CN116875591A - 提取血浆样本游离dna的试剂盒及提取方法 - Google Patents

提取血浆样本游离dna的试剂盒及提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116875591A
CN116875591A CN202311050793.3A CN202311050793A CN116875591A CN 116875591 A CN116875591 A CN 116875591A CN 202311050793 A CN202311050793 A CN 202311050793A CN 116875591 A CN116875591 A CN 116875591A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
kit
hole site
washing
magnetic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311050793.3A
Other languages
English (en)
Inventor
陆亚平
魏光
曹现涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sinopharm Wuhan Precision Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Sinopharm Wuhan Precision Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sinopharm Wuhan Precision Medical Technology Co ltd filed Critical Sinopharm Wuhan Precision Medical Technology Co ltd
Priority to CN202311050793.3A priority Critical patent/CN116875591A/zh
Publication of CN116875591A publication Critical patent/CN116875591A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads

Abstract

本发明涉及核酸提取领域，具体涉及一种提取血浆样本游离DNA的试剂盒及提取方法，该试剂盒包括包括裂解液、洗涤液Ⅰ、洗涤Ⅱ、洗涤液Ⅲ、结合液、洗脱液、磁珠CF1，其中裂解液由SDS的质量体积比为15～25％的Buffer溶液和LiCl组成，LiCl的质量体积浓度为18～22％；洗涤液Ⅰ中包含异硫氰酸胍；洗涤液Ⅱ由Tris‑NaCl缓冲液、乙醇和磁珠MPG制备而成；洗涤液Ⅲ中由Tris‑NaCl缓冲液和乙醇制备而成；结合液中包含异硫氰酸胍和表面活性剂；洗脱液包含Tris；磁珠CF1为MagPure A4XP。该试剂盒通过对磁珠提取试剂进行改进，使得游离DNA的提取通过机器全自动化提取的得率得到显著提高，对于提高NIPT低胎儿浓度样本的检出率，降低假阴性率，具有重要意义，且提取过程不涉及氯仿苯酚等有毒试剂。

Description

提取血浆样本游离DNA的试剂盒及提取方法
技术领域
本发明涉及核酸提取领域，具体涉及一种提取血浆样本游离DNA的试剂盒及提取方法，更具体的涉及一种高通量、自动化提取血浆样本游离DNA的提取试剂盒及提取方法。
背景技术
常用遗传性疾病产前诊断技术手段多为有创性操作，对孕妇及胎儿均有一定伤害，以致在临床推广及应用中受到限制。而非侵入性的产前检查方法如孕期母血清HCG、AFP定量及超声检查的检测范围各有侧重，仅能作为遗传性疾病筛查的一种手段，不能作为诊断依据。近年来，随着胎儿游离DNA的研究不断深入使无创产前诊断方法取得了巨大进展，利用孕妇血浆检测胎儿性别、RhD基因已经在国外的一些产前诊断中心开展。
