融狀態之FFPE組織樣本100所構成的混合物，於均勻混合後即可取得一第一混合物11。其中，本發明採用的油相溶液10與水相溶液20的體積比例為：油相溶液10體積與水相溶液20體積之比值為0.5至4，其較佳比例為1至3，更佳值為1.5至2.5。
前述步驟所使用之油相溶液10係用於溶解石蠟材料103，本發明所使用之油相溶液10的成分中，廣泛包含苯環類有機溶劑以及現今常用的脫蠟溶劑，只要能夠充分溶解石蠟之溶劑即可適用於本發明，具體而言，油相溶液10成分為直鏈碳氫化合物或支鏈碳氫化合物(可包含苯環結構)，其化合物之碳數介於7-10，於常溫下為液態，以利作為溶劑使用；本發明不限制油相溶液為單一成份之碳氫化合物或是混合兩種以上碳氫化合物成分所構成的混合物，惟其須具有融溶石蠟的能力，以作為石蠟之溶劑。其中則以：甲苯(toluene)、二甲苯(Xylene)、6-溴己基乙酸酯(6-bromohexyl acetate)、檸檬油精(citrosol；CAS 65996-99-8)為較佳之實施態樣。換言之，油相溶液10在水相溶液20中具有良好的分散能力，使油相溶液10能在水相溶液20並存的情況下充分溶解石蠟103，使生物性組織樣本102暴露於水相溶液20中，進而促進生物性組織樣本102之裂解(如第2A圖之FFPE組織樣本100虛線所示意)，以充分釋放出其內含的核酸分子101。
關於水相溶液20，係用於裂解生物性組織樣本102，本發明並不加以限制水相溶液20的種類，一般常用或市售用於裂解生物組織與細胞的水性裂解液均適用，使用者可依照生物性組織樣本102的種類而選用不同配方的水性裂解液，只要能有效裂解生物性組織樣本102，使核酸分子101充分釋出至水相溶液20即適用於本發明所提出之方法。水相溶液20之成分通常包含至少一 緩衝液、至少一界面活性劑與至少一金屬螯合劑。而較佳的水相溶液20，其較佳成分應包括下列成分：緩衝液(例如：Tris系統緩衝液、高鹽緩衝液)、離子螯合劑(例如：EDTA)、界面活性劑(detergent；例如：SDS、NP-40、Triton X-100、Tween-20等)、蛋白質水解酵素(例如：Proteinase K)並可視需求選擇性加入蛋白酶抑制劑(proteinase inhibitor)或其他種類的抑制劑、蛋白質變性劑(例如：鹽酸胍；guanidine hydrochloride；GuCl)等有助於裂解組織用之試劑。
需要說明的是，本發明之油相溶液10與水相溶液20具有良好的分散特性，故於實際操作上，並不限制加入油相溶液10或水相溶液20之先後順序，因此，本發明亦涵括了油相溶液10與水相溶液20兩者混合加入之實施態樣(第2A圖中步驟S1之虛線係示意加入前述溶液至FFPE組織樣本100狀態時之液面)；只要將油相溶液10與水相溶液20充分混合，使油相溶液10、20水相溶液20與溶解之FFPE組織樣本100混合均勻，便可達到本發明步驟S1之效果，即取得前述之第一混合物11。
接著，步驟S2係先行將前述步驟所得之第一混合物12進行加熱程序(圖未示)。本發明之加熱程序較佳可細分為兩種溫度區間，其一為第一段加熱區間，可實施溫度為50至80℃；較佳溫度為50至65℃；更佳溫度為53至60℃；另一為第二段加熱區間，可實施溫度為80至95℃；較佳溫度為80至95℃；更佳溫度為85至93℃。前述第一段加熱區間時間係取決於FFPE組織樣本100特性而定，例如：FFPE組織樣本100的體積大小(體積愈大所需要的加熱時間相對較長)。根據FFPE組織樣本100的特性需求，若FFPE組織樣本100較大，其加熱時間甚至可延長為隔夜加熱，以提升其融溶效果。但一般實務上較常見的狀況及時效考量而言，其可實施範圍介於30至90分鐘；較佳為45至80分鐘；更佳為50至70分鐘。而第二段加熱區間時間可實施範圍30至90分鐘；較佳為45至80分鐘；更佳為50至70分鐘。
而根據本領域技術人員可理解，此步驟S2中採用的實際加熱方式並無嚴格限制，可將加熱器(或可供加熱的各式加熱設備均適用)先行定溫 達指定溫度後後，將裝有第一混合物11之微量離心管置入並加熱達指定之加熱時間，或是裝有第一混合物11之微量離心管置於加熱器中，共同加熱至指定溫度，達到指定之加熱時間。此加熱步驟的目標包含：使第一混合物中的物質(例如：石蠟材料103與生物性組織樣本102)溶解或裂解得更加完全，使生物性組織樣本102所含之核酸更加充分釋出至第一混合物11中，以利後續核酸分離或萃取等應用。就實際操作而言，較佳之實施狀態係使第一混合物11充分均質化(homogenization)，同時也表示第一混合物11中之石蠟材料103與生物性組織樣本102已充分溶解或裂解，並釋出至第一混合物11。經由以上加熱步驟，可增進石蠟材料103溶解的效果，並促進生物性組織樣本102的裂解，整體提升脫蠟與裂解之效率與品質。此外，須強調的是，本發明所提出的方法，既已具備免繁複步驟執行脫蠟程序之優點，亦可在加入油相溶液10能在水相溶液20之後，整體進行加熱，不需要像傳統方法(必須在脫蠟時先行加熱助石蠟溶解，於脫蠟完全後，再次針對裂解之目的進行加熱)便可達到促進脫蠟與核酸分離效果之目標，明顯較習知方法簡易且有效。
