CN113106085B - 核酸分离方法及核酸分离系统 - Google Patents

Abstract

一种核酸分离方法及其系统：(1)首先提供含有细胞的生物样品；(2)由细胞浓缩单元对生物样品执行细胞浓缩程序；(3)由磁性分离单元行第一磁性分离程序；(4)由悬浮单元执行悬浮程序；(5)由裂解单元执行裂解程序；以及核酸萃取单元(6)执行核酸萃取程序，以利从生物样品中萃取核酸；其中，细胞浓缩程序不使用任何离心方法，方法简便有效，尤其适合全自动化分离核酸；且整个核酸分离方法与系统中可进一步包含由澄清单元执行的澄清程序，亦不使用任何离心方法，更进一步提升分离核酸的质量。

Description

核酸分离方法及核酸分离系统

技术领域

本发明涉及一种核酸分离技术领域，尤其有关于一种磁性核酸分离方法及核酸分离系统。

背景技术

众所皆知，生物体所含核酸(nucleic acid)涵盖丰富遗传信息，对于现今生物医学研究、药物开发与临床应用领域而言，已然成为不可或缺的基础材料。随着研究方法、分析方法与日俱进，各种应用领域对于“核酸”的分离或萃取的效率与质量愈加讲究，如何更有效率地从多元类型的生物样品中，取得质量良好、回收率佳的核酸供后续应用，成为本领域的重要目标。

针对上述目标，人们开始发展自动化分离核酸的技术及设备，其中，磁性分离方法是广为运用的自动化核酸分离方法。磁性分离方法基本原理是利用具有磁性的固相载体吸附生物样品中的核酸，并搭配可控制磁性载体的设备(例如磁盘或磁棒)，在各种管柱间和试剂之间移动磁性载体以分离固相物质与液相物质，进而取代人工操作移液，达成分离或萃取核酸的目标。由于磁性分离方法十分适合以机械自动化控制，除了可达成高效能、操作质量稳定、低污染风险的等功效外，更有利于将标准流程套用至核酸分离程序上，建立一致性，并进一步发展高通量自动化核酸分离技术和设备。

然而，即便磁性分离技术促进了核酸分离技术自动化，但就现有磁性分离技术而言，在生物样品的前处理上仍有限制。具体而言，由于核酸存在于各式不同生物样品中，例如血液、体外培养细胞、粪便、未经固定的组织、经固定的组织、经福尔马林固定与石蜡包埋的组织、菌液、生物发酵液等，而在来源众多的生物样品中，各式生物材料(如血液、组织、细胞、菌液/发酵液沉淀等)经裂解后，经常产生碎片、杂质与沉淀等，若是形成半固态或黏稠物质，会明显干扰磁性分离的移液管操作程序，并产生不必要的样品耗损，减损核酸分离的回收率；另一方面，若是裂解后溶液中溶有过多杂质，则会显着影响后续核酸分离的溶液环境，连带冲击核酸质量和核酸分离效能。

一般而言，针对上述技术缺陷，现有技术多数采取离心或过滤方法移除碎片、杂质与沉淀，因而无法排除人工操作衍生的缺点，并且依赖离心方法。另一种解决方案则是在裂解生物样本取得裂解液(lysate)之后，执行裂解液澄清(lysate clearance)步骤，藉由置换核酸所处的溶液环境，减少杂质的负面作用，但此方法同样难以免除依赖离心方法的限制，故难以达成“全自动核酸分离”的目标。

针对上述不利自动化分离核酸的缺点，举例而言，美国发明专利公告第US7078224B1号提出一项技术方案，其利用硅胶(silica gel)或pH值依赖型(pHdependent)离子交换材料的磁性颗粒(magnetically responsive particles)进行改质(例如glycidyl-alanine改质硅磁珠、glycidyl-histidine改质硅磁珠)，并且依所选的改质磁珠类型，配合特定溶液条件与步骤分离核酸。此方法虽然可免除使用离心方法，但必须选用特定材料的改质磁珠，同时必须搭配此种特定的改质磁珠使用特定试剂条件，以营造出特定溶液环境，方可发挥技术效果，其操作条件上相对严格，使实务运用大为受限。

再举一例说明，福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed and paraffin-embedded；简称FFPE)组织为临床上分子诊疗所需核酸的重要来源，此类生物样品的前处理程序十分繁复，在分离核酸前需要先去除石蜡，又由于生物样品中的组织或细胞经过固定后，会导致其中的生物分子(如蛋白质、核酸)交联，致使生物样品裂解后产生碎片或不溶杂质的不良效应更加明显。

美国发明专利公告第US8703931B2号提出一种从FFPE生物样品分离核酸的方法，其采用磁性分离方法，透过磁性颗粒有效地从裂解液中去除细胞碎片及其他杂质碎屑，以免堵塞移液器(pipette)尖端；其利用疏水性塑料材料构成的特殊设计容器，盛装含有石蜡的裂解液，并运用石蜡遇热熔化、遇冷固化的特性，先以温度控制装置将容器内的石蜡加热至50℃以上熔化，接着降温冷却，使石蜡再次固化，于其容器边缘形成环状沉淀，再由机器自动且准确地吸出液体样品，有效避免石蜡及碎屑堵塞移液器吸头，并将石蜡沉淀留在容器中，达成分离效果。实际操作上，此技术针对石蜡沉淀的特殊设计，必须对应设置磁性环，并利用磁性装置控制磁珠的移动和空间分布，以达成预期的去碎屑效果，其过程中不需要使用特定的离液盐溶液，亦可能免除离心步骤。然而，由于此种方法是利用容器材质特性、石蜡特性与温度控制共同达成的磁性分离效果，分离目标仅限石蜡本身，对于其他不溶杂质的移除效果仍然有限，且实施时势必需要使用特殊构型设计的容器及对应的温控装置、磁性装置方可运作，实务上亦难以普及运用。