游离DNA提取方法一般有TRizol法、离心柱法、磁珠法。其中，TRizol方法因其对操作者带来毒性，现在越来越被弃用，磁珠法比较适合机器自动化提取，适合较多样本的高通量处理，但磁珠法的核酸提取得率不如离心柱法，然而离心柱法很难实现完全的自动化提取，不适合大量样本的处理，通量受限。
而对于NIPT而言，胎儿游离DNA浓度过低会提高阳性样本漏检的风险，NIPT的检测极限为3～4％，但由于孕妇个体差异、样本质量以及实验误差等影响，现有技术中，当胎儿游离DNA浓度低于5％时，其NIPT检测结果则可能出现假阴性。因此，提高母体外周血中胎儿游离DNA的浓度，可进一步提高NIPT对于低胎儿浓度样本的检出水平，降低假阴性率，同时也是无创胎儿微缺失微重复基因检测和无创胎儿单基因病检测得以进行的先决条件。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种新的磁珠法提取血浆样本游离DNA的试剂盒及方法，使得游离DNA的提取通过机器全自动化提取的得率得到显著提高，对于提高NIPT低胎儿浓度样本的检出率，降低假阴性率，具有重要意义，且提取过程不涉及氯仿苯酚等有毒试剂。
本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的：本发明提供一种提取血浆样本游离DNA的试剂盒，包括裂解液、洗涤液Ⅰ、洗涤Ⅱ、洗涤液Ⅲ、结合液、洗脱液、磁珠CF1，其中
所述裂解液由SDS的质量体积比为15～25％的Buffer溶液和LiCl组成，所述LiCl的质量体积浓度为18～22％；
所述洗涤液Ⅰ中包含异硫氰酸胍；
所述洗涤液Ⅱ由Tris-NaCl缓冲液、乙醇和磁珠MPG制备而成；
所述洗涤液Ⅲ中由Tris-NaCl缓冲液和乙醇制备而成；
所述结合液中包含异硫氰酸胍和表面活性剂；
所述洗脱液包含Tris；
所述磁珠CF1为MagPure A4 XP。
作为一种优选的实施方式，所述洗涤液Ⅰ的成分配比如下：1.5～2.5M/L的异硫氰酸胍，体积比为0.3～0.5％的1M/L的Tris-HCl，体积比为0.3～0.5％的曲拉通x-100和体积比为50～60％的无水乙醇；
所述洗涤液Ⅱ的成分配比如下：质量体积比为0.5～0.7％的Tris、质量体积比为2.2～2.4％的NaCl、体积比为70～90％的乙醇、质量体积比为0.05～0.07％的磁珠MPG；
所述洗涤液Ⅲ的成分配比如下：质量体积比为0.5～0.7％的Tris、质量体积比为2.2～2.4％的NaCl、体积比为70～90％的乙醇；
所述结合液的成分配比如下：3～5M/L的异硫氰酸胍，体积比为3～5％的曲拉通x-100；
所述洗脱液为EB洗脱液。
更优选的，所述洗涤液Ⅰ的成分配比如下：2M/L的异硫氰酸胍，体积比为0.44％的1M/L的Tris-HCl，体积比为0.44％的曲拉通x-100和56％的无水乙醇；
所述洗涤液Ⅱ的成分配比如下：Tris的质量体积比为0.6％、NaCl的质量体积比为2.3％，乙醇的体积比为80％，磁珠MPG的体积比为0.06％；
所述洗涤液Ⅲ的成分配比如下：Tris的质量体积比为0.6％、NaCl的质量体积比为2.3％，乙醇的体积比为80％；
所述结合液的成分配比如下：4M/L的异硫氰酸胍，体积比为4％的曲拉通x-100；
所述洗脱液为EB洗脱液。
该试剂盒裂解液中，仅含有SDS、LiCl和Buffer，其中SDS是阴离子去污剂，在高温(55～60℃)裂解细胞，使蛋白变性，搭配蛋白酶K(切割丝氨酸蛋白)共同作用，形成SDS/蛋白质/多糖复合物，释放核酸。氧化锂是强脱水剂，可降低核酸的溶解性，并剥离染色质上的蛋白质。该裂解液在裂解血浆样本时，在55℃加热的条件下0.5h，即可保证核酸与核酸结合蛋白迅速彻底分离，释放大量核酸，裂解液中释放出来的核酸与磁珠高效特异性吸附。
核糖核酸载体(Carrier RNA)是助沉剂，显著提高孕妇血浆游离DNA提取效率的同时对下游实验(PCR、高通量测序实验)无不利影响，对高通量测序结果的生物信息血分析无干扰。