完成前述步驟後，於此階段的樣本中，石蠟材料103已充分融溶於油相溶液10中，使得生物性組織樣本102充分暴露於水相溶液20中，同步進行組織與細胞裂解作用，將生物組織中的核酸釋放至第一混合物11中。本發明之另一的優勢在於，同步使用油相溶液10與水相溶液20對於生物性組織樣本102的裂解作用的效果並不產生干擾。因此，本發明所提供之方法可同步加入油相溶液10與水相溶液20進行融溶脫去石蠟材料103與生物性組織樣本102裂解，達到簡化程序且提高效率的效果。
接著，自加熱器取出加熱後的、裝有第一混合物11之微量離心管，於室溫中稍加靜置，使第一混合物11產生分層現象，即形成一水相層122與一油相層121(第2A圖中步驟S2之虛線係示意油水分層之介面位置)。換言之，由於此第一混合物11實質上仍包含不互溶的油相溶液10與水相溶液20，因此將其靜置後，即產生「油水分層」的現象，可區分為上層部分以油相溶液 10為主的油相層121與下層部分以水相溶液20為主的水相層122，而此階段之油相層121與水相層122的體積比例隨著前述之步驟S1所加入的油相溶液10體積與水相溶液20體積之比例而定。在油水分離產生分層後，其中核酸101與可能尚未裂解完全的少部分生物性組織樣本102係存於水相層122中；溶解後的石蠟材料103與溶劑成分則被充分分離至油相層121，故於後續之核酸分離與萃取程序上，係針對水相層122進行後續處理，使用者可選擇：移除油相層121以留存水相層122；或是直接吸取水相層122，以進行後續處理，而本發明係採用直接吸取水相層122之方式為較佳實施態樣。
因此，本發明提供之方法並僅需以前述之簡易方式或取得含有核酸101的水相層122，即可用於後續之核酸分離。相較之下，傳統方法必須對有機溶劑與水性溶液進行置換，且在置換的過程中必然需要對樣品進行洗淨(wash)，例如使用乙醇反覆數次清洗二甲苯脫蠟後的生物組織樣本，以充分置換並洗去殘留的二甲苯，方能執行後續生物組織裂解與核酸分離萃取的程序，故往往需要多重的離心步驟。而本發明提供之方法不需要繁複的離心步驟進行脫蠟與溶劑置換等前置處理方法，以供核酸101分離，明顯地簡化了處理程序；然而，如因使用者需求，需要加速第一混合物11產生分層，亦可選用離心方法以達成加速分層的目標。
此外，前述之經加熱後的第一混合物11在逐漸冷卻至石蠟的融點溫度(通常落於60℃至65℃左右)以下，甚至到室溫後，仍能維持液體狀態，不會有石蠟凝結成塊的現象產生。相較之下，傳統的脫蠟方法如採用加熱方式融溶石蠟，則脫蠟程序將受限於溫度，換言之，在脫蠟程序中，溫度必須高溫(以高於石蠟融點溫度為佳)，使溫度條件足以維持石蠟溶解，直到確實從生物組織中分離石蠟後，才能回復為室溫操作，否則石蠟會隨著溫度降低而能凝結，對於脫蠟效果及後續的核酸分離程序產生顯著的干擾。反觀本發明所提出的方法，第一混合物11經過加熱至冷卻的過程中，均不產生石蠟凝結的現象，故有效地避免了上述缺失。
此外，由於生物性組織樣本102的體積通常很小，經傳統方法脫蠟後的生物性組織樣本102係以屑狀片段或微小團塊的狀態散佈於溶液中，故必須經由離心方式使其聚集於試管底部，以執行前述之置換或洗淨步驟。然而，即使是將生物性組織樣本102聚集後形成塊狀體(pellet)，其塊狀體整體之體積與溶液(即待後續移除的溶液)之體積仍相差懸殊，勢必須經由人工操作，仔細將溶液移除以進行後續處理，故需要較冗長繁複的人工操作；又，如人工操作不當或疏失，亦可能造成溶液置換不全或殘留的現象，以及生物組織的流失的缺失，影響核酸分離品質。故本發明之方法不須採用離心步驟的優點對於處理微量的生物性組織樣本102時，將更加有利於應用。
請繼續參考第2B圖，係示意延續自步驟S2之步驟S3 。S3之步驟係針對含有核酸101之水相層122進一步處理，供後續核酸分離使用。針對步驟S2所得之分層的第一混合物11，以移液管伸入微量離心管內之水相層122，吸取出水相層122內之一水相層液122' 。
