JP4036625B2 - 二本鎖／単鎖核酸構造物の分離方法 - Google Patents

二本鎖／単鎖核酸構造物の分離方法 Download PDF

Info

Publication number
JP4036625B2
JP4036625B2 JP2001288689A JP2001288689A JP4036625B2 JP 4036625 B2 JP4036625 B2 JP 4036625B2 JP 2001288689 A JP2001288689 A JP 2001288689A JP 2001288689 A JP2001288689 A JP 2001288689A JP 4036625 B2 JP4036625 B2 JP 4036625B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
stranded nucleic
inorganic support
double
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2001288689A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2002187897A (ja
Inventor
ヘルゲ バスチャン
シモーネ ガウクス
メチン コルパン
ペトラ ファーザー
Original Assignee
クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6510036&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP4036625(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング filed Critical クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Publication of JP2002187897A publication Critical patent/JP2002187897A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4036625B2 publication Critical patent/JP4036625B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、全核酸を同時に無機支持体に吸収させ、分別溶出により二本鎖核酸及び単鎖核酸に分離するか、液体試料の二本鎖核酸または単鎖核酸を無機支持体に選択的に吸収させることによる、核酸混合物のその二本鎖及び単鎖フラクションへのクロマトグラフィー分離のための方法、並びに本発明の方法を実施するための溶液及びキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
RNA及びDNAの両者を含む核酸の製造は益々重要なものとなってきている。これは例えば、RNAあるいはDNAを単離する生物学的原料を例えば機械的作用あるいは化学的作用、例えば洗剤による処理、により溶解することを含む。そして核酸の回収のための細胞溶解の後、通常は塩化セシウム密度勾配遠心分離、あるいはフェノール抽出を行う。これらの方法は核酸の単離のために有用であるが、その使用を困難にする欠点を有している。即ち、塩化セシウム密度勾配遠心分離は時間と費用のかかる超遠心分離の使用を必要とし、一方フェノールで処理することは作業者の保護の観点から問題である。
【０００３】
そこで、核酸の単離を簡易化するための試みが過去に多くある。
DE 36 39 949 A1 、DE 40 34 036 A1 あるいはDE 41 39 664 A1 は、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のような多くの装置を要する方法を避けながらクロマトグラフィー法による核酸の精製を改良することに関する。これらの方法は例えば超遠心分離やフェノール抽出よりは進歩しているが、技術的にまだ複雑であり、労力を要するものである。分画化には多くの連続的な精製段階を必要とすることが多いので、例えば物質の損失の面から、少量の試料を処理することには特に問題が多い。
【０００４】
EP 0 389 063 A2 も核酸の単離方法に関する。核酸を含む原料はカオトロピックイオンの存在下に溶解され、次いでそのような条件下に核酸を吸着するような物質で処理される。そのような物質としては、珪藻土あるいはその他のシリカ含有無機支持体が挙げられている。EP 0 389 063 A2 に挙げられた方法によればRNAとDNA、及びRNAとssRNAを同時に分離することができる。しかし、二酸化ケイ素支持体に結合した核酸のDNAとRNAフラクションへの所望の分画化は達成されていない。RNAはその後RNアーゼを添加することにより分解し、DNAを残すことができる。
【０００５】
米国特許5,155,018 号において、ギレスピイ(Gillespie)らは、RNA、DNA及びその他の細胞内容物を含む生物学的原料から、生物学的に活性なRNAを単離及び精製する方法を開示している。RNAを含む原料は、例えば細かく粉砕されたガラスのような材料を含むシリカゲルからなる粒子と接触させられる。そこからRNAが前記物質に吸着される結合バッファーはカオトロピック塩を含む酸性化溶液である。そのような条件下、RNAはシリカ物質に結合するが、DNAはしない。酸性化カオトロピックバッファーの使用は、グアニジニウムチオシアネート(GTC) を含む結合バッファーの酸性化がシアン化水素の生成の危険を伴い、従って特に注意を払う必要があるという欠点を有する。また、DNAが酸の作用により破壊される。さらに、この方法では本来の試料からDNAを精製することはできない。
【０００６】
米国特許第5,075,430 号において、リトル(Little)はDNAをカオトロピック剤の存在下に珪藻土に固定し、水または低塩含量のバッファーによりDNAを溶出することによる単鎖及び二本鎖のプラスミドあるいはその他のDNAの精製方法を記載しているが、この方法ではDNA/RNAの精製は不可能である。
“アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)" 121, p.382-387 (1982) において、M.A.マルコ(M.A. Marko)らは、アルカリ抽出及びガラス粉末に対する結合を使用した、高度に精製されたプラスミドDNAの大規模な単離のための方法を記載しているが、単一の試料からのRNAとDNAの分画化及び別々の精製については記載していない。
【０００７】
核酸の未処理の調製物にその後の反応を行うが、これらのその後の反応については、単離手順及び単離された核酸の純度と完全性の両者について一定の要件が課される。特に、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応) 、LCR(リガーゼ連鎖反応) 、NASBA(核酸配列をベースとする増幅) あるいは3SR(自己維持配列複製) 等の酵素的増幅反応を行う場合には、他の試料との相互の汚染の危険なく核酸調製物を得ることが可能でなければならず、単離された核酸が阻害細胞成分及び／または代謝物を含まないものでなければならない。その特異性及び感度により、DNAの酵素的増幅 (例えばPCR)あるいはRNAの酵素的増幅 (例えばRNA-PCR)は、基礎研究の分野だけでなく、例えば微量の細胞及び／または組織あるいはバイオプシー材料からの核酸配列の検出、あるいは血液もしくは血漿からのウイルス核酸の検出等のための医療分野及び診断用途の分野においても重要度を増しつつある。これらの用途は、上記に挙げた要件の他、核酸の単離方法の収率と再現性について最も高度な要件を課すものである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の一つの目的は、細胞溶解物及び組織溶解物のような、同一の生物学的試料からRNA及びDNAを別々に精製することだけでなく、一般的に単鎖核酸から二本鎖のものを分離することもできる方法を提供することである。そのような方法の実施は、例えば安価な非修飾分離材料を使用することにより、できるだけ安価なものであるべきである。加えてそのような方法は、診断用の試料調製に適し、種々の増幅方法にも適合したものであるべきである。さらに先行技術について述べたような欠点を有していないことが必要である。
【０００９】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
驚くべきことに、本発明の目的は、請求項１又は２に記載の方法により達成される。請求項３〜１９は本発明の方法の好ましい態様に係わり、請求項２０は本発明の方法を実施するのに必要な成分を含むキットに係わる。
より詳細には、生物学的原料からの二本鎖及び単鎖核酸構造物を分画化するための本発明の方法は、以下の択一的方法により表される。
【００１０】
本発明の方法の第１の態様においては、単鎖核酸及び二本鎖核酸の分離のための処理条件は、アルカリ土類金属イオンを錯化する物質がアルコール基を含む物質の存在しない前記溶液中に含まれ、前記単鎖核酸は第１の無機支持体に吸着されず、試料の残りから分離できるように調整される。分離された単鎖核酸はそれ自体公知の方法によりさらに処理することができる。これに対し二本鎖核酸は第１の無機支持体に主として結合し、任意に行われる洗浄段階の後、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができる。このようにして得られる二本鎖核酸はその後それ自体公知の方法でさらに精製することができる。
【００１１】
回収される非吸着単鎖核酸はその後、特にアルコール基を有する物質を添加することにより、単鎖核酸が第２の無機支持体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができるようになる条件に調整することができる。
【００１２】
処理条件を、溶液に湿潤剤、洗浄剤あるいは分散剤が含まれ、アルコール基を有する物質が存在しないように調整すると、そのような条件下では単鎖核酸は第１の無機支持体に吸着されず、従って試料の残りから分離し、さらに処理することができる。これに対し二本鎖核酸は第１の無機支持体に主として結合し、任意に行われる洗浄段階の後、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができる。溶出された二本鎖核酸はその後それ自体公知の方法でさらに精製することができる。
【００１３】