磁珠液MPG(购自广州美基生物科技有限公司)，是运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后制备成的超顺磁性氧化硅纳米磁珠。磁珠的内部是一个磁核，外部是一层包覆层，表面分布着许多活性基团，能在微观界面上与细胞、蛋白质、核酸、酶等生化试剂发生偶联，在外部磁场的作用下，磁珠可以定向移动，实现与介质溶液的分离。在外加磁场的作用下，磁珠与核酸分子特异性地识别和高效结合，能将生物样本以及环境等样本中的DNA分离出来。
磁珠CF1是由MagPure A4 XP(购自广州美基生物科技有限公司)分装所得，采用均一的弱离子交换磁珠纯化技术，适合于从DNA产物、限制性内切酶切体系、或其它酶促反应液中选择回收100bp-20Kbp DNA片段，MagPure A4 XP采用独特的结合条件，可通过加入不同的体积MagPure A4XP，可选择性回收不同的片段，特别适合引物二聚体严重的DNA产物，或为第二代测序准备DNA文库。经过结合-洗涤-洗脱的步骤。转移含目的DNA片段的DNA产物、限制性内切酶切体系、或其它酶促反应液块于离心管，吸打混匀后，DNA吸附在磁珠上；杂质经过两次清洗被去除，最后用少量洗脱液或水洗脱出纯化的DNA。
该试剂盒通过对磁珠法提取试剂进行改进，使得其提取得率得到了极大提高，能够有效减少磁珠法机器全自动化提取过程中的假阴性，且无氯仿苯酚等有毒试剂，对于提高NIPT检测结果的准确性及改善操作人员给工作环境具有重要意义。
作为一种优选的实施方式，该试剂盒还包括预分装试剂板和磁棒套。
作为一种优选的实施方式，所述预分装试剂板为96测试/盒。
作为一种优选的实施方式，该试剂盒还包括蛋白酶K和核糖核酸载体。
作为一种优选的实施方式，所述蛋白酶K的浓度为15～25mg/mL，所述核糖核酸载体的浓度为0.05～0.15mg/mL。
本发明还提供了上述提取血浆样本游离DNA的试剂盒的应用，包括以下步骤：
S1，将结合液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗涤液Ⅲ、洗脱液分别分装在预分装试剂板中，并分别将含有上述试剂的孔位记作孔位2、孔位3、孔位4、孔位5、孔位6，用于裂解的孔位记作孔位1，用于预埋磁棒套的孔位记作孔位7；
S2，向孔位1内加入核糖核酸载体、蛋白酶K、裂解液以及样本后，打开提取仪，将加入了试剂及样本后的预分装试剂板放入提取仪中，然后插入磁棒套；
S3，按照如下核酸提取程序1运行进行提取；
S4，提取完成后，取出预分装试剂板室温放置5～10min，冷却后将孔位2中的结合液转移到孔位1中，然后将预分装试剂板放回提取仪，点击继续，按照如下核酸提取程序2运行至结束后，取出预分装试剂板和磁套，将孔位6中提取的核酸溶液取出；
S5，采用磁珠CF1进行富集，即得。
作为一种优选的实施方式，步骤S5中采用磁珠CF1富集的方法如下：
S5-1，将步骤S4中提取得到的核酸溶液与磁珠CF1吹打混匀后，静置结合，再置于磁力架上静置至澄清；
S5-2，取上清液重复步骤S5-1后，弃上清；
S5-3，加入70～80％的乙醇重复吹打洗涤多次后，弃去上清并室温晾干至磁珠CF1出现1～2条裂缝；
S5-4，加入洗脱液进行洗脱，收集上清液即得。
作为一种优选的实施方式，步骤S2中，孔位1中的裂解体系为：核糖核酸载体8～12μL、蛋白酶K12～18μL、裂解液18～22μL。
作为一种优选的实施方式，孔位2中结合液的加样量为300～340μL/孔，孔位3中洗涤液Ⅰ的加样量为400～600μL/孔，孔位4中的洗涤液Ⅱ加样量为450～550μL/孔，孔位5中的洗涤液Ⅲ的加样量为400～600μL/孔，孔位6中洗脱液的加样量为50μL/孔。
本发明所提供的血浆样本游离DNA提取试剂盒，可以有效排除基因组DNA和大片段DNA等其它核酸的污染，有效富集短片段的CFDNA，提高测序数据的有效性，提取方法操作步骤简单、安全、搭配全自动核酸提取仪使用，可以实现96个样本的同时提取，且抑制物残留少，无氯仿苯酚等有毒试剂。与现有常见的市售试剂盒相比，其提取的核酸建库后浓度可到现有试剂盒的2～4倍，且大片段DNA等其它核酸能够显著减少。
附图说明
图1为实施例3中步骤S4提取后的核酸进行NIPT建库后，安捷伦2100生物分析仪检测构建的文库峰图；
图2为实施例3中步骤S5处理后的核酸进行NIPT建库后，安捷伦2100生物分析仪检测构建的文库峰图；