本發明所提供之簡化的福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，除不須採用離心步驟之外；其油相層121與水相層122之體積相當、或是體積差異小，有利於分離水相層122的效果。
具體言之，根據前述之實施方式，本案油相溶液10與水相溶液20之比例可實施範圍為：油相溶液10體積與水相溶液20體積之比值為0.5至4；換言之，本領域技術人員可輕易理解，當第一混合物11分層後，油相層121與水相層122之體積比例是可以預先估量後加以設定為定值，以減少兩者之體積差異。因此，就人工操作而言，以人工手動操作吸取水相層122時，由於其分層明顯且油水界面清晰、兩層的體積差異不大，既可避免誤取油相層121的問題，又可充分吸取水相層122之溶液以獲得更足量且完整的核酸，使吸取的效果更完善。此外，由於水相層122比重較油相層121大，水相層122分層後係分佈於微量離心管下層近管底尖端處，足以讓使用者輕易地取出水相層122中的水相層液122' ，且依據水相層122溶液體積而言，回收率高達80%(即取得 之水相層液122' 體積佔水相溶液20體積之比率)，且當以自動化設備操作，其回收率更佳，有效改善了生物性組織樣本102於繁複操作步驟中流失的問題。
而上述的操作便利性不僅有利於人工操作並減少取液誤差(pipette errors)。就自動化設備之應用而言，由其兩相(油相溶液10與水相溶液20)之體積比例固定，使用者可充分預估水相層122的體積，並規劃欲取得之水相層液122' 之體積，賦予本發明福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法「可定量」之特性，使本發明更加適合自動化之機械移液設備，亦即使用者可根據需求預先評估、之體積比例，並預估所得水相層液122' 的量(相應為分層後兩相介面之位置)，無須額外添購設備便能以現有之自動化設備加以應用，進行標準化並同步的核酸分離處理。具體言之，由於本發明可免除離心步驟，故可直接採用現有的自動化設備進行加液或移液之步驟；而油水分層且兩層體間的積積比例穩定的特性，則讓使用者可預先估算水相層122體積，藉以設定自動化設備，使其快速且穩定地取得一致的水相層122體積供後續分離萃取使用，可顯著提升操作效能，且自動化的操作更有利於後續步驟的「量化分析」應用。此舉不但提升了核酸分離效能，更能避免人為誤差所造成之定量誤差、樣本流失或誤取非樣本物質所造成的汙染(contamination)等問題。
於取得水相層液122' 之後，可進一步以步驟S3' 加以處理。步驟S3' 之目的包含(1)使水相層液122' 中仍可能存有之生物性組織樣本102進一步充分裂解以更完整地回收取得核酸101；(2)根據後續的核酸分離方法執行S3' 步驟，並調整其添加的試劑成分，以利提升整體的核酸分離品質。於步驟S3' 中，加入一同樣可裂解此生物性組織樣本102之裂解液30(第三溶液)至此水相層液122' ，並加以均勻混合，以形成第二混合液12；由於裂解液的主要用途為裂解殘餘的生物性組織樣本102，其成分以「裂解生物組織與細胞」為訴求，一般常用或市售用於裂解生物組織與細胞的裂解液均適用，使用者可依照生物性組織樣本102的種類或其他使用需求而選用不同配方的裂解液30，只要能有效裂解生物性組織樣本102，使核酸101充分釋出至第二混合液12之裂解液，即適 用於本發明所提出之方法；此外，根據不同的後續核酸分離方法(例如：有機溶劑萃取分離方法、磁性分離方法、層析管柱分離方法)，可調整裂解液30的成分，使所得之第二混合液12更符合核酸分離方法的需求；舉例而言，當後續欲使用層析管柱分離方法時，即可選擇添加鹽酸胍(GuCl)至裂解液30中，使裂解液30能讓第二混合液12充分的裂解殘留的蛋白質，使含有核酸101的第二混合液12在通過層析管柱之層析濾膜時賦予層析濾膜適當的荷電性，使核酸101與濾膜的結合效率更佳，以提升整體核酸分離效果。就本發明較佳實施態樣而言，裂解液30之成分通常包含至少一種緩衝液、至少一種界面活性劑。而較佳的裂解液30，其較佳成分應包括下列成分：緩衝液(例如：Tris系統緩衝液)、多種界面活性劑(例如：SDS、NP-40、Triton X-100、Tween-20等)、及變性劑如：尿素(Urea)或鹽酸胍(GuCl)等，並可視需求選擇性加入各式之酵素抑制劑，調整裂解液30之成分。因此本發明對於裂解液30之成分與組成不加以特別限制。