近期，中国发明专利申请案公开第CN108841920号提出一种从FFPE生物样品中自动化分离核酸的方法。此发明利用磁性分离方法提取核酸，使用的技术方案是利用磁珠与磁性控制装置，依移液需求将细胞组织限定于特定空间范围内，避免碎屑悬浮影响移液操作。然而，这种核酸分离的技术方案虽然不依赖离心方法，但在脱蜡阶段必须使用有机溶剂(例如二甲苯)，因而难以避免传统方法中以有机溶剂萃取核酸导致的高污染、高毒性等缺点。

基于上述说明及示例可知，针对自动化分离核酸的技术，各式生物样品的前处理效果攸关自动化操作的效能和质量，因而根据前述的技术需求和限制，本发明另提出一简易、高效率、通用各式生物样品的核酸分离方法及其系统，前处理过程中无需采用离心方式及特殊器材或设备，即可达成良好的分离效能。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种核酸分离方法及其对应的操作系统，可取代惯用的离心方法步骤，用于全自动化核酸分离。

根据上述目的，本发明披露一种核酸分离方法，包含以下步骤：

(1)提供含有细胞的生物样品；(2)对生物样品执行细胞浓缩程序，将细胞抓取试剂及磁性载体加入生物样品中，使磁性载体自生物样品中浓缩细胞，进而使磁性载体与细胞共同形成磁性团块；(3)执行第一磁性分离程序，以分离磁性团块；(4)执行悬浮程序，加入悬浮试剂至磁性团块，混合均匀，使细胞重新悬浮至悬浮试剂中，以形成第一溶液；(5)执行裂解程序，将裂解试剂加入第一溶液中，以裂解第一溶液中的细胞，进而形成第二溶液；以及(6)执行核酸萃取程序，从第二溶液中萃取核酸；其中，该细胞浓缩程序不使用任何离心方法。

根据上述目的，本发明进一步提出一种核酸分离方法，于前述的步骤(5)中，进一步包含澄清程序，于细胞裂解之后，加入澄清试剂于含有已裂解细胞与裂解试剂的第一溶液中并混合均匀，以形成第二溶液。

根据上述目的，本发明进一步提出一种核酸分离方法，其中，澄清程序中使用的澄清试剂为不含醇类、酮类或离液盐的单价离子盐溶液。

根据上述目的，本发明进一步提出一种核酸分离方法，其中，细胞抓取试剂为体积百分比浓度介于10％-70％的低分子醇、丙酮及其组合的水溶液。

根据上述目的，本发明进一步提出一种核酸分离方法，其中，磁性载体包含硅、硝化纤维素或聚乙烯醇。

根据上述目的，本发明提出一种核酸分离系统，包含以下单元：

细胞浓缩单元，用以执行细胞浓缩程序，将细胞抓取试剂及磁性载体加入含有细胞的生物样品中，使磁性载体自生物样品中浓缩细胞，进而使磁性载体与细胞共同形成磁性团块；磁性分离单元，用以执行第一磁性分离程序，以分离磁性团块；悬浮单元，用以将悬浮试剂加入磁性团块，混合均匀，使细胞重新悬浮至悬浮试剂中，以形成第一溶液；裂解单元，用以将裂解试剂加入第一溶液中，以裂解第一溶液中的细胞，以形成第二溶液；以及核酸萃取单元，用以从第二溶液中萃取核酸；其中，细胞浓缩程序不使用任何离心方法。

根据上述目的，本发明进一步提出一种核酸分离系统，进一步包含澄清单元，用以在第一溶液中的细胞裂解之后执行澄清程序；在细胞裂解之后，澄清单元进一步用以提供澄清试剂加入具有已裂解的细胞及裂解试剂的第一溶液中，并混合均匀，以形成第二溶液。

根据上述目的，本发明进一步提出一种核酸分离系统，其中，澄清试剂为不含醇类、酮类或离液盐试剂的单价离子盐溶液。

根据上述目的，本发明进一步提出一种核酸分离系统，其中，细胞抓取试剂为体积百分比浓度介于10％-70％的低分子醇、丙酮及其组合的水溶液。

根据上述目的，本发明进一步提出一种核酸分离系统，其中，磁性载体包含硅、硝化纤维素或聚乙烯醇。

基于上述本发明提出的核酸分离方法及核酸分离系统，本发明提出一种配方简单又容易取得的细胞抓取试剂及澄清试剂，可依使用者需求任意搭配市面上常用的溶剂系统及人工操作或自动化产品，尤其适合应用于全自动化分离核酸，免除离心步骤使用，大幅提升分离核酸的质量和效能。

附图说明

图1为本发明实施例说明核酸分离方法的步骤流程图。

图2为本发明实施例说明核酸分离系统的方块图。

图3为依本发明实施例1所得数据的直方图。

图4为依本发明实施例2所得数据的直方图。

图5为依本发明实施例3所得数据的直方图。

图6为本发明实施例5的胶体电泳图。

图7为依本发明实施例7所得数据的直方图。

图8为依本发明实施例8所得数据的直方图。

图9为依本发明实施例9所得数据的直方图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术特征及优点，能更为相关技术领域人员所了解，并得以实施本发明，在此配合附图具体阐明本发明的技术特征与实施方式，并列举优选实施例进一步说明。以下文中所对照的附图，仅为表达与本发明特征有关的示意，并未亦不需要依据实际情形完整绘制。而关于本案实施方式的说明中涉及本领域技术人员所熟知的技术内容，亦不再加以陈述。