图3为实施例4中本发明提取的核酸进行NIPT建库后，安捷伦2100生物分析仪检测构建的文库峰图；
图4为实施例4中凯杰游离DNA试剂盒提取的核酸进行NIPT建库后，安捷伦2100生物分析仪检测构建的文库峰图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供一种高通量、自动化提取血浆游离样本DNA的试剂盒，包括裂解液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗涤液Ⅲ、结合液、洗脱液、磁珠CF1，其中
裂解液的配制方法如下：向SDS的质量体积比为20％的Buffer溶液中按照质量体积浓度为18％的比例加入LiCl，混匀，即得。
洗涤液Ⅰ的成分配比如下：2M/L的异硫氰酸胍，体积比为0.44％的1M/L的Tris-HCl，体积比为0.44％的曲拉通x-100和56％的无水乙醇；
洗涤液Ⅱ的配制方法如下：Tris的质量体积比为0.6％、NaCl的质量体积比为2.3％，乙醇的体积比为80％，磁珠MPG的体积比为0.06％；
洗涤液Ⅲ的配制方法如下：Tris的质量体积比为0.6％、NaCl的质量体积比为2.3％，乙醇的体积比为80％；
结合液的配制方法如下：4M/L的异硫氰酸胍，体积比为4％的曲拉通x-100；
洗脱液为EB洗脱液。
磁珠CF1：磁珠CF1为MagPure A4 XP。
还可以包括蛋白酶K和核糖核酸载体(Carrier RNA)，其中，蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL，核糖核酸载体(Carrier RNA)的浓度为0.1mg/mL。
还可以包括预分装试剂板和磁棒套，其中预分装试剂盒为96测试/盒，使用时可以选用两种形式，第一种形式为(16测试/板)×6板，每板为8行12列；第二种形式为(96测试/板)×6板。根据预分装板的不同，配备由8联磁棒套(如长112mm、宽11.5mm、高45.7mm)或96孔磁棒套(如长120.7mm、宽85.0mm、高45.0mm)。
实施例2
本实施例提供一种高通量、自动化提取血浆样本游离DNA的方法，具体为采用实施例1中所述的试剂盒进行提取，包括以下步骤：
S1，将结合液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗涤液Ⅲ、洗脱液依次分别分装在预分装试剂板中，并分别将含有上述试剂的孔位记作孔位2、孔位3、孔位4、孔位5、孔位6，用于裂解的孔位记作孔位1，用于预埋磁棒套的孔位记作孔位7。具体预分装方式如下1、2所示：
表1采用16测试/板时的预分装信息
表2采用96测试/板时的预分装信息
S2，向孔位1(如16测试/板的第1、7列)中加入10μL核糖核酸载体、20μL蛋白酶K、20μL裂解液、300μL样本，打开提取仪，将加入样本的预分装试剂板放入提取仪中，然后插入磁棒套；
S3，选择对应的核酸提取程序，运行提取程序，提取程序如表3所示；
S4，约30min后仪器自动暂停，拿出已分装试剂板室温放置5～10min，冷却后再孔位1内加入280μL结合液(已预分装在孔位2中)，然后将预分装试剂板放回提取仪(购自：国药(武汉)精准医疗科技有限公司型号：WHPM-TQY32A)，点击“继续”，自动化程序结束后，取出预分装试剂板和磁棒套，将孔位6中(如16测试/板的第1、7列或96测试/板的结合板)提取得到的核酸溶液取出进行下一步检测或保存于-20℃±5℃。
表3提取程序如下
S5，采用磁珠CF1进行富集处理，结果如下：
S5-1，取新的浅孔板，将已平衡30min的磁珠CF1每孔分装39μL至浅孔板中，标记为磁珠板1；
再取新的浅孔板，将已平衡30min的磁珠CF1每孔分装30μL至浅孔板中，标记为磁珠板2；
用50mL BD管配制75％乙醇：用12.5mL超纯水+38.5mL无水乙醇；
吸取30μL提取后的产物，加入至磁珠板1，吹打混匀15次，静置结合5min，再置于磁力架上静置5min至澄清；
S5-2，取磁珠板1中的上清溶液转移至磁珠板2中，吹打混匀15次，静置结合5min，再置于磁力架上静置8min至澄清，弃上清；