步驟S4(未圖示)係自前述之第二混合液12中分離出核酸101。根據前述本發明之步驟S1至S3，可取得一第二混合液12，並可選擇採用步驟S3' 加以處理第二混合液12。其中溶有核酸101，須進一步以後續分離與純化方法，自第二混合液取得核酸101。然而本發明對於核酸101之分離與純化方法並不加以特別限制，換言之，本發明之概念及實施方式係廣泛適用於現有的各種核酸分離與純化方法。然而，本技術領域中目前常用於分離與純化核酸的方法主要包含：有機溶劑萃取分離方法、磁性分離方法、層析管柱分離方法。其中，有機溶劑萃取分離方法最常採用「酚-氯仿有機溶劑法」(phenol-chloroform method)；而層析管柱分離方法則泛指「離心式層析濾膜法」(spin-column based method)；磁性分離方法係主要採用「磁性顆粒之磁性吸附法」，廣泛應用於自動化設備。而前述方法之原理與實施細節係為本領域技術人員所熟知，其中各方法均具有其優缺點，故不再加以詳述。簡單舉例言之，有機溶劑萃取分離方法可得到高純度且高品質的核酸，然而較易產生樣本流失問題及溶劑使用安全 性考量；而層析管柱分離方法則具有快速且方便的優勢，然而其費用通常較為昂貴，且須配合離心設備並依序搭配多種特定配方溶液使用才能達到預期效果；至於磁性分離方法亦為一簡易且安全之方法，雖然其成本較有機溶劑萃取分離方法高，但其分離效果佳、操作簡便且安全，更非常適用於自動化設備，極適合用於高通量(high throughput)分析之操作。
綜上所述，本發明所提供的簡化的福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，整合了脫蠟程序與生物組織裂解程序，使移除石蠟材料與裂解生物性組織樣本得以同步進行，可有效減少繁複處理所造成的組織損失問題，故能在效率較佳的核酸分離過程中，仍然保有良好的核酸分離品質與回收率(產率)。
為充分說明本發明之精神與具體實施方式使本領域之通常知識者得據以實施，以下列舉本發明之較佳實施例與對照例加以闡釋。
首先要說明的是，以下所有實施例述及FFPE組織樣本依體積大小區分為三類：小型FFPE組織樣本、中型FFPE組織樣本、大型FFPE組織樣本；其體積之範圍分別為如前述實施方式內容所定義，於此不再重複描述。
對照例1
傳統二甲苯逐步脫蠟方法(傳統脫蠟)
本對照例係以一種傳統二甲苯逐步脫蠟方法分別對大型、中型、小型FFPE組織樣本進行脫蠟處理，後續以「層析管柱分離方法」分離取得核酸產物。實施步驟如下：將1 ml二甲苯加入分別裝有大型、中型、小型之FFPE組織樣本的微量離心管中，加以震盪混合(vortex)後，靜置於60℃環境下10分鐘，接著於室溫下離心(轉速12000 rpm)10分鐘，取出微量離心管，移除上清液；接著加入1 ml 95%乙醇(以下簡稱EtOH)，震盪混合後於室溫下靜置10分鐘，接著於室溫下離心(轉速12000 rpm)10分鐘，取出微量離心管，移除上清液；於60℃環境下使樣本乾燥10分鐘。加入180 μl裂解液A(1% SDS；30 mM Tris-Hcl；10 mM EDTA)及20 μl蛋白質水解酵素K(proteinase K)於56℃環 境下加熱1小時候，於室溫下靜置，同時啟動加熱設備使加熱器升溫至90℃；將前述樣本於90℃環境下加熱1小時，接著加入200 μl裂解液B(5% TritonX-100,10% Tween-20,5M GuHCl)，混合均勻後再加入200 μl 100% EtOH並混合均勻，短暫離心(spin down)後，取得樣本混合液。
接著以QIAGEN核酸純化套組接著以QIAGEN核酸純化套組(QIAGEN；QIAamp DNA FFPE Tissue Kit；Cat.No.56404)之層析管柱分別對大型、中型、小型FFPE組織樣本所得之樣本混合液進行核酸分離，其係利用離心式層析管柱(spin-column)方法分離核酸，其實際方法係參照廠商所附之使用說明，簡述如下：將所有的樣本混合液加入層析管柱中，離心(轉速8000 rpm)1分鐘，換新的集液管(collection tube)之後，加入500 μl W1緩衝液(Buffer W1)，離心(轉速8000 rpm)1分鐘；換新的集液管(collection tube)之後，加入500 μl沖洗緩衝液(Buffer Wash)，離心(轉速8000 rpm)1分鐘；換新的集液管(collection tube)之後，不加入任何試劑，直接對層析管柱離心(轉速13000 rpm)3分鐘。接著將層析管柱移至新的微量離心管上，加入60 μl之已預熱之沖提緩衝液(Elution buffer)至層析管柱的濾膜(membrane)上，靜置5分鐘。最後，將層析管柱連同微量離心管進行離心(轉速13000 rpm)1分鐘，即為核酸產物。