针对自动化分离核酸的需求，本发明提出一种核酸分离方法及对应的核酸分离系统，此方法及系统采用简单的试剂与步骤，促进磁性载体抓取生物样品中的细胞，进而有效浓缩细胞，并同步排除杂质，广泛适用于各种类型的核酸分离程序。此外，除了浓缩细胞外，本发明提出的方法与系统亦适用于处理裂解后的生物样品，产生澄清裂解后产物(clearing lysate)的效果，亦同样有利于分离核酸。相关实施方式与对应达成的效果与优点，将于以下文中连同各项实施例一并说明。

首先须定义，本发明记载的核酸意指脱氧核糖核酸(下称DNA)及核糖核酸(下称RNA)、DNA/RNA复合物，具体包括但不限于：质体DNA、人工扩增DNA(amplified DNA)、基因组DNA(genomic DNA)、染色体DNA(chromosomal DNA)、RNA片段、总体RNA(total RNA)、mRNA等，然而，依实务上的应用频率和需求量，本发明以分离DNA为优选实施态样。

依据本发明的优选实施方式，并参考图1所示的核酸分离方法步骤流程图，说明本发明核酸分离方法的步骤如下：

步骤S1：首先提供生物样品，此谓生物样品泛指各种含有核酸的生物材料，具体示例包括但不限于：临床检体(如血液、活体分离的细胞、新鲜组织、冷冻组织、精液、粪便)、培养菌液、体外培养细胞、组织培养液、微生物发酵液等，其中均含有细胞作为核酸来源。需声明者，此谓细胞涵盖适用于本发明的各式生物样品与检体，并非限制用于活细胞，亦即，只要条件得宜，经固定或包埋的组织亦适用于本发明的方法。

取得特定的生物样品后，进一步执行步骤S2的细胞浓缩程序。细胞浓缩程序是利用本发明提出的细胞抓取(cell grabbing)试剂，配合非特定的磁性载体，使磁性载体可以透过非化学键结方式，例如利用范德瓦耳斯力(van der Waals force)的物理性吸附，以“抓取”细胞；由于此谓“抓取细胞”是指在微观环境中，磁性载体暂时性吸附、留滞、附载细胞的交互作用，此种抓取作用并不改变细胞(包含固定后的细胞)的状态或本质，亦不影响细胞内核酸。据此特性，依据本发明的优选实施方式之一，细胞浓缩程序是将细胞抓取试剂及磁性载体加入生物样品中，并且温和地混合均匀，使磁性载体从各种生物样品中抓取细胞，达成浓缩细胞的效果，如此交互作用之下，可使磁性载体与细胞共同形成磁性团块。惟应叙明者，由于不同磁性载体颗粒范围及生物样品中的细胞体积范围均十分多元化，致使每单位数量/体积的磁性载体颗粒能够抓取的细胞数量也随之变异，但总体而言不影响抓取细胞的效果；因此，此谓磁性团块泛指磁性载体抓取细胞后，在溶液中分散、悬浮或聚集所形成的固相物质或胶体物质，并非限制其磁性团块形态、外观或体积范围。

为达成本发明细胞浓缩程序的功效，依据本发明的优选实施例之一，细胞抓取试剂优选为含有低分子醇、丙酮的水溶液，以及混掺不同低分子醇或丙酮的水溶液，且于以下实施说明中，所有叙及细胞抓取试剂浓度是以“待浓缩的样品、检体、溶液”添加细胞抓取试剂后的整体溶液最终浓度(final concentration)界定，此为本领域技术人员可轻易理解的界定原则；依此原则，本发明的细胞抓取试剂体积百分比浓度(最终浓度)以介于10％-70％为佳，并以20％-60％为优选实施范围。其中，针对低分子醇的种类，则以甲醇、乙醇、异丙醇为优选。上述实施选项亦为本技术领域实施上相对容易取得的试剂，十分方便应用。此外，根据本发明的优选实施例之一，本发明采用的细胞抓取试剂中可不含任何盐类，无须仰赖缓冲液系统达成其抓取细胞的功效，因而不衍生离子浓度影响待浓缩细胞的完整性的可能缺陷，在运用上更彰显其简便和实用的特点。

接着，执行步骤S3，主要包含第一磁性分离程序，其目的为分离细胞浓缩程序取得的磁性团块，并进一步将其用于后续核酸分离步骤。如前文所述，由于本领域技术人员通常知晓磁性分离的原理，故不再赘述。其中，磁性载体是磁性分离技术的重要工具，具备感应磁力并随之移动的特性，广泛应用于核酸分离。本发明所指的磁性载体泛指颗粒、磁粒或薄膜型式等感磁性固相载体。依据本发明的实施例之一，以颗粒或磁粒状的磁性载体为优选实施方案，故以下将泛称磁性载体为“磁珠”，但并非用以限制本发明的磁性分离系统采用磁珠作为磁性载体。此外，依据本发明的通用性，针对前述的磁性载体，以使用现今常用磁珠产品为优选，尤其以目前市售或容易取得的磁珠为更佳选项。更具体言之，本发明的磁性载体以使用含有硅、硝化纤维素或聚乙烯醇的材料为佳，其中亦包括不同成分组合而构成的复合性材料，或因应特殊需求而经修饰和改质的磁珠。

承前文所述，由于现有磁性分离技术对于生物样品前处理的要求仍有诸多限制，因此，即使在现有自动化系统中，生物样品通常需要经过一定程度的前处理后才适合添加磁珠以分离核酸(例如，于细胞均质化之后才加入磁珠进行后续分离)，故仍难以达成“全自动化分离核酸”的目标。对照之下，本发明提出的方法于细胞浓缩程序时即可运用磁珠，作法是将磁珠连同细胞抓取试剂一起加入生物样品中，使磁珠作为附载细胞的磁性载体，并在细胞抓取试剂的作用之下，由全自动化设备控制进行后续的磁性分离步骤。因此，依照本发明提出的核酸分离方法，不仅在细胞浓缩程序中无需任何离心步骤，在衔接下一步程序时，亦无需任何离心步骤，即可接续进行第一磁性分离程序，藉此免除人工操作，达成全自动化的目标。