回収される非吸着単鎖核酸はその後、好ましくはアルコール基を有する物質を添加することにより、単鎖核酸が第２の無機支持体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができるようになる条件に調整することができる。
【００１４】
本発明の方法の別の態様においては、両者とも結合された単鎖核酸及び二本鎖核酸の分画化を行う。これは、塩、特にカオトロピック物質、及びアルコール基を有する物質の適当な水性混合物で、処理条件を、単鎖核酸及び二本鎖核酸からなる全核酸が無機支持体に吸着されるようになるように調整し、次いで第１の支持体に結合した二本鎖／単鎖核酸を、より低いイオン強度及びアルコール基を有する物質のより低い濃度の溶液で処理することにより二本鎖核酸を選択的に溶出するか、あるいはアルカリ土類金属イオンを錯化する物質及び／または湿潤剤、洗浄剤もしくは分散剤並びに１種以上の塩、特にカオトロピック剤を含む溶液で単鎖核酸を溶出することにより分画化することを含む。最初の場合においては、単鎖核酸は支持体に結合して残り、これに対し２番目の場合は二本鎖核酸が無機支持体に結合して残る。それぞれの溶出フラクションはその後それ自体公知の方法によりさらに処理することができる。
【００１５】
本発明によれば、核酸の分離のためのアルコール基を有する物質及び塩、特にカオトロピック物質での処理条件の調整は、本明細書において初めて規定される以下の物理化学的原則に基づいて実施される。
【００１６】
尚、本願請求項に記載された本発明の方法以外に、以下の方法もあり得る。
分離するべき核酸の種類（単鎖及び二本鎖のもの）を含む試料を少なくとも１種の無機支持体で処理し、ここで処理条件は、塩、特にカオトロピック物質、及びアルコール基を含む物質の適当な水性混合物により、単鎖核酸フラクションが主として第１の無機支持体に吸着され、二本鎖核酸は吸着されないように調整する。その後流出する二本鎖核酸はそれ自体公知の方法によりさらに処理することができる。任意に洗浄段階を行った後、第１の無機支持体上に吸着された単鎖核酸を低イオン強度条件下に、あるいは水で溶出する。回収された非吸着二本鎖核酸は、例えば、その後に塩、特にカオトロピック物質、及びアルコール基を有する物質の適当な水性混合物で、二本鎖核酸が第２の無機支持体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができるようになる条件にフラクションを調整することによりさらに精製することができる。
【００１７】
図１は、単鎖RNA及び二本鎖DNAにより例示される単鎖/二本鎖核酸の結合を示す。ここに記載するのは、アルコール基を有する物質 (ここではエタノール) とカオトロピック物質 (ここではGTC)の濃度の関数としての組織溶解物からのRNA/DNAの無機支持体への結合である。アルコールまたはカオトロピック剤のいずれかの物質の濃度を一定とする条件下では、高いアルコール濃度及び／またはカオトロピック物質の量において、両方の種類の核酸(RNA/DNA) が無機支持体に結合することが判った。一方または両方の物質 (アルコールまたはカオトロピック剤) の濃度が規定値よりも低くなると、実質的な程度で無機支持体に結合する核酸はない。驚くべきことに、その中間においては、RNA及びDNAが、核酸の分離に利用できるような異なる程度で無機支持体に結合する。従って、細胞から開始して、高い濃度のカオトロピック物質による細胞の溶解の後、カオトロピック物質とアルコール基を有する物質の濃度を、その後にアルコール基を有する物質またはアルコール基を有する物質及び水もしくはバッファーの混合物を加えることにより、RNAの選択的結合を得、一方DNAは通過物中に残るように調整できる。図１による実施例においては、1.75 M GTC及び30容量% のエタノールの濃度を選択して分別結合によりDNAからのRNAの分離を得るものである。
【００１８】
一方、単鎖核酸及び二本鎖核酸の無機支持体への同時の結合は、アルコール基を有する物質の高い濃度及び／またはカオトロピック物質の高い濃度の条件下で得られ、二本鎖核酸の脱着は、最初にアルコール基を有する物質及び／またはカオトロピック物質の濃度を低下させることにより開始できる。単鎖核酸は結合したまま残り、一方または両方の物質がさらに減少したときに溶出される。図１による実施例においては、1.75 M GTC及び45容量% のエタノールの濃度を選択して全核酸の結合を得るものである。実施例８において説明するように、DNAの選択的脱着のためには0.3 MのGTC及び10容量%のエタノールの濃度を選択する。
このように、無機支持体への吸着によりRNA及びDNAを分離でき、あるいは全核酸を最初に無機支持体に吸着させ、次いで単鎖核酸または二本鎖核酸を選択的に溶出することができる。
【００１９】
任意に、それぞれの核酸 (単鎖核酸または二本鎖核酸) の溶出の前に洗浄段階を行うこともできる。
次いで、低イオン強度条件下あるいは水で溶出をそれぞれ行う。無機支持体から最初に脱着される核酸は、後にイオン強度及び／またはアルコール基を含む物質の濃度を増加させることにより、二本鎖核酸または単鎖核酸が第２の無機支持体に吸着され、任意に行われる洗浄段階の後、低イオン強度条件下あるいは水で溶出されるように調整することができる。
【００２０】
核酸は、例えば塩化ナトリウム／エタノール混合物中で無機支持体に吸着し、低イオン強度条件下あるいは水で溶出できるので、本発明の方法に使用される塩溶液は必ずしもカオトロピック塩を含む必要はなく、任意の塩溶液をアルコール基を含む物質と組み合わせて使用することができると考えられる。
【００２１】
本発明の方法は、少量の試料の処理を可能とし、取り扱いが簡単で安全であり沈殿段階がないので有利である。さらに本発明の方法は比較的安価に人手をあまり必要とせず行うことができ、多数の試料を同時の処理を容易に可能とする。本発明の方法は融通性があり取り扱いが容易であることから、操作を自動化するのにも適している。
【００２２】
本発明の方法により、二本鎖/単鎖核酸構造物を核酸構造物を含む原料から分離することができる。分離される核酸構造物を含み得る原料は、例えば請求項７に挙げた原料を含む。それらは特に、細胞培養物、あらゆる種類の組織、体液、例えば血液、血漿、血清、尿、糞便；微生物、例えば細菌、ウィルス、例えばサイトメガロウィルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、δ型肝炎ウィルス；植物、植物の部分、胎児、胚、果実、あるいは例えばin vitro転写及び／またはcDNA合成及び／または逆転写のような酵素反応とその後のポリメラーゼ連鎖反応(PCR) の後の核酸を含む混合物である。
【００２３】
好ましくは、細胞は最初に、カオトロピック物質及び／またはその他の塩を含む水性溶解系中で、最も簡単な場合においてはそれを細胞に添加することにより溶解される。この溶解工程は任意に機械的作用により促進してもよい。
その後、このように処理された試料を課題に応じて、即ちどの種類の核酸をその他のものから分離したいかにより、請求項１又は２に記載したようにさらに処理する。
【００２４】
例えば細菌のような、挙げられた材料のいくつかのものはその細胞壁の状態によりカオトロピック物質を含む水性系では直接溶解することができない。そこでこれらの出発材料については、本発明の方法に使用する前に、例えば溶解酵素により前処理しなければならない。
核酸を含む原料を溶解するための系は、好ましくは、0.1 〜10 Mの濃度のカオトロピック物質の溶液である。カオトロピック物質としては、特に、塩、例えば過塩素酸ナトリウム、塩化グアニジニウム、グアニジニウムイソチオシアネート/グアニジニウムチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、及び／またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２５】
塩、例えば塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、塩化マグネシウムを0.1 〜10 Mの濃度で含む水溶液、または尿素を対応する0.1 〜10 Mの濃度で含む水溶液、及び／またはそのような物質の組み合わせも、核酸を含む原料を溶解しあるいは結合するための水性系として使用することができる。
【００２６】
アルコール基を含む物質は好ましくは１〜５の炭素原子を有する低級脂肪アルコール、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール及びペンタノールである。これらは好ましくは１〜90容量% の濃度で使用される。
【００２７】
無機支持体は好ましくは、多孔質あるいは非多孔質の金属酸化物あるいは混合金属酸化物、シリカゲル、主としてガラスからなる物質、例えば非改変ガラス粒子、粉末化ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタン、二酸化ジルコニウムからなり、無機支持体の粒子径は0.1μm 〜1000μmであり、孔径は2 〜1000μmである。前記多孔質あるいは非多孔質の支持体材料は、緩くパックされた形態であってもよく、あるいはガラス、石英あるいはセラミックからなるフィルター層、及び／またはシリカゲルが配置された膜、及び／または無機支持体から形成される粒子または繊維、及び石英またはグラスウールの織物、並びに官能基を有しているか有していないラテックス粒子、あるいはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオリド、特に超高分子量ポリエチレン、高密度ポリエチレンからなるフリット材料の形態とすることができる。
【００２８】
アルカリ土類金属イオンを結合する物質としては、特に、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)あるいはEGTAを使用することができ、サルコシネートを湿潤剤、洗浄剤または分散剤として使用できる。
【００２９】
所望ならば、本発明により得られた核酸を、アニオン交換クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法によりさらに精製することができる。
【００３０】
本発明の方法においては、RNA、特に単鎖核酸としてのRNAを二本鎖核酸(DNA) から分離できる。DNAが単鎖形態で存在する場合には、そのようなDNAも二本鎖DNA並びに二本鎖RNAから分離できる。
【００３１】
本発明の方法に使用される溶液もまた本発明の主題である。溶解バッファー及び／または結合バッファーとして、本発明に従い、特に0.5〜8.0M のグアニジニウムイソチオシアネート/グアニジニウムチオシアネート、及び／または塩化グアニジニウム、及び0 〜50%のエタノール及び／またはイソプロパノールを含む水溶液を使用することができる。
【００３２】