實施例2
以二甲苯溶解石蠟之前置處理方法(前置處理1)
本實施例係列舉本發明之一較佳實施例，分別對大型、中型、小型FFPE組織樣本進行前置處理，同步使FFPE組織樣本中的石蠟材料溶解且生物性組織樣本裂解，後續以「層析管柱分離方法」分離取得核酸產物。實施步驟如下：首先，將400 μl的二甲苯(油相溶液)、180 μl水相溶液(1% SDS；30 mM Tris-Hcl；10 mM EDTA)及20 μl蛋白質水解酵素K(proteinase K)加入裝有FFPE組織樣本之微量離心管中，加以震盪混合10秒鐘，取得一混合液2A。 之後進行加熱步驟，係將前述混合液2A於56℃環境下加熱1小時之後，於室溫下稍加靜置，同時可將加熱器升溫至90℃，待加熱器溫度完成，於90℃環境下加熱混合液2A達1小時之後。加熱時，微量離心管內會產生水氣，因此可稍微短暫離心將水氣離下至混合液2A中。於此步驟時，可觀察到混合液2A開始產生分層現象，上層為油相層，下層為水相層。接著，以移液管吸取下層之水相層中之水相層液約190 μl，移入新的微量離心管後，加入200 μl裂解液(5% TritonX-100；10% Tween-2；5M GuHCl)至水相層液，並加以混合均勻，即取得混合液2B。
混合均勻後再加入200 μl 100% EtOH至混合液2B中並混合均勻，短暫離心(spin down)後，取得樣本混合液。
接著以QIAGEN核酸純化套組(QIAGEN；QIAamp DNA FFPE Tissue Kit；Cat.No.56404)之層析管柱對樣本混合液進行核酸分離。由於此分離步驟實質上係同於對照例1所敘述之核酸分離步驟，故不再加以重複描述。
實施例3
以6-溴己基乙酸酯溶解石蠟之前置處理方法(前置處理2)
本實施例係列舉本發明之一較佳實施例，分別對大型、中型、小型FFPE組織樣本進行前置處理，同步使FFPE組織樣本中的石蠟材料溶解且生物性組織樣本裂解，後續以「層析管柱分離方法」分離取得核酸產物。其實施步驟實質上同於實施例2，其差異僅在於，實施例3所採用的油相溶液係6-溴己基乙酸酯，故不再贅述實施細節。
實施例4
以檸檬油精溶解石蠟之前置處理方法(前置處理3)
本實施例係列舉本發明之一較佳實施例，分別對大型、中型、小型FFPE組織樣本進行前置處理，同步使FFPE組織樣本中的石蠟材料溶解且生物性組織樣本裂解，後續以「層析管柱分離方法」分離取得核酸產物。其實施步驟實質上同於實施例2，其差異僅在於，實施例4所採用的油相溶液係檸檬油 精，故不再贅述實施細節。
實施例5
自動化磁珠萃取
本實施例係列舉本發明之一較佳實施例，分別對大型、中型、小型FFPE組織樣本進行前置處理，同步使FFPE組織樣本中的石蠟材料溶解且生物性組織樣本裂解，後續以「自動化磁珠萃取方法」分離取得核酸產物。
於前置處理的步驟，本發明實施例5採用的方法實質上同於實施例2，其間不同之處在於：在起初的步驟中，係採用400 μl二甲苯(油相溶液)、400 μl水相溶液(1% SDS；30 mM Tris-Hcl；10 mM EDTA)及20 μl蛋白質水解酵素K加入裝有FFPE組織樣本之微量離心管中進行處理取得混合液；而在於在混合液分層後取得水相層液之後，本實施例係將水相層液直接應用至自動化磁珠萃取設備(型號：MagCore® HF-16，RBC bioscience)進行自動化核酸分離，各樣本最終可取得60 μl之核酸產物。此外，如使用者之核酸萃取設備具有加熱裝置，則可直接應用其設備進行前述之前置處理作業。
對照例6
離心層析管柱萃取方法1(人工離心萃取1)
本對照例係分別對大型、中型、小型FFPE組織樣本以目前市面上廣泛流通使用的傳統脫蠟方法進行處理，分離取得核酸產物。於本對照例中，係採用QIAGEN核酸純化套組(QIAGEN；QIAamp DNA FFPE Tissue Kit；Cat.No.56404)進行整體之脫蠟與核酸分離程序，操作上係按照其使用說明，簡述如下：首先，將1 ml二甲苯分別加入裝有FFPE組織樣本之微量離心管中，震盪混合10秒鐘，室溫下離心(轉速13000 rpm)2分鐘。接著，以移液管吸除上層後丟棄，操作過程中須留意勿吸到離至管底的塊狀體(pellet)。接著，加入1 ml 95% EtOH至微量離心管中，加以震盪以洗去殘留xylene，並於室溫下加以離心(轉速13000 rpm)2分鐘。以移液管吸除管中的EtOH，再以將微 量離心管開蓋，於室溫下靜置或以37℃加熱，使EtOH充分蒸發散逸。同樣地，在吸除廢液的過程中應注意仔細操作，勿誤吸管底的塊狀體。