于第一磁性分离程序中，采用可以产生磁力的磁性装置控制附载着细胞的磁珠，使磁性装置将磁珠连同细胞完整地从原本所处的溶液中取出而无损伤，如此一来，只要磁珠用量充足，且与磁性装置的操作条件搭配得宜，即可充分浓缩生物样品中的细胞，并以磁性团块型态作为后续分离核酸的材料，因而排除非细胞物质、溶液、碎屑的干扰。其中，依据本发明通用各式自动化核酸分离装置的特性，并不限制磁性装置种类，其中以现有市售的装置为优选。

此外，本发明不限制各程序使用的磁珠类型。依据本发明的一优选实施例，细胞浓缩程序使用的磁珠与所有磁性分离程序为相同磁珠，更有利于分离效率。然而，倘若为了因应提高细胞浓缩程序的效能，或是为了提升后续各程序分离核酸的特定效果，本发明亦不排除在不同阶段分别使用不同类型(包括不同材质、结构、组成、成分、粒径或物理特性)的磁珠，以求充分发挥本发明的效用。

分离并取得磁性团块后，接着进行步骤S4的悬浮程序。此步骤主要将悬浮试剂加入已分离的磁性团块，并温和地均匀混合两者，让磁性团块中的细胞再次均匀分散，使细胞重新悬浮于悬浮试剂中，使悬浮细胞与悬浮试剂共同形成第一溶液。然而，依本发明的概念，此悬浮程序可进一步依生物样品种类及目标细胞的特性而调整第一溶液的条件，例如添加缓冲液或特定细胞适用的添加剂，以维持细胞的完整性与稳定性，均有利于保持后续核酸分离质量。

此外，在此所指的细胞重新悬浮时，并不限制细胞与磁珠的附载状态，亦无需先确认细胞与磁珠脱附后方能重新悬浮。换言之，在悬浮程序中，可利用适当的涡流震荡(vortex)将细胞完整脱附磁珠，使细胞以其原貌重新悬浮于悬浮试剂中；然而，于特定实施例中，使用者可依据整体核酸分离流程的设计和需求弹性运用此一悬浮程序，即使细胞仍附载于磁珠上，依然可以藉由分散磁性团块的方式，重新将细胞悬浮至溶液中，此一操作方式同样属于本发明所指“重新悬浮”的实施方案范围内。然而，依据本发明的一优选实施例，则先将细胞完整脱附磁珠后再执行后续流程。

步骤S5主要包含裂解程序，作法是将裂解试剂加入第一溶液中，目的是裂解第一溶液中所含的细胞。裂解试剂用于瓦解组织结构及细胞结构(例如细胞膜、细胞壁、细胞内的胞器)，使其碎裂并释出其中所含的核酸，进而使裂解后的产物与溶液形成第二溶液。本领域技术人员可轻易理解，此第二溶液可视为一种裂解液(lysate)或均质液(homogenate)。本领域技术人员亦可轻易理解，不同生物样品因组织或细胞特性各异，因而有对应适用的裂解试剂，其中不排除添加特定离液试剂(chaotropic agent)、酵素，或者配合裂解试剂施加外力(例如涡流震荡)、提高反应温度以提升裂解(lysis)或均质化(homogenization)的效果；因此，本发明对此步骤使用的试剂及作用条件不加以限制。实际上，目前市售或惯常使用的各种裂解试剂，只要能针对欲分离核酸的生物样品发挥良好的裂解与均质化效果，不限任何裂解试剂及作用条件均适用于本发明。

依据本发明的另一实施例，于步骤S5中，可进一步包含澄清程序(lysateclearance)，目的为澄清裂解产物，使整体溶液更适合用于后续的核酸分离步骤。澄清程序的施用时机在于将裂解试剂加入第一溶液使细胞裂解之后，此时的第一溶液含有裂解后的细胞及裂解试剂，因此澄清程序具体作法是于此时将澄清试剂加入含有裂解后的细胞及裂解试剂的第一溶液中并混合均匀，进而形成第二溶液(例如：澄清后的裂解液或均质液)，以供后续核酸萃取之用。

一般传统方法中，常使用离心方法或过滤方法去除裂解液或均质液中的悬浮碎片、杂质，亦不利于自动化。此外，一般而言，现今常用的澄清程序中通常使用含有离液盐试剂(chaotropic reagent，其中包含但不限于碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍或盐酸胍等)处理待澄清溶液，以提升澄清效果，而离液盐的效果则取决于其配比，因此增加澄清所用试剂成分的复杂性。然而，依据本发明提供的澄清程序，乃利用一种成分简单的澄清试剂加入裂解液或均质液中均匀混合，即可达成澄清效果，而澄清程序处理完的溶液则可直接配合磁珠进行磁性分离作业，并完全取代离心或过滤方法，可直接套用现有自动化流程、系统与设备使用。此外，目前本技术领域中针对澄清程序使用的试剂，倘若因为各项程序使用的试剂而含有醇类甚至酮类溶剂，在后续的核酸分离程序中，会导致核酸滞留在磁珠上，无法完全脱附，产生残留而影响核酸的回收率；此缺点尤其对于微量核酸的萃取效能造成不良影响。因此，依据本发明的一优选实施例，澄清试剂为不含醇类、酮类或离液盐的单价离子盐溶液，此谓单价离子盐包含但不限于乙酸铵(NH₄OAc)、乙酸钠(NaOAc)、乙酸钾(KOAc)、氯化铵(NH₄Cl)、氯化钾(KCl)。