無機支持体に結合した核酸を洗浄除去または溶出するための溶液としては、0.1 〜3 Mのグアニジニウムイソチオシアネート/グアニジニウムチオシアネート、及び／または塩化グアニジニウムを、1 〜30%のエタノール及び／またはイソプロパノールとともに含む水溶液を使用することができる。
【００３３】
二本鎖核酸を無機支持体に結合するために使用する水性溶液系としては、1〜5Mのグアニジニウムイソチオシアネート、及び／または1〜8Mの塩化グアニジニウムを、0.1〜5%のサルコシネート、または5mM〜200mMのEDTAとともに含む水溶液を使用することができる。二本鎖核酸を結合するためには、1〜5Mのグアニジニウムチオシアネート、及び／または1〜8Mの塩化グアニジニウム及び5mM〜200mMのEDTAまたはEGTAを含む水溶液も使用することができる。
【００３４】
前記方法を実施するための本発明による成分のキットは、特に、１以上の無機支持体を上記したような形態でその中に配置する通過流路に適した中空体を含む。無機支持体は、２つの手段の間に固定された緩くパックされたものの中にあってもよく、あるいは中空体内部に配置された膜の形態であってもよい。さらにキットは、溶液を含んでもよく、あるいはそのような溶液を配合するための成分は濃縮形態であってもよい。ユーザーは必要な溶液をそれぞれ必要な濃度で調製することができる。
【００３５】
キットのその他の成分として有利なものは、細胞溶解物の溶液を均質化するための装置である。均質化のための特に好ましい装置は国際特許出願WO95/18851に提案されている。この装置は、本質的に少なくとも２つの多孔質層からなり、その多孔質層は層中の流れの方向にみて減少する孔径を有するものである。細胞溶解物が減少する孔径を通過すると、細胞溶解物の粘性の溶液が均質化される。
【００３６】
【実施例】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
材料及び方法
1. シリカ支持体材料
シリカ支持体材料は膜あるいは懸濁粒子の形態で使用した。
1.1. シリカ膜
シリカ膜（例えばワットマン(Whatman)社の繊維ガラスフィルター) の２層をP 43 21 904 に記載されたように遠心分離クロマトグラフィーカラム（「スピンカラム」）中に固定した。膜形態の支持体材料については標準プロトコルの「スピン法」を行った(cf. 4.1) 。
1.2. シリカ粒子
いくつかの種類のシリカ粒子（例えば、ダルムスタット(Darmstadt)、ドイツのメルク(Merck)社及びセントルイス(St. Louis)のシグマ(Sigma)社のもの) をそれぞれ使用した溶解バッファー(cf. 3.1.)中の50%懸濁物として使用した。平均粒子径は材料により0.5〜50μmであった。標準プロトコルの「バッチ法」を行った(cf. 4.2) 。
【００３７】
2. 核酸を含む原料
2.1. 組織
調製に使用した組織は収集した直後に液体窒素中で凍結し、-70℃で貯蔵した。あるいは新鮮組織を使用した。
2.2. 植物
葉を液体窒素下に乳鉢ですりつぶし、微細な粉末を得、調製に直接使用するか-70℃で貯蔵した。
2.3. 細胞培養物
細胞を回収した後、PBSで２回洗浄し、ペレット化した。適当な数(トーマ(Thoma)チャンバー中で計数して測定した) の細胞を含むアリコートを、調製に新鮮なまま使用するか、-20℃で貯蔵した。
あるいは、固着増殖した細胞を培養皿中で洗浄し、それぞれの溶解バッファー(cf. 3.1.)を添加することにより培養皿中で直接溶解してもよい。
2.4. 血漿
ACD血液を3000xgで10分間遠心分離し、上清を取って再度同様に遠心分離した。２回目の遠心分離の後に得られた上清からアリコートを作製し、-70℃で貯蔵した。
2.5. 細菌
培地に一晩培養物を接種し、0.5 〜0.8のOD600まで増殖させた。適当な数の細胞(1 OD600=109細胞/ml)を含むアリコートをペレット化し、細胞ペレットを-20℃で貯蔵するか、新鮮なまま調製に使用した。
【００３８】
3. 試薬
3.1. 溶解バッファー
L1 4.5 M GTC（グアニジウムチオシアネート）, 25mMクエン酸ナトリウム, pH 7.5, 0.7%β-メルカプトエタノール(MSH)
L2 4.0 M GTC, 25mMクエン酸ナトリウム, pH 7.5, 0.7%β-MSH
L3 5.0 M GTC, 50mMトリス/HCl, pH 7.0
L4 3.5 M GTC, 25mMクエン酸ナトリウム, pH 7.5, 1%β-MSH
L5 2.5 M GTC, 25mMクエン酸ナトリウム, pH 7.5, 1%β-MSH, 30%エタノール
L6 8.0 M GuHCl（塩化グアニジニウム）, 20mM MOPS, pH 7.0, 0.7% β-MSH
L7 3.0 M GTC, 25mMクエン酸ナトリウム, pH 7.5, 1%β-MSH
L8 4.0 M GTC, 50mMトリス/HCl, pH 7.5, 1%サルコシル
L9 4.0 M GTC, 50mMトリス/HCl, pH 7.5, 25 mM EDTA
3.2. 結合バッファー
B1 エタノール
B2 n-ブタノール
B3 イソプロパノール
B4 水中70% エタノール
B5 5.9 M GTC
3.3. 洗浄バッファー
W1 2.0 M GTC, 25mMトリス/HCl, pH 7.5, 30%エタノール
W2 4.0 M GTC, 40mMトリス/HCl, pH 7.5, 20%イソプロパノール
W3 1.0 M GTC, 25mMトリス/HCl, pH 7.5, 20%エタノール
W4 5.0 M GuHCl, 15mM MOPS, pH 7.0, 37%エタノール
W5 0.5 M GTC, 25mMトリス/HCl, pH 7.5, 10%エタノール
【００３９】
4. 標準プロトコル
4.1. 「スピン法」
1) 溶解バッファー(cf. 3.1.)を核酸を含む原料に加え、ハンドホモジナイザーにより完全に均質化する。
2) 結合試薬(cf. 3.2.)を加えそれぞれの結合条件を調整する。
3) 溶解物をスピンカラムにピペットで取り、卓上遠心分離器で10,000rpmで15秒間、スピンカラムの膜を通して遠心分離する。溶解物の容量がスピンカラムの最大容量よりも多い場合は、この結合段階を繰り返す。
4) カラム通過物を所望の場合にはさらに処理し、あるいは捨てる。
5) 700μl の洗浄バッファー(cf. 3.3.)をスピンカラムにピペットで取り、3)に記載したようにして遠心分離して混入細胞成分を除去する。
6) 5)のように行って膜に結合した核酸を700μl の水中の80%エタノールで２回洗浄し、塩を含まないようにする。
7) スピンカラムを最大回転数で２分間遠心分離し、エタノールを完全に除去する。
8) 80℃に加熱した50〜100μl の水をスピンカラムの膜上に直接ピペットで取り、最大回転数で１分間遠心分離し、核酸を溶出する。必要な場合には溶出段階を繰り返す。
4.2. 「バッチ法」
1) 溶解バッファー(cf. 3.1.)を核酸を含む原料に加え、ハンドホモジナイザーにより完全に均質化する。
2) 結合試薬(cf. 3.2.)を加えそれぞれの結合条件を調整する。
3) 50μl のシリカ懸濁物 (溶解バッファー中50%)を加え、繰り返し攪拌しながら室温で10分間インキュベートして核酸を結合させる。
4) 卓上遠心分離器で10,000rpmで15秒間遠心分離し、シリカ材料をぺレット化する。
5) 上清をピペットで取り、所望の場合にはさらに処理し、あるいは捨てる。
6) 700μl の洗浄バッファー(cf. 3.3.)をペレットに加え、ペレットが完全に再懸濁されるまで攪拌し、4)に記載したように遠心分離する。
7) 700μl の水中の80%エタノールで6)の洗浄段階を２回繰り返し、シリカ材料を塩を含まないように洗浄する。
8) ふたを開けて56℃で10分間ペレット化したシリカ材料を乾燥する。
9) 50〜100μl の水を加え、攪拌することによりペレットを完全に再懸濁し、繰り返し攪拌しながら56℃で10分間インキュベートする。必要な場合にはこの溶出段階を繰り返す。
10) 最大回転数で１分間遠心分離し、上清を新しい反応容器に移す。
【００４０】
5. 電気泳動法
単離された核酸をアガロースゲル上でエチジウムブロミドにより染色して分析した。この目的のため、1.2%ホルムアルデヒドまたは1.2% 1 x TBEゲルを調製した。
ゲル上を流した後、ホルムアルデヒドゲルを水中で3〜4時間攪拌し、その後10μg/ml RN アーゼA 中で一晩攪拌してRNAを消化し、DNAをより容易に可視化できるようにした。TBEゲルは予め平衡化することなくRNアーゼ消化した。
【００４１】
以下に記載する実施例は本発明の方法の性能を示すものである。これに従って単離した全ての核酸は電気泳動により分析し、分光分析により定量した。全ての溶出物についてOD260/280値は1.7〜2.0の間であった。
【００４２】
参考例１〜５
全核酸の単離
以下の参考例１〜５においては、DNA及びRNAの両方が無機支持体に結合し、一緒に溶出されるように、結合、洗浄及び溶出条件のそれぞれを選択した。
これらの例はいくつかの異なるアルコール（エタノール、イソプロパノール、ブタノール）の結合試薬としての使用を説明するものである。
【００４３】
参考例１
腎臓組織からの全核酸の単離
15mgの腎臓組織（ラット）から、標準プロトコル4.1に従って全核酸を単離した。組織を400μl のL1と混合し、均質化し、その後280μlのB1を加えた。第１の洗浄段階はW1で行い、溶出容量は2x50μlであった。
【００４４】
参考例２
肝臓組織からの全核酸の単離
7mgの肝臓組織（ラット）から、標準プロトコル4.1に従って全核酸を単離した。組織を300μlのL2と混合し、均質化し、その後200μlのB2を加えた。第１の洗浄段階はW1で行い、溶出容量は2x50μl とした。
【００４５】
参考例３
HeLa細胞からの全核酸の単離
1x106のHeLa細胞から、標準プロトコル4.1に従って全核酸を単離した。細胞を400μlのL2と混合し、均質化し、その後200μlのB1を加えた。第１の洗浄段階はW1で行い、溶出容量は1x50μlとした。
【００４６】
参考例４
血漿からの全核酸の単離
標準プロトコル4.1及び4.2にそれぞれ従って、２つの並行した実験において全核酸を血漿から単離した。それぞれの場合、800μlのL3及び660μlのB2を200μlの血漿に加え、混合した。この場合、均質化は必要なかった。「バッチ法」(4.2) のための混合物にさらに40μlのシリカ懸濁物を加えた。両方の実験において、第１の洗浄段階はW2で行い、溶出容量は2x100μlとした。
【００４７】
実施例１
一定のGTC濃度及び増加するエタノール濃度によるRNA及びDNAの分別結合
一定のGTC濃度及び増加するエタノール濃度によるRNA/DNAの無機支持体への結合の依存性を、各試料の実験について10mgの腎臓組織を350μlのL4中で溶解し、各実験について350μlのエタノール/水混合物を加えてエタノールの濃度を調整することにより示した。前記混合物のエタノール含量は水中に20〜90%のエタノールであった。別のバッチに350μlの無水エタノールを加えた。それぞれの実験において、これは1.75Mの一定のGTC濃度及び10〜50% の範囲で増加するエタノール濃度に対応した(cf.図1)。
最初のシリーズの実験においては、このように調整した溶解物のそれぞれに、150,000cpmの32P-標識0.9kb in vitro転写物を加え、溶解物をスピンカラム上に固定した無機支持体上にピペットで取った。卓上遠心分離器で10,000rpmで15秒間遠心分離し、カラムに結合した放射能及びカラム通過物中に存在する放射能をチェレンコフ計数により測定した。
32P-標識RNAの代わりに、150,000cpmの、クレノウ充填反応により32P-標識した直線化pTZプラスミドを添加して一連の実験を繰り返した。
図１に示すように、RNAフラクションは、すでに記載した条件下において25%より高いエタノール濃度から無機支持体に結合するが、DNAフラクションは40%より高いエタノール濃度からしか結合しない。
【００４８】
実施例２〜８
全RNAの単離
以下の実施例においては、無機支持体への結合のためのアルコール／塩混合物を、RNAの選択的な結合が得られるように選択した(cf.図１）。
結合条件は、それぞれ溶解された材料の種類（組織、細胞培養物、植物、細菌）に合わせた。
これらの実施例は、出発材料の溶解のためのGTC、GuHClまたはGTC/エタノール混合物の使用を説明するものである。単離されたRNAの完全性はノーザンブロッティングまたはRT-PCRにより確認した。
これらの実施例においては、支持体に結合しなかったDNAはさらに処理しなかった。カラム通過物からのDNAのその後の精製については実施例12に示す。またDNAは、結合条件を参考例１〜５において選択したものに調整することによりさらに精製してもよい。
【００４９】
実施例２
脾臓組織からの全RNAの単離
15mgの脾臓組織（マウス）から、標準プロトコル4.1に従って全RNAを単離した。組織を350μlのL4と混合し、均質化し、その後350μlのB4を加えた。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は1x 50μlとした。
【００５０】
実施例３
肝臓組織からの全RNAの単離(A)
この実施例においては、エタノール含有溶解バッファーを使用して標準プロトコル4.1 を若干改変した。
8mgの肝臓組織（ラット）を700μlのL5と混合し、均質化した。溶解物をスピンカラムにピペットで取り、標準プロトコル4.1を段階3)から実施した。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は1x 50μlとした。
【００５１】
実施例４
肝臓組織からの全RNAの単離(B)
15mgの肝臓組織（ラット）から、標準プロトコル4.1 に従って全RNAを単離した。組織を300μlのL6と混合し、均質化し、その後175μlのB1を加えた。第１の洗浄段階はW4で行い、溶出容量は1x 50μlとした。
【００５２】
実施例５
HeLa細胞からの全RNAの単離
1x107のHeLa細胞から、標準プロトコル4.1及び4.2にそれぞれ従って、２つの並行した実験において全RNAを単離した。それぞれの場合、細胞を350μlのL7と混合し、均質化し、その後350μlのB4を加えた。「バッチ法」(4.2) の混合物にさらに50μlのシリカ懸濁物を加えた。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は1x50μlとした。
【００５３】
実施例６
タバコからの全RNAの単離
植物からの全RNAの単離のためには標準プロトコル4.1を少し改変する。該プロトコルの段階1)（溶解）の後、卓上遠心分離器による5000rpmでの遠心分離を加え、繊維残留物のような非溶解細胞成分を分離する。上清を除去し、結合試薬と混合し、前記標準法の段階2)からに従ってさらに処理する。
100mgのタバコ葉から、植物用に改変した標準プロトコル4.1により全RNAを単離した。粉末化した細胞材料を600μlのL2と混合し、均質化し、その後350μlのB4を加えた。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は1x50μlとした。
【００５４】
実施例７
大腸菌からの全RNAの単離
細菌からの全RNAの単離については、細菌の細胞壁を溶解するために前記標準プロトコルを行う前に追加の段階を加える。細胞ペレットをTE中の400μg/mlリゾチーム中に再懸濁し、氷上で５分間、そして室温で10分間インキュベートする。その後これを標準法により溶解する。
1x109の大腸菌細胞から、細菌用に改変した標準プロトコル4.1により全RNAを単離した。ペレットを80μlのTE中の400μg/mlリゾチーム中に再懸濁し、上記のようにインキュベートした。その後これに270μlのL2を加え、均質化し、350 μl のB4を加えた。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は2x50μlとした。
【００５５】
実施例８
洗浄バッファーを最適化することによる選択的RNA結合
この実施例に示すように、第１の洗浄段階（標準プロトコル4.1.5)で使用する洗浄バッファーを最適化することにより、特異的に結合したRNAからDNA混入物を除去することができる。
標準プロトコル4.1に従い、それぞれの場合について1x106のHeLa細胞を350μlのL4中で溶解し、350μlのB4と混合し、シリカ支持体に結合した。その後第１の洗浄段階において試料を以下の洗浄バッファーで洗浄した。
【００５６】
【表１】
Figure 0004036625
【００５７】
標準プロトコルによりその後の段階を行った。溶出容量は1x50μlとした。
溶出物の半分を1.2%ホルムアルデヒドゲル上で分析した(cf.図２)。次にゲルを「電気泳動法」で記載したようにしてRNアーゼAで処理した(cf.図３)。
【００５８】
図２及び３の説明
図２：実施例８からの溶出物を分析するための1.2%ホルムアルデヒドゲル、結合条件: 1.75M GCT, 12.5分; クエン酸ナトリウム, pH 7.5, 35%エタノール、洗浄条件: cf. 表１。トラックの番号は表１の試料の番号に対応する。
図３：図２のゲルのRNアーゼ消化物
【００５９】
実施例９及び10
DNAの単離
以下の実施例９及び10においては、DNAだけが無機支持体に結合でき、RNAは通過するように結合条件を選択した。
これらの実施例においては、支持体に結合しなかったRNAはさらに処理しなかった。カラム通過物からのRNAのその後の精製については実施例11に示す。さらにカラム通過物中のRNAは、結合条件を実施例２〜８において選択したものに調整することによりさらに精製してもよい。
DNAの選択的結合はアルコールの非存在下で溶解バッファー中で行う。即ち、標準プロトコル4.1及び4.2の段階2)を省略する。
【００６０】
実施例９
腎臓組織からのゲノムDNAの単離
10mgの腎臓組織（ラット）を700μlのL8中で溶解した。DNAは結合試薬の添加なしで無機支持体に結合し、第１の洗浄段階で700μlのL8で洗浄した。その後標準プロトコル4.1 を段階6)から行った。溶出容量は2x50μlとした。
【００６１】
実施例 10
HeLa細胞からのゲノムDNAの単離
1x107のHeLa細胞を700μlのL9中で溶解した。DNAは結合試薬の添加なしで無機支持体に結合し、第１の洗浄段階で700μlのL9で洗浄した。その後標準プロトコル4.1を段階6)から行った。溶出容量は2x50μlとした。
【００６２】
実施例11〜13
全RNA及びゲノムDNAの分離
同じ細胞溶解物からのRNA及びDNAの別々の処理についての以下の実施例11〜13は、RNA、DNAあるいは全核酸分離についての上記の例の組み合わせである。
分離は、RNA及びDNAの分別結合あるいは分別溶出により行うことができる。
【００６３】
実施例11及び12
分別結合による全RNA及びゲノムDNAの分離
分別結合については、やはり２つの可能性がある。
溶解の後、DNAが最初に無機支持体に結合するように条件を選択するか（実施例11）、RNAが第１の結合段階で吸着され、DNAは通過物から別途処理されるようにすることができる（実施例12）。
【００６４】
実施例 11
腎臓組織からのゲノムDNA及び全RNAの単離
10mgの腎臓組織（ラット）を350μlのL8中で溶解し、DNAを溶解バッファー中で無機支持体に結合させた。カラム通過物に350μlのB4を加え、実施例3.1に従って全RNAを単離した。ゲノムDNAの単離は参考例１のようにして行った。
【００６５】
実施例 12
肺組織からの全RNA及びゲノムDNAの単離
20mgの肺組織（ラット）から、全RNAを実施例２のようにして単離した。カラム通過物中の結合しなかったゲノムDNAを、標準プロトコル4.1に記載したように、350μlのB1及び350μlのB5を添加し、DNAを無機支持体に結合することにより単離した。第１の洗浄段階はW1で行い、溶出容量は2x50μl とした。
【００６６】
実施例 13
分別溶出による全RNA及びゲノムDNAの分離
以下の実施例は、無機支持体に結合した全核酸のDNAフラクションの選択的溶出を説明するものである。
結合条件は、全核酸が無機支持体に結合するように選択した。その後DNAフラクションを溶出し、RNAフラクションは結合されたままとなるようにした。溶出されたDNAは、DNA結合条件を再調整することによって別の無機支持体に結合させ(cf.図１）、さらに処理する。
肝臓組織からのゲノムDNA及び全RNAの単離
標準プロトコル4.1, 1) 〜4)に従い、15mgの肝臓組織（ブタ）を300μlのL2中で溶解し、250μlのB1と混合し、全核酸を無機支持体に結合させた。DNAフラクションは300μlのW5で溶出し、RNAフラクションを結合したままの無機支持体を標準プロトコル4.1 の5)からに従って処理した。標準プロトコル4.1 に従って350μlのB1及び250μlのB5を加え、別の無機支持体に結合させることによりDNAフラクションを溶出物から単離した。
【図面の簡単な説明】
【図１】単鎖RNA及び二本鎖DNAにより例示される単鎖/二本鎖核酸の結合を示す。
【図２】実施例８からの溶出物を分析するための1.2%ホルムアルデヒドゲルを示す。
【図３】図２のゲルのRNアーゼ消化物を示す。

Claims (7)

  1. 生物学的原料の処理により、二本鎖核酸から単鎖核酸を分離するための方法であって、前記処理が以下の工程を含む方法：
    ａ）前記生物学的原料を塩、及びアルコール基を含む物質を含む水溶液に溶解する工程
    ｂ）前記の生物学的原料を溶解した水溶液における、塩、及びアルコール基を含む物質を、全核酸（単鎖核酸及び二本鎖核酸）が無機支持体に吸着される濃度に調整し、この濃度に調整した水溶液を無機支持体に供給し全核酸を無機支持体に吸着させる工程
    ｃ）前記無機支持体を任意に洗浄する工程、
    ｄ）より低いイオン強度及びアルコール基を有する物質のより低い濃度の溶液により二本鎖核酸を前記無機支持体から選択的に溶出する工程、および
    ｅ）任意に単鎖核酸を前記無機支持体から溶出する工程。
  2. 生物学的原料の処理により、単鎖核酸から二本鎖核酸を分離するための方法であって、前記処理が以下の工程を含む方法：
    ａ）前記生物学的原料を塩、及びアルコール基を含む物質を含む水溶液に溶解する工程
    ｂ）前記の生物学的原料を溶解した水溶液における、塩、及びアルコール基を含む物質を、全核酸（単鎖核酸及び二本鎖核酸）が無機支持体に吸着される濃度に調整し、この濃度に調整した水溶液を無機支持体に供給し全核酸を無機支持体に吸着させる工程
    ｃ）前記無機支持体を任意に洗浄する工程、
    ｄ）アルカリ土類金属イオンを結合する物質及び／又は湿潤剤、洗浄剤、若しくは分散剤並びに１種以上の塩を含む溶液により単鎖核酸を前記無機支持体から選択的に溶出する工程、および
    ｅ）任意に二本鎖核酸を前記無機支持体から溶出する工程。
  3. アルカリ土類金属イオンを結合する物質が、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）又はＥＧＴＡであり、湿潤剤、洗浄剤又は分散剤がサルコシネートである請求項２に記載の方法。
  4. 前記水溶液を無機支持体に供給する前に、前記生物学的原料を０．１〜１０Ｍの濃度のカオトロピック物質で細胞溶解する工程をさらに含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 無機支持体に供給される前記水溶液中の塩が、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、塩化マグネシウム、尿素及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、０．１〜１０Ｍの濃度である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. アルコール基を含む物質が１〜９０容量％の濃度の低級脂肪アルコールである請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 単鎖核酸がRNAであり、二本鎖核酸がDNAである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
JP2001288689A 1994-02-11 2001-09-21 二本鎖／単鎖核酸構造物の分離方法 Expired - Lifetime JP4036625B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4404361.9 1994-02-11
DE4404361 1994-02-11

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP52095895A Division JP3256238B2 (ja) 1994-02-11 1995-02-08 二本鎖／単鎖核酸構造物の分離方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002187897A JP2002187897A (ja) 2002-07-05
JP4036625B2 true JP4036625B2 (ja) 2008-01-23

Family

ID=6510036

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP52095895A Expired - Lifetime JP3256238B2 (ja) 1994-02-11 1995-02-08 二本鎖／単鎖核酸構造物の分離方法
JP2001288689A Expired - Lifetime JP4036625B2 (ja) 1994-02-11 2001-09-21 二本鎖／単鎖核酸構造物の分離方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP52095895A Expired - Lifetime JP3256238B2 (ja) 1994-02-11 1995-02-08 二本鎖／単鎖核酸構造物の分離方法

Country Status (7)

Country Link
US (3) US6180778B1 (ja)
EP (2) EP1146049B1 (ja)
JP (2) JP3256238B2 (ja)
AT (2) ATE210671T1 (ja)
DE (2) DE59509941D1 (ja)
DK (2) DK1146049T3 (ja)
WO (1) WO1995021849A1 (ja)

Families Citing this family (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6180778B1 (en) * 1994-02-11 2001-01-30 Qiagen Gmbh Process for the separation of double-stranded/single-stranded nucleic acid structures
DE29601618U1 (de) * 1996-01-31 1996-07-04 Invitek Gmbh Vorrichtung zur gleichzeitigen multiplen Isolierung
ATE284891T1 (de) 1996-02-14 2005-01-15 Biomerieux Bv Isolierung von einzelsträngigen nukleinsäuren
AU1676597A (en) * 1996-02-14 1997-09-02 Amsterdam Support Diagnostics B.V. Separation of single stranded and double stranded nucleic acid materials
NL1002781C1 (nl) * 1996-04-03 1997-10-06 Amsterdam Support Diagnostics Isolatie en/of amplificatie van hepatitis-C-virus-(HCV) -nucleïnezuren uit monsters waarvan vermoed wordt dat zij HCV bevatten.
DE69719409T2 (de) * 1996-06-18 2004-01-15 Rikagaku Kenkyusho Verfahren zur Reinigung von DNS
US6872527B2 (en) * 1997-04-16 2005-03-29 Xtrana, Inc. Nucleic acid archiving
DE19746874A1 (de) 1997-10-23 1999-04-29 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren an hydrophoben Oberflächen - insbesondere unter Verwendung hydrophober Membranen
CA2313654A1 (en) * 1997-12-10 1999-06-17 Sierra Diagnostics, Inc. Methods and reagents for preservation of dna in bodily fluids
JP2004500002A (ja) * 1998-02-02 2004-01-08 ジエントラ・システムズ・インコーポレーテツド Ｄｎａを単離するための溶出試薬、方法およびキット
US7078224B1 (en) * 1999-05-14 2006-07-18 Promega Corporation Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles
EP0959141A2 (en) * 1998-05-20 1999-11-24 Hitachi, Ltd. Method of preparing nucleic acid sample for rare expressed genes and analysing method using the nucleic acid prepared thereby
EP0969090A1 (en) * 1998-05-27 2000-01-05 QIAGEN GmbH Rapid and simple process for isolation of circular nucleic acids
DE10031236A1 (de) 2000-06-27 2002-01-10 Qiagen Gmbh Verwendung von Carbonsäuren und anderen Additiven in Kombination mit kationischen Verbindungen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in biologischen Materialien
DE10033991A1 (de) * 2000-07-12 2002-01-24 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren
WO2002046398A2 (en) * 2000-11-06 2002-06-13 The University Of Houston System Nucleic acid separation using immobilized metal affinity chromatography
US20050032105A1 (en) 2001-10-12 2005-02-10 Bair Robert Jackson Compositions and methods for using a solid support to purify DNA
US7208271B2 (en) 2001-11-28 2007-04-24 Applera Corporation Compositions and methods of selective nucleic acid isolation
EP1516181A2 (en) * 2002-05-07 2005-03-23 Becton Dickinson and Company Container for taking samples and in particular blood samples
AU2003279696A1 (en) * 2002-05-14 2004-02-23 Fidelity Systems, Inc. Helix-hairpin-helix motifs to manipulate properties of dna processing enzymes
DE10222133A1 (de) * 2002-05-17 2003-12-04 Gl Biotech Gmbh Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion und Nukleinsäure-Reinigung
CA2498345A1 (en) * 2002-10-18 2004-04-29 Promega Corporation Methods for separating molecules
US20060160085A1 (en) † 2002-11-08 2006-07-20 Timo Hillebrand Novel buffer formulations for isolating purifying and recovering long-chain and short-chain nucleic acids
US20040121336A1 (en) * 2002-12-20 2004-06-24 Greenfield I Lawrence Method for generating multiple samples containing a predetermined amount of nucleic acid
JP3644641B2 (ja) * 2003-03-07 2005-05-11 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸回収方法
US7267950B2 (en) * 2003-05-01 2007-09-11 Veridex, Lcc Rapid extraction of RNA from cells and tissues
JP4241183B2 (ja) 2003-05-19 2009-03-18 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸回収方法及び核酸回収キット
US8377715B2 (en) * 2003-07-14 2013-02-19 Phynexus, Inc. Method and device for sample preparation
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
ATE554166T1 (de) † 2003-07-25 2012-05-15 Life Technologies Corp Verfahren und zusammensetzungen zur herstellung von rna aus einer fixierten probe
EP2311994A1 (en) * 2003-08-01 2011-04-20 Life Technologies Corporation Compositions and methods for preparing short RNA molecules and other nucleic acids
US7031802B2 (en) * 2003-08-13 2006-04-18 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Semi-autonomous operation of a robotic device
JP3714940B2 (ja) * 2003-11-07 2005-11-09 株式会社日立ハイテクノロジーズ Ｒｎａ抽出方法、および生体材料の分析方法
KR20050061767A (ko) * 2003-12-18 2005-06-23 삼성전자주식회사 알루미나를 이용한 핵산의 정제 방법
JP4690656B2 (ja) * 2004-02-12 2011-06-01 ジーエルサイエンス株式会社 核酸の分離精製方法及び分離吸着体
MXPA05001815A (es) * 2004-02-20 2005-08-24 Hoffmann La Roche Adsorcion de acidos nucleicos a una fase solida.
CA2502549C (en) * 2004-04-23 2016-02-16 Becton, Dickinson And Company Use of an extraction control in a method of extracting nucleic acids
DE102004045332B3 (de) * 2004-09-16 2006-03-09 Macherey, Nagel Gmbh & Co. Handelsgesellschaft Verfahren zur Isolierung und Trennung von einzel- und doppelsträngigen Nucleinsäuren aus einer diese Nucleinsäuren enthaltenden Probe sowie Trennsäule zur Durchführung dieses Verfahrens
EP1809744B1 (en) 2004-11-05 2018-06-06 QIAGEN North American Holdings, Inc. Compositions and methods for purifying nucleic acids from stabilization reagents
US20070042384A1 (en) * 2004-12-01 2007-02-22 Weiwei Li Method for isolating and modifying DNA from blood and body fluids
US20060240409A1 (en) * 2005-01-21 2006-10-26 Prince Alfred M Method for extraction and identification of nucleic acids
DE102005015005A1 (de) 2005-04-01 2006-10-05 Qiagen Gmbh Verfahren zur Behandlung einer Biomoleküle enthaltenden Probe
JP4699868B2 (ja) 2005-11-04 2011-06-15 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸精製方法及び核酸精製器具
DE102005053463A1 (de) * 2005-11-06 2007-05-10 Aj Innuscreen Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur automatisierten Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus beliebigen komplexen Ausgangsmaterialien
WO2007070381A2 (en) 2005-12-09 2007-06-21 Promega Corporation Nucleic acid purification with a binding matrix
US20070202511A1 (en) * 2006-02-28 2007-08-30 Sigma-Aldrich Co. Methods and compositions for the rapid isolation of small RNA molecules
US20070249821A1 (en) * 2006-03-08 2007-10-25 Promega Corporation Small RNA purification
EP2029777B1 (en) * 2006-05-31 2017-03-08 Sequenom, Inc. Methods and compositions for the extraction of nucleic acid from a sample
US20080153078A1 (en) * 2006-06-15 2008-06-26 Braman Jeffrey C System for isolating biomolecules from a sample
US20080113357A1 (en) * 2006-06-29 2008-05-15 Millipore Corporation Filter device for the isolation of a nucleic acid
DE102006031764B4 (de) * 2006-07-06 2009-10-01 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zur parallelen Isolierung doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren sowie zur selektiven Entfernung doppelsträngiger Nukleinsäuren aus einem Gemisch von doppel- und einzelsträngigen Nukleinsäuren
US10131935B2 (en) * 2006-07-11 2018-11-20 Aj Innuscreen Gmbh Method for parallel isolation of viral nucleic acids
GB2445441B (en) 2006-09-26 2010-06-30 Ge Healthcare Bio Sciences Nucleic acid purification method
EP1911844A1 (en) 2006-10-10 2008-04-16 Qiagen GmbH Methods and kit for isolating nucleic acids
ES2394815T3 (es) * 2006-12-13 2013-02-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Utilización de TDE para el aislamiento de ácidos nucleicos
US8686129B2 (en) * 2007-03-20 2014-04-01 Agilent Technologies, Inc. Methods for the separation of biological molecules using sulfolane
CN101878294B (zh) * 2007-10-03 2014-12-10 3M创新有限公司 微生物浓集方法
CN101981177B (zh) * 2007-10-03 2013-06-26 3M创新有限公司 微生物浓集方法
EP3167958A1 (en) * 2007-10-03 2017-05-17 3M Innovative Properties Company Process for preparing microorganism concentration agent
WO2009079156A2 (en) * 2007-11-20 2009-06-25 3M Innovative Properties Company Detection devices and methods
WO2009117167A1 (en) * 2008-01-02 2009-09-24 Blood Cell Storage, Inc. Devices and processes for nucleic acid extraction
DE102008010693A1 (de) 2008-02-22 2009-08-27 Qiagen Gmbh Neue Matrixmaterialien, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen
DE102008010692A1 (de) 2008-02-22 2009-08-27 Qiagen Gmbh Neue Matrices, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen
US7871764B1 (en) * 2008-03-18 2011-01-18 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Universal nucleic acids sample preparation method for cells, spores and their mixture
US20110046361A1 (en) * 2008-04-30 2011-02-24 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Method for separation of double-stranded and single-stranded nucleic acids
EP2128169A1 (de) * 2008-05-30 2009-12-02 Qiagen GmbH Verfahren zur Isolierung von kurzkettigen Nukleinsäuren
DE102008026058A1 (de) 2008-05-30 2009-12-03 Qiagen Gmbh Lyse, Binde- und/oder Waschreagenz verwendbar zur Isolierung und/oder Reinigung von Nukleinsäuren
WO2009155128A1 (en) * 2008-06-18 2009-12-23 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Method for separation of double-stranded and single-stranded nucleic acids from the same sample
US20110224913A1 (en) * 2008-08-08 2011-09-15 Juan Cui Methods and systems for predicting proteins that can be secreted into bodily fluids
EP2163620A1 (de) 2008-09-03 2010-03-17 Qiagen GmbH Verfahren zum Isolieren und Reinigen von Nukleinsäuren
CN105671124A (zh) 2008-12-31 2016-06-15 3M创新有限公司 大肠菌检测方法以及其中使用的试剂盒
US8277651B2 (en) 2009-03-13 2012-10-02 Terrasep, Llc Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography
US8039613B2 (en) 2009-08-28 2011-10-18 Promega Corporation Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods
US8222397B2 (en) * 2009-08-28 2012-07-17 Promega Corporation Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods
EP2345719A1 (en) * 2010-01-18 2011-07-20 Qiagen GmbH Method for isolating small RNA
NO2588609T3 (ja) 2010-06-29 2018-06-16
EP2407540A1 (en) 2010-07-15 2012-01-18 Qiagen GmbH Method for purifying a target nucleic acid
ES2617778T3 (es) * 2010-09-02 2017-06-19 Qiagen Gmbh Método para aislar un ácido nucleico diana que incluye ácidos nucleicos diana pequeños, con alto rendimiento
WO2012044991A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Phynexus, Inc. Purification of nucleic acids
CN103348242B (zh) 2011-01-12 2016-08-17 积水医疗株式会社 单核苷酸多态性的检测方法
CN104946626A (zh) 2011-01-12 2015-09-30 积水医疗株式会社 离子交换色谱法用洗脱液以及核酸链的分析方法
CA2835641C (en) * 2011-05-11 2019-05-28 Exosome Diagnostics, Inc. Nucleic acid extraction from heterogeneous biological materials
CN102250876B (zh) 2011-05-18 2014-08-13 李学敬 从生物材料中分离纯化rna的方法
US9695465B2 (en) 2011-08-12 2017-07-04 Qiagen Gmbh Method for isolating nucleic acids
EP2756079A1 (en) 2011-09-13 2014-07-23 Qiagen GmbH Method for isolating nucleic acids from a veterinary whole blood sample
CN113388605A (zh) 2011-09-26 2021-09-14 凯杰有限公司 用于分离细胞外核酸的快速方法
AU2012314515B2 (en) 2011-09-26 2018-03-15 Preanalytix Gmbh Stabilisation and isolation of extracellular nucleic acids
US11021733B2 (en) 2011-09-26 2021-06-01 Qiagen Gmbh Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
US9528107B2 (en) * 2012-01-31 2016-12-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for selection of nucleic acids
WO2014029791A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Qiagen Gmbh Method for isolating nucleic acids from a formaldehyde releaser stabilized sample
EP2888354B1 (en) 2012-08-21 2020-04-01 Qiagen GmbH Virus particle stabilisation and method for isolating viral nucleic acids
SG11201500655VA (en) 2012-09-03 2015-05-28 Qiagen Gmbh Method for isolating rna including small rna with high yield
EP2898090B1 (en) 2012-09-18 2017-11-08 Qiagen GmbH Method and kit for preparing a target rna depleted sample
US10724074B2 (en) 2012-09-25 2020-07-28 Qiagen Gmbh Stabilisation of biological samples
KR101984700B1 (ko) 2012-11-19 2019-05-31 삼성전자주식회사 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도
US9938520B2 (en) 2012-12-11 2018-04-10 Qiagen Gmbh Preparation of silica particles
US9556427B2 (en) * 2013-02-27 2017-01-31 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for preparation of nucleic acids
EP2971169A4 (en) * 2013-03-13 2016-10-26 Abbott Molecular Inc SYSTEMS AND METHODS FOR ISOLATING NUCLEIC ACIDS
US10077439B2 (en) * 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
WO2014144209A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Abbott Molecular Inc. One-step procedure for the purification of nucleic acids
EP2976425B1 (en) 2013-03-18 2019-11-06 Qiagen GmbH Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
JP6381628B2 (ja) 2013-03-18 2018-08-29 キアゲン ゲーエムベーハー 生物試料の安定化
WO2015140218A1 (en) 2014-03-18 2015-09-24 Qiagen Gmbh Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
JP6525001B2 (ja) 2014-04-18 2019-06-05 凸版印刷株式会社 短鎖核酸の回収方法
BR112016024632A2 (pt) 2014-04-25 2018-01-30 Shire Human Genetic Therapies métodos de purificação de rna mensageiro
EP2940136A1 (en) 2014-04-30 2015-11-04 QIAGEN GmbH Method for isolating poly(A) nucleic acids
US11091810B2 (en) * 2015-01-27 2021-08-17 BioSpyder Technologies, Inc. Focal gene expression profiling of stained FFPE tissues with spatial correlation to morphology
JP2018503366A (ja) * 2014-12-09 2018-02-08 コーニング インコーポレイテッド プラスミドｄｎａ精製のための方法及びキット
GB201504459D0 (en) * 2015-03-17 2015-04-29 Moorlodge Biotech Ventures Ltd Isolation of DNA
US10655122B2 (en) 2015-04-20 2020-05-19 Qiagen Gmbh Method, lysis solution and kit for selectively depleting animal nucleic acids in a sample
AU2016277476B2 (en) 2015-06-10 2022-07-21 Qiagen Gmbh Method for isolating extracellular nucleic acids using anion exchange particles
WO2017040992A1 (en) 2015-09-04 2017-03-09 Mo Bio Laboratories, Inc. Methods for co-isolation of nucelic acids and proteins
CN105087549A (zh) * 2015-09-16 2015-11-25 吉林大学 一种同时高效提取rna和dna的方法及试剂
US10214739B2 (en) * 2015-10-30 2019-02-26 Axagarius Gmbh & Co. Kg RNA binding solution
US11203777B2 (en) 2015-11-20 2021-12-21 Qiagen Gmbh Method of preparing sterilized compositions for stabilization of extracellular nucleic acids
US10287625B2 (en) * 2016-03-18 2019-05-14 Norgen Biotek Corp. Methods and kits for separating nucleic acids by size
US11091792B2 (en) * 2016-05-04 2021-08-17 Children's Hospital & Research Center At Oakland Rapid extraction of nucleic acids from clinical samples for downstream applications
AU2017328927B2 (en) * 2016-09-15 2024-03-07 Sun Genomics Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
US11959125B2 (en) 2016-09-15 2024-04-16 Sun Genomics, Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
US10428370B2 (en) 2016-09-15 2019-10-01 Sun Genomics, Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
WO2018119295A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Ventana Medical Systems, Inc. Fully automated nucleic acid extraction method for tissue samples
US10975369B2 (en) * 2017-02-27 2021-04-13 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
EP3652315A4 (en) 2017-07-12 2021-09-01 Exosome Diagnostics, Inc. METHOD OF ISOLATION AND ENRICHMENT OF POPULATIONS OF EXTRACELLULAR VESICULES FROM A BIOFLUID AND METHOD OF USING THEREOF
WO2019063071A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 Qiagen Gmbh METHOD FOR HIGH-PERFORMANCE RNA ISOLATION
WO2019067388A1 (en) * 2017-09-30 2019-04-04 The Regents Of The University Of California EXTRACTION OF SHORT NUCLEIC ACIDS BY NANOFIBERS
AU2019260569A1 (en) * 2018-04-24 2020-10-29 Qiagen Sciences Llc Nucleic acid isolation and inhibitor removal from complex samples
KR102117833B1 (ko) * 2019-01-04 2020-06-02 남장희 생물시료로부터 유전물질을 신속하게 분리하는 핵산 흡착 물질을 포함하는 조성물 및 그를 이용하여 생물시료로부터 유전물질을 신속하게 분리하는 방법
CA3116149A1 (en) 2019-01-04 2020-07-09 Qiagen Gmbh Urine stabilization
US11926817B2 (en) 2019-08-09 2024-03-12 Nutcracker Therapeutics, Inc. Microfluidic apparatus and methods of use thereof
CN111808844A (zh) * 2020-07-29 2020-10-23 广州捷倍斯生物科技有限公司 一种同时提取dna和rna的试剂盒及其使用方法
CN115197935A (zh) * 2021-04-08 2022-10-18 上海细胞治疗集团有限公司 纤维素色谱纯化rna的方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4493892A (en) * 1982-12-20 1985-01-15 Memorial Hospital For Cancer & Allied Diseases Solvent system for peroxidase inhibitor reagent for fecal occult blood determinations
JPH01135792A (ja) * 1987-11-20 1989-05-29 Mitsui Toatsu Chem Inc 核酸の分離・精製方法
EP0341927B1 (en) 1988-05-10 1993-07-14 AMERSHAM INTERNATIONAL plc Biological sensors
US5017726A (en) 1988-11-09 1991-05-21 Union Camp Corporation Processes for the conversion of myrcene to nerol and citral
US5075430A (en) * 1988-12-12 1991-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Process for the purification of DNA on diatomaceous earth
NL8900725A (nl) * 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
US5232830A (en) * 1990-05-11 1993-08-03 Microprobe Corporation Intrinsic fluorescent quenching methods
DE69213112T2 (de) * 1991-06-20 1997-04-03 Hoffmann La Roche Verbesserte Methoden zur Nukleinsäure-Amplifizierung
US5155018A (en) * 1991-07-10 1992-10-13 Hahnemann University Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources
DE4139664A1 (de) * 1991-12-02 1993-06-03 Diagen Inst Molekularbio Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsaeuren
US5268097A (en) * 1992-06-19 1993-12-07 Sepracor Inc. Passivated and stabilized porous mineral oxide supports and method for the preparation and use of same
EP0580305B1 (en) 1992-07-02 1999-09-22 Edge Biosystems, Inc. Method and material for purification of nucleic acids
US6180778B1 (en) * 1994-02-11 2001-01-30 Qiagen Gmbh Process for the separation of double-stranded/single-stranded nucleic acid structures

Also Published As

Publication number Publication date
DK1146049T3 (da) 2005-12-12
US20030224389A1 (en) 2003-12-04
JP3256238B2 (ja) 2002-02-12
EP1146049A2 (de) 2001-10-17
US6180778B1 (en) 2001-01-30
US20020081619A1 (en) 2002-06-27
US6946250B2 (en) 2005-09-20
EP1146049B1 (de) 2005-08-17
ATE302208T1 (de) 2005-09-15
DE59511013D1 (de) 2005-09-22
DK0743950T3 (da) 2002-03-25
JPH09508638A (ja) 1997-09-02
WO1995021849A1 (de) 1995-08-17
US7074916B2 (en) 2006-07-11
EP0743950A1 (de) 1996-11-27
EP0743950B1 (de) 2001-12-12
JP2002187897A (ja) 2002-07-05
DE59509941D1 (de) 2002-01-24
EP1146049A3 (de) 2001-10-24
ATE210671T1 (de) 2001-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4036625B2 (ja) 二本鎖／単鎖核酸構造物の分離方法
US5783686A (en) Method for purifying nucleic acids from heterogenous mixtures
US7264927B2 (en) Isolation and purification of nucleic acids
AU2002333673A1 (en) Isolation and purification of nucleic acids
JP2002531126A (ja) 任意の複合的出発物質からの核酸の単離、ならびにその後の複合的遺伝子解析のための製剤および方法
JPH10501246A (ja) 極度に少量でかつ非常に強く汚染された非常に種々の出発物質から核酸を単離および精製する一般的方法
EP2137309B1 (en) Methods for the separation of biological molecules using sulfolane
WO2009155128A1 (en) Method for separation of double-stranded and single-stranded nucleic acids from the same sample
JPH1075784A (ja) リボ核酸の単離方法
US20080146789A1 (en) Methods for the separation of biological molecules using dioxolane
EP2250182B1 (en) Isolation of dna, rna and protein from a single sample
WO2009134652A1 (en) Method for separation of double-stranded and single-stranded nucleic acids
JP3811767B6 (ja) 均質な混合物から核酸を純化する方法
LI VERFAHREN ZUR TRENNUNG BIOLOGISCHER MOLEKÜLE UNTER VERWENDUNG VON SULFOLAN PROCÉDÉS DE SÉPARATION DE MOLÉCULES BIOLOGIQUES UTILISANT DU SULFOLANE

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20060516

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20060810

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20060815

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20061031

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070612

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070830

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20071023

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20071030

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101109

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111109

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111109

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121109

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121109

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131109

Year of fee payment: 6

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term