接著，將180 μl緩衝液ATL(Buffer ATL)與20 μl蛋白質水解酵素K加入微量離心管，與塊狀體震盪混合。再以56℃加熱前述混合物1小時之後，於室溫靜置，同時將加熱器加熱至90℃後，將混合物以90℃加熱1小時候，稍加短暫離心以離下加熱產生的水氣。再加入200 μl緩衝液AL(Buffer AL)，混合均勻。接著，再加入200 μl 100% EtOH，並將所有的樣本混合液加入層析管柱中，以「層析管柱分離方法」進行核酸分離，係採用QIAGEN核酸純化套組(QIAGEN；QIAamp DNA FFPE Tissue Kit；Cat.No.56404)之層析管柱；其操作步驟如前述，故不再加以詳述，最終步驟係以60 μl ATE緩衝液(Buffer ATE)沖提取得核酸產物。
實施例7
離心層析管柱萃取方法2(人工離心萃取2)
本實施例係列舉本發明之一較佳實施例，分別對大型、中型、小型FFPE組織樣本進行前置處理，同步使FFPE組織樣本中的石蠟材料溶解且生物性組織樣本裂解，後續以「層析管柱分離方法」分離取得核酸產物。
實施例7之實施方式與前述實施例2一致，其差異僅在於，於實施分離核酸的「層析管柱分離方法」時，係採用另一試劑套組(RBC Bioscience；Genomic DNA Extraction Kit(Tissue)；Cat.No.YGT)之層析管柱，並按產品說明書操作，簡言之，係將前述的樣本混合液移入層析管柱中，以系列緩衝液與離心步驟，最後以60 μl沖提緩衝液沖提取得核酸產物。
對照例8
離心層析管柱萃取方法3(人工離心萃取3)
對照例8係根據先前技術(美國專利申請案公開第20070026432)所揭露之FFPE組織樣本處理方法，分別對大型、中型、小型FFPE組織樣本進行裂解，後續以「層析管柱分離方法」分離取得核酸產物。對照例8之核酸分離方法實質上與實施例7一致，惟對照例8與實施例7之差異在於執行層析管 柱分離方法前的前置處理方式不同，即對照例8僅採用水相溶液處理FFPE組織樣本，之後便直接進行核酸分離。詳言之，對照例8係先將180 μl水相溶液之緩衝液(1% SDS；30 mM Tris-Hcl；10 mM EDTA)及20 μl蛋白質水解酵素K加入裝有FFPE組織樣本之微量離心管中，加以震盪混合10秒鐘後，於56℃環境下加熱1小時之後，於室溫下稍加靜置，同時可將加熱器升溫至90℃，待加熱器溫度完成，於90℃加熱1小時。稍微將水氣離下後，石蠟材料逐漸凝結，並區隔出液態層與固態層，自液態層吸取約190 μl溶液至新的微量離心管後，加入200 μl裂解液(5% TritonX-100；10% Tween-20；5M GuHCl)，混合均勻，得一混合液，再加入200 μl 100% EtOH並混合均勻，經短暫離心後，將所有溶液轉置入層析管柱中，以層析管柱分離方法(RBC Bioscience；Genomic DNA Extraction Kit(Tissue)；Cat.No.YGT)，進行核酸分離，取得核酸產物。
根據上述實施例，將其所得之各樣品進行定量檢測以評估其核酸萃取量，並同時說明本發明之所帶來之效益如下述。首先，請參見第3A圖及第3B圖，均呈現前述對照例1及實施例2至4所得之DNA分離效果之比較結果。根據比較結果可知，本發明本發明所提供之方法與傳統方法相較，無論對於大型、中型或小型體積之FFPE組織樣本，其核酸分離之產率(亦可視作核酸之回收率)均與傳統方法相當(本發明尤其對於小型體積的FFPE組織樣本之效益更佳)，表示本發明提供之方法，除了具有簡易有效且便於操作之特性，產率表現亦佳；此外，根據本發明實施例列舉的三種廣泛使用的溶劑(二甲苯、6-溴己基乙酸酯、檸檬油精)充分證明本案發明之方法十分適合套用於前述溶劑操作系統中，亦可合理推知，目前常用的各種溶解石蠟材料的溶劑皆可套用於本方法中，因此可以依實驗需要，成本與安全性考量選取合適的溶劑，故本發明之概念與精神可推及其他種類之石蠟材料的溶劑。
尤其值得注意的是，請參見表一係基於對照例1及實施例2至4所得樣本之實驗數據加以計算其間差異之倍率，係以特定實施例(2至4)之核酸產物萃取量(DNA萃取量)除以對照例1之方法(即傳統脫蠟方法)所得之 倍率分析表，例如，表一中記載「前置處理1/傳統脫蠟」即前置處理1之DNA萃取量除以傳統脫蠟之DNA萃取量所得之倍率。根據表一並且同時參見第3A圖及第3B圖，本發明所提供之方法隨著FFPE組織樣本體積愈小，愈具有額外優越的產率。具體言之，於大型FFPE組織樣本中可觀察到，前置處理1相較於使用同樣溶劑(二甲苯)的傳統脫蠟方法而言，其DNA萃取量稍高；於中型FFPE組織樣本中，前置處理1同樣優於傳統脫蠟方法之效果，且前置處理2、3的DNA萃取量均亦高於傳統脫蠟方法；至於小型FFPE組織樣本中，其表現更加優異。此現象顯示，本發明提供之方法可克服前述之愈微小體積之FFPE組織樣本於傳統處理方法中，易在處理或沖洗過程產生組織的損失之缺點。