取得含有裂解后产物的第二溶液后，接着执行步骤S6核酸萃取程序。此一核酸萃取程序泛指所有从裂解液或均质液提取目标核酸(例如各类型DNA和RNA)的程序，因此，无论是人工手动操作萃取核酸或是由机械自动化萃取核酸，均属于本发明所指核酸萃取程序的范畴。根据本发明优选实施例之一，核酸萃取程序以采用自动化磁性萃取程序优选，以高效率、一致、可靠的自动化流程，取得质量俱佳的核酸。其中，关于各式核酸萃取原理，包含但不限于：磁珠吸附、洗涤(washing)、中和(neutralization)、溶析(elution)等流程，实为本领域技术人员可轻易理解，故不再赘述。

本发明进一步依据上述方法对应提出一种核酸分离系统100，如图2所示，其组成单元包含：细胞浓缩单元101、磁性分离单元103、悬浮单元105、裂解单元107与核酸萃取单元109，其运作方式与执行功能分述如下。细胞浓缩单元101用于执行前述的细胞浓缩程序，针对生物样品，将细胞抓取试剂及磁性载体加入含有细胞的生物样品中，使磁性载体自生物样品中浓缩细胞，进而使磁性载体与细胞共同形成磁性团块。磁性分离单元103用于执行前述的第一磁性分离程序，用以分离该磁性团块。悬浮单元105用于加入悬浮试剂至磁性团块，混合均匀，使细胞重新悬浮至悬浮试剂中，以形成第一溶液。裂解单元107用于将裂解试剂加入第一溶液中，裂解第一溶液中的细胞，以形成第二溶液。核酸萃取单元109用于从第二溶液中萃取核酸。其中，细胞浓缩单元不使用任何离心单元进行细胞浓缩程序；至于其他各项单元执行的程序详情与特点已于前文分别说明，不再赘述。

综上述说明可知，藉由本发明提供的核酸分离方法与对应的核酸分离系统，利用单一种简单的细胞抓取试剂，即可直接执行细胞浓缩程序而无须离心，故依据本发明所提的技术方案，整体核酸分离过程中不需使用离心方法，亦无需配合使用特殊容器、试管匣或更换设备，显然适用于现有的各式自动化核酸分离设备。与现有技术对照之下，本发明的细胞浓缩程序实际上可取代传统惯用于浓缩细胞的离心步骤，以更便捷的方式达成细胞浓缩效果，利于后续的核酸萃取效率和质量。

此外，针对不同生物样品的需求，可选择性采用澄清程序，以成分简单、不含醇类、有机溶剂或离液盐试剂的澄清试剂，进行裂解液或均质液的澄清，进一步提升核酸分离质量。

为利于说明本发明的具体特点和技术效果，以下列举实施例说明。

实施例1：细胞抓取试剂应用于不同磁性载体

取大肠杆菌菌液(DH5a菌株，已选殖TA载体，以下简称为DH5a/TA)为生物样品，利用不同细胞抓取试剂，针对不同类型磁珠操作细胞浓缩程序。为举例说明，本实施例分别使用甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮水溶液作为细胞抓取试剂，并以传统离心的细胞浓缩方法为对照，目标为分离大肠杆菌的质体DNA，并以质体DNA的回收率(recovery)为评估指标。

同时，以前述的对照实验设计，应用于不同类型的磁珠进行细胞浓缩，以评估细胞抓取试剂搭配不同磁性载体的整体效能，具体评估指标为最终萃取所得质体DNA的量化(例如回收率)、质性(胶体电泳图像)数据。本实施例举例的磁珠包括：二氧化硅磁珠、硝化纤维素磁珠、聚乙烯醇(PVA)磁珠、羧酸官能基(carboxyl functional group)修饰的二氧化硅磁珠。以下依据磁珠类型分组进行实验，共分为A、B、C、D四组，其重点条件如表1所示。关于表1及下文所列细胞抓取试剂的浓度，是指细胞抓取试剂加入生物样品后所形成的最终浓度，因此使用者实施本发明时，可依自身需求选用适当种类且适量体积的试剂作为细胞抓取试剂，只要细胞抓取试剂的最终浓度包含在本发明主张的实施范围内，即可达成本发明主张的效果。

表1、实施例1的分组实验条件列表

首先，分别执行对照组和实验组的细胞浓缩程序：

A.对照组：将500μL隔夜培养的DH5a/TA菌液，离心(转速13000rpm)3分钟，留取沉淀用于后续核酸分离，并移除抛弃上清液。

B.实验组：将750μL细胞抓取试剂(种类及浓度如表1所示)连同22.5μL磁珠，加入500μL隔夜培养的DH5a/TA菌液，温和翻转(inverting)混合1分钟，接着静置于磁性分离装置1分钟，直到形成沉淀状的磁性团块，并移去澄清的上清液。

接着，两组均进行相同的质体DNA分离程序，步骤如下：

1.将150μL悬浮缓冲液加入试管中后立即涡流震荡混合，重新将细菌细胞悬浮至溶液中，接着进行磁性分离将细胞悬浮液移至新试管。

2.将150μL裂解缓冲液加入试管中，温和地混合均匀，以避免基因组DNA断裂。

3.将150μL中和缓冲液加入试管中，温和地混合均匀，于室温下离心(13,000rpm)以沉淀杂质，取上清液并移至新试管中。

4.将300μL核酸结合缓冲液(binding buffer)及22.5μL ImaBeads(ImagenBioscience公司产品编号IB50)加入试管中，涡流震荡混合10分钟。