S5-3，将75％乙醇倒入套有PE手套的试剂分液槽中，保持浅孔板在磁力架上，加入180μL75％乙醇，吹打洗涤6次，之后弃去上清；
重复操作一次后，将75％乙醇吸干净后，直接室温晾干，磁珠出现1～2条裂缝即可，切勿过干；
S5-4，将洗脱液倒入套有PE手套的试剂分液槽中，加入42μL洗脱液，将浅孔板从磁力架上取下，吹打混匀10次，静置10min，然后置于磁力架上等待液体澄清，吸取上清液，即得。
实施例3
本发明实施例提供一种高通量、自动化提取血浆样本游离DNA的方法，具体是采用实施例1中所述的试剂盒、实施例2中所述的方法进行提取，将步骤S4和步骤S5提取得到的核酸样品分别进行NIPT建库后，使用安捷伦2100生物分析仪检测构建文库峰图，结果如图1、2所示，其中图1为步骤S4中获得的核酸样品构建的文库峰图，图2为步骤S5处理后获得的核酸样品构建的文库峰图。
从图1、图2可以看出，步骤S5处理后获得的核酸样品构建的文库，大片段文库明显减少。
实施例4
采用实施例3所述的提取方法以及采用市面上购买得到的凯杰游离DNA提取试剂盒(购自上海优宁维生物科技股份有限公司，货号是55114)分别对16份NIPT检测项目临床血浆样本进行提取，所提取的核酸经富集后，进行NIPT文库构建，在Qubit荧光定量仪上检测浓度，其中某份样本构建的文库峰图如图3、4所示，其中图3为本申请提取方法提取得到的核酸构建的文库峰图，图4为凯杰游离DNA提取试剂盒提取得到的核酸构建的文库峰图，检测结果如表4所示：
表4本申请和市售试剂盒提取得到的核酸文库浓度比较
本申请 市售试剂盒
样本名称 文库浓度(ng/μL) 文库浓度(ng/μL)
样本1 27.6 6.64
样本2 29.7 16.3
样本3 25.9 7.25
样本4 41.7 20.9
样本5 14.2 6.05
样本6 10.6 9.22
样本7 19.7 18.3
样本8 25.7 12.3
样本9 27 6.04
样本10 29.4 16
样本11 25 7.75
样本12 41.1 20.4
样本13 14.8 6.98
样本14 10.9 9.52
样本15 19.2 18.8
样本16 25.21 12.6
由表4可知，本发明提取的核酸建库后浓度远高于现有的市售试剂，普遍可达2～4倍，说明本发明所述的方法提取效果较佳。由图3、4可知，本发明所述的提取试剂和提取方法提取后构建的文库中大片段文库明显低于市售试剂盒。说明本发明所述的提取试剂和提取方法可以有效排除基因组DNA和大片段DNA等其它核酸的污染，有效富集短片段的游离DNA，提高测序数据的有效性。
实施例5裂解液配方实验研究
本实施例的目的在于对裂解液中各组分的浓度进行实验，裂解液的配方如下表5所示，使用下表5中的不同裂解液按照实施例3所述的方法对两份血浆样本分别进行游离DNA的提取，其中实验1～12为同一份血浆样本，实验13～24为同一份血浆样本，提取后进行NIPT建库，再用Qubit荧光定量仪检测文库浓度，结果如表5所示：
表5裂解液浓度对构建文库浓度的影响
由表5可知，针对本实验所用的血浆样本，由10～30％的Buffer SDS(即SDS质量体积比为10～30％的Buffer溶液)和质量体积浓度为0～30％的LiCl组成的裂解液均能满足测序所需文库浓度，但以15～25％的Buffer SDS和18～22％的LiCl组成的裂解液效果最佳。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.提取血浆样本游离DNA的试剂盒，其特征在于，包括裂解液、洗涤液Ⅰ、洗涤Ⅱ、洗涤液Ⅲ、结合液、洗脱液、磁珠CF1，其中
所述裂解液由SDS的质量体积比为15～25％的Buffer溶液和LiCl组成，所述LiCl的质量体积浓度为18～22％；
所述洗涤液Ⅰ中包含异硫氰酸胍；
所述洗涤液Ⅱ由Tris-NaCl缓冲液、乙醇和磁珠MPG制备而成；
所述洗涤液Ⅲ中由Tris-NaCl缓冲液和乙醇制备而成；
所述结合液中包含异硫氰酸胍和表面活性剂；
所述洗脱液包含Tris；
所述磁珠CF1为MagPure A4 XP。
