CN113388605A - 用于分离细胞外核酸的快速方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于分离细胞外核酸的快速方法。具体地，本发明涉及一种用于从样品分离细胞外核酸的方法，其中通过将所述细胞外核酸结合于带有阴离子交换基团的固相，任选地使所述样品稳定，所述方法包括下列步骤：在结合混合物中将所述细胞外核酸结合于所述固相，所述结合混合物具有允许所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的第一pH；其中所述样品占所述结合混合物体积的至少85％；分离带有所述被结合的细胞外核酸的所述固相；任选地清洗所述细胞外核酸；任选地从所述固相洗脱细胞外核酸。所述方法具有可以处理大样品体积并且可以高得率快速分离细胞外核酸的优点。所述方法特别适合于可自动化的过程。

Description

用于分离细胞外核酸的快速方法

本申请是国际申请日2012年9月25日、国际申请号PCT/EP2012/068847于2014年5月12日进入中国国家阶段、申请号201280055508.0、发明名称“用于分离细胞外核酸的快速方法”的申请的分案申请。

产生本发明的工作接受了欧洲共同体第七框架计划(European Community'sSeventh Framework Programme)(FP7/2007-2013)的资助协议号222916下的资助。

技术领域

本文所公开的发明涉及从样品、尤其是血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清分离细胞外核酸的方法以及相关的技术。

背景技术

已在血血浆、血清和其他体液中鉴定到细胞外核酸。在相应样品中发现的细胞外核酸，由于它们受到保护而免受核酸酶影响(例如因为它们以蛋白脂质复合物的形式分泌、与蛋白质结合或被包含在囊泡内)这一事实，因此具有一定程度的抗降解性。许多医学病症、恶性肿瘤和感染过程中存在水平升高的细胞外核酸例如DNA和/或RNA，对于疾病进展的筛选、诊断、预后、监测，对于鉴定潜在的治疗靶点以及对于监测治疗反应来说，是尤为令人感兴趣的。此外，母体血液中升高的胎儿DNA/RNA被用于确定例如性别同一性、评估染色体异常和监测妊娠相关的并发症。除了例如源自于肿瘤细胞或胎儿的哺乳动物细胞外核酸之外，包含细胞外核酸的样品还可能包含未包含在细胞内的其他目标核酸。重要的非限制性实例是病原体核酸例如病毒核酸。病毒核酸从样品例如尤其是血液样品或源自于血液的样品的有效分离，对于许多诊断应用来说也是重要的。因此，细胞外核酸在非侵入性诊断和预后中特别有用，并且可以在许多应用领域例如非侵入性产前遗传检测、肿瘤学、移植医学或许多其他疾病中用作例如诊断标志物，并因此具有诊断相关性(例如胎儿来源或肿瘤来源的核酸)。然而，在健康人类中也发现了细胞外核酸。细胞外核酸的常见应用和分析方法被描述在例如下述文献中：WO97/035589，WO97/34015，Swarup等，FEBS Letters 581(2007)795-799，Fleischhacker Ann.N.Y.Acad.Sci.1075:40-49(2006)，Fleischhacker和Schmidt，Biochmica et Biophysica Acta 1775(2007)191-232，Hromadnikova等，(2006)DNA and Cell biology,Volume 25,Number 11pp 635-640；Fan等，(2010)ClinicalChemistry 56:8。

因此，为了允许可靠的分析，细胞外核酸的有效分离是极为重要的。然而，细胞外核酸通常仅仅以低浓度包含在样品中。例如，自由循环的核酸以1-100ng/ml血浆的浓度存在于血浆中。此外，细胞外核酸通常作为大小为500nt、300nt(当指示尺寸以及因此链长时，术语“nt”在DNA的情形中也包括“bp”)或甚至更小的片段(循环核小体)循环。此外，出于诊断目的打算鉴定的真正的目标细胞外核酸通常仅占总细胞外核酸的一小部分。例如，肿瘤特异性DNA片段非常稀少，并且通常以比“正常”细胞外核酸背景低1000倍的浓度被包含。因此，希望处理大样品体积以便获得足够量的细胞外核酸，尤其是足够量的包含在其中的稀有目标分子，以用于下游测定。

在现有技术中，已知几种用于从样品例如尤其是血浆样品分离细胞外核酸的方法。在这里，几种试剂盒也是可商购的。然而，尽管这些试剂盒提供了有用的结果，但它们也具有需要改进的缺点。

例如，QIAamp循环核酸试剂盒允许处理高达5ml的样品量，用于分离细胞外核酸。然而，它需要手动核酸提取。自动进行大体积样品的制备是困难的，这是由于所使用的化学试剂(裂解和结合缓冲液)造成相应的试剂盒需要操控高达25ml的总处理体积。然而，标准的机器人系统仅处理最大3ml的体积。此外，相应的试剂盒还需要几个方法步骤。因此，不但允许处理大样品体积而且同时允许自动进行分离过程的方法，将是有利的。旨在从无细胞样品例如血浆分离例如病毒核酸的其他可商购试剂盒，只能处理相当小的样品体积(参见例如

EasyPlex^TM病毒试剂盒)。在这里，较大样品体积的处理将是有利的，因为这将允许提高核酸得率。

因此，现有技术方法具有几个缺点。为了克服现有技术的缺点，希望提供用于从大样品体积分离细胞外核酸的方法。这将确保分离到足够的细胞外核酸用于下游应用。如果这种要求得不到满足，则存在着例如即使灵敏的方法也不能检测到被分离的细胞外核酸群体中包含的目标分子的风险。此外，现有技术方法通常是耗时的，因此需要几个操作步骤并因此需要在手上花费的时间。在这里，希望提供仅需要几个步骤来分离细胞外核酸的简单快速的方法。这也将减少在制备期间由操作中的错误造成的潜在错误。此外，希望提供适合于自动化的方法。一旦为常规测试建立起诊断靶之后，顾客例如在实验室中需要自动化来管理更高的通量。自动化分离流程在诊断领域中将具有显著优势，因为它降低由手动核酸分离期间发生的错误造成的错误结果的风险。然而，被设计用于执行这样的自动化核酸分离过程的机器人，受到它们可以操作的最大样品体积的限制(参见上文)。因此，通过添加执行分离过程所必需的试剂而增加样品体积，直接减少了可以处理的样品的量，并因此减少了可以通过自动化分离过程的单次运行而获得的核酸的量。最后，现有技术的试剂盒通常需要用于裂解样品的步骤。需要在现有技术中通常进行的相应的裂解步骤不仅仅是为了例如从细胞释放出核酸。当从所谓的无细胞样品例如血浆分离核酸时，通常也进行相应的裂解步骤，以便变性和/或消化蛋白质污染物或可能干扰例如核酸与固相的结合和/或可能导致不适当的纯化的其他污染物质。为了进行相应的裂解步骤，通常添加大体积的裂解试剂例如离液序列高的试剂。执行相应的增加体积的裂解步骤的必要性是一种缺点，因此这减小了可以在例如自动化系统中处理的真正样品的体积。

US 2005/0106602描述了从细胞材料样品分离核酸的方法。没有急性化学裂解。相反，使用了核酸结合基团，其用于双重目的，即结合核酸和支持细胞的裂解。WO2006/036243描述了类似的方法。

Melkonyan等的《跨肾核酸：从原理验证到临床试验》(Transrenal nucleicacids:"From proof of principle to clinical tests",2008)描述了从尿液分离细胞外核酸。将样品与Q-Sepharose阴离子交换基质相接触以结合核酸，随后对其进行清洗和洗脱。所使用的分离流程的详细情况描述在Shekhtman等，“跨肾DNA分析的优化：母体尿液中胎儿DNA的检测”(Optimization of transrenal DNA analysis:Detection of fetal DNAin maternal urine)(Clinical Chemistry 55:4，723-729页，(2009))中。Shekhtman等教导了在将核酸结合于固相之前大量稀释尿液。将10ml尿液用10ml水稀释，并将得到的稀释样品与Q-Sepharose相接触。在WO2008/45505中描述了类似的方法，其还描述了用于从尿液或血浆分离无细胞核酸的基于柱子的方法。

WO02/48164描述了使用阴离子交换基质和电荷切换程序来分离核酸的方法。在第一pH下，使样品与包含可电离基团的材料发生接触，其中所述材料在其第一pH下具有正电荷，使得核酸被结合在材料中。核酸在更高的第二pH下被释放，在所述第二pH下，材料上的电荷为负、中性或正电荷较少。没有描述循环核酸例如肿瘤来源的细胞外核酸的分离。

DE 10 2008 063 003描述了一种使用阴离子表面来分离核酸的方法。没有描述使用大样品体积的细胞外核酸的分离。DE 10 2008 063 001还公开了一种使用阴离子交换基团和特别设计的用于结合核酸的固相来分离核酸的方法。

Kirsch等的“用于从其他体液分离自由循环的血浆DNA和无细胞DNA的改进方法”(An improved method for the isolation of free-circulating plasma DNA andcell-free DNA from other body fluids,2008)描述了使用NucleoSpin Plasma XS试剂盒(Macherey-Nagel)分离无细胞核酸的方法。没有使用用于结合核酸的阴离子交换表面。

本发明的目的是提供一种用于从含有细胞外核酸的样品分离细胞外核酸的方法，所述方法避免了至少一个上面讨论的现有技术的缺点。在特定实施方式中，本发明的目的是提供用于分离细胞外核酸的简单快速的方法，所述方法适合于自动化并允许处理大样品体积。

发明概述

本发明是基于下述发现，即可以通过使用特定流程从各种不同样品有效地分离细胞外核酸，所述特定流程包含使用结合细胞外核酸的阴离子交换材料。

根据第一方面，提供了用于从样品分离细胞外核酸的方法，其中通过将所述细胞外核酸结合于带有阴离子交换基团的固相，任选地使所述样品稳定，其中所述方法包括下列步骤：

a.在允许所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的第一pH下，将所述细胞外核酸结合于所述固相，其中所述样品优选地占所述结合混合物体积的至少85％；

b.分离带有所述被结合的细胞外核酸的所述固相；

c.任选地清洗所述细胞外核酸；

d.任选地从所述固相洗脱细胞外核酸。

本发明的分离方法与现有技术中使用的方法相比具有显著优点，所述优点在于它是快速的，允许处理大样品体积，需要极少的操作步骤，提供高的细胞外核酸回收率，并且是可自动化的。为了有效分离细胞外核酸，所需要的仅仅是将样品酸化以建立结合条件，将所述细胞外核酸结合于所述固相，并将带有被结合的细胞外核酸的固相与剩余样品分开。令人吃惊的是，为了制备用于核酸分离的样品，裂解步骤不是必需的。此外，也不必需添加大体积的试剂或稀释剂来制备用于核酸分离的样品和例如建立结合条件。因此，所述方法具有结合混合物可以主要由样品材料构成的优点。这是优于常规纯化方法、例如基于使用聚硅酸和聚硅酸固相以及离液序列高的试剂的方法的重要优点，在所述常规方法中，几乎50％的结合混合物由为了裂解和/或制备样品以备结合而不得不添加的化学物质构成。按照本发明进行以建立结合条件的酸化，对结合混合物的体积仅有很小的贡献(通常小于10％或甚至小于5％)。因此，由于不必添加大体积的试剂来建立结合条件，因此可以在例如自动化系统中处理的样品的量增至最大。这在使用在可以操作的样品体积方面受到限制的自动化系统时是重要的优点。凭借能够在使用自动化过程时处理大样品体积，本发明的方法能够增加分离到的细胞外核酸的量。这进而能够对细胞外核酸群体中包含的低丰度靶分子进行灵敏的检测和/或分析。

根据第二方面，提供了一种用于从样品分离细胞外核酸的方法，所述样品是或源自于体液，优选地选自血液、血浆、血清或尿液，并且其中所述样品任选地被稳定化，其中为了分离，将细胞外核酸结合于带有阴离子交换基团的固相，其中所述方法包括下列步骤：

a.在结合混合物中将细胞外核酸结合于所述固相，所述结合混合物处于允许将所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的≤6的第一pH下；

b.分离带有所述被结合的细胞外核酸的固相；

c.任选地清洗所述细胞外核酸；

d.优选地在比用于将所述细胞外核酸结合于所述固相的第一pH更高的第二pH下，将所述细胞外核酸从所述固相洗脱；

e.从所述洗脱液分离所述细胞外核酸。

相应的方法允许将细胞外核酸从大样品体积浓缩到可以例如通过常规的自动化系统容易地操作的较小样品体积。在步骤e中使用适合的分离方法，例如在自动化系统上运行的已建立的分离方法，对被分离的细胞外核酸进行进一步纯化。如上述步骤那样包含本发明的概念以便将细胞外核酸从大样品体积浓缩到小样品体积具有可以提高细胞外核酸的总产率的优点，这是因为与使用常规系统相比，可以更方便地处理明显更大的样品体积。

此外，本发明人发现了一种在使用结合核酸的固相时提高小核酸的回收的方法。当分离核酸、尤其是较小的核酸例如细胞外核酸时，较小的核酸通常不被有效地回收，尽管它们最初在结合步骤中结合于核酸固相。本发明人发现，在将所述核酸结合于所述固相之前用聚合物、优选为聚丙烯酸预处理结合核酸的固相，令人吃惊地提高了较小核酸的回收率。因此，在另一方面，本发明提供了已用聚合物例如聚丙烯酸预处理的结合核酸的固相。此外，本发明提供了一种用于产生相应的结合核酸的固相的方法，所述方法包括将所述结合核酸的固相与聚合物相接触，由此将所述聚合物结合于所述固相。此外，本发明涉及一种用于分离核酸、优选为细胞外核酸的方法，其中使用了已用聚合物预处理的结合核酸的固相。用聚合物例如例如聚丙烯酸预处理所述固相，由于可以增加小核酸的回收，导致所述核酸固相的核酸结合特性得以改进。

对于本领域技术人员来说，从下面的描述和随附的权利要求书，本申请的其他目的、特征、优点和方面将变得显而易见。然而，应该理解，下面的描述、随附的权利要求书和具体实施例，尽管指示了本申请的优选实施方式，但仅仅是为了说明而给出的。对于本领域技术人员来说，在阅读了下文之后，在所公开的发明的精神和范围内之内的各种改变和修改将变得显而易见。

附图说明

图1：使用3种不同珠子类型的DNA片段的百分得率

图2：ccfDNA的富集(18S DNA双重PCR测定法)：通过分析结合步骤后的上清液和洗脱液的成功结合的对照

图3：磁性珠子(II型)的尺寸选择性行为-使用两种不同洗脱缓冲液的两个洗脱步骤的珠子

图4：ccfRNA的富集，使用GAPDH测定法测量

图5：抑制试验，用于分析浓缩物是否是PCR相容的，或者是否必须进行清理流程

图6：使用3种不同类型的磁性阴离子交换珠子的病毒富集

图7：与所有供体个体的参比相比的百分得率的中位数(在这里示出了三种不同DNA测定的结果)

图8：在使用片段DNA测定(内部对照)后回收率的中位数

图9：使用不同核酸浓度的分离效能

图10：ccfDNA(18S)的回收-手动富集流程

图11：掺杂的DNA的回收-手动富集流程

图12：胎儿DNA的富集，使用18S检测测定法、Dys14测定法和RhD测定法测量。

图13：短的细胞外DNA片段的尺寸选择性富集，通过APP测定法测量。

图14：靶DNA在具有碱性pH值的缓冲液中的检测，通过双重18S DNA测定法测量。

图15：较长DNA片段在低盐洗脱缓冲液中的低得率回收。

图16：盐依赖性和尺寸选择性，较长DNA片段在高盐洗脱缓冲液中的回收，通过双重18S检测测定法测量。

图17：PCR相容性，掺有不同量靶DNA的洗脱缓冲液没有PCR抑制。

图18：在没有其他盐的情况下，较短DNA片段在碱性pH下的尺寸选择性洗脱，通过双重18S DNA检测来测量。

图19：使用具有不同pH和盐浓度的洗脱缓冲液的ccf DNA的尺寸选择性富集。

图20：具有确定尺寸的DNA片段的盐依赖性富集，使用APP测定法测量。

图21：从母体血浆完全提取胎儿DNA，使用Dys14测定法测量。

图22：PAA的添加提高DNA回收，正如通过双重18S DNA测定法所测量的。

图23：使用不同洗脱体积的DNA分离效率。

图24：高效DNA结合和在洗脱缓冲液中的释放，通过双重18SDNA检测测定法测量。

图25：分离到的DNA的PCR检测不受洗脱缓冲液组分的影响。

图26：DNA的pH值和珠子体积依赖性的富集。

图27：使用I型或II型珠子的DNA富集的比较，使用18S检测测定法测量。

图28：从血清富集DNA。

发明详述

本发明提供了一种用于从样品分离细胞外核酸的方法，其中通过将细胞外核酸结合于带有阴离子交换基团的固相，任选地将所述样品稳定化，其中所述方法包括下列步骤：

a.在允许将所述细胞外核酸结合于所述固相的阴离子交换基团的第一pH下，将所述细胞外核酸结合于所述固相，其中样品优选地占所述结合混合物体积的至少85％；

b.分离带有被结合的细胞外核酸的固相；

c.任选地清洗细胞外核酸；

d.任选地从固相洗脱细胞外核酸。

与所述方法相关的关键优点描述在上面的发明概述中。本发明人发现，使用带有非特异性(即序列不依赖性)结合细胞外核酸的阴离子交换基团的固相，可以从各种样品以高得率快速分离细胞外核酸。所述方法允许处理大样品体积，这是由于为了建立结合条件，所需要的基本上仅仅是样品的酸化。酸化仅仅少量增加样品体积和结合混合物体积，因此与为了能够分离核酸而必须添加大量裂解和/或结合试剂的常规方法相比，允许处理更大的样品体积。正如在实施例中所示，取决于所使用的固相，本发明的方法可以获得高达100％的回收率。因此，使用本发明的方法可能实现的较大样品体积的处理，导致细胞外核酸的得率提高，这是重要的优点，因为细胞外核酸通常以低浓度例如<100ng/ml样品被包含在样品中。使用这样的简单方法处理大样品体积的可能性，还允许在对能够操作的溶液的最大体积有限制的自动化系统中执行本发明。由于为了建立核酸的结合条件只向初始样品添加非常小体积的试剂，因此自动化系统的最大操作体积可以尽可能多地被有效地用于初始样品。通过允许处理较大体积并通过实现高回收率并因此实现提取的细胞外核酸的高得率，本发明的方法允许最大化核酸得率。因此，本发明的方法特别适合于从细胞外核酸含量低例如<100ng/ml样品的生物样品例如体液回收细胞外核酸。本发明的方法可用于分离细胞外核酸，以便可以将它们直接用于下游应用例如随后的分析方法，以便例如扩增、鉴定、定量和/或检测提取的细胞外靶核酸群体中某些靶核酸的存在或不存在。因此，尽管本发明的方法非常简单且快速这一事实，但分离到的核酸的纯度足以用于标准的下游应用，例如在实施例中所示的分析和检测测定法中。

此外，本发明的分离方法也可用作以处理流程，用于从大样品体积分离并因此浓缩细胞外核酸。然后可以任选地使用标准的核酸分离流程对相应地浓缩的细胞外核酸进行进一步纯化。将本发明的方法作为减小用于随后纯化步骤的样品体积的浓缩流程来执行，具有由于可以处理较大的初始样品体积，因此可以节省时间和成本并且可以提到细胞外核酸得率的优点。因此，本发明的方法也可用作预处理流程，以便将细胞外核酸从大样品体积浓缩到允许使用标准的核酸分离和相应的纯化流程的较小的样品体积，其可以在例如对可以操作的样品体积有限制的已建立的自动化系统上运行。相应的预提取以及相应地浓缩步骤的合并，也允许建立并相应地改进使用自动化系统的细胞外核酸的常规试验，这是因为分离结果尤其是在得率方面得以改善。

本发明的方法可以手动或使用自动化系统来进行。手动方法具有通常可以处理较大样品体积的优点(自动化系统由于它们的设计而通常在能够处理的体积方面具有一定限制)。自动化系统具有可以同时处理许多样品，并且自动化系统由于避免了操作误差而倾向于误差较小的优点。通过分拆原始样品样品，平行地处理样品部分，并将洗脱液或洗脱之前的阴离子交换材料重新合并，可以在一定程度上克服在样品体积方面的限制。根据一种实施方式，按照本发明的方法、尤其是在权利要求1中所定义的方法，将包含在第一样品中的细胞外核酸结合于固相。优选地使用粒子、尤其是磁性粒子作为固相。然后将所述带有被结合的细胞外核酸的固相与第二样品的结合混合物相接触，其中所述第二样品优选为同一原始样品的分拆的部分，即将原始样品分拆成第一和第二样品。由此，将第一样品的固相与第二样品的固相合并，然后对合并的固相进行进一步处理。这种样品分拆和洗脱液和/或固相的重新合并，允许使用只能处理有限样品体积的自动化系统容易地处理较大样品体积。

使用本发明时的另一个优点在于不论样品中细胞外核酸的稀释度如何，回收率都能基本上保持相同。因此，本方法允许不论在1ml、5ml、10ml或25ml样品中是否存在相同量的核酸，都能以基本上相同的得率和相应地回收率分离细胞外核酸(参见实施例)。这在从大样品体积分离低丰度细胞外核酸时是特别有利的，因为在使用本发明的方法时，低浓度不妨碍核酸的有效分离。

当在本文中使用时，术语“细胞外核酸”具体是指未被包含在细胞中的核酸。相应的细胞外核酸通常也被称为无细胞核酸。这些术语在本文中作为同义词使用。因此，细胞外核酸通常存在于样品内细胞的外部或多个细胞的外部。术语“细胞外核酸”是指例如细胞外RNA以及细胞外DNA及其混合物。生物样品例如体液或源自于体液的样品例如血浆的无细胞级分(相应地部分)中存在的典型的细胞外核酸的实例，包括但不限于哺乳动物细胞外核酸例如细胞外肿瘤相关或肿瘤来源的DNA和/或RNA、其他细胞外疾病相关的DNA和/或RNA、表观遗传学修饰的DNA、胎儿DNA和/或RNA、小干扰RNA例如miRNA和siRNA，以及非哺乳动物细胞外核酸例如从例如原核生物(例如细菌)、病毒或真菌释放到细胞外核酸群体中的病毒核酸、病原体核酸。根据一种实施方式，细胞外核酸从作为生物样品的体液或源自于体液的样品获得，所述体液例如血液、血浆、血清、唾液、尿液、液剂、脑脊液、痰液、泪液、汗液、羊水或淋巴液；优选地，细胞外核酸从上述样品的无细胞或贫细胞部分获得。在本文中，我们将从循环体液或源自于循环体液的样品、尤其是从循环体液的无细胞或贫细胞部分获得的细胞外核酸，称为循环的细胞外核酸或循环的无细胞核酸(ccf)。根据一种实施方式，术语细胞外核酸具体是指哺乳动物的细胞外核酸，优选为疾病相关的细胞外核酸或疾病来源的细胞外核酸，例如肿瘤相关的细胞外核酸或肿瘤来源的细胞外核酸，由于炎症或损伤、尤其是创伤而释放的细胞外核酸，与其他疾病相关和/或由于其他疾病而释放的细胞外核酸，或源自于胎儿的细胞外核酸。本文中描述的术语“细胞外核酸”还指从其他样品、尤其是除了体液之外的生物样品获得的细胞外核酸。

正如上面讨论的，本发明的方法还可用于分离作为细胞外核酸的一种实施方式的病毒核酸。本发明方法的效率导致后续的下游检测方法灵敏度更高，使得可以在例如献血中更可靠地检测临床上重要的病毒例如HIV或HCV。此外，由于病毒检测的下限更低，因此可以改进抗病毒疗法的监测。当旨在分离病毒核酸时，优选地将本发明的方法用作预处理流程，用于在进行其他核酸分离流程例如标准的表达核酸分离流程之前浓缩所包含的病毒核酸。

当在本文中使用时，术语“结合混合物”是指为结合步骤而制备，并且允许将样品中包含的细胞外核酸结合于固相的阴离子交换基团的组合物。因此，结合混合物为细胞外核酸与固相的结合提供了适合的条件。结合混合物包含样品和添加到样品以便为结合步骤制备样品的试剂和/或化合物。例如，可以向样品添加酸化试剂和/或化合物以建立第一pH值。根据本发明，优选地，结合混合物体积的至少85％由样品提供，并且如果处理稳定化的样品例如稳定化的血浆或血清样品，相应地由稳定化的样品提供。优选地，结合混合物体积的至少90％、至少92％、至少94％、至少95％和最优选地至少97％，由样品和相应地任选被稳定化的样品提供。这确保了结合混合物主要由含有细胞外核酸的样品(其任选地被稳定化)构成。这允许处理大样品体积(参见上文)。当在本文中使用时，术语“结合混合物”不包括固相。因此，在上述体积指标中没有考虑固相的潜在体积贡献。固相是否终究对结合混合物的体积有贡献，还取决于用于结合细胞外核酸的固相。固相的适合实例在下文中描述。

根据一种实施方式，通过将样品的pH调整到第一pH来制备结合混合物。这可以通过加入酸化化合物和/或试剂来实现。酸化试剂的适合实例包括但不限于酸、酸性缓冲剂例如羧酸如乙酸、乙酸钠/乙酸缓冲剂、柠檬酸/柠檬酸盐缓冲剂、丙二酸、酒石酸、HCl、HClO₄、HClO₃、甲酸、硼酸、H₂SO₄、H₂SO₃、酸性磷酸/磷酸盐缓冲系统、MES或其他水溶性无机或有机酸。在优选实施方式中，作为酸化化合物和/或试剂向样品加入酸化溶液、优选为酸化缓冲液，以在结合混合物中建立结合条件。酸化溶液可以含有能够将得到的结合混合物的pH调整到第一pH的缓冲物质。它可以另外地包含盐，优选在溶液中，尤其是在水性溶液中。优选地，酸化溶液包含缓冲物质或不同缓冲物质的组合，其优选地溶解在水中。酸化溶液的特别优选的实例是乙酸钠/乙酸缓冲剂的水性溶液，其浓度优选为0.5至5M，更优选为0.5至4M、0.5至3M，更优选为约1至2M，并优选地具有约2至约5的范围内、更优选约4的pH值。酸化溶液优选地以约1:10至约1:1000的体积比(体积(酸化溶液)：体积(样品，相应地任选被稳定化的样品))，优选地以约1:100至1:20的体积比，更优选地以约1:30的体积比，最优选地以约1:40的体积比添加到样品。其他适合的缓冲系统包括例如乙酸钾/乙酸、柠檬酸钠(或钾)/柠檬酸和磷酸钠(或钾)/磷酸。当处理作为样品的体液(或源自于体液的样品)例如血液、血浆或血清时，相应的比例是特别有用的。

根据一种实施方式，第一pH低于提供在固相表面上的阴离子交换基团的可质子化基团的pKa值。用于将核酸结合于固相的第一pH优选地低于阴离子交换基团的可质子化基团的pKa值。如果阴离子交换基团包含超过一个可质子化基团，则第一pH优选地低于至少一个可质子化基团的pKa。优选地，第一pH比pKa值低至少0.5个单位，更优选地至少1个单位、至少1.5个单位、至少2个单位、至少2.5个单位，并且最优选地比所述pKa值低至少3个单位。优选地，所述pH高于4。

相应地使用的适合于将细胞外核酸结合于固相的阴离子交换基团的第一pH值，还取决于阴离子交换基团的本质和/或阴离子交换基团在固相表面上的密度。所使用的盐浓度也可能影响结合。适用于第一pH值的pH值可以由专业技术人员确定。根据一种实施方式，第一pH处于约4至约7的范围内，更优选地在选自4至6.5、4.5至6.5、5至6.5和5至6的范围内。当使用实施例中描述的阴离子交换粒子时，为结合核酸例如DNA和/或RNA对相应的pH值特别地进行优化。优选地，结合混合物的pH≤6.5，优选地≤6。当旨在分离细胞外RNA时，优选地使用≤5.5或≤5的酸性更强的第一pH值，因为这可能提高RNA得率。样品的酸化建立起第一pH，用于将细胞外核酸结合于固相的阴离子交换基团。此外，酸化对样品进行处理，并因此可以例如通过释放细胞外核酸、例如可以被捕获在例如组蛋白复合体中的DNA来改善结合。

结合发生的时间长度足以允许细胞外核酸与固相的显著结合。适合的以及相应地必需的温育时间取决于所使用的固相和阴离子交换基团的类型和量、样品体积和样品中细胞外核酸的浓度。例如，如果使用具有高阴离子交换基团密度并因此紧密结合细胞外核酸的固相，较短的温育时间可能是足够的。更长的温育时间确保核酸高度有效地结合于固相，由此允许最大化细胞外核酸从样品的回收。根据某些实施方式，温育时间选自至少1min.、至少2min.、至少5min.、至少10min、至少15min，更优选为至少约20min。

在本发明的方法的步骤(b)中，将结合于固相的细胞外核酸与其余样品分离开。为此目的，可以使用本领域中已知的任何手段。适合的手段还取决于用于结合的固相的类型，并且包括但不限于使用磁性固相时的磁性分离、使用例如非磁性粒子或膜时的离心、沉降、施加真空、过滤或层析。适合的固相在下文中描述，并且专业技术人员熟悉相应固相的操作。

在优选实施方式中，用于分离核酸的整个方法在室温下进行。

样品、固相和酸化化合物和/或试剂可以以任何顺序相接触。在优选实施方式中，向样品加入至少一种酸化化合物和/或试剂，以便建立第一pH并因此建立结合条件。然后将得到的结合混合物与固相相接触，以将细胞外核酸结合于固相。任选地，在接触后可以进行进一步的pH调节，以优化结合条件或建立所需的第一pH。然而，首先提供固相，然后以任何顺序添加样品和至少一种酸化化合物和/或试剂，也在本发明的范围之内，并且也取决于所使用的固相的类型。可以使用允许细胞外核酸结合于固相的任何适合的接触顺序。在步骤(b)之后，作为步骤(c)，可以任选地进行一个或多个清洗步骤。根据一种实施方式，将至少一种清洗溶液与带有被结合的细胞外核酸的固相相接触。为了确保被结合的核酸的最大回收，清洗条件优选地被选择成使得在清洗期间，没有显著量的结合于核酸结合基质的核酸从其上被移除。清洗缓冲液优选为水性溶液，并且可以含有表面活性剂。适合的表面活性剂包括但不限于基于聚氧化乙烯的非离子型表面活性剂，优选地选择聚氧化乙烯脂肪醇醚、聚氧化乙烯烷基苯基醚和聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物。优选的实例是例如浓度为约0.01％–1％的TritonX-100或Brij58。适合的清洗溶液在现有技术中也是已知的，因此在这里不需任何进一步描述。如果例如打算将被分离的细胞外核酸不用进一步纯化在例如诊断测定法中进行直接分析和/或检测，则清洗是尤为推荐的。如果打算使用例如对潜在杂质敏感的方法(例如PCR方法)来直接分析被分离的细胞外核酸，则推荐进行至少两个清洗步骤。根据一种实施方式，优选地使用两个不同体积的清洗溶液。在这里，第一清洗溶液的体积优选地大于第二清洗溶液的体积。然而，如果随后使用对杂质相当不敏感的检测和/或分析方法，则清洗不是必需的。此外，如果将本发明的分离方法用于富集并因此将细胞外核酸浓缩在小样品体积中，作为用于随后的核酸分离方法和相应地纯化流程的制备物时，清洗液不是强制性的。如果例如病毒核酸是细胞外核酸群体内的主要靶，则进行相应的后续分离流程是尤为推荐的。

根据一种实施方式，用于分离细胞外核酸的方法还包括从固相洗脱细胞外核酸的步骤(d)。

一般来说，可以使用任何适合的洗脱方法。优选地，通过改变pH值来实现洗脱。因此，根据一种实施方式，洗脱在比用于将细胞外核酸结合于固相的第一pH更高的第二pH下进行。适用于将细胞外核酸从阴离子交换基团洗脱的第二pH值的选择，尤其取决于固相上存在的阴离子交换基团的本质、固相表面上阴离子交换基团的密度和洗脱溶液的离子强度。对于第二pH来说，适合的pH值可以由专业技术人员确定。第二pH优选地比第一pH高至少0.5个单位，比第一pH高至少1个单位，更优选地比第一pH高至少1.5个单位或高至少2个单位。第二pH可以低于、等于或高于阴离子交换基团的可质子化基团的pKa。然而，优选地，它比pKa低至少1个单位，更优选地比pKa低至少1.5个单位或比所述pKa低至少2个单位。优选地，洗脱在≥8的第二pH下进行。优选地，洗脱在选自下列的pH范围内进行：pH≥8并≤14，pH≥8并≤12.6，pH≥8并≤12，pH≥8并≤11，pH≥8并≤10和pH≥8并≤9。用于洗脱的pH值可能还取决于洗脱液的其他目标应用。较低的洗脱pH值可能是有利的，这是因为相应的较低pH值与许多常见的下游反应(例如PCR)更相容。例如，如果需要单链DNA或者必须减少RNA污染物，则例如强碱性pH值、例如至少12的pH值可以被使用并且是有利的。根据一种实施方式，通过使用≤1mol/l的氢氧化钠溶液来实现洗脱。对于某些应用例如随后用亚硫酸氢盐试剂处理洗脱的DNA以便分析DNA甲基化模式来说，在≥12并≤14的pH下洗脱核酸以便将洗脱的DNA变性，可能也是有益的。如果在更高的pH值(例如10或更高)下进行洗脱，如果例如相应的中性pH值对于下游目标应用有益，则可以将包含核酸的洗脱液中和。此外，已发现RNA可以在较低pH值下洗脱。例如，当使用带有聚乙烯亚胺基团的固相时(参见实施例)，RNA可以在8的pH值下被有效洗脱，而对于DNA来说，高于12的更高pH值更加适合。如果打算在洗脱步骤中回收RNA，由于RNA可能被损坏，因此优选地不使用高pH值。如果由第二pH所提供的洗脱强度不足以有效洗脱，则可以例如通过提高洗脱溶液中的盐浓度来避免高于pH 9的高pH值。

洗脱优选地通过将结合于固相的细胞外核酸与洗脱溶液相接触来实现。洗脱溶液优选地包含能够调节第二pH的缓冲物质。具体来说，可以使用生物缓冲剂。适合的实例是浓度为约1mM至1M、优选地10mM至500mM、更优选地50mM至约250mM、最优选地75mM至150mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，并使用例如HCl调整到所需pH。然而，根据一种实施方式，使用缓冲物质的游离碱，例如作为游离碱的Tris。它可以在上述浓度范围内使用。根据一种实施方式，使用包含Tris作为游离碱的洗脱溶液。含有所述游离碱的所述洗脱溶液的pH值可以例如在10至10.5的范围内。根据一种实施方式，所述洗脱溶液不含盐类，尤其是不含碱金属盐或碱土金属盐。正如实施例所示，使用包含Tris作为游离碱并且没有其他盐类的相应的洗脱溶液，允许选择性地洗脱主要是小的核酸，其具有300nt或更短、优选地250nt或更短、更优选地200nt或更短、150nt或更短或甚至100nt或更短的长度，正如将在后面解释并在实施例中示出的。因此，可以使用这些洗脱条件在洗脱缓冲液中富集相应的短核酸而不是更长的核酸。通过向包含Tris作为游离碱的洗脱溶液添加盐类，也可能洗脱更长的核酸。如果对更长的核酸感兴趣，可以调整盐浓度，所述浓度取决于所需截止值。洗脱溶液优选地是包含缓冲物质和任选地其他组分例如盐、尤其是碱金属盐例如氯化钠或氯化钾的水性溶液，所述盐的浓度为例如约0.05至约0.5M、优选地约0.1至约0.2M、更优选地约0.16M。所使用的盐浓度对洗脱效率、尤其是较长核酸的洗脱效率有影响。盐浓度越高，较长核酸的洗脱越高效。因此，提高盐浓度增加较长核酸的洗脱效率。因此通过控制缓冲溶液中的盐浓度，可以控制被洗脱的核酸的尺寸。例如，将洗脱溶液中的盐、尤其是碱金属盐例如氯化钠或氯化钾的浓度提高到75mM或更高，导致尺寸为至少500nt的核酸以高于40％的回收率被洗脱。其他可能的缓冲剂包括但不限于HEPES、Tris-硼酸盐和MOPS。因此，优选地，洗脱在低盐浓度下发生。使用低盐浓度具有洗脱液可以直接用于下游测定法例如PCR反应的优点。根据一种实施方式，使用包含100mM Tris-HCL(含有0.5-1.5％、优选地0.9％的氯化钠，pH 9)的洗脱溶液。然而，使用更高的盐浓度也在本发明的范围之内，尤其是为了提高离子强度以避免例如高于10或高于12的高pH值(参见上文)，例如如果这样的高pH值与下游目标反应不相容的话。根据一种实施方式，使用包含碱金属氢氧化物例如氢氧化钠或氢氧化钾的洗脱溶液。正如由实施例所示，通过改变洗脱溶液中碱金属氢氧化物的浓度，还可以影响主要被洗脱的核酸的尺寸。提高洗脱溶液中碱金属氢氧化物的浓度，增加了被洗脱的核酸的尺寸。优选地，结合于固相的细胞外核酸或具有所需尺寸范围的细胞外核酸的至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％在步骤(d)中被从其洗脱。也可以通过加热和/或振摇来帮助洗脱。

此外，通过在洗脱溶液中包含含有至少两个阴离子基团的阴离子化合物，可以提高洗脱效率，尤其是对于洗脱较长核酸来说。相应的阴离子化合物支持核酸/阴离子交换复合物的破坏，因此支持洗脱。作为含有至少两个阴离子基团的阴离子化合物，可以使用例如羧酸如草酸、苯六甲酸、苯均四酸和柠檬酸。此外，也可以使用聚合的阴离子化合物，例如聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸(PMA)、聚谷氨酸(PGA)和硫酸葡聚糖。相应的阴离子化合物也描述在WO 2011/037692中。正如实施例所示，当加入相应的阴离子化合物时，可以提高洗脱效率。

根据一种实施方式，本发明提供了按照尺寸分离核酸的方法。令人吃惊的是，本发明人发现，当使用阴离子交换基质来结合核酸时，可以简单地通过调整和相应地改变洗脱pH，将被结合的核酸根据它们的尺寸从基质上洗脱。在较低洗脱pH下，只有小的核酸分子从阴离子交换基质上洗脱。当洗脱pH升高时，较大的核酸也可以被洗脱。这允许按照尺寸分离被结合的细胞外核酸。具体来说，已发现为了获得这种尺寸分级效果，仅需要洗脱pH的小的变化。

根据一种实施方式，在高于第一pH的第二pH下，仅有一部分、相应地部分细胞外核酸从固相上洗脱，其中从固相上洗脱的细胞外核酸的平均长度短于保持结合于固相的细胞外核酸的平均长度。根据一种实施方式，第二pH在约7.5至10.5、优选地约8至10、8.2至9.5、优选地约8.5至9的范围内。正如实施例所示，使用具有相应pH值的洗脱溶液允许实现尺寸选择性洗脱，其中从固相上洗脱的细胞外核酸的平均长度短于保持结合于固相的细胞外核酸的平均长度。可以通过调整洗脱条件来调整截止值。具体来说，洗脱溶液的pH值和盐浓度是对截止值、因此对主要被洗脱的核酸的长度有影响的决定性特征。

取决于核酸群体例如被结合或洗脱的核酸中核酸的尺寸分布，核酸分子群体中的平均核酸长度，可以是指群体中一半的核酸分子具有比其更短的长度，另一半核酸分子具有比其更长的长度的核酸长度。然而，核酸分子群体中的平均核酸长度也可以是指在相应的核酸群体中出现频率最高的核酸长度。对于其中某些核酸尺寸或某些核酸尺寸范围占优势的偏态核酸群体来说，确定平均核酸长度的后一种选择方案通常更加适合并因此是优选的。通过调整洗脱条件，可以控制并因此改变被洗脱的核酸的长度和保持结合于阴离子交换基质的核酸的长度。因此，可以调整被洗脱和结合的核酸的尺寸和相应地尺寸范围，从而获得具有预先选择的目标尺寸和相应地预先选择的目标尺寸范围的核酸。优选地，使用所述第二pH从固相上洗脱的核酸的平均长度与保持结合于固相的核酸的平均长度之间的差异，为至少约50nt、至少约75nt、至少约100nt、至少约150nt、至少约200nt、至少约250nt、至少约300nt、至少约350nt或至少约400nt。根据一种实施方式，在第一洗脱步骤中，在第二pH值下从固相洗脱的细胞外核酸的平均长度在最大约700nt、最大约600nt、约10nt至约500nt、10nt至约400nt、15nt至约300nt、优选地约20nt至约250nt、20nt至200nt或约50nt至约150nt的范围内。此外，在这个第一洗脱步骤中，保持结合于固相的核酸的平均长度为至少约200nt、优选地至少约250nt、至少约300nt、至少约400nt、至少约500nt、至少约600nt、至少约700nt、至少约1000nt或至少约1500nt。在优选实施方式中，在第一洗脱步骤中，在第二pH下从固相主要洗脱的细胞外核酸具有最大约1000nt、最大约700nt、最大约600nt、最大约500nt、优选地最大约400nt、最大约300nt、最大约250nt或最大约200nt的长度，和/或在所述第一洗脱步骤中，长度为约200nt或更长、300nt或更长、350nt或更长、400nt或更长、500nt或更长、优选地约700nt或更长、约800nt或更长或约1000nt或更长的核酸主要保持结合于固相。如上所述，核酸的长度被指明。因此，如果细胞外核酸是双链分子(例如DNA)，则上面对于nt长度的指示是指bp。就此而言，术语“主要被洗脱”尤其是指至少50％、优选地至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的指定组的核酸分子从核酸结合基质的洗脱。同样地，就此而言，术语“主要保持结合”尤其是指少于50％、优选地少于40％、少于30％、少于20％、少于10％或少于5％的指定组的核酸分子从核酸结合基质的洗脱。

在步骤(d)中，通过调整固相表面上正电荷的浓度，使得在步骤(d)期间只有较长核酸分子保持结合于基质，而较小的核酸被洗脱，可以实现短核酸的选择性洗脱。可以通过选择在洗脱期间使用的pH值来控制截止值。可以通过在洗脱步骤期间使用的pH来控制正电荷的调整。具体来说，通过添加洗脱溶液进行洗脱，所述洗脱溶液包含能够在洗脱步骤期间提供第二pH的缓冲物质。在优选实施方式中，洗脱在低盐浓度下进行。具体来说，洗脱溶液包含不超过0.5M的盐、不超过0.3M的盐、优选地不超过0.27M的盐、更优选地不超过0.25M的盐。

在特别优选的实施方式中，使用包含含有二乙基氨基、优选地二乙基氨基丙基的阴离子交换基团的固相。正如实施例中所示，包含相应的阴离子交换基团的固相具有显著优点。首先，获得出色的回收率，这也优于其他阴离子交换表面。其次，可以使用温和的洗脱条件，尤其是对于洗脱小核酸来说，这对于被分离的细胞外核酸的许多下游应用来说是有利的。第三，相应地官能化的固相特别好地适合于通过执行尺寸选择性洗脱来富集短的细胞外核酸。包含含有二乙基氨基、优选地二乙基氨基丙基的阴离子交换基团的固相，有利地允许通过改变pH值和/或盐浓度来调控被洗脱核酸的尺寸。正如由实施例所示，可以在狭窄的范围内调整截止值，这引起可靠的尺寸选择性洗脱。根据一种实施方式，在使用包含含有二乙基氨基、优选地二乙基氨基丙基的阴离子交换基团的固相的实施方式中，第二pH在约7.5至10.5、优选地约7.5至9.5、约7.5至约9.0、优选地约8.0–8.5的范围内。具体来说，可以使用洗脱溶液，其包含用于调节所述pH值的缓冲物质和任选地盐例如氯化钠，所述盐的浓度优选为约0.1至约0.2M、更优选为约0.16M。此外，正如由实施例所示，也可以通过洗脱溶液中包含的盐的量来改变并因此控制被洗脱的核酸的尺寸。较大的盐量导致较大核酸的洗脱。

进行尺寸选择性洗脱具有几个优点。首先，由于正如简介中所描述的，细胞外核酸主要具有小的尺寸，因此可以选择性洗脱细胞外核酸。因此，可以使用这样的洗脱条件，在所述洗脱条件中，高分子量核酸例如基因组DNA或其他较长的细胞内核酸不被相应的尺寸选择性洗脱程序回收。这是重要的优点，因为它减少或甚至避免了被分离的细胞外核酸被可能甚至在贫细胞或无细胞样品中存在的残留量的细胞内核酸例如基因组DNA污染，这是因为细胞内核酸可能被例如在储存期间和/或细胞贫化过程中可能发生的消蚀或破坏的细胞释放。本发明的方法允许在如上所述调整洗脱条件时消除分离的核酸中的相应的细胞内核酸污染例如基因组DNA，使得主要洗脱并因此回收尺寸为1,500nt或更小、优选地1,000nt或更小的核酸。通过调整洗脱条件来消除基因组DNA的可能性是重要的优点，因为这允许跳过超离心步骤，所述超离心步骤通常在16000g下进行以进一步澄清血浆，以便除去可能仍与包含的细胞碎片结合的相应的基因组DNA污染。这节省了在手上的时间和设备。此外，正如由实施例所示，通过调整洗脱缓冲液的pH值和/或盐浓度，甚至可以按照尺寸分级尺寸为1,000nt或更小的细胞外核酸。由此可以确定哪个尺寸为1000nt或更小的小细胞外核酸群体被洗脱，并且例如可以主要洗脱并因此回收尺寸为500nt或更小、400nt或更小、300nt或更小、200nt或更小或甚至150nt或更小的核酸。此外，如本文中所述，如果例如对较长的核酸叶感兴趣，但是打算将其作为分开的级分洗脱并因此回收，则也可以进行第二洗脱步骤。在该第二洗脱步骤中，使用允许洗脱较长核酸的条件。适合的条件描述在本文中。因此，由于本发明的方法提供了通过改变洗脱条件来控制被洗脱核酸的尺寸的可能性，因此它是非常灵活的。用于分离尺寸为1,000nt或更小、700nt或更小、600nt或更小、500nt或更小、400nt或更小、300nt或更小、200nt或更小或甚至100nt或更小的小核酸的特别适合的洗脱条件，也描述在实施例中。具体来说，使用包含pH值在8至10.5范围内的缓冲物质例如Tris的洗脱溶液，允许选择性地洗脱尺寸为1,000nt或更小、优选为700nt或更小或甚至500nt或更小的核酸。例如，使用包含Tris作为游离碱并且pH约为10至10.5的洗脱溶液，允许选择性地洗脱尺寸小于500nt并甚至小于300nt的核酸。此外，使用包含碱金属氢氧化物例如氢氧化钠或氢氧化钾的洗脱溶液，允许选择性地洗脱尺寸小于500nt、优选地小于300nt的小核酸。正如由实施例所示，获得的截止值取决于所使用的碱金属氢氧化物的量。洗脱溶液中碱金属氢氧化物的浓度越高，被洗脱的细胞外核酸的尺寸越大。因此，通过调整氢氧化物浓度，可以调整被洗脱的核酸的尺寸。当以缓冲剂的形式使用Tris时，优选地使用在8至9.5、优选地8.5至9范围内的pH值。正如由实施例所示，使用相应的洗脱溶液允许选择性地洗脱小核酸。截止值也可以受到在洗脱溶液中掺入盐、优选为碱金属盐例如氯化钠或氯化钾的影响。正如由实施例所示，调整洗脱缓冲液中盐的浓度对被洗脱的核酸的尺寸具有强烈影响。盐浓度越高，从固相上洗脱的细胞外核酸越长。因此，如本文中所述，通过调整pH值、盐浓度和/或影响洗脱效率的其他添加剂的掺入，可以进行尺寸选择性洗脱。在这里，根据本申请以及尤其是实施例中给出的教示和指导，专业技术人员能够提供具有所需截止值的洗脱溶液。

当进行尺寸选择性洗脱时，优选地固相带有阴离子交换基团，所述阴离子交换基团包含可质子化基团，并且可质子化基团的pKa值在8至12、更优选地9至11的范围内。阴离子交换基团可以包含氮原子，优选地所述阴离子交换基团源自于胺类。具体来说，阴离子交换基团是叔氨基，优选为二烷基氨基，更优选为二乙基氨基，特别优选为二乙基氨基丙基。正如在实施例中所示，相应的叔胺显示出特别良好的回收率，并且允许以定义明确的截止值进行可靠的尺寸选择性洗脱。因此，当打算在洗脱期间进行尺寸选择和相应地尺寸分级时，优选地使用叔氨基、优选为二烷基氨基、更优选为二乙基氨基、特别优选为二乙基氨基丙基。在某些实施方式中，固相材料具有含硅表面例如聚硅酸表面，并且使用硅烷基团，即通过硅烷化将阴离子交换基团偶联到所述表面。例如，固相可以包含含硅表面、优选为聚硅酸表面，并且可以用包含阴离子交换基团的硅烷化合物、优选地用二乙基氨基丙基三甲氧基硅烷进行衍生。优选地，固相表面不用另一种硅烷化合物进行衍生。最优选地，使用磁性粒子作为固相。

根据一种实施方式，尺寸分级洗脱步骤包含下列步骤：

aa)在高于第一pH的第二pH下，将至少一部分结合于固相的细胞外核酸从固相上洗脱，其中在这一步骤中从固相上洗脱的核酸的平均长度短于保持结合于固相的核酸的平均长度；

bb)任选地从固相上洗脱在步骤aa)中保持结合于固相的核酸。在此，可以使用任何洗脱方法。

优选地，在步骤bb)中使用高于第二pH的第三pH来实现洗脱。第三pH优选地可以被选择成使得基本上所有的在步骤aa)中保持结合于固相的核酸在步骤bb)中从其上洗脱下来。在这种情况下，术语“基本上所有的”是指至少70％、优选地至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％的被结合的核酸。第三pH优选地比第二pH高至少0.1个单位、至少0.2个单位、至少0.3个单位、至少0.5个单位、至少0.75个单位、至少1个蛋白、至少1.25个单位、至少1.5个单位、至少1.75个单位或至少2个单位。此外，第二pH与第三pH之间的差优选为3个单位或更小，更优选为2个单位或更小、1.5个单位或更小、1个单位或更小、0.7个单位或更小或0.5个单位或更小。已发现，小的差异例如0.5个pH单位的差异已经足以用于尺寸选择性洗脱。

根据一种实施方式，在一种实施方式的步骤(bb)的洗脱期间的盐浓度和/或温度与步骤(aa)的洗脱期间相比没有显著差异，尤其是没有显著升高。优选地，盐浓度的差异不超过100mM、更优选地不超过50mM、最优选地不超过25mM。此外，根据一种实施方式，用于洗脱的温度的差异不超过10℃，更优选地不超过5℃或不超过2.5℃。此外，优选地，在第一和第二洗脱步骤中，除了pH值之外的其他洗脱条件优选地也相近。

在本发明的方法中，在步骤(a)之前和/或步骤(a)与(b)以及任何随后的步骤(c)和(d)(如果进行相应的任选步骤(c)和(d)的话)之间，可以进行其他处理步骤。根据一种实施方式，在步骤(a)之前不进行其中使用的试剂使样品(其任选地是稳定化的样品)体积增加超过15％的样品消化步骤。优选地，在步骤(a)之前不进行其中使用的试剂使样品体积增加超过10％、更优选地超过5％的样品消化步骤，最优选地，不使用使体积增加超过2.5％的试剂来消化样品。由此确保了结合混合物主要由包含细胞外核酸(其任选地被稳定化)的样品材料构成，从而如上所解释地确保细胞外核酸的最高得率。

取决于待处理的样品类型，已发现，分离结果可以由于样品组成的变化而变。可以通过用适合的手段预处理样品(其任选地是稳定化的样品)，来提高分离结果的均一性。因此，在本发明的范围之内包括在步骤(a)之前进行样品预处理步骤。然而，所述预处理步骤不应显著增加样品的体积并因此增加结合混合物的体积。优选地，如果终究使用增加体积的试剂的话(参见上文)，在相应的样品预处理步骤期间使用的试剂对结合混合物的体积的贡献小于5％、优选地小于2.5％、更优选地小于2％、小于1.5％或小于1％。适合的预处理步骤包括但不限于对样品的机械、化学、物理或酶作用。预处理步骤的实例包括但不限于在珠磨机中研磨样品、使用超声、加热、冷冻和融化、添加去污剂和/或添加降解蛋白质的化合物例如降解蛋白质的酶例如水解酶或蛋白酶。根据一种实施方式，在步骤a)之前进行预处理步骤，其中在步骤a)之前想样品添加至少一种降解蛋白质的化合物、优选为蛋白水解酶、优选为蛋白酶例如蛋白质酶，和/或去污剂。

根据一种实施方式，在步骤c)之前，不使用离液序列高的盐来处理样品。

优选地，样品是包含细胞外核酸的生物样品。样品可以例如选自全血、血浆、血清、痰液、泪液、淋巴液、尿液、汗液、液剂、脑脊液、腹水、乳液、粪便、支气管灌洗液、唾液、羊水、鼻分泌物、阴道分泌物、精液、伤口分泌物和排泄物，以及细胞培养上清液和从其他拭子样品获得的上清液。根据一种实施方式，样品是体液、身体分泌物或身体排泄物，优选为包含细胞外核酸的体液或源自于体液的样品，最优选为全血、血浆或血清。样品包含细胞外核酸。根据另一种实施方式，样品是源自于人类或动物的非流体样品，例如粪便、组织或活检样品。可以使用本发明的方法处理的样品的其他实例包括但不限于生物样品细胞悬液、细胞培养物、细胞培养物的上清液等，其包含细胞外核酸。

根据一种实施方式，包含细胞外核酸的样品是无细胞或贫细胞样品。相应的无细胞或贫细胞样品可以例如从含细胞的样品，通过使用适当的技术除去细胞来获得。典型的实例是可以从全血获得的血浆或血清。如果样品包含大量细胞，如例如使用全血时的情形，则将细胞与其余样品分离开，以便获得包含细胞外核酸的无细胞以及相应的细胞减少的样品级分。因此，根据一种实施方式，从含细胞的样品除去细胞以提供包含细胞外核酸的无细胞或贫细胞样品，并使用本发明的方法从其分离细胞外核酸。这个细胞去除步骤仅仅是任选的，并且如果处理(以及相应地获得以用于处理)仅包含少量残留细胞的样品例如血浆或血清，则该步骤可以废弃。然而，为了改进结果，优选地也除去相应的残留细胞(或可能残留的细胞)，因为它们可能在分离期间污染细胞外核酸。取决于样品类型，可以例如通过离心、优选为高速离心，或通过离心之外的手段例如过滤、沉降或者如果打算避免离心步骤的话结合于(任选地磁性)粒子的表面，来分离并去除细胞，包括残留细胞。相应的细胞去除步骤也可以被容易地包括在自动样品制备流程中。被相应地去除的细胞也可以进一步处理，以便例如分析细胞内核酸。可以例如将细胞储存，和/或可以从被去除的细胞分离生物分子例如核酸或蛋白。

根据一种实施方式，从中分离细胞外核酸的样品是稳定化的样品。许多样品例如血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清，在收集后使用适合的稳定剂进行稳定化。例如血液或源自于血液的样品例如例如血浆或血清，通常至少通过添加抗凝剂、优选为螯合剂例如EDTA或柠檬酸钠进行稳定化。可以加入所使用的稳定化作用以保护样品中的细胞外核酸群体。在本领域中已知几种实现样品稳定化、包括样品中包含的细胞外核酸群体的稳定化的方法。稳定化防止细胞外核酸的降解和/或防止细胞外核酸被细胞内核酸、尤其是从样品中包含的细胞释放的基因组DNA的污染。一种常用的稳定化方法使用甲醛来稳定细胞膜，由此减少细胞裂解，此外，甲醛抑制核酸酶。相应的方法描述在例如US 7,332,277和US 7,442,506中。稳定血液样品的可替选方法描述在例如US 2010/0184069和US 2010/0209930中。用于稳定化样品的优选方法公开在2011年9月26日提交的欧洲专利申请EP11182819.0和2011年9月26日提交的美国专利申请61/539,245中，以及今天提交并要求上述欧洲和美国申请的优先权的相应的PCT申请中。

根据一种实施方式，样品是稳定化的样品，其通过将样品与下述物质相接触来稳定化：

a)至少一种凋亡抑制剂，

b)至少一种高渗剂，其使样品中包含的细胞稳定，和/或

c)至少一种式1的化合物

其中R1是氢基团或烷基基团，优选为C1-C5烷基基团，更优选为甲基基团，R2和R3是相同或不同的以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基团，并且R4是氧、硫或硒基团。

当在本文中使用时，术语“凋亡抑制剂”具体是指其在含细胞的生物样品中的存在提供了细胞内凋亡过程的减少、防止和/或抑制，和/或使细胞更耐受凋亡刺激的化合物。优选地，用于稳定化样品的至少一种凋亡抑制剂选自代谢抑制剂、半胱天冬酶抑制剂和钙蛋白酶抑制剂。优选地，凋亡抑制剂是可透过细胞的。优选地，凋亡抑制剂是具有一个或多个下列特征的半胱天冬酶抑制剂：a)它是泛半胱天冬酶抑制剂并因此是广谱半胱天冬酶抑制剂；b)它包含修饰的半胱天冬酶特异性肽，其中所述半胱天冬酶特异性肽优选地用醛、腈或酮化合物修饰；c)它包含修饰的半胱天冬酶特异性肽，所述肽优选地在羧基端处用O-苯氧基或氟甲基酮(FMK)基团修饰；和/或d)它选自Q-VD-OPh和Z-VAD(OMe)-FMK。在稳定化的样品中，凋亡抑制剂的适合的浓度范围包括但不限于0.01μM至100μM、0.05μM至100μM、0.1μM至50μM、0.5μM至50μM、1μM至40μM、更优选地1μM至30μM或2.5μM至25μM。根据一种实施方式，将半胱天冬酶抑制剂与抗凝剂组合使用以便稳定化血液样品。

可以被包含在稳定化的样品中的至少一种高渗剂，优选地与凋亡抑制剂、优选为半胱天冬酶抑制剂组合使用。高渗剂通过轻度高渗效应(渗透作用)诱导细胞皱缩，由此提高细胞稳定性。具体来说，存在于稳定化的样品中的高渗剂使样品中包含的细胞稳定，从而减少了从损伤的细胞释放的细胞内核酸、尤其是基因组DNA的量。由此，细胞外核酸群体基本上得到保护，并且降低了细胞内核酸、尤其是基因组DNA污染或相应地稀释细胞外核酸的风险。优选地，高渗剂具有一个或多个下列特征：

a)它是不带电荷的；

b)它是羟基化的有机化合物并因此带有至少一个、优选地至少两个羟基；

c)它是多元醇，优选地包含2至10个羟基，优选地3至8个羟基；

d)它是羟基-羰基化合物，并因此是具有一个或多个羟基(OH)和一个或多个羰基的化合物；

e)它选自羟基化酮化合物和糖类或从它们衍生的化合物；

f)它选自多元醇、糖醇、糖类、葡萄糖、棉籽糖、蔗糖、果糖、α-d-乳糖单水合物、二羟基丙酮，醇类、甘油、赤藓糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、倭勒米糖醇(volemitol)；

g)它是水溶性的并且对细胞无毒性；和/或

h)它不诱导或支持生物样品中包含的细胞的裂解，因此优选地不起到去污剂或细胞膜溶解剂的作用。

稳定化的样品可以包含至少一种高渗剂或高渗剂的混合物，其浓度范围选自0.05M至2M、0.1M至1.5M、0.15M至0.8M、0.2M至0.7M或0.1M至0.6M。当使用羟基化的有机化合物例如糖类例如二羟丙酮作为用于稳定化的高渗剂时，相应的浓度是特别适合的。

正如上面讨论的，稳定化的样品可以包含式1的化合物，其在实现显著的稳定化效应和基本上保护稳定化的样品中细胞外核酸群体的组成方面是有效的。也可以使用一种或多种式1的化合物的混合物进行稳定化。所述化合物还可以与上述凋亡抑制剂和/或高渗剂组合使用。烃基团R2和/或R3可以彼此独立地选自烷基包括短链烷基和长链烷基、烯基、烷氧基、长链烷氧基、环烷基、芳基、卤代烷基、烷基甲硅烷基、烷基甲硅烷基氧基、亚烷基、烯二基、亚芳基、羧酸和羰基。R2和/或R3的链长n具有来说可以具有值1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。优选地，R2和R3具有1-10的碳链长度。优选地，R2和R3具有1-5的碳链长度。对于R2和R3来说，特别优选的是1或2的链长。R1的链长n优选地具有值1、2、3、4或5。对于R1来说特别优选的是1或2的链长。R4优选地是氧。根据优选实施方式，式1的化合物是N,N-二烷基-羧酸酰胺。根据一种实施方式，化合物选自N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二乙基甲酰胺。优选地，式1的物质是N,N-二甲基乙酰胺(DMAA)。稳定化的样品可以包含式1的所述化合物或相应化合物的混合物，其浓度在0.1％直至50％的范围内。优选的浓度范围可以选自0.1％至30％、1％至20％、1.25％至15％、1.5％至10％、1.5％至7.5％和1.5％至5％。当使用N,N-二烷基-羧酸酰胺例如N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、N,N-二乙基甲酰胺或N,N-二甲基甲酰胺作为稳定剂时，相应的浓度是特别适合的。也可以使用N,N-二甲基丙酰胺。

除了上述稳定剂之外，还可以使用抗凝剂，优选为螯合剂。

术语“样品”优选地是指天然样品，例如从人类或动物获得的样品，然而它可能已任选地通过适当的试剂稳定化。稳定化的样品也被术语“样品”并且也被术语“天然样品”所涵盖。此外，细胞可能已从原始样品中除去。相应的贫细胞或无细胞样品也被术语“样品”并且也被术语“天然样品”所涵盖。相应的天然样品的典型实例是体液例如血液或源自于体液的样品，尤其是通过从体液除去细胞而源自于体液的样品。血液从人类或动物获得，并且通常立即在例如EDTA或其他适合的稳定化组合物(参见上文)中稳定化。此外，可以从血液样品中去除细胞，以获得血浆和/或血清。已任选地被稳定化并且可能已任选地从中除去细胞的相应的样品，也被术语“样品”以及术语“天然样品”所涵盖。适合的样品也在上文中描述。术语“天然样品”优选地不指称并因此不包括已向其添加结合试剂、裂解试剂或离液序列高的盐，使得天然样品的体积增加超过10％、超过5％、超过2.5％、超过2％或超过1％的处理过的样品。根据一种实施方式，不添加相应试剂。正如上面讨论的，天然样品可以包含稳定剂。为避免疑义，当获得样品例如体液时添加的相应的稳定剂和/或稳定组合物，不涵盖在为处理样品而添加的试剂的体积贡献的确定中。这尤其适用于所述稳定剂不引起和/或促进细胞裂解的情况。如果使用引起和/或促进裂解的稳定剂，根据一种实施方式，它们被涵盖在为处理样品而添加的试剂的体积贡献的确定中。然而，通常不使用相应的试剂作为稳定剂来稳定化无细胞核酸，因为如果它们引起细胞裂解，则它们不使细胞外核酸群体稳定，而是促进它们被细胞内核酸的污染。

在本发明的方法中使用的固相带有阴离子交换基团。阴离子交换基团优选地包含至少一个可质子化基团。可以使用适合于阴离子交换层析的任何固相，包括但不限于含硅材料例如二氧化硅和聚硅酸材料、硼硅酸盐、硅酸盐、无机玻璃、有机聚合物例如聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚苯乙烯、琼脂糖、多糖例如纤维素、金属氧化物例如氧化铝、氧化镁、氧化钛和氧化锆、金属例如金或铂、sephadex、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺、二乙烯苯聚合物、苯乙烯-二乙烯苯聚合物、葡聚糖及其衍生物、玻璃或二氧化硅表面。固相的优选格式包括但不限于粒子、珠子、膜、滤膜、板和毛细管。在某些实施方式中，可以将阴离子交换基团连接到处理管例如微量管、微孔板的孔或毛细管的表面，并且使用这些表面，也可以在微尺度上分离核酸。固相优选地由矿物或聚合材料制成或包含这些材料，例如二氧化硅、玻璃、石英、聚乙烯、聚丙烯、聚偏氯乙烯、聚丙烯腈、聚氯乙烯、聚丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸甲酯。优选地，至少带有阴离子交换基团的表面由这些材料之一或其混合物、优选为二氧化硅材料和/或玻璃构成。

此外，固相可以包含磁性材料，磁性粒子的使用是特别优选的。实例包括但不限于磁性(例如顺磁性、超顺磁性、铁磁性或亚铁磁性)粒子，包括但不限于其中合并或结合有磁性材料的聚苯乙烯、琼脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖和/或二氧化硅和聚硅酸材料。磁性材料可以是亚铁磁性、铁磁性、顺磁性或超顺磁性的，并优选地是超顺磁性或铁磁性的。优选地，磁性材料被例如二氧化硅、聚硅酸、玻璃或聚合材料完全包封。在某些优选实施方式中，核酸结合基质是含硅粒子，优选为聚硅酸粒子，优选为带有阴离子交换基团的磁性聚硅酸粒子。当使用磁性粒子时，优选地通过磁体的帮助来实现分离。根据一种实施方式，带有核酸的核酸结合基质被磁性吸引到含有反应混合物的反应管的底部或壁，然后例如通过吮吸或倾倒从反应容器除去剩余的反应混合物，或通过将磁体投入到反应容器中并从剩余的样品除去磁性粒子，将磁性粒子从反应容器移除。

为了用阴离子交换基团对表面进行官能化，几种方法是可行的。可以将阴离子交换基团共价或非共价、静电地直接结合于表面，或者阴离子交换基团可以形成聚合物或其他组合物的一部分，所述聚合物或其他组合物形成表面涂层或提供在固相表面处。阴离子交换基团也可以沉淀在固相上。根据一种实施方式，阴离子交换基团以涂层形式施加在固相上。

优选地将阴离子交换基团附连于如上所述的固相材料的表面，尤其是通过共价偶联。因此，可以将固相官能化，以使用官能团例如Si-O-Si、Si-OH、醇、二元醇或多元醇、羧酸、胺、磷酸酯或膦酸酯来附连阴离子交换基团。例如，通过使用环氧化物、(活化的)羧酸、硅烷、酸酐、酰氯、甲酸基、三氟乙酰磺酰基或五氟苯基，可以将阴离子交换基团附连于固相。可以将官能团直接或通过(直链或支链)间隔物基团例如烃类例如-(CH₂)_n-基团、糖类、聚乙二醇和聚丙二醇附连到固相。或者，由包含阴离子交换基团例如氨基官能团的单体构成的聚合物，也可以用作阴离子交换材料。在某些实施方式中，固相材料具有含硅表面例如聚硅酸表面，并且使用硅烷基团将阴离子交换基团偶联于所述表面。

可以在本发明的情形中使用的阴离子交换材料包括但不限于用阴离子交换基团修饰的材料。这样的阴离子交换基团的实例是单胺、二胺、多胺和含氮芳香族或脂族杂环基团。优选地，阴离子交换基团包含至少一个伯、仲或叔氨基，在优选实施方式中，阴离子交换基团包含选自下式的伯、仲和叔胺的基团

R₃N、R₂NH、RNH₂和/或X-(CH₂)_n-Y

其中

X是R₂N、RNH或NH₂，

Y是R₂N、RNH或NH₂，

R彼此独立地是直链、支链或环状烷基、烯基、炔基或芳基取代基，其可以包含优选地选自O、N、S和P的一个或多个杂原子，并且

n是0至20、优选地0至18范围内的整数。

因此，阴离子交换基团可以具有可质子化基团，并任选地可以具有超过一个可以彼此相同或不同的可质子化基团。可质子化基团优选地是在高pH值下为中性或不带电荷，并且在低pH值下质子化从而具有正电荷的化学基团。具体来说，在本发明的方法中发生核酸与固相的结合的第一pH下，可质子化基团带有正电荷。优选地，(质子化的)可质子化基团的pKa值在约8至约13、更优选地约8.5至约12或约9至约11的范围内。

因此，具体来说，适合的阴离子交换基团的实例是氨基例如伯、仲和叔氨基以及环状胺、芳香族胺和杂环胺，优选为叔氨基。氨基优选地带有烷基、烯基、炔基和/或芳香族取代基，包括环状取代基和与氮原子一起形成杂环或杂芳族环的取代基。取代基优选地包含1至20个碳原子，更优选地1至12、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3或1或2个碳原子。它们可以是直链或支链的，并可以包含重原子例如氧、氮、硫、硅和卤素(例如氟、氯、溴)原子。优选地，取代基包含不超过4个、更优选地不超过3个、不超过2个或不超过1个杂原子。

在一种实施方式中，阴离子交换基团优选地带有1至10个氨基。更优选地，阴离子交换基团带有2至8个氨基，并且特别低，阴离子交换基团带有2至6个氨基。

胺官能团的具体实例是伯胺例如氨基甲基(AM)、氨基乙基(AE)、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基例如二乙基氨基乙基(DEAE)、乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、三甲基氨基(TMA)、三乙基氨基乙基(TEAE)、直链或支链聚乙烯亚胺(PEI)、羧基化或羟基烷基化的聚乙烯亚胺、聚醚胺(jeffamine)、精胺、亚精胺、3-(丙基氨基)丙胺、聚酰胺胺(PAMAM)树枝状聚合物、聚丙烯胺、聚乙烯胺、N-吗啉乙基、聚赖氨酸和四氮杂环烷类。附连于核酸结合配体的优选的可质子化基团是二烷基氨基，特别是二乙基氨基。正如由实施例所示，这些基团在它们的结合效率和它们在进行尺寸选择性洗脱时的优势方面是有利的。

阴离子交换基团优选地通过连接物基团附连于固相。因此，具体来说，阴离子交换基团包含附连于连接物基团的可质子化基团。连接物基团优选地是直链、支链或环状亚烷基、亚烯基或亚炔基，其优选地包含1至20个碳原子，更优选地1至12、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3或1或2个碳原子。它还可以包含杂原子例如氧、氮、硫、硅和卤素(氟、氯、溴)原子，优选地不超过4个、更优选地不超过3个、不超过2个或不超过1个杂原子。在优选实施方式中，连接物基团是亚烷基，尤其是亚丙基。

在某些实施方式中，固相还包含惰性配体。优选地，惰性配体不显著参与核酸结合和/或不强烈结合于核酸。具体来说，惰性配体是中性或不带电荷的，并优选地是亲水性的。可以将惰性配体附连于本文中所描述的用于核酸结合配体的核酸结合基质。优选地，惰性配体是有机组成部分，尤其是烷基、烯基、炔基或芳香族组成部分，其可以是直链、支链或环状的，并优选地包含至少一个杂原子例如氧、氮、硫、硅和卤素(氟、氯、溴)原子。惰性配体优选地包含1至20个碳原子，更优选地1至12、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3或1或2个碳原子，以及最多4个、更优选地最多3个、最多2个或最多1个杂原子。特别优选的是包含至少一个羟基、尤其是至少2个羟基的惰性配体，例如包含2,3-二羟基丙基的配体。惰性配体的具体实例是(2,3-二羟基丙基)氧基丙基。

惰性配体可用于减少在阴离子交换基团的偶联期间附连于固相的核酸结合性阴离子交换基团的量。因此，可以为固相的随后应用控制并调节固相表面上阴离子交换基团的密度。具体来说，固相可以包含阴离子交换基团和惰性配体，其比例在约1:1至约1:10、优选地约1:2至约1:5的范围内，更优选为约1:3。使用另外包含所描述的惰性配体的固相例如磁性粒子，具有可以使用非常温和的洗脱条件的优点，这对许多下游应用来说是有利的。

在另一种实施方式中，固相不包含这样的惰性配体。优选地，固相仅包含阴离子交换基团并且不包含任何其他配体。根据一种实施方式，固相包含含硅表面、优选为聚硅酸表面，并且使用包含阴离子交换基团的硅烷化合物衍生化，而不使用另一种硅烷化合物衍生化。

适合的结合核酸的固相、阴离子交换基团、可质子化基团和惰性配体的实例描述在WO 2010/072834 A1、DE10 2008 063 001A1、WO002010072821A1和DE 10 2008 063 003中，并且相应的公开通过参考并入本文。

根据一种实施方式，从样品分离总核酸，并且细胞外核酸作为一部分被包含在其中。如果样品是无细胞或贫细胞样品，则从其中分离的总核酸主要包含细胞外核酸或甚至由细胞外核酸构成。在本发明的范围之内还包括至少主要分离特定靶核酸。靶核酸可以是例如某种类型的核酸例如RNA或DNA，包括mRNA、microRNA、其他非编码核酸、表观遗传学修饰的核酸和细胞外核酸群体中包含的其他核酸。本发明的范围内还包括例如在分离后使用核酸酶消化非靶核酸。术语靶核酸也可以指称特定种类的核酸，例如已知是某些疾病标志物的细胞外核酸或病毒核酸。正如上面讨论的，细胞外核酸的分离还可以包含例如使用适合的捕获探针来特异性分离相应的靶核酸。术语“靶核酸”也指称具有某些长度的核酸，例如长度为2000nt或更短、1000nt或更短或500nt或更短的核酸(正如上面讨论的，用“nt”指示的链长在双链DNA的情况下是指bp)。分离相应的较小靶核酸可能是有利的，因为已知细胞外核酸通常具有小于2000nt、通常小于1000nt、通常甚至小于500nt的较小尺寸。将分离和相应地纯化聚焦于相应的小核酸，可以提高在分离到的核酸中获得的细胞外核酸的比例。适合的手段例如选择性洗脱，公开在上文中。

可以使用适合的测定法和/或分析方法对分离的核酸进行直接分析和/或进一步处理。如果打算进行相应的直接使用，在本发明的方法中优选进行一个或多个上面描述的清洗步骤，特别是如果使用对杂质敏感的下游测定法时。

被分离的细胞外核酸和/或被包含或怀疑被包含在其中的特定靶细胞外核酸，可以被鉴定、定量、修饰、与至少一种酶进行接触、扩增、反转录、克隆、测序、与探针相接触和/或被检测。相应的方法在现有技术中是公知的，并且通常应用于医学、诊断和/或预后领域以便分析细胞外核酸(也参见本发明的背景中的详细描述)。因此，在将细胞外核酸任选地作为总核酸、总RNA和/或总DNA的一部分(参见上文)分离后，可以对它们进行分析以鉴定疾病状态的存在、不存在和严重性，所述疾病状态包括但不限于多种肿瘤疾病，尤其是前恶性和恶性肿瘤，例如不同形式的癌症。例如，可以对被分离的细胞外核酸进行分析，以便检测许多应用领域中的诊断和/或预后标志物(例如胎儿或肿瘤来源的细胞外核酸)，所述应用包括但不限于非侵入性产前遗传检测和相应的筛查、疾病筛查、肿瘤学、癌症筛查、早期癌症筛查、癌症疗法监测、遗传测试(基因分析)、传染病测试、病原体测试、受伤诊断、创伤身段、移植医学或许多其他疾病，并因此是诊断和/或预后相关的。根据一种实施方式，对被分离的细胞外核酸进行分析，以鉴定和/或表征疾病感染或胎儿特征。因此，正如上面讨论的，本文描述的分离方法可以进一步包含核酸分析和/或处理的步骤c)。核酸的分析/进一步处理可以使用任何核酸分析/处理方法来进行，所述方法包括但不限于扩增技术、聚合酶链反应(PCR)、等温扩增、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链反应(Q-PCR)、数字PCR、凝胶电泳、毛细管电泳、质谱术、荧光检测、紫外光谱术、杂交测定法、DNA或RNA测序、限制性分析、反转录、NASBA、等位基因特异性聚合酶链反应、聚合酶循环组装(PCA)、不对称聚合酶链反应、指数后线性聚合酶链反应(LATE-PCR)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、热启动聚合酶链反应、序列间特异性聚合酶链反应(ISSR)、反向聚合酶链反应、连接介导的聚合酶链反应、甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、多重聚合酶链反应、巢式聚合酶链反应、固相聚合酶链反应或其任何组合。相应的技术对于本领域技术人员来说是公知的，因此不需要在这里进行进一步描述。

根据一种实施方式，对被分离的细胞外核酸精心分析以鉴定、检测、筛查、监测或排除疾病、感染和/或至少一种胎儿特征。

此外，正如上面讨论的，本发明的分离方法还可以用作预处理流程，以便从样品浓缩细胞外核酸，用于随后的核酸纯化流程。这种实施方式具有可以将细胞外核酸从大样品体积浓缩至小样品体积的优点。在本发明的方法之后可以使用基本上任何标准的核酸纯化流程，以进一步纯化使用本发明的方法浓缩的细胞外核酸。相应的纯化方法的实例包括但不限于提取、固相提取、基于聚硅酸的纯化、基于磁性粒子的纯化、酚-氯仿提取、阴离子交换层析(使用阴离子交换表面)、电泳、沉淀及其组合。通过例如使用能够提供序列特异性结合并偶联于固相支持物的适合的探针从富集的细胞外核酸群体特异性分离特定的靶细胞外核酸，也在本发明的范围之内。还可以使用本领域技术人员已知的任何其他核酸分离技术。根据一种实施方式，使用离液序列高的试剂和/或至少一种醇从富集的细胞外核酸分离并因此进一步纯化核酸。优选地，通过将核酸结合于固相、优选为包含硅、优选为聚硅酸的固相，来分离核酸。适合的方法和试剂盒也是可商购的，例如

循环核酸试剂盒(

Circulating Nucleic Acid Kit)(QIAGEN)、QIAamp MinElute病毒离心或真空试剂盒(QIAamp MinElute Virus Spin或Vacuum Kit)(QIAGEN)、Chemagic循环NA试剂盒(Chemagic Circulating NA Kit)(Chemagen)、NucleoSpin血浆XS试剂盒(NucleoSpinPlasma XS Kit)(Macherey-Nagel)、血浆/血清循环DNA纯化试剂盒(Plasma/SerumCirculating DNA Purification Kit)(Norgen Biotek)、血浆/血清循环RNA纯化试剂盒(Plasma/Serum Circulating RNA Purification Kit)(Norgen Biotek)、高纯度病毒核酸大体积试剂盒(High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit)(Roche)和适用于纯化循环核酸的其他可商购试剂盒。在这里，也可以获得自动化流程，例如在QIAsymphony系统、EZ1仪器、QIAcube(QIAGEN)或MagNApure系统(Roche)、m2000样品制备系统(Abbott)、EasyMag系统(bioMérieux)上运行的流程。此外，还可以使用适合于从生物无细胞样品分离核酸的任何其他可商购的液体操作样品制备系统。如果在本发明的分离方法后进行相应的进一步纯化步骤，则不必进行上述清洗步骤。

从大体积(例如5ml或更多)的起始材料富集细胞外核酸，允许随后使用常规的可商购核酸提取方法来纯化核酸。具体来说，通过将细胞外核酸可逆结合于带有阴离子交换基团的固相来进行在前面的富集步骤，允许使用目前可获得的自动化系统纯化这些核酸，由于通过添加为裂解样品和/或建立结合条件而添加的其他试剂造成的体积增加，所述自动化系统通常将原始样品输入体积限制到1ml或更小。

正如在下面的实施例部分中示出的，本发明的分离流程可以手动进行，但是也在机器人系统，例如一种能够全自动地执行核酸富集和纯化流程的可商购的核酸提取机器人QIAsymphony SP上试验。由于根据本发明仅仅必须添加小体积的简单化学物质，因此可以自动处理接近3ml样品，并且可以从接近3ml样品(可以由所述机器人系统操作的体积限制在3ml)提取核酸。当手动进行本发明的方法时(或者当相应地改造自动化系统时)，可以处理甚至更大的5ml、10ml、15ml或更大的样品体积。由于本发明方法的简单性，操作错误的风险低。此外，所述方法非常快速，因此可以容易地作为预处理程序整合在现有的操作中，以便在进行标准的核酸分离流程之前从大样品体积浓缩细胞外核酸。由此确保了被分离的细胞外核酸的最高得率和纯度。

本发明的方法特别适合于处理包含少量细胞外核酸的样品。令人吃惊地，本发明人可以证实，即使样品中的核酸浓度非常低，本发明的方法也提供良好的核酸得率。正如在简介中讨论的，细胞外核酸通常以1至100ng/ml样品的相当低的量被包含在样品(例如血浆或血清样品)中。因此，根据一种实施方式，含有核酸的样品仅包含少量核酸，其浓度选自低于1μg/ml样品、低于500ng/ml样品、低于300ng/ml样品、低于200ng/ml样品、低于150ng/ml样品、低于100ng/ml样品、低于50ng/ml样品或低于30ng/ml样品。

可以使用本发明的方法处理大样品体积并将分离到的核酸浓缩在小洗脱体积中这一优点，补偿了起始材料中细胞外核酸的低浓度。此外，正如在实施例中所示，本发明的方法的性能不受样品中细胞外核酸的低浓度的妨碍。因此，不论核酸以高还是低的浓度稀释率被包含在样品中，回收率基本上相同。

还提供了用于从样品分析细胞外核酸的方法，所述样品是体液或源自于体液，优选地选自血液、血浆或血清，并且其中所述样品任选地被稳定化，其中为了分离，将细胞外核酸结合于带有阴离子交换基团的固相，其中所述方法包括下列步骤：

a.在结合混合物中将细胞外核酸结合于固相，所述结合混合物处于允许将细胞外核酸结合于固相的阴离子交换基团的≤6的第一pH下；

b.分离带有所述被结合的细胞外核酸的固相；

c.任选地清洗所述细胞外核酸；

d.在第二pH下从固相洗脱细胞外核酸，所述第二pH高于用于将细胞外核酸结合于固相的第一pH；

e.从洗脱液分离所述细胞外核酸。

这种方法描述了本发明的概念的实施方式，其中使用步骤a.至d.将细胞外核酸优选地从大样品体积浓缩到小样品体积中，然后可以在步骤e.中使用例如标准的核酸分离方法对所述小样品体积进行进一步处理，以从其分离细胞外核酸。优点已在上面解释。关于哥哥步骤a.至e.的详细情况，也已在上文中描述并且也适用于这里。它参考上面的公开内容。

此外，本发明人发现了在使用结合核酸的固相时提高小核酸的回收的方法。当分离核酸、尤其是较小的核酸例如细胞外核酸时，即使它们一开始在结合步骤中结合于核酸固相，较小的核酸也不被高效地回收。据推测，回收率的这种损失来自于较小的核酸与结合核酸的固相的紧密、潜在地不可逆的结合。因此，这些核酸在常见洗脱条件下主要保持结合于结合核酸的固相。因此，较小的核酸的得率降低，这在小核酸仅以例如低于100ng/ml样品的少量存在于核酸群体中时，正如细胞外核酸的情况下，造成问题。此外，在细胞外核酸的群体中，潜在的靶核酸例如某些诊断标志物通常以甚至更低的量被包含。因此，当使用结合核酸的固相时，对提高较小核酸的回收率存在着需求。

本发明人发现，在将核酸结合于固相之前用聚合物、优选为聚丙烯酸预处理结合核酸的固相，令人吃惊地提高了较小核酸的回收率。

因此，另一方面，本发明提供了已经用聚合物预处理的结合核酸的固相。此外，另一方面，本发明提供了用于生产相应的结合核酸的固相的方法，所述方法包括将结合核酸的固相与聚合物相接触，由此将聚合物结合于固相。此外，本发明涉及用于分离核酸、优选为细胞外核酸的方法，其中使用已用聚合物预处理的结合核酸的固相。正如上面讨论的，用聚合物、优选为合成聚合物例如聚丙烯酸预处理固相，引起核酸固相的核酸结合特征的改善，这是因为可以提高小核酸的回收。

聚合物可以是任何聚合物或聚合化合物，只要它能够结合于结合核酸的固相并提供本文中描述的效果、即提高小核酸的回收即可。聚合物与结合核酸的固相的结合优选为非共价的，并且优选地涉及离子相互作用。聚合物优选为包含多个酸性基团的聚酸和/或包含多个带负电荷基团的聚阴离子。根据一种实施方式，聚合物具有至少一个可以去质子化的氧官能团，并且优选地，去质子化的形式的负电荷可以在对位氧原子之间离域。相应的聚合物的实例包括含有羧基官能团的聚合物例如聚丙烯酸或马来酸共聚物，以及含有包括磷或硫的有机官能团的聚合物，例如聚磷酸酯、聚-dT或相应的聚磺酸酯。当如上所述使用包含阴离子交换基团的结合核酸的固相时，相应的聚合物是特别适合的。在这些实施方式中，聚合物优选地通过离子相互作用附连于结合核酸的固相。根据一种实施方式，所述聚合物是多肽(该术语包括蛋白质)例如乳蛋白或BSA。在优选实施方式中，所述聚合物不是核酸和/或多肽和/或多糖。当附连于核酸结合基质时，聚合物优选地至少部分被去质子化。

优选地，为了预处理结合核酸的固相，使用聚丙烯酸。优选地使用具有低于2500、优选地低于2000的分子量的短的聚丙烯酸。根据一种实施方式，聚丙烯酸的分子量在1500至1950之间的范围内。正如在实施例中所示，用相应的聚丙烯酸预处理结合核酸的固相，导致较小的核酸例如长度短于500nt、300nt、250nt、200nt、150nt、100nt或75nt(正如上面讨论的，由“nt”指示的链长在双链DNA的情况下是指“bp”)的核酸的回收显著提高。

结合核酸的固相的实例包括但不限于含硅材料例如二氧化硅和聚硅酸材料、硼硅酸盐、硅酸盐、无机玻璃、有机聚合物例如聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚苯乙烯、琼脂糖、多糖例如纤维素、金属氧化物例如氧化铝、氧化镁、二氧化硅、氧化钛和氧化锆、金属例如金或铂、sephadex、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺、二乙烯苯聚合物、苯乙烯-二乙烯苯聚合物、葡聚糖及其衍生物、玻璃或二氧化硅表面。固相的优选格式包括但不限于粒子、珠子、膜、滤膜、板和毛细管。优选地，结合核酸的固相是如上所述包含阴离子交换基团的固相。优选地，固相在其表面上包含硅烷基团，并且例如已被硅烷化。优选地，使用优选地包含二氧化硅材料例如聚硅酸的磁性粒子作为固相。根据一种实施方式，固相是多孔材料。

为了生产预处理的结合核酸的固相，可以将固相浸泡在聚合物中。由此，固相的紧密结合小核酸的结合位点的至少一部分变得阻断。阻断可以是可逆或不可逆的。根据一种实施方式，将结合核酸的固相与与聚合物温育几个小时。在温育过程中，聚合物可以以至少1mg/ml、优选地至少5mg/ml、至少7.5mg/ml、更优选地至少10mg/ml的浓度使用。适合的范围包括但不限于2.5mg/ml至25mg/ml，优选地5mg/ml至20mg/ml。当使用聚丙烯酸时，这些量特别适合。

还提供了试剂盒，其包含如上所述已用聚合物预处理的结合核酸的固相。试剂盒可以包含其他试剂，例如结合、清洗和/或洗脱溶液。试剂盒优选地被设计成在本发明的任何方法中使用。此外，如上所述已用聚合物预处理的结合核酸的固相可以在本发明的方法中使用。

还提供了用于生产具有改进特征的结合核酸的固相的方法，所述方法包括将结合核酸的固相与如上所述的优选地选自聚丙烯酸、马来酸共聚物、聚磺酸酯、聚磷酸酯和聚(dT)的聚合物相接触，并将所述聚合物结合于结合核酸的固相，其中当用于本发明的核酸分离方法中时，已用聚合物处理的结合核酸的固相与未处理的结合核酸的固相相比，提供了长度短于500nt，例如短于400nt、短于350nt、短于300nt、短于250nt、短于200nt、短于150nt或短于100nt(正如上面讨论的，由“nt”指示的链长在双链DNA的情况下是指“bp”)的核酸的更高得率。当然，所述预处理过的结合核酸的固相也可用于不同的核酸分离程序中。关于聚合物、结合核酸的固相和预处理方法的详细情况在上文中描述。参考也适用于此处的上述公开内容。

另一方面，本发明提供了在使用结合核酸的固相分离核酸的方法中用于提高小核酸(例如具有短于500nt、350nt、250nt、200nt、150nt或100nt的长度)的回收的方法，所述方法包括将结合核酸的固相与聚合物相接触的步骤。优选地，所述接触通过在固相生产过程中将结合核酸的固相浸泡在优选为聚酸的聚合物中来进行。详细情况在上文中描述。

优选地，在将核酸结合基质与聚合物相接触的步骤之后和将核酸结合基质与核酸相接触之前，方法还包括清洗步骤。清洗条件优选地被选择成使得结合在核酸结合基质的小孔内部和/或其表面开口的聚合化合物主要地保持结合，而其余聚合化合物被主要地从核酸结合基质移除。在这种情况下，“主要地”具体是指聚合化合物的指定群体的至少50％的聚合化合物，优选是指至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的聚合化合物。

除非在本文中另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的意义。本发明不受本文所公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文所描述的相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实施方式的实践或试验中。数值范围包括定义所述范围的数字。数值范围包括+/-10％、+/-5％、优选地+/-3％、最优选地+/-1％的公差范围。根据一种实施方式，所指明的数值范围不包括公差范围。

当在本文中例如以酸化溶液、清洗溶液或洗脱溶液的形式使用时，术语“溶液”具体是指液体组合物，优选为水性组合物。它可以是仅仅一相的均质混合物，但是按照本发明的方法使用的溶液包含固体组分例如沉淀物这种情况，也在本发明的范围之内。

实施例

在实施例中，作为结合核酸的固相，使用了下列三种磁性离子交换粒子。这些磁性粒子(“珠子”)允许以低浓度存在于复杂样品材料中的核酸的直接且特异性的结合：

1.磁性珠子(I型)

2.磁性珠子(II型)

3.磁性珠子(III型)

所有三种珠子类型都具有磁性核心和阴离子交换表面。

磁性珠子(I型)和磁性珠子(II型)珠子具有磁铁矿(Fe₃O₄)的磁性核心。将这些磁性粒子用聚硅酸覆盖，并且它们合在一起形成所谓的珠子。两种类型的磁性粒子储存在水中，但是也可以储存在其他溶液例如SN-C溶液(0.5M MES和Triton X-100，pH 6.1)中。磁性珠子(I型)珠子具有带正电荷的胺类和中性醇类的混合表面(相应的珠子技术的详细情况也描述在WO 2010/072834中)。因此，珠子表面上的正电荷被中性基团“稀释)。这种低的正电荷引起靶核酸的较弱结合，从而允许在低pH值(例如8.5)下洗脱。相反，磁性珠子(II型)具有一致且强烈的正电荷，在其表面上仅含有带正电荷的叔胺。因此带负电荷的核酸的结合快速且容易地发生。为了高效洗脱，优选地使用较高pH值。

磁性珠子(III型)在磁性核心的表面上带有聚乙烯亚胺基团。这些珠子储存在SN-C悬液中。对于磁性珠子(I型)和(II型)来说，叔胺存在于表面上。对于胺的碱反应来说，将自由电子对附连在氮原子上。氮组成部分的质子化可以由酸加成来诱导。叔胺基团产生用于结合聚阴离子(核酸)的正电荷。偶联在磁性珠子(III型)表面上的聚乙烯亚胺基团以类似方式起作用。附连于氮原子的自由电子对在酸加成后被质子化。

在随后的实施例中，使用QIAamp循环核酸试剂盒(QIAamp Circulating Nucleicacid Kit)作为在使用本发明的方法的先前的细胞外核酸的浓缩/富集之后的清理流程。由此获得非常高的纯度。然而，正如在下面证实的，本发明的方法还允许例如在PCR检测测定法中直接使用被分离的细胞外核酸。

在下面示出的实施例中，QIAamp循环核酸试剂盒也被用作参比方法来测定给定样品中的循环和病毒核酸的总量，因此能够监测按照本发明使用基于不同阴离子交换珠子的富集流程所成功获得的浓缩。

QIAamp循环核酸试剂盒被鉴定为是适合的参比方法，因为它允许从多达5ml血浆、血清和其他体液提取循环、无细胞和病毒核酸。这种手动试剂盒基于二氧化硅-离液剂技术来工作，其与其他方法相比，导致ccfDNA中所有片段尺寸的高回收。

为了定量分离到的核酸，使用了不同测定法：

除了下述例外之外，DNA测定法按照QuantiTect多重PCR手册(QuantiTectMultiplex PCR Handbook)来准备：

·对于18S双重测定法来说，使用另一种引物浓度(16μM代替8μM)。

·对于18S DNA测定法来说，用于退火/延伸的时间从1分钟改为2分钟。

GAPDH RNA测定法按照QuantiTect多重RT-PCR手册(QuantiTect Multiplex RT-PCR handbook)来进行，并进行了下列修改：

·改变循环条件：变性在95℃进行1min.，退火/延伸在60℃进行1:30min.。

CMV和HIV测定法可以作为artus PCR试剂盒从QIAGEN商购。PhHV测定法由机构内部自行开发。

实施例1：核酸提取的得率取决于所使用的珠子

为了进行核酸分离，执行下述流程。

·将4ml合并的血浆在4℃下以16,000g离心10min.以除去残留的细胞，并将贫细胞的血浆转移到15ml falcon管中

·加入100μl 1M乙酸钠/乙酸缓冲液(pH 4)以将pH调整到5至6之间的值(～25mMNaOAc/HOAc在4ml样品中)

·然后将两种磁性珠子(I型)类型各8mg、磁性珠子(II型)珠子4mg或磁性珠子(III型)4mg用于结合

·结合在高架旋转摇床(20rpm)上，在室温下进行20min.

·然后将珠子在磁性falcon管架中分离10min.，并舍弃上清液

·加入1ml 100mM Tris-HCl(含有0.9％氯化钠并处于pH 8.5下)

·将溶液转移到1.5ml Eppendorf管中，并在热混合器上将核酸从珠子上洗脱20min.

·将珠子在磁性管架上分离10min.

·使用QIAamp循环核酸试剂盒，按照手册对洗脱液进行纯化，但是不添加CarrierRNA

·将核酸洗脱在100μl AVE中，将其作为模板用于定量实时PCR(在qPCR反应混合物中10％的模板体积)

图1示出了DNA片段的百分得率，其中对使用三种不同珠子类型的结果进行比较。将三种不同尺寸(75、200和1000bp)的片段作为内部对照掺入到血浆样品中，并在提取后进行检测。向4ml样品加入三种片段中每种的200,000个拷贝。为了确定添加的DNA的参比得率，将血浆用QIAamp循环核酸试剂盒处理，并将测量到的DNA得率用作参比，以便能够确定使用基于阴离子交换珠子的富集流程获得的得率(参见图1)。

磁性珠子(II型)珠子的使用导致～100％的回收。为了确保核酸的最大回收，已发现对磁性珠子(I型)进行修饰以特别地提高较小DNA片段(在这里，试验了75bp的内部对照片段)的回收是有利的。因此，根据一种实施方式，在浓缩过程之前将磁性珠子(I型)珠子与聚丙烯酸温育以避免小DNA片段扩散到珠子孔中，在那里它们可以被结合并相应地被不可逆地捕获。短的聚丙烯酸聚阴离子使结合位点饱和并因此提高它们的回收(所有片段尺寸～100％的回收)。磁性珠子(III型)珠子也导致70至90％之间的DNA回收。由于所使用的阴离子交换基团，使用pH值约为12.6的洗脱缓冲液(40mM氢氧化钠)是有利的。对于其他珠子类型来说，可以使用更温和的洗脱条件，并且使用含有0.9％氯化钠的pH 8.5的100mMTris-HCl来洗脱细胞外核酸。

实施例2：ccfDNA的富集

然后使用磁性珠子(II型)来富集ccfDNA。因此，使用与实施例1中所述相同的流程并做出下述改变：

·不仅从洗脱液，而且从结合步骤后的血浆上清液提取核酸。这允许评估结合和洗脱效率。

·在使用QIAamp循环核酸试剂盒纯化洗脱液之后，现在将核酸洗脱在更小体积中(60μl AVE)。

对于这个实验来说，内部对照(75、200和1000bp片段)的结果通过ccfDNA的分析来证实。由此，不仅确认了～100％的DNA回收，而且还显示，在结合步骤期间没有损失珠子。在图2中，使用DNA测定法来检测循环无细胞DNA。对18S rRNA编码序列的两种不同DNA扩增子(66和500bp)进行定量。使用参比来确定ccfDNA的总量。

尽管在结合步骤之后，在上清液中只能发现低于2％或甚至1％的未结合的DNA，但对于两种18S rDNA靶来说都获得了接近100％的回收。这表明使用磁性珠子(II型)可以从4ml血浆有效地结合并回收DNA片段。

实施例3：DNA的尺寸选择性洗脱

使用与用于ccfDNA的富集几乎相同的流程，发现了磁性珠子(II型)的出人意料的尺寸选择性行为。唯一的区别是使用两种不同的洗脱缓冲液将核酸分两步从珠子洗脱。图3示出了DNA片段测定法的结果。

在第一步中，使用已经提到过但处于pH 8下的洗脱缓冲液(100mM Tris-HCl，含有0.9％氯化钠)，可以实现较短DNA片段的优选洗脱。剩余的以及特别是较长的DNA片段，最后使用40mM氢氧化钠在碱性pH下(12.6)洗脱。然而，正如在其他实施例中所示，例如8.5的较低pH值也可用于高效洗脱。低于10并且优选地低于9的较低pH值的使用，对于下游反应是有利的。

向含有40mM氢氧化钠的600μl洗脱液加入400μl磁性珠子(III型)中和缓冲液(pH8.5)，然后使用QIAamp循环核酸试剂盒清理样品。对于洗脱液的中和，使用含有30mM氢氧化钠、170mM Tris、0.31％HCl和6mM叠氮钠的缓冲液。

实施例4：ccfRNA的富集

为ccfDNA特别优化了结合和洗脱条件。但是，如图4所示，也可以使用本发明的方法从血浆富集ccfRNA。

图4示出了Ct的平均值。使用参比提取获得的29.6的Ct值，代表了4ml血浆样品中循环GAPDH mRNA的总量，而30.5的Ct值表明，在使用磁性珠子(III型)珠子从血浆直接富集之后，最终可以回收GAPDH mRNA。

在所试验的实施方式中产生最佳RNA回收的流程：

·将4ml合并的血浆在4℃下以16,000g离心10min.，并置于falcon管中

·加入1000μl 0.12M乙酸钠/乙酸缓冲液(pH 4)，以调整pH值≤5(在4ml样品中～25mM)

·然后使用400μl磁性珠子(III型)珠子进行结合

·结合在高架旋转摇床(20rpm)上，在室温下进行20min.

·然后在磁性falcon管架中将珠子分离10min.，并舍弃上清液

·加入1ml 100mM Tris-HCl(0.9％氯化钠，并处于pH 8下)

·将溶液转移到1.5ml eppendorf管中，并在热混合器上将核酸从珠子洗脱20min.

·在磁性eppendorf管架上将珠子分离10min.

·使用QIAamp循环核酸试剂盒，按照用于从4或5ml血浆或血清纯化循环DNA的手册流程来纯化洗脱液，但是不使用Carrier RNA

·将核酸洗脱在60μl AVE中，将其作为模板用于定量实时PCR(10％模板体积)

实施例5：将洗脱液直接用作PCR模板

图2已经显示，使用磁性珠子(II型)可以获得几乎100％的DNA回收。但是对于这些实验来说，使用带有附加清理的流程版本。因此，试验了在对杂质敏感的方法例如定量实时PCR中，是否可以将洗脱液直接用作模板。流程设计如下：

用于证实PCR相容性的没有附加清理的“直接”分离流程

·将4ml合并的血浆在4℃下以16,000g离心10min.，并置于falcon管中

·加入100μl 1M乙酸钠/乙酸缓冲液(pH 4)，以将pH调整到5至6之间(在4ml样品中～25mM)

·然后将4mg磁性珠子(II型)用于结合

·结合在高架旋转摇床(20rpm)上，在室温下进行20min.

·然后在磁性falcon管架中将珠子分离10min.，并舍弃上清液

·将珠子用H₂O+0.05％TritonX-100清洗两次(第一次使用1000μl，然后使用300μl)；在第一次清洗步骤期间，将珠子溶液转移到1.5ml falcon管中

·在加入清洗缓冲液后，使用热混合器将珠子温育5min.，并分离10min.

·在第二个清洗步骤之后，加入150μl 100mM Tris-HCl(0.9％氯化钠，并处于pH8.5下)

·在热混合器上将核酸从珠子洗脱20min.

·然后将它们在磁性eppendorf管架上分离10min.

·将洗脱液/浓缩液作为模板直接用于定量实时PCR(10％模板体积)

对于带有附加清理的分离流程来说，使用QIAamp循环核酸试剂盒，按照用于从4或5ml血浆或血清纯化循环DNA的可用流程来处理洗脱液，但是不使用Carrier RNA。将核酸洗脱在100μl AVE中，将其作为模板用于定量实时PCR。

为了试验洗脱液(在这里是合并的血浆样品的洗脱液)是否可以作为模板直接用于qPCR，进行了PCR抑制实验；

对在qPCR之前进行或不进行清理流程的ccf DNA回收进行比较。对于每种PCR三个不同模板体积进行了比较。如果存在PCR抑制问题，则进行清理流程之后的回收应该高于直接使用洗脱液作为模板用于qPCR的情况。此外，由于反应混合物中PCR抑制性物质的浓度提高，使用较大模板体积时回收将降低。

图5示出了进行或不进行清理流程的DNA回收是几乎相同的，并且在三种不同的模板体积之间结果相似。因此，令人吃惊的是，当使用简单快速的本发明的方法时获得的洗脱液，不需任何进一步纯化就是PCR相容的。

为了定量循环的无细胞DNA，使用已描述过的18S测定法(66bp扩增子)。作为参比方法，使用QIAamp循环核酸试剂盒。

实施例1–5证实了在通过添加乙酸钠/乙酸来酸化样品之后，可以使用磁性阴离子交换珠子成功地富集细胞外核酸，例如循环的无细胞DNA和RNA。通过使用中性至碱性洗脱缓冲液来实现DNA/RNA的洗脱。

实施例6：从血浆富集病毒

流程

·将4ml合并的血浆在4℃下以16,000g离心10min.，并置于falcon管中

·掺入病毒CMV、HIV和PhHV(采取粒子的形式)

·加入100μl 1M乙酸钠/乙酸缓冲液(pH 4)，以将pH调整到5至6之间(在4ml样品中～25mM)

·然后使用两种磁性珠子(I型)类型(使用和不使用聚丙烯酸)8mg或磁性珠子(II型)珠子4mg进行结合

·结合在高架旋转摇床(20rpm)上，在室温下进行20min.

·在磁性falcon管架中将珠子分离10min.，并舍弃上清液

·加入1ml 100mM Tris-HCl(0.9％氯化钠，pH 8.5)

·将溶液转移到1.5ml eppendorf管中，并在热混合器上将核酸从珠子洗脱20min.

·在磁性eppendorf管架上将珠子分离10min.

·使用QIAamp循环核酸试剂盒，按照用于从4或5ml血浆或血清纯化循环DNA的可用流程来清理洗脱液，但是不使用Carrier RNA

·将核酸洗脱在100μl AVE中，将其作为模板用于定量实时PCR

试验了各种病毒，并对三种不同珠子类型进行比较(磁性珠子(I型)，与聚丙烯酸温育后的磁性珠子(I型)，以及磁性珠子(II型)珠子)。对于CMV、HIV和PhHV来说，获得了对应于使用参比流程获得的相应回收率的70-100％的回收率(参见图6)。

实施例7：自动化核酸富集

在QIAsymphony SP仪器(QIAGEN)上自动进行用于分离循环的无细胞核酸和病毒的基于阴离子交换珠子的流程，并与同一流程的手动执行进行比较。与以前的实验相反，使用来自于个体供体的血浆样品。

流程

将来自于12位个体供体的2.9ml血浆样品(a)用QIAamp循环核酸试剂盒处理作为参比，(b)使用磁性珠子(II型)进行手动分离(直接流程版本)或(c)在QIAsymphony SP上分离。QIAamp循环核酸试剂盒按照用于从1ml、2ml或3ml血浆或血清纯化循环DNA的手册流程进行操作，但是不使用Carrier RNA(洗脱在150μl AVE中)。

本发明的“直接”流程的手动版本

·将2.9ml血浆在4℃下以16,000g离心10min.，并置于管中

·掺入病毒CMV、HIV和PhHV(以粒子的形式)

·加入75μl 1M乙酸钠/乙酸缓冲液(pH 4)，以将pH调整到5至6之间

·然后使用4mg磁性珠子(II型)珠子进行结合

·结合在高架旋转摇床(20rpm)上，在室温下进行20min.

·然后在磁性falcon管架中将珠子分离10min.，并舍弃上清液

·将珠子用H₂O+0.01％TritonX-100清洗两次(第一次使用1000μl，然后使用300μl)，并且在第一次清洗步骤期间，已经将珠子溶液转移到1.5ml falcon管中

·在加入清洗缓冲液后，使用热混合器将珠子温育5min.，并分离10min.

·在第二个清洗步骤之后，加入150μl 100mM Tris-HCl(0.9％氯化钠，pH 8.5)

·在热混合器上将核酸从珠子洗脱20min.

·然后将珠子在磁性eppendorf管架上分离10min.

·将洗脱液作为模板直接用于定量实时PCR(10％模板体积)本发明的直接流程的 自动化版本

·将2.9ml血浆在4℃下以16,000g离心10min.，并置于例如14ml聚苯乙烯圆底试管(17*100mm，BD)中

·掺入病毒CMV、HIV和PhHV(以粒子的形式)

·将管插入到管架中，然后装载到QIAsymphony SP仪器上，用于自动化处理

·使用与用于手动浓缩版本相同的温育时间和试剂

·洗脱体积也相同(150μl)

在各个血浆样品之间，循环的无细胞核酸的总量不同。在大多数情况下，手动和自动化流程版本是可比的。循环DNA的回收通过靶向18S rDNA(66bp扩增子)、DYS14和RhD(外显子#5)的qPCR测定法来测量。图7中示出的回收中位数显示，在手动和自动化流程版本之间事实上没有显著差异，并且使用基于阴离子交换珠子的流程所获得的ccfDNA回收对应于循环的无细胞DNA的总量(在使用QIAamp循环核酸试剂盒参比方法提取后所测定的)的60-80％。通过优化结合和洗脱条件，可以进一步提高回收率。

图8示出了内部对照的三种不同片段尺寸(75、200和1000bp)的回收中位数。但是尽管在浓缩液中检测到70至80％的75和200bp DNA片段，但长的1000bp DNA片段的回收率<50％。这个令人吃惊的结果指向了基于阴离子交换珠子的流程的尺寸选择性质：在这里，与较长的(1000bp)DNA相比，较短的DNA片段(75-200bp)被偏好地回收。这种行为对于例如细胞外核酸例如母体血浆中的胎儿循环DNA以及源自于肿瘤的循环DNA片段的富集来说是有用的。较小核酸优于较长核酸的偏好性结合，减少了分离到的核酸群体中较长核酸的量。这对于细胞外核酸的分离来说是一个优点，这是因为在包含细胞外核酸的样品例如尿液、血液或血液制品例如血浆或血清中，所包含的较长核酸通常代表从细胞(例如从损坏的细胞)释放的细胞内核酸。这样的细胞内核酸代表了细胞外核酸群体的污染。所描述的核酸分离方法有利地贫化了被分离的细胞外核酸中相应的污染的较长核酸。

实施例8：低度浓缩的核酸的结合

为了分析样品仅含低核酸浓度时磁性珠子(I型)的结合能力以及它们的结合性能，进行下列测定：

·将50mg珠子移取到2mL反应容器中，磁性分离(3min.)，从珠子悬液舍弃上清液

·加入所指示体积的含有40μg质粒DNA(pCMV-b，7164bp)的结合缓冲液(50mMMOPS，pH 7.0)

·在翻滚式旋转摇床上温育10min.

·磁性分离(3min.)，舍弃上清液，用500μL结合缓冲液清洗两次(5min.，翻滚)

·用500μL(每次)50mM Tris，20mM KCl，pH 8.5洗脱两次

在所述测定法中，不论所使用的样品体积如何，全部添加的DNA被结合到磁性珠子(I型)并从其上洗脱(参见图9)。因此，样品的稀释没有降低方法的性能和得率。这些测定法的结果证实，即使在仅含低浓度核酸的样品中，磁性珠子(I型)也能高效地结合所有核酸。

因此，从上述实验可以得出下列结论：

1.从血液样品(血浆和血清)或其他体液分离细胞外核酸的最适结合条件，可以使用1/40样品体积的酸性乙酸钠/乙酸缓冲液来调整，以将样品的pH值设定到5至6之间，尤其是当打算分离细胞外DNA时。

2.从生物流体完全且直接结合细胞外核酸，在加入例如具有阴离子交换表面化学(例如磁性珠子(I型)或磁性珠子(III型)的叔胺或聚乙烯亚胺)的磁性粒子之后实现。优选地，在用于提高特别是较短片段的DNA回收之前，将磁性珠子(I型)与聚丙烯酸温育。

3.在结合步骤之后，可以将剩余的上清液移除，并且可以通过加入pH为8或更高的碱性缓冲液(例如100mM Tris或MOPS)(任选的：加入盐例如氯化钠用于提高回收)，将被结合的细胞外核酸从磁性粒子洗脱。

4.在移除磁性粒子之后，可以将洗脱液进一步纯化或直接作为模板用于分析/检测方法例如定量实时PCR(在后一种情况下，推荐在将核酸洗脱之前进行两个附加的清洗步骤)。

5.可以从仅含低核酸浓度的样品定量地分离核酸，并且样品的稀释度不降低本发明方法的性能。

实施例9：使用本发明的手动富集流程回收ccfDNA(18S)

按照本发明的教示，使用手动流程，将来自于健康供体的EDTA血浆用于ccfDNA的富集。使用本发明的富集流程的手动版本，从来自于8个个体供体的3ml血浆纯化循环的无细胞DNA。使用QIAGEN

多重PCR试剂盒，通过靶向18S核糖体RNA编码序列内的66bp扩增子的实时PCR，对DNA得率进行定量。将

循环核酸试剂盒(QIAGEN)用作参比(＝100％)。结果显示在图10中。在右侧，示出了所有供体的百分回收率的中位数。为了指示上下偏差，通过误差条标出了10th和90th百分位数。

实施例10：掺杂DNA的回收-手动富集流程

为了追踪程序的可能的尺寸选择性并且作为内部对照，以200,000个拷贝/样品的浓度向EDTA稳定化的血浆样品加入DNA片段(75bp、200bp、1000bp)。使用本发明的流程的手动版本，从来自于8个个体供体的3ml血浆纯化循环的无细胞DNA。使用QIAGEN

多重PCR试剂盒，通过靶向75bp、200bp和1000bp片段内的区域的三重实时PCR，对DNA得率进行定量。将

循环核酸试剂盒(QIAGEN)用作参比(＝100％)。结果示出在图11中。

实施例11：产前诊断

使用本发明的方法从母体血液样品分离循环的无细胞核酸，并使用三重qPCR测定法检测ccf DNA。对来自于12位个体供体的5.8ml血浆进行处理。样品在QIAsymphony SP仪器上进行处理，然而所述仪器仅能处理最大3ml的体积。因此，将样品分拆成两个部分(每个部分2.9ml血浆)并装载在QIAsymphony SP仪器上，按照用于QIAsymphony SP的自动化富集流程(参见实施例7)进行自动化处理。因此，通过对样品部分进行酸化，并向每个样品部分加入珠子等分试样，平行地对原始样品的两个部分进行处理。如果没有另外陈述，则在这个以及后面的所有实施例中使用II型珠子。在结合后，将带有结合的核酸的珠子从产生自第一样品部分的结合混合物中移除，并转移到从也包含珠子等分试样的第二样品部分产生的结合混合物中。由此，将来自于第一和第二样品部分的核酸合并。因此，对于第二样品部分的结合混合物的其余结合温育来说，存在双倍量的珠子。这种样品分拆和重新合并允许处理两倍于自动系统的处理体积的样品体积。当处理甚至更大的样品时，可以产生更多的部分。收集带有结合的核酸的所有珠子，将其用100mM Tris+154mM NaCl(pH 7.2)+0.1％TritonX-100清洗两次，并将核酸洗脱在150μl 100mM Tris+154mM NaCl(pH 9)中。将使用QIAamp循环核酸试剂盒分离的核酸作为对照用于确定回收率。此外，在将结合有核酸的珠子移除后，使用QIAamp循环核酸试剂盒从得到的上清液中分离核酸。由此可以检测并定量上清液中残留的未结合的ccfDNA。在三重qPCR测定法中使用10％模板体积的洗脱液来检测18S rDNA(参见图12a)、DYS14(参见图12b)和RhD(参见图12c)。示出的是与QIAamp循环核酸试剂盒相比的回收百分数。

图12a显示，ccf DNA被几乎完全结合于磁性粒子并在最后被洗脱(例外：供体10)。在上清液级分中只能检测到残留量的ccf DNA。图12b示出了Dys14测定法的结果。Dys14是一种睾丸特异性蛋白。因此，在源自于胎儿的血浆中DYS14 ccf DNA的检测，可用于性别确定并预测男性胎儿。在试验的12个样品中，仅检测到2个男性供体。ccf DNA回收与18S rDNA的结果可比。

图12c示出了作为三重DNA qPCR测定法的一部分的RhD测定法的结果。在这里，通过试验D抗原来确定Rh因子血型。供体7和8是RhD阴性的。所有RhD阳性供体的ccf DNA回收与18S rDNA和DYS14测定法的结果可比。

实验显示，本发明的方法可用于母体血浆中ccf DNA的特异性检测。本发明的方法可以容易地应用于产前诊断，例如用于产前性别鉴定和Rh因子确定。

实施例12：从血浆有效回收和富集短的细胞外DNA片段

使用淀粉样肽β前体蛋白(APP)的不同扩增子尺寸来检查ccf DNA。按照实施例11中所述分离ccfDNA。尺寸为67、180和476bp的ccf DNA片段的实时PCR检测按照Pinzani等，2011，Clin.Chim.Acta.412:2141中所述进行。计算67/476和180/476的拷贝数比率。为使用QIAamp循环核酸试剂盒(QIAamp CNA试剂盒)分离的ccf DNA计算同样的比率。较短DNA片段的富集引起拷贝数比率的增加。

正如可以在图13a中看到的，用QIAsymphony SP(QSSP)处理的本发明的自动化富集流程与QIAamp CNA试剂盒参比流程(QIAamp)相比，显示出相似或更高的比值。因此，本发明的方法可用于有效地分离各种尺寸的ccf DNA片段，尤其是甚至可以富集短的ccf DNA片段。图13b示出了使用本发明的方法(QIAsymphony SP流程)获得的DNA回收百分率与使用QIAamp CNA试剂盒分离的APP ccf DNA片段相比的比率。较短DNA片段的富集导致比率>1.0。结果显示，使用QIAsymphony SP流程，较短的DNA片段被完全从血浆提取。对于某些供体来说，与参比流程相比，使用本发明的方法甚至可以实现更短DNA片段的富集。

实施例13：洗脱条件的PCR相容性

为了确定洗脱期间的高pH值是否可能干扰随后的基于PCR的检测，将不同量的男性人类基因组DNA(31–8.000个拷贝)掺入到不同洗脱缓冲液(10-50mM Tris缓冲液，在pH 9和～pH 10.2下)中。使用18S双重测定法检测ccf DNA。将无RNAse的水用作参比。对实时PCR反应中使用40％模板体积的Ct值进行比较。

短的66bp扩增子的结果示出在图14a中，500bp扩增子的结果示出在图14b中。在所试验的洗脱缓冲液与纯水之间的可比的Ct值表明，对于不同的DNA浓度和所试验的洗脱缓冲液来说，不存在显著的PCR抑制。正如可以看见的，所有试验的缓冲液可以被容易地用于DNA洗脱，并且不抑制下游PCR反应。

实施例14：在高碱性pH值下短DNA片段的选择性洗脱

试验了不同的洗脱缓冲液对具有各种尺寸的DNA的洗脱。按照实施例11中对QIAsymphony SP流程所述，对5.8ml合并血浆的4个平行样进行处理。在将DNA结合于珠子后，进行使用无RNAse水+0.1％TritonX-100的两个清洗步骤，然后使用如图15a中所示的5种不同的Tris缓冲液150μl进行洗脱。使用18S rDNA双重测定法分析被洗脱的DNA的66bp扩增子。对于500bp扩增子来说，只示出了20mM Tris(游离碱，～pH 10.2)和作为参比的QIAamp CNA试剂盒的数据。

图15a示出了从合并的血浆样品获得的66bp扩增子的结果，500bp扩增子的结果示出在图15b中。对于66bp扩增子来说，在所有平行样之间结果是可比的，并且使用不同洗脱缓冲液获得的DNA得率与QIAamp CNA试剂盒参比是可比的。然而，对于500bp扩增子来说，与参比相比，DNA得率非常低。因此，当使用本发明的方法时，使用20mM Tris(游离碱，～pH10.2)洗脱，可以实现较短DNA片段的选择性洗脱(66bp相比于500bp)。

实施例15：较长DNA相比于较短DNA片段的盐依赖性洗脱

ccfDNA使用18S双重测定法来检测。如实施例11中所述对5.8ml血浆样品进行处理。在将DNA结合于珠子后，进行使用无RNAse水+0.1％TritonX-100的两个清洗步骤，然后使用5种不同的Tris缓冲液150μl进行洗脱。将使用QIAamp CNA试剂盒分离的ccf DNA用作参比。使用QIAsymphony SP流程(与QIAamp CNA试剂盒相比)的回收百分数示出在图16中。Tris摩尔浓度和盐浓度似乎对小DNA片段(18S rDNA 66bp扩增子)的回收没有影响。然而，对于较长DNA片段(18S rDNA 500bp扩增子)来说，使用较高盐浓度时DNA回收增加。因此，通过改变洗脱缓冲液中的盐浓度，可以影响并调整被洗脱的核酸的尺寸。

实施例16：不同洗脱缓冲液的PCR相容性

ccfDNA使用18S双重测定法来检测。将各种不同量的男性人类基因组DNA(0至5.000个拷贝)掺入到无RNAse水(参比)和100mM pH 9的Tris+154mM NaCl中。在实时PCR反应中使用20％模板体积的ccf DNA。66bp扩增子的结果示出在图17中。所试验的洗脱缓冲液与纯水之间的可比的Ct值，表明对于不同DNA浓度来说不存在PCR抑制，至少在高达5.000个拷贝的范围内不存在PCR抑制。

实施例17：在不存在盐和高碱性pH下，使用不同摩尔浓度的洗脱缓冲液对较短DNA片段的优选洗脱

ccfDNA使用18S双重测定法来检测。如实施例11中所述对5.8ml合并的血浆样品的4份平行样进行处理。在将DNA结合于珠子后，进行使用无RNAse水+0.1％TritonX-100的两个清洗步骤，然后使用5种不同的Tris缓冲液(10–50mM Tris碱和100mM Tris+154mM NaCl，pH 9)150μl进行洗脱。将使用QIAamp CNA试剂盒分离的ccf DNA用作参比。在实时PCR反应中使用10％的模板体积。结果示出在图18a和18b中。在所试验的平行样1-4之间，所有结果是可比的。对于较短的DNA片段(66bp扩增子)来说，在使用具有不同摩尔浓度的洗脱缓冲液后获得的DNA得率，与使用含盐的缓冲液获得的DNA得率和参比是可比的。然而，对于不含NaCl的试验的缓冲液来说，与含盐的缓冲液和参比相比，较长DNA片段(500bp扩增子)的DNA得率非常低。因此，使用例如具有不同摩尔浓度、没有其他盐并且处于～pH 10.2下的Tris缓冲液，可以实现较短DNA片段(66bp扩增子)的优选洗脱。

实施例18：通过调整洗脱条件、尤其是洗脱缓冲液的pH值和盐浓度的尺寸选择性

ccfDNA使用18S双重测定法来检测。如实施例11中所述对5.8ml血浆样品进行处理。在将DNA结合于珠子后，进行使用无RNAse水+0.1％TritonX-100的两个清洗步骤，然后使用不同的Tris缓冲液或NaOH 150μl进行洗脱。在实时PCR反应中使用10％的被洗脱的DNA作为模板。分析与使用QIAamp CNA试剂盒分离的ccf DNA相比的回收百分数。结果示出在图19中。添加盐或使用NaOH进行洗脱，增加了较长DNA片段的回收(参见500bp扩增子)。因此，通过在盐浓度和pH值方面调整特定洗脱条件，可以实现尺寸选择性。

实施例19：通过调整洗脱条件、尤其是洗脱缓冲液的pH值和盐浓度的尺寸选择性

在这个实验中，试验了不同洗脱缓冲液对具有不同长度的DNA片段的洗脱。从血浆分离ccf DNA，并使用用于4种不同扩增子长度的APP测定法进行检测。分离和检测基本上图实施例18中所述来进行。对67bb、180bp、306bp和476bp的APP扩增子长度进行APP测定法，并且所有DNA片段以相同方式被扩增。将DNA回收与使用QIAamp CNA试剂盒分离的ccf DNA进行比较。

结果示出在图20中。向洗脱缓冲液添加盐增加了较长DNA片段的回收。因此，通过调整盐浓度可以实现尺寸选择性洗脱。这在本质上意味着使用的盐越多，较长DNA片段的DNA回收率越高。

实施例20：使用本发明的自动化方法回收胎儿DNA

比较本发明的自动化ccf DNA分离流程与QIAamp CNA试剂盒参比方法对胎儿DNA从母体血浆的分离。在分离后，使用Dys14/18S测定法检测胎儿DNA。使用4ml母体血浆作为用于QIAsymphony SP流程的样品输入体积，同时将0.4–1ml用于QIAamp CNA试剂盒。QIAsymphony SP流程基本上按照实施例11中所述来进行。使用35mM pH 7.2的Tris+0.1％TritonX-100进行两个清洗步骤。将结合的DNA用35mM Tris+80mM NaCl(pH 10.2)洗脱在100μl洗脱体积中。如实施例11中所述，使用Dys14/18S测定法进行胎儿DNA的检测。在实时PCR反应中使用10％的模板体积。最后，计算Dys14/18S测定法的DNA拷贝数之间的比率，以确定以％为单位的胎儿DNA分数。结果示出在图21中。对于QIAsymphony SP流程(QSSP)和QIAamp CNA试剂盒(QIAamp)来说，检测到的胎儿DNA在ccf DNA中的百分率是可比的。使用本发明的自动化方法，可以将胎儿DNA完全提取。

实施例21：从尿液样品富集ccf DNA，并且聚丙烯酸提高洗脱效率

ccfDNA使用18S双重测定法来检测。对3ml血浆样品进行手动处理。另外，对尿液(3ml)进行处理。使用100mM Tris+154mM NaCl(pH 7.2)+0.1％TritonX-100进行两个清洗步骤。将结合的DNA用100mM Tris+154mM NaCl(pH 9.0)(也被用于尿液)、100mM Tris+154mM NaCl(pH 9.0)+0.02％PAA或用100mM Tris+154mM NaCl(pH 9.0)+0.04％PAA洗脱。洗脱体积为150μl.。使用18S双重测定法对洗脱的ccf DNA进行定量。将DNA回收与用QIAampCNA试剂盒处理的ccf DNA进行比较。结果示出在图22中。PAA的添加引起66bp和500bp片段两者的更高的DNA回收。也可以从尿液富集ccf DNA。

实施例22：使用不同洗脱体积将ccf DNA容易地从珠子洗脱

ccfDNA使用18S双重测定法(66和500bp扩增子)来检测。如上所述对源自于3位不同供体的3ml血浆样品进行手动处理。使用100mM Tris+154mM NaCl(pH 7.2)+0.1％TritonX-100进行两个洗脱步骤。使用100mM Tris+154mM NaCl(pH 9)，使用60、80、100或150μl的洗脱体积来洗脱结合的DNA。使用双重18S rDNA测定法对洗脱的ccf DNA进行定量。66bp扩增子的检测结果示出在图23a中，500bp扩增子的检测结果示出在图23b中。洗脱体积的减少对DNA回收没有显著影响。然而，为了获得高的富集倍数，尽可能小的洗脱体积是有利的。通过使用高的样品输入体积和低的洗脱体积，可以获得高的富集倍数。

实施例23：来自于血浆的ccf DNA的高效结合和释放

如上所述对源自于3位不同供体的3ml血浆样品进行手动处理。在将ccf DNA结合于珠子后，保留上清液级分。使用100mM Tris+154mM NaCl(pH 7.2)+0.1％TritonX-100进行两个清洗步骤。使用两步流程来洗脱被结合的DNA：首先，使用100mM Tris+154mM NaCl(pH 9)在150μl洗脱体积中进行洗脱。然后，使用150μl 40mM NaOH将残留的DNA从珠子释放。在qPCR检测之前，对NaOH级分进行中和。ccf DNA的检测使用如实施例2中所述用于66bp和500bp扩增子的双重18S rDNA测定法来进行。

结果示出在图24中。在上清液中基本上不能检测到未结合的ccf DNA。此外，在NaOH洗脱级分中也不能检测到残留的ccf DNA。因此，ccf DNA可以从血浆完全结合到磁性珠子并再次释放到洗脱缓冲液中。这产生良好的回收率。

实施例24：在PCR检测之前清理洗脱液被废弃–在洗脱液中没有PCR抑制效应

在这个实验中，试验了洗脱液是否可能包含PCR抑制剂。为此目的，如上所述对源自于2位不同供体的3ml血浆样品进行手动处理。使用无RNase水+0.1％TritonX-100进行两个清洗步骤。使用两步流程来洗脱被结合的DNA：第一次洗脱使用100mM Tris+154mM NaCl(pH 7.2)，在150μl洗脱体积中进行。第二次洗脱使用100mM Tris+154mM NaCl(pH 9.0)，同样在150μl洗脱体积中进行。将100μl第一和第二洗脱液作为样品输入用于使用QIAamp CNA试剂盒的清理。然后将5％模板体积的剩余的50μl级分和清理过的100μl级分，根据双重18SrDNA测定法(66bp和500bp扩增子)用于实时PCR检测。将使用QIAamp CNA试剂盒分离的ccfDNA用作参比。

66bp扩增子的结果示出在图25a中，500bp扩增子的结果示出在图25b中。18S rDNA的的66bp和500bp扩增子只能在pH 9.0的洗脱液中而不能在pH 7.2的洗脱液中被检测到。这意味着洗脱是高度pH依赖性的，并因此可以通过pH值来控制。在直接和清理过的洗脱液中，66bp和500bp片段的检测同等有效。因此，在洗脱液中未能观察到PCR抑制效应。

实施例25：珠子体积、类型之间的比较和PAA的影响

如上所述，对源自于3位不同供体的3ml血浆样品进行手动处理。使用3mg或7.5mgII型珠子。另外，试验了用PAA处理的I型珠子。将珠子在水性PAA溶液中温育过夜，并将上清液舍弃。在结合之后，使用无RNase水+0.1％TritonX-100进行两个清洗步骤。如另外的实施例24中所述使用两步洗脱流程将被结合的DNA从II型珠子洗脱。使用150μl 100mM Tris+154mM NaCl(pH 9.0)+15mg/ml PAA或使用150μl 100mM Tris+154mM NaCl(pH 9.0)+20mg/ml PAA将结合的DNA从I型珠子洗脱。将使用QIAamp CNA试剂盒分离的ccf DNA用作参比。将5％的洗脱的体积用于实时PCR中。如图26中所示，珠子体积的增加引起更好的DNA回收。如果向I型珠子添加PAA，则I型和II型珠子产生可比的结果。此外，人们可以观察到，在第一个洗脱步骤期间，没有DNA从II型珠子洗脱。

实施例26：不同珠子类型和体积之间的比较

如实施例25中所述，对源自于8位不同供体的3ml血浆样品进行手动处理。然而，为了结合，加入3mg PAA处理的I型珠子和3mg或7.5mg II型珠子以结合ccf DNA。在两个清洗步骤之后，用150μl 100mM Tris+154mM NaCl(pH 9.0)将被结合的DNA从I型珠子洗脱，同时使用如实施例24中所描述的两步流程将被结合的DNA从II型珠子洗脱。按照双重18S rDNA测定法(66bp和500bp扩增子