接著，請參照第4圖，係呈現本發明之實施例5、7與對照例6、8中，對於不同體積大小之FFPE組織樣本核酸分離效果之比較。由第4圖所顯示的結果可知，本發明所提供之方法不僅確實適用於自動化磁性分離設備(自動化磁珠萃取)，且自動化磁性分離方法無論對於大型、中型或小型體積的FFPE組織樣本，其分離效能亦優於其他人工操作離心萃取之方法(人工離心萃取1、2、3)。此外，以最廣泛使用傳統脫蠟方法(人工離心萃取1，採用QIAGEN出產之試劑套組進行傳統脫蠟方法之前置處理與核酸分離方法)做為對照，採用不同的試劑組合(人工離心萃取3，採用RBC Bioscience出產之試劑套組進行傳統脫蠟方法之前置處理與核酸分離方法)其核酸分離不具有明顯差異。而採用本發明所提供之方法(人工離心萃取2)所得之核酸分離效能亦與傳統方法分離效能相當，顯示本發明之方法確實簡化了FFPE組織樣本之操作流程，改善了操作效率。須強調的是，當本發明之方法應用於自動化設備時，其所帶來的效益 更加顯著。
請參考表二，係以特定實施例之核酸產物萃取量(DNA萃取量)除以對照方法所得之倍率分析表，其表示方式與表一之表示方式一致，故不再贅述。可充分得知，本發明所提供之方法係顯著了減少操作繁複的流程(人工離心萃取2)，即可達到相當於傳統方法(人工離心萃取3)之效能，顯見其改善了既有缺失。此外，本發明應用於自動化磁珠萃取所得之效果明顯優於各式人工操作方法(人工離心萃取1、2、3)，且其效益隨著FFPE組織樣本之體積愈小，愈加顯著(倍率超過7倍以上)，故相當有利於應用至小型FFPE組織樣本。故根據上述本發明之優點，使用者可充分應用此特性至高通量的核酸分離與篩檢分析，提升整體分析效果。
除了相較於傳統方法外，本對照例8係根據前述之美國專利申請案公開第20070026432號說明書提出之改良方法與概念，進行實際驗證，以對照本發明之方法之效益。為利於對照，本發明係沿用前述實施例7示範之處理方法取得樣本混合液之結果，與對照例8所示之先前技術方法進行對照。
根據上述分析比對，可知，兩項方法所得之核酸產率相當；然而，本發明相較於對照例8所述之方法之優點在於克服了過程中沉澱物之干擾。具體而言，請參照第5圖，其中樣品8與樣品8' 均為根據對照例8所得之混合液之樣品；樣品1000係本發明之實施例7之對照方法所得之水相層液之樣品；空管E則為不含任何樣品之空微量離心管。因此，由第5圖可明顯得知，根據對照例8之方法所得之混合液樣品存有明顯的混濁狀態，其中肉眼可見懸浮物及白色沉澱；反觀樣品1000，則呈現澄清透明狀態。由此可知，對照例8之方法 雖然能回收取得定量的核酸，但其石蠟凝結產生的混濁與沉澱問題，將顯著干擾操作。尤其，此現象十分不利於應用至自動化設備，並限制了其應用性。反觀本發明所提供之方法，可由簡易且便利的操作方式取得澄清的水相層液，並合併前述之各項優點，均顯示本發明之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法相當適合應用於自動化設備。
10‧‧‧油相溶液、第一溶液
20‧‧‧水相溶液、第二溶液
11‧‧‧第一混合物
100‧‧‧FFPE組織樣本、福馬林固定石蠟包埋樣本
101‧‧‧核酸
102‧‧‧生物性組織樣本
103‧‧‧石蠟材料
121‧‧‧油相層
122‧‧‧水相層
S1‧‧‧步驟S1
S2‧‧‧步驟S2

Claims (9)

  1. 一種福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，係自一福馬林固定石蠟包埋樣本分離出核酸，該福馬林固定石蠟包埋樣本中包含一石蠟材料及一生物性組織樣本，該福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法包含以下步驟：(1)加入一可溶解該石蠟材料之第一溶液與一可裂解該生物性組織樣本之第二溶液至該福馬林固定石蠟包埋樣本，其中該第一溶液與該第二溶液混合體積之比值為0.5~4，均勻混合該第一溶液、該第二溶液與該福馬林固定石蠟包埋樣本之後，取得一第一混合液；(2)以50至80℃範圍內之溫度加熱該第一混合液30至90分鐘之後，再以80至95℃範圍內之溫度加熱該第一混合液30至90分鐘；使該第一混合液產生分層現象，形成一水相層與一油相層；(3)取出該水相層內之一水相層液；以及(4)自該水相層液中分離出一核酸。