2.根据权利要求1所述的提取血浆样本游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液Ⅰ的成分配比如下：1.5～2.5M/L的异硫氰酸胍，体积比为0.3～0.5％的1M/L的Tris-HCl，体积比为0.3～0.5％的曲拉通x-100和体积比为50～60％的无水乙醇；
所述洗涤液Ⅱ的成分配比如下：质量体积比为0.5～0.7％的Tris、质量体积比为2.2～2.4％的NaCl、体积比为70～90％的乙醇、质量体积比为0.05～0.07％的磁珠MPG；
所述洗涤液Ⅲ的成分配比如下：质量体积比为0.5～0.7％的Tris、质量体积比为2.2～2.4％的NaCl、体积比为70～90％的乙醇；
所述结合液的成分配比如下：3～5M/L的异硫氰酸胍，体积比为3～5％的曲拉通x-100；
所述洗脱液为EB洗脱液。
3.根据权利要求1所述的提取血浆样本游离DNA的试剂盒，其特征在于，还包括预分装试剂板和磁棒套。
4.根据权利要求3所述的提取血浆样本游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述预分装试剂板为96测试/盒。
5.根据权利要求1～4任一项所述的提取血浆样本游离DNA的试剂盒，其特征在于，还包括蛋白酶K和核糖核酸载体。
6.根据权利要求5所述的提取血浆样本游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K的浓度为15～25mg/mL，所述核糖核酸载体的浓度为0.05～0.15mg/mL。
7.权利要求1～6任一项所述的提取血浆样本游离DNA的试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将结合液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗涤液Ⅲ、洗脱液分别分装在预分装试剂板中，并分别将含有上述试剂的孔位记作孔位2、孔位3、孔位4、孔位5、孔位6，用于裂解的孔位记作孔位1，用于预埋磁棒套的孔位记作孔位7；
S2，向孔位1内加入核糖核酸载体、蛋白酶K、裂解液以及样本后，打开提取仪，将加入了试剂及样本后的预分装试剂板放入提取仪中，然后插入磁棒套；
S3，按照如下核酸提取程序1运行进行提取；
S4，提取完成后，取出预分装试剂板室温放置5～10min，冷却后将孔位2中的结合液转移到孔位1中，然后将预分装试剂板放回提取仪，点击继续，按照如下核酸提取程序2运行至结束后，取出预分装试剂板和磁套，将孔位6中提取的核酸溶液取出；
S5，采用磁珠CF1进行富集，即得。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤S5中采用磁珠CF1富集的方法如下：
S5-1，将步骤S4中提取得到的核酸溶液与磁珠CF1吹打混匀后，静置结合，再置于磁力架上静置至澄清；
S5-2，取上清液重复步骤S5-1后，弃上清；
S5-3，加入70～80％的乙醇重复吹打洗涤多次后，弃去上清并室温晾干至磁珠CF1出现1～2条裂缝；
S5-4，加入洗脱液进行洗脱，收集上清液即得。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤S2中，孔位1中的裂解体系为：核糖核酸载体8～12μL、蛋白酶K12～18μL、裂解液18～22μL。
10.根据权利要求7～9任一项所述的应用，其特征在于，孔位2中结合液的加样量为300～340μL/孔，孔位3中洗涤液Ⅰ的加样量为400～600μL/孔，孔位4中的洗涤液Ⅱ加样量为450～550μL/孔，孔位5中的洗涤液Ⅲ的加样量为400～600μL/孔，孔位6中洗脱液的加样量为50μL/孔。
CN202311050793.3A 2023-08-19 2023-08-19 提取血浆样本游离dna的试剂盒及提取方法 Pending CN116875591A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311050793.3A CN116875591A (zh) 2023-08-19 2023-08-19 提取血浆样本游离dna的试剂盒及提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311050793.3A CN116875591A (zh) 2023-08-19 2023-08-19 提取血浆样本游离dna的试剂盒及提取方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116875591A true CN116875591A (zh) 2023-10-13

Family

ID=88257031

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311050793.3A Pending CN116875591A (zh) 2023-08-19 2023-08-19 提取血浆样本游离dna的试剂盒及提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116875591A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9624252B2 (en) Selective nucleic acid fragment recovery
US10954507B2 (en) Method for isolating RNA with high yield
CN108624586B (zh) 一种核酸提取试剂盒及其应用方法
Vomelova et al. Technical note methods of RNA purification. All ways (should) lead to Rome
CN107043766A (zh) 一种即用型的核酸磁珠提取试剂
CN106591297A (zh) 一种磁珠法核酸提取方法
CN106834277A (zh) 一种用磁珠法分离游离dna的方法及分离试剂盒
JP2002501759A (ja) 核酸の改善された単離方法
CN111154750A (zh) 一种针对性富集血浆目标游离dna的方法
CN113293196A (zh) 适用于冷冻组织的单细胞核提取方法
CN113913421A (zh) 全血dna提取试剂及提取方法
US20170191054A1 (en) Methods for extraction and purification of components of biological samples
CN111662959A (zh) 一种真菌高通量快速检测方法
CN110938624A (zh) 一种用于基因组dna提取的试剂盒及其应用
CN114395552A (zh) 分离多聚(a)核酸的方法
CN113637668A (zh) 一种同时提取血浆和血细胞病原菌dna的试剂盒及应用
CN107119039A (zh) 一种组织不研磨直接提取核酸的方法
CN112941067A (zh) 一种全血核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用
CN116875591A (zh) 提取血浆样本游离dna的试剂盒及提取方法
CN115247171A (zh) 一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法
CN109439655B (zh) 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法
CN116926064B (zh) 一种核酸提取试剂盒及其制备方法和应用
JP2002528093A (ja) 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段
CN111996189A (zh) 一种磁珠法核酸提取试剂盒及其使用方法
CN107058288B (zh) 一种快速提取病毒rna的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination