CN111154750A - 一种针对性富集血浆目标游离dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种针对性富集血浆目标游离DNA的方法，所述方法包括样品预处理、样品裂解、磁珠分选、洗涤液清洗、和洗脱等步骤，从而将DNA富集以及DNA片段筛选合二为一，在核酸富集的过程中，一并对核酸片段大小进行筛选，获得目标产物，为特定的分子诊断实验提供更灵敏的检测保障，也节省了操作。
Description
技术领域
本发明涉及DNA检测领域，具体涉及一种针对性富集样品中目标游离DNA的方法。
背景技术
自从Mander和Metais于1948年发现人体外周血中存在着细胞外游离DNA和RNA后，游离核酸的检测作为一种有效的微创性诊疗手段广泛应用于临床的各个方面，如肿瘤的发生发展、妊娠相关性疾病、自身免疫病、移植排斥反应、创伤急救医学等，其检测在疾病的早期诊断、分期、治疗检测、预后判断以及产前分子诊断等方面有着重要意义。
随着分子生物学技术的高速发展，DNA富集在诸多分子诊断以及检测技术中日益凸显其重要性，DNA提取富集是生物学分子诊断的前提与基础，且DNA富集质量对下游分子诊断结果起直接影响作用。除却传统的DNA核酸富集方法：酚抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法以及EtBr-CsCl梯度离心法等。目前常见的DNA富集方法包括离心柱提取法、玻璃珠吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法和纳米磁珠提取法。其中，离心柱提取法以其便捷且价格亲民的优势获得广泛应用，随着分子诊断行业的迅猛发展，针对诊断的目的性，研究人员对需要富集的DNA要求越来越严格，离心柱DNA提取日益不能满足对富集的DNA提取总质量增多的需求。
为了顺应分子诊断行业发展需要，磁珠法DNA富集越来越被得到肯定，它有着其他DNA提取方法不能抗衡的优势。磁珠法提取的原理是纳米磁珠表面带带有特定活性基团，在特定条件下可与核酸进行特异性可逆结合，利用磁珠自身具备的磁响应能力，在外加磁场的作用下可方便地进行定向移动与富集，进而实现对核酸的分离纯化。该方法的优势在于：低投入量；全程无需离心操作，操作简单；可实现全自动化操作满足高通量需求；无毒无害，不涉及任何酚、氯仿等有毒化学试剂。
特定目的的DNA检测对于待测DNA片段的大小通常具有特定的要求但是现有的磁珠DNA富集方法并不能很好地满足后续检测对于DNA片段选择性的要求。例如，母体来源的DNA比胎儿DNA长，胎儿DNA绝大部分<300bp，而母体来源的DNA平均>1kb。因此，通过选择性去除母体血浆中母体来源的大片段游离DNA，从而提高母体血浆中胎儿游离DNA比例，降低检测过程中母源cffDNA背景的方法可提高利用cffDNA进行无创产前诊断的特异性和敏感度，扩展其适用范围，促进该诊断技术的发展和在临床上的推广应用。因此，亟需能够针对性富集血浆目标游离DNA的方法
发明内容
本发明对目前磁珠法富集DNA技术进行了优化，将DNA富集以及DNA片段筛选合二为一，即在核酸富集的过程中，一并对核酸片段大小进行筛选，获得目标产物，此为特定的分子诊断实验提供更灵敏的检测保障，也节省了操作时长。
为实现上述目的，本发明提出一种针对性富集样品中目标游离DNA的方法，所述的方法包括以下步骤：
S1.将样品进行预处理；
S2.向预处理后样品中依次加入蛋白酶、裂解液，混匀各组分并孵育以进行样品裂解获得裂解液；
S3.向裂解液中加入磁珠，混匀，获得混合物1；
S4.使混合物1中磁珠被吸附，获取上清液；
S5.向上清液中再次加入磁珠，混匀，获得混合物2；
S6.使混合物2中磁珠被吸附，去除上清液；
S7.使用洗涤液清洗；
S8.加入洗脱液，使磁珠上的游离DNA洗脱，
步骤S1中所述的样品为血浆或尿液，优选为血浆，更优选为孕妇外周血或肿瘤患者血液样本。当所述样品为孕妇外周血时，分离的DNA可进一步用于PCR法孕前早筛检测，当所述样品为肿瘤患者血液样本时，分离的DNA可进一步用于二代测序肿瘤检测。
步骤S2中在加入蛋白酶前还可加入表面活性剂，所述表面活性剂为本领域中常用的离子型或非离子型表面活性剂，例如Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂。
步骤S2中蛋白酶为蛋白酶K。
步骤S2中所述裂解液的pH值为5-8，优选pH值为6-7。所述裂解液由一定浓度的Tris、EDTA、氯化钠和表面活性剂配置而成。优选地，所述裂解液中还可包含试剂A，所述试剂A为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种。优选地，所述表面活性剂为Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂。更优选地，所述裂解液包含Tris、EDTA、氯化钠、Tween20、异硫氰酸胍、盐酸胍；特别优选地，所述裂解液由Tris、EDTA、氯化钠、Tween20、异硫氰酸胍、盐酸胍、异丙醇和PEG8000配置而成。
步骤S3和S5中所述磁珠为通用的磁性纳米颗粒，磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒，优选的，超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒的表面分别修饰有羟基或羧基，并且由二氧化硅包裹。
步骤S3和S5中，所述磁珠以磁珠悬浮液的形式使用，优选的，所述磁珠悬浮液中磁珠浓度为70-95％，更优选地，所述磁珠悬浮液浓度为90-95％，所述磁珠悬浮液中还可含有一定浓度的PEG8000。
步骤S3和S5中，所述磁珠表面偶联核酸结合蛋白，磁珠孔径大小为3-10nm，优选的所述磁珠平均孔径为6nm。
步骤S3中裂解液：磁珠/磁珠悬浮液体积比为10-80:1；优选地，步骤S3中裂解液：磁珠/磁珠悬浮液体积比为20-40:1；更优选地，步骤S3中裂解液：磁珠/磁珠悬浮液体积比为35-40:1、25-30:1或20-25:1；特别优选地，步骤S3中裂解液：磁珠/磁珠悬浮液体积比为35-40:1。
步骤S5中上清液：磁珠/磁珠悬浮液体积比为100-180:1；优选地，步骤S5中上清液：磁珠/磁珠悬浮液体积比为140-155:1；更优选地，步骤S5中上清液：磁珠/磁珠悬浮液体积比为140-145:1、145-150:1、或150-155:1。特别优选地，步骤S5中上清液：磁珠/磁珠悬浮液体积比为150-155:1。
步骤S7中洗涤包含步骤S7.1使用一次洗涤液洗涤和步骤S7.2二次洗涤液洗涤。
步骤S7.1中一次洗涤液清洗次数为1-3次；所述一次洗涤液包含Tris、乙醇和碳酸氢钠；所述一次洗涤液pH值为7.0-10.0，优选为8.0-9.5；最优选地，所述一次洗涤液由15mM的Tris、50％乙醇、40mM的碳酸氢钠配置而成，pH为8.0-9.5。
步骤S7.2中二次洗涤液清洗次数为1-3次；所述二次洗涤液为乙醇水溶液，优选为60-90％的乙醇水溶液，更优选为80％乙醇水溶液。
步骤8中洗脱液为无核酸酶水、Tris缓冲液或者TE缓冲液中一种；优选地，洗脱液由Tris、EDTA配制而成；所述洗脱液pH值为7-9，优选为7.5-8.5。
本发明的有益效果在于
(1)低投入量；全程无需离心操作，操作简单；可实现全自动化操作满足高通量需求；无毒无害，不涉及任何酚、氯仿等有毒化学试剂。
(2)将DNA富集与DNA片段筛选技术方法合二为一，大大节约研究人员操作时长；
(3)通过对两次加入的磁珠比例的选择，能针对性富集不同大小的DNA片段，进而提高特定分子诊断结果灵敏度，如数字PCR法产前无创检测、肿瘤检测等。
附图说明
图1为本发明实施例中游离DNA提取富集操作流程示意图；
图2为本发明实施例1中富集筛选后文库的生物分析仪质检图；
图3为本发明实施例2中富集筛选后文库的生物分析仪质检图；
图4为本发明实施例3中富集筛选后文库的生物分析仪质检图；
图5为本发明实施例4中富集筛选后文库的生物分析仪质检图。
具体实施方式
下面将详细描述本发明的实施例，实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同标号表示相同的元件或具有相同功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.数字PCR法孕前早筛检测DNA片段的富集
1.1将血浆从冰箱中取出后，室温融化(或室温水浴融化后)，转移2ml血浆至15ml离心管中。
1.2向离心管中加入100μl 20％SDS，混匀(目的使SDS均匀分散)，再加入30μl蛋白酶K(20mg/ml)，上下颠倒混匀。然后60℃水浴20min，期间颠倒混匀3-5次，之后冰浴5min。
1.3在上述离心管中加入2.5ml裂解结合液(Tris的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，氯化钠的浓度为50-500mmol/L，Tween20的浓度为1-10％体积分数，异硫氰酸胍的浓度为1-6mol/L，盐酸胍的浓度为1-8mol/L，异丙醇70％，PEG 8000 8％，pH为7.0)和120μl磁珠，涡旋振荡使磁珠充分混匀，然后上下颠倒混匀5min(磁珠使用前需充分颠倒混匀)。
1.4简单离心收集管盖液体后将离心管放置在磁力架上，使磁珠完全被吸附，吸取上清液至新的离心管中，目的是去除大片段。向上清液中，再次添加30μl磁珠，涡旋振荡使磁珠充分混匀，然后上下颠倒混匀5min(磁珠使用前需充分颠倒混匀)。简单离心收集管盖液体后将离心管放置在磁力架上，使磁珠完全被吸附，去除上清液(如果没有适配15ml离心管的磁力架，可将液体转移至1.5ml离心管中，通过多次吸附弃废液收集磁珠。)，目的是丢弃上清液中的小片段，最终将获得100-250bp大小的DNA片段。将离心管从磁力架上取下，加入1ml Wash BufferⅠ，颠倒混匀2min。
1.5将上述的磁珠悬液转移至1.5ml离心管中，置于磁力架上，使磁珠全部被吸附到离心管侧面，用1ml移液器移走上清，再用200μl移液器尽量去除液体。如果由15ml离心管转移到1.5ml离心管时发现底部有磁珠残留，可以将上清液再次加入15ml离心管中，然后再加到已有磁珠的的1.5ml管中，再次富集后弃上清(如果上一步已将磁珠转移至1.5ml离心管中，则直接将离心管至于磁力架上，吸附磁珠后弃掉液体即可)。
1.6向离心管中加入1ml Wash BufferⅠ(Tris 15mM、乙醇50％、碳酸氢钠40mM，pH为8.0-9.5)，颠倒混匀2min。将离心管置于磁力架上，使磁珠全部被吸附到离心管侧面，用1ml移液器吸走上清，再用200μl移液器尽量去除液体。
1.7向离心管中加入1ml Wash BufferⅡ(80％无水乙醇)，颠倒混匀2min。将离心管置于磁力架上，使磁珠全部被吸附到离心管侧面，用1ml移液器吸走上清，再用200μl移液器尽量去除液体。
1.8重复1.7步。
1.9尽量吸干净液体，让离心管在磁力架上保持3-5min，晾干磁珠上的醇。
1.10向离心管中加入50μl-100μl(建议加入60μl，实际使用时根据下游应用调节体积)洗脱液(Tris10-25mM、乙二胺四乙酸的浓度为0.2-0.5mM，pH为7.5-8.5)，水平晃动使磁珠进入到洗脱液中，室温静置3-5min，期间水平晃动几次，使DNA被洗脱下来。
1.11简单离心收集管盖上液体后将离心管放置在磁力架上，使磁珠完全被吸附，将核酸溶液转移至低吸附的离心管中。保存于4℃(24h内使用)或-20℃(长期保存)。
结果显示(如图2)，富集的DNA特异性集中在100bp-250bp大小区间段，该片段大小区域与胎儿游离DNA大小近似，适当过滤掉部分母体大片段游离DNA，降低后续检测背景。
实施例2-4
其余操作同实施例1，调整第一、二次磁珠投放比例，富集筛选后所得结果如下
| 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | |
| 第一次投放比例 | 25-30:1 | 20-25:1 | 40-50:1 |
| 第二次投放比例 | 145-150:1 | 140-145:1 | 150-155:1 |
| 大小范围 | 250-400bp | 400-550bp | 300-600bp |
实施例2-4筛选结果分别如图2-4所示。
以上的仅为本发明的部分或优选实施例，无论是文字还是附图都不能因此限制本发明保护的范围，凡是在与本发明一个整体的构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明保护的范围内。
Claims (10)
1.一种富集样品中游离DNA的方法，所述的方法包括以下步骤：
S1.将样品进行预处理；
S2.向预处理后样品中依次加入蛋白酶、裂解液，混匀各组分并孵育以进行样品裂解获得裂解液；
S3.向裂解液中加入磁珠，混匀，获得混合物1；
S4.使混合物1中磁珠被吸附，获取上清液；
S5.向上清液中再次加入磁珠，混匀，获得混合物2；
S6.使混合物2中磁珠被吸附，去除上清液；
S7.使用洗涤液清洗；
S8.加入洗脱液，使磁珠上的游离DNA洗脱，
其特征在于：步骤S3中裂解液：磁珠体积比为10-80:1。
2.权利要求1所述的富集样品中游离DNA的方法，其特征在于，步骤S3中裂解液：磁珠体积比为20-40:1；优选地，步骤S3中裂解液：磁珠悬浮液体积比为35-40:1、25-30:1或20-25:1。
3.权利要求1所述的富集样品中游离DNA的方法，其特征在于，步骤S5中上清液：磁珠体积比为100-180:1；优选地，步骤S5中上清液：磁珠体积比为140-155:1；更优选地，步骤S5中上清液：磁珠体积比为140-145:1、145-150:1、或150-155:1。
4.权利要求1所述的富集样品中游离DNA的方法，其特征在于，所述磁珠为通用的磁性纳米颗粒，磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒，所述超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒的表面分别修饰有羟基或羧基，并且由二氧化硅包裹，优选地，所述磁珠以磁珠悬浮液的形式使用。
5.权利要求1所述的富集样品中游离DNA的方法，其特征在于，步骤S7中使用洗涤液洗涤包含使用一次洗涤液洗涤和二次洗涤液洗涤，一次洗涤液和二次洗涤液洗涤次数各为1-3次。
6.权利要求5所述的富集样品中游离DNA的方法，其特征在于，所述一次洗涤液包含Tris、乙醇和碳酸氢钠，所述一次洗涤液pH值为7.0-10.0；所述二次洗涤液为乙醇水溶液。
7.权利要求1所述的富集样品中游离DNA的方法，其特征在于，步骤S2中所述裂解液的pH值为5-8，优选pH值为6-7，所述裂解液包含Tris、EDTA、氯化钠和表面活性剂，所述表面活性剂为Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂的一种或多种，优选地，所述裂解液中还可包含试剂A，所述试剂A为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种。
8.权利要求1所述的富集样品中游离DNA的方法，其特征在于，步骤S8中洗脱液为无核酸酶水、Tris缓冲液或者TE缓冲液中一种；优选地，洗脱液由Tris、EDTA配制而成；所述洗脱液pH值为7-9，优选为7.5-8.5。
9.权利要求1所述的富集样品中游离DNA的方法，其特征在于，步骤S2中在加入蛋白酶前加入表面活性剂，所述表面活性剂为Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂中的一种或多种。
10.权利要求1所述的富集样品中游离DNA的方法，其特征在于，步骤S1中所述的样品为血浆或尿液，优选为血浆，更优选为孕妇外周血或肿瘤患者血液样本。
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