  2. 根據申請專利範圍第1項所述之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，其中該第一溶液係一油相溶液。
  3. 根據申請專利範圍第2項所述之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，其中所述之該油相溶液係可為碳數介於7-10之直鏈碳氫化合物、支鏈碳氫化合物、碳數介於7-10之可包含苯環結構的直鏈碳氫化合物或碳數介於7-10之可包含苯環結構的支鏈碳氫化合物其中之一。
  4. 根據申請專利範圍第3項所述之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，其中所述之該油相溶液包含二甲苯、6-溴己基乙酸酯或檸檬油精。
  5. 根據申請專利範圍第1項所述之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，其中該第二溶液係一水相溶液，其成分包含至少一緩衝液、至少一界面活性劑與至少一金屬螯合劑。
  6. 根據申請專利範圍第5項所述之福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，其中所述之水相溶液之成分可進一步包含一蛋白質水解酵素。
  7. 一種福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，係自一福馬林固定石蠟包埋樣本分離出核酸，該福馬林固定石蠟包埋樣本中包含一石蠟材料及一生物性組織樣本，該福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法包含以下步驟：(1)加入一可溶解該石蠟材料之第一溶液與一可裂解該生物性組織樣本之第二溶液至該福馬林固定石蠟包埋樣本，其中該第一溶液與該第二溶液混合體積之比值為0.5~4，均勻混合該第一溶液、該第二溶液與該福馬林固定石蠟包埋樣本之後，取得一第一混合液；(2)以50至80℃範圍內之溫度加熱該第一混合液30至90分鐘之後，再以80至95℃範圍內之溫度加熱該第一混合液30至90分鐘；使該第一混合液產生分層現象，形成一水相層與一油相層；(3)取出該水相層內之一水相層液；以及(4)以一有機溶劑萃取分離方法，自該水相層液分離出一核酸。
  8. 一種福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，係自一福馬林固定石蠟包埋樣本分離出核酸，該福馬林固定石蠟包埋樣本中包含一石蠟材料及一生物性組織樣本，該福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法包含以下步驟：(1)加入一可溶解該石蠟材料之第一溶液與一可裂解該生物性組織樣本之第二溶液至該福馬林固定石蠟包埋樣本，其中該第一溶液與該第二溶液混合體積之比值為0.5~4，均勻混合該第一溶液、該第二溶液與該福馬林固定石蠟包埋樣本之後，取得一第一混合液；(2)以50至80℃範圍內之溫度加熱該第一混合液30至90分鐘之後，再以80至95℃範圍內之溫度加熱該第一混合液30至90分鐘；使該第一混合液產生分層現象，形成一水相層與一油相層；(3)取出該水相層內之一水相層液；以及(4)以一層析管柱分離方法，自該水相層液分離出一核酸。
  9. 一種福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法，係自一福馬林固定石蠟包埋樣本分離出核酸，該福馬林固定石蠟包埋樣本中包含一石蠟材料及一生物性組織樣本，該福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法包含以下步驟：(1)加入一可溶解該石蠟材料之第一溶液與一可裂解該生物性組織樣本之第二溶液至該福馬林固定石蠟包埋樣本，其中該第一溶液與該第二溶液混合體積之比值為0.5~4，均勻混合該第一溶液、該第二溶液與該福馬林固定石蠟包埋樣本之後，取得一第一混合液；(2)以50至80℃範圍內之溫度加熱該第一混合液30至90分鐘之後，再以80至95℃範圍內之溫度加熱該第一混合液30至90分鐘；使該第一混合液產生分層現象，形成一水相層與一油相層；(3)取出該水相層內之一水相層液；以及(4)以一磁性分離方法，自該水相層液分離出一核酸。
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