5.将试管静置于磁性分离装置中1分钟，直到ImaBeads形成沉淀状团块，接着移除澄清后的上清液。

6.加入1mL W1缓冲液(Imagen Bioscience公司产品编号IPD100-W1)，涡流震荡3分钟。

7.将试管静置于磁性分离装置中1分钟，直到ImaBeads沉淀状团块，接着移除澄清后的上清液。

8.加入1mL洗涤缓冲液(Wash Buffer)(Imagen Bioscience公司产品编号IPD100-W2)，涡流震荡3分钟。

9.将试管静置于磁性分离装置中1分钟，直到ImaBeads沉淀状团块，接着移除澄清后的上清液。

10.将试管以60℃加热5分钟，以干燥ImaBeads。

11.加入50μL溶析缓冲液(Elution Buffer)并涡流震荡混合10秒钟。

12.将试管静置于60℃下加热10分钟，期间每3分钟涡流震荡一次，取得质体DNA后保存。

经由以上实验步骤取得A、B、C、D四组的质体DNA，量化其回收率的结果如图3，其中显示，四种细胞抓取试剂对于四种类型磁珠均能发挥浓缩细胞功效，部分条件的效果则媲美传统离心方法。

实施例2：细胞抓取试剂应用于不同生物样品(体外培养细胞)

首先，对照组和实验组分别执行细胞浓缩程序：

A.对照组：取已收集的体外培养Hela细胞500μL(内含25％trypsin及75％液体培养基)，离心(转速13000rpm)3分钟，留取细胞团块用于后续核酸分离，并移除抛弃上清液。

B.实验组：取已收集的体外培养Hela细胞500μL(内含25％trypsin及75％液体培养基)，加入500μL细胞抓取试剂(种类及浓度如表1所示)与22.5μL ImaBeads磁珠，翻转混合1分钟，进行磁性分离程序，并移除上清液，准备进行核酸分离。

接着，两组均以磁性分离方法，进行相同的基因组DNA分离程序，步骤如下：

1.加入200μL PBS及20μL Proteinase K(10mg/ml)至细胞团块中，于56℃反应10分钟。

2.加入1μL RNase A(50mg/ml)，室温下反应5分钟。

3.加入200μL IGB缓冲液(Imagen Bioscience公司产品编号IGT100-IGB)，于56℃反应10分钟。

4.加入200μL核酸结合缓冲液并涡流震荡10分钟。

5.进行磁性分离，并移除上清液。

6.加入1.0ml W1缓冲液后，立即涡流震荡3分钟，进行充分混合。

7.进行磁性分离，并移除上清液。

8.重复步骤5及步骤6。

9.加入1.0ml洗涤缓冲液后，立即涡流震荡3分钟，进行充分混合。

10.进行磁性分离，并移除上清液。

11.重复步骤8及步骤9。

12.加入100μL溶析缓冲液，于56℃反应10分钟；期间每3分钟涡流震荡一次，进行充分混合。

13.进行磁性分离，将上清液(溶有基因组DNA)移至新试管保存。

此外，除了使用人类来源的Hela细胞之外，亦采用了不同物种(仓鼠来源)的CHO细胞进行同样试验，流程不再赘述。须强调者，本实施例中，实验组从浓缩细胞开始到核酸萃取过程中，所有步骤均于现有的自动化磁性分离系统上执行。经由以上实验步骤取得的Hela细胞或CHO细胞DNA，量化其取得DNA的浓度结果详如图4，其中显示，两种细胞在细胞抓取试剂的作用下，均达成良好的核酸分离效果，充分验证本发明提出的方法与系统，确实可轻易应用于全自动化分离核酸，且其整体核酸分离校能与质量与离心方法不相上下，部分条件的效果甚至略优于传统离心方法。

实施例3：细胞抓取试剂应用于不同生物样品(全血)

实施例3的实验目标大致上与实施例2类似，主要差别在于使用全血作为生物样品，是临床上极为频繁使用的生物样品。此外，本实施例进一步以相同的实验流程套用三种不同的自动化磁珠(二氧化硅磁珠、硝化纤维素磁珠、聚乙烯醇磁珠)进行操作，以验证本发明的实施效果。

首先，对照组与实验组分别执行细胞浓缩程序：

A.对照组：取200μL全血加入2mL微量试管中，加入0.6mL RBC裂解缓冲液并以翻转试管的方式混合均匀；以100rpm速度摇晃混合物5分钟，接着离心(转速13000rpm)1分钟，留取细胞团块用于后续核酸分离，并移除抛弃上清液，重复步骤2-步骤5，再次洗涤生物样品，以沉淀状的细胞团块(无论细胞的完整性)进行后续的核酸分离程序。

B.实验组：先将200μL全血经RBC裂解缓冲液处理后，加入250μL细胞抓取试剂(种类及浓度如表1所示)及22.5μL ImaBeads磁珠，翻转混合1分钟，进行磁性分离程序，并移除上清液，准备进行核酸分离。

接着，两组均以磁性分离方法，进行相同的基因组DNA分离程序。因自动化萃取全血核酸的技术已为成熟技术，且步骤过程大致与实施例2的分离程序类似，使本领域技术人员可轻易理解其实施方式，故不再于此赘述。

本实施例中，实验组从浓缩细胞开始到核酸萃取过程中，所有步骤均于现有的自动化磁性分离系统上执行。经由以上实验步骤取得的全血DNA，量化其取得DNA的浓度结果详如图5，其中显示，全血在细胞抓取试剂的作用下，达成良好的核酸分离效果，且套用至三种不同的磁珠系统中均表现良好，充分验证本发明提出的方法与系统，确实可轻易应用于全自动化分离核酸，且其整体核酸分离校能与质量与离心方法不相上下，部分条件的效果甚至略优于传统离心方法。

实施例4：细胞抓取试剂应用于不同生物样品(精液检体)的核酸分离

本实施例的实验组针对精液检体取得生物样品，依据本发明提供的方法与自动化系统，先以细胞抓取试剂(种类及浓度如表1所示)进行细胞浓缩程序，最终再使用磁性分离方法萃取基因组DNA(核酸萃取程序)。另一方面，对照组则一贯使用离心方法收集及浓缩细胞，最终再使用磁性分离方法萃取基因组DNA(核酸萃取程序)。本实施例取得的基因组DNA浓度、吸光值结果如表3所示，显示本发明的自动化核酸分离方法的效果良好，甚至优于对照组代表的传统程序。

表3、实施例4的核酸分离效能

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实施例5：澄清程序(有机溶剂水溶液澄清试剂)

如前文所述，为提升核酸分离质量，既有技术方案之一为使用澄清步骤或相关程序减少杂质作用。然而，目前用于澄清的试剂多半为含有离液盐或醇类水溶液或其他有机溶剂的水溶液，虽可达成澄清裂解液或均质液的目的，却存有核酸残留，回收不完全的问题。

本实施例针对此一缺点，以四种经常用于澄清程序的溶剂为例：60％甲醇水溶液(简示为Me)、60％乙醇水溶液(简示为Eth)、60％异丙醇水溶液(简示为Iso)、60％丙酮水溶液(简示为Ace)，分别提供此四种试剂作为澄清试剂，运用于三种磁珠系统：二氧化硅磁珠(A组)、硝化纤维素磁珠(B组)、聚乙烯醇磁珠(C组)。具体作法为使用DH5a/TA菌液，先以传统离心方法浓缩取得细菌细胞，接着再进行裂解与核酸分离(详细执行步骤原则上类似前述实施例，不再冗述)，并针对最终取得的质体DNA、磁性分离吸附核酸磁珠后遗留的上清液、溶析后的磁珠进行胶体电泳分析，以评估核酸分离后磁珠残留核酸的情形，结果如图6所示，其中以样品条带M(DNA Ladder或DNA Marker)及该次萃取所得的质体DNA(简示为Ctrl)作为对照。由图6可知，采用有机溶剂的澄清试剂导致核酸产物(本实施例以质体DNA示例)残留于磁珠上，势必影响回收率。

对此，本发明针对有机溶剂水溶液作为澄清试剂的缺点，提出一种简便、有效的澄清试剂，不仅可轻易取代既有的澄清试剂，更可搭配本发明提出的细胞抓取试剂与方法，进一步促进核酸分离效果，如实施例6的举例说明。

实施例6：澄清程序(本发明的澄清试剂及澄清程序)

本实施例提出一种以特定单价离子盐溶液作为澄清试剂的概念，列举10种不同单价离子盐作为澄清试剂，代表各不同单价离子盐种类与浓度的样品序号如表2所示。进一步将此等澄清试剂用于DH5a/TA菌液裂解液、小鼠组织(来自肾脏、心脏、脾脏)的澄清程序，以观察其澄清溶液的效果。由于本实施例对于收集细胞/组织、浓缩细胞及裂解等程序的操作与前述实施例大致相近，为本技术领域人员可轻易理解，故不再冗述。此一澄清程序于裂解后进行，取得的澄清产物承装至透明微量试管中，以未经处理的裂解液作为对照，进而比较澄清效果。其结果(图未示出)显示，表2所列的各种澄清试剂，均能有效达成澄清裂解液的效果，并且排除了核酸残留于磁珠上的缺点。

表2、澄清试剂的单价离子盐

实施例7：组织澄清程序(本发明的澄清试剂及澄清程序)

本发明以特定单价离子盐溶液作为澄清试剂的方法及系统，事实上可取代原有的澄清试剂，广泛通用于各种类型的磁珠及各式生物样品，更包含活体组织。本实施例以传统澄清程序(离心方法)作为对照，采用三种小鼠器官(肾脏、心脏、脾脏)的组织(取10mg)作为生物样品，展现此方法及系统用于三种磁珠系统(二氧化硅磁珠、硝化纤维素磁珠、聚乙烯醇磁珠)的核酸分离效果。

由于活体组织核酸分离所惯用的前处理程序、裂解程序及其后的磁性分离程序，实为本领域技术人员可轻易理解，又本实施例与惯用手段的差异在于以特定单价离子盐溶液(种类及浓度如表2所示)实施的澄清程序取代传统澄清程序，其余操作方法大致上与惯用磁性核酸分离方法相似或一致，故不再冗述相关操作细节。本实验例以磁性分离取得的DNA浓度为指标，呈现结果如图7所示；其中显示，依据本发明提出的澄清试剂执行澄清程序，不仅简化操作步骤与试剂，并且通用于不同组织与磁珠系统，其达成的核酸分离良好，甚至优于传统澄清程序。

基于上述实施例可清楚得知本发明运用细胞抓取试剂及澄清试剂所提供的方法及其系统，可取代诸多传统方法的步骤，并达成同样优异的核酸分离效果，故以下进一步列举实施例，说明共同运用本发明所述方法的细胞浓缩程序及澄清程序达成的核酸分离效果。以下为求说明简洁，仅针对各实施例的主要参数或观察目标加以记载并说明其结果，所有实施过程中涉及常用且为本领域技术人员可轻易理解的技术操作细节，不再加以详述。

实施例8：不同生物样品(选殖菌株)的核酸分离

本实施例的实验组针对不同大肠杆菌的菌株：DH5a菌株选殖pEGFP-C2载体(DH5a/pEGFP-C2)及HB101菌株选殖pBr322载体(HB101/pBr322)取得生物样品，依据本发明提供的方法与自动化系统，先以细胞抓取试剂(种类及浓度如表1所示)进行细胞浓缩程序；再以澄清试剂(种类及浓度如表2所示)执行澄清程序，并同时产生中和(neutralization)作用；最终再使用磁性分离方法萃取质体DNA。此外，本实施例将此一流程套用于三种磁珠系统：二氧化硅磁珠、硝化纤维素磁珠、聚乙烯醇磁珠，以评估通用性。另一方面，对照组则一贯使用离心方法收集、浓缩细胞及澄清程序，最终再使用磁性分离方法萃取质体DNA。本实施例取得的质体DNA浓度结果如图8所示，显示本发明的自动化核酸分离方法的效果良好，甚至优于对照组代表的传统程序。

实施例9：不同生物样品(FFPE)的核酸分离

针对临床使用需求庞大的FFPE生物样品，亦同样适用于本发明提出的方法及系统，本实施例进一步说明运用于FFPE生物样品的操作重点。针对实验组，首先取用不同尺寸的FFPE组织，依组织体积归类为大型、中型、小型组织，以常用的厚度为5μm的FFPE切片样本面积为例，將生物样品概略区分为大型组织约为200cm²、中型组织约为120cm²、小型组织约为50cm²。将前述三种FFPE组织进行脱蜡处理，之后加入适量的细胞抓取试剂混合均匀，完成细胞(尤其指FFPE中经固定及包埋后的细胞)浓缩程序；接着进行磁性分离，取出其中的磁性团块进行裂解程序；接着再使用澄清试剂加入裂解液执行澄清程序，再以磁性分离方式取得上清液；最终以磁性装置执行核酸萃取程序，取得核酸。

另一方面，对照组则同样先取用三种不同尺寸的FFPE组织进行脱蜡处理，之后采用离心方式取得细胞夹杂碎屑的沉淀团块(pellet)；接着经过多重离心洗涤步骤后，取得沉淀团块进行裂解程序取得裂解液；接着再以离心方式针对裂解液执行澄清程序，使杂质沉淀，取得上清液；最终使用同于实验组的条件，以磁性装置执行核酸萃取程序，取得核酸。

将实验组与对照组的实验结果(图9)比对可知，无论生物样品的组织尺寸大小，实验组的核酸分离效果均良好，显示本发明提出的核酸分离方法及系统亦十分符合FFPE的核酸分离需求。

从上述实施例可清楚而具体了解，针对从生物样品至核酸萃取的流程，本发明提出一种配方简单又容易取得的细胞抓取试剂及澄清试剂，可依使用者需求任意搭配市面上常用的悬浮试剂、裂解试剂、洗涤试剂、中和试剂、溶析试剂等系统，运用至现有的人工操作或半自动化产品。此外，由于试剂使用简便且实施上不受器材与设备限制，本发明提供的方法与系统更可轻易整合应用于现有自动化核酸分离系统，大幅改善全自动化分离核酸的质量与效能，达成全自动化分离核酸的目标。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非用以限定本发明的权利范围；同时以上的描述，对于相关技术领域的专门人士应可明了及实施，因此其他未脱离本发明所揭示的精神下所完成的等效改变或修饰，均应包含在权利要求的范围中。

Claims (4)

1.一种核酸分离方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)提供含有多个细胞的生物样品；

(2)对所述生物样品执行细胞浓缩程序，将细胞抓取试剂及磁性载体加入所述生物样品中，使所述磁性载体自所述生物样品中浓缩所述细胞，进而使所述磁性载体与所述细胞共同形成磁性团块，其中所述细胞抓取试剂为体积百分比浓度介于10％-70％的低分子醇、丙酮及其组合的水溶液，且所述低分子醇为甲醇、乙醇、异丙醇；

(3)执行第一磁性分离程序，以分离所述磁性团块；

(4)执行悬浮程序，加入悬浮试剂至所述磁性团块，混合均匀，使所述细胞重新悬浮至所述悬浮试剂中，以形成第一溶液；

(5)执行裂解程序，将裂解试剂加入所述第一溶液中，以裂解所述第一溶液中的所述细胞，且在所述细胞裂解之后，执行澄清程序，加入不含醇类、酮类或离液盐的单价离子盐溶液至具有已裂解的所述细胞与所述裂解试剂的所述第一溶液中并混合均匀，进而形成第二溶液，其中所述单价离子盐溶液为乙酸铵、乙酸钠、乙酸钾、氯化铵、氯化钾；以及

(6)执行核酸萃取程序，从所述第二溶液中萃取核酸；

其中，所述细胞浓缩程序不使用任何离心方法。

2.如权利要求1所述的核酸分离方法，其特征在于，所述磁性载体包含硅、硝化纤维素或聚乙烯醇。

3.一种核酸分离系统，其特征在于包含：

细胞浓缩单元，用以执行细胞浓缩程序，将细胞抓取试剂及磁性载体加入含有多个细胞的生物样品中，使所述磁性载体自所述生物样品中浓缩所述细胞，进而使所述磁性载体与所述细胞共同形成磁性团块，其中所述细胞抓取试剂为体积百分比浓度介于10％-70％的低分子醇、丙酮及其组合的水溶液，且所述低分子醇为甲醇、乙醇、异丙醇；

磁性分离单元，用以执行第一磁性分离程序，以分离所述磁性团块；

悬浮单元，用以将悬浮试剂加入所述磁性团块，混合均匀，使所述细胞重新悬浮至所述悬浮试剂中，以形成第一溶液；

裂解单元，用以将裂解试剂加入所述第一溶液中，以裂解所述第一溶液中的所述细胞，在所述细胞裂解之后，澄清单元进一步用以提供不含醇类、酮类或离液盐的单价离子盐溶液加入具有已裂解的所述细胞与所述裂解试剂的所述第一溶液中并混合均匀，以形成第二溶液，其中所述单价离子盐溶液为乙酸铵、乙酸钠、乙酸钾、氯化铵、氯化钾；以及

核酸萃取单元，用以从所述第二溶液中萃取核酸；

其中，所述细胞浓缩程序不使用任何离心单元。

4.权利要求3所述的核酸分离系统，其特征在于，所述磁性载体包含硅、硝化纤维素或聚乙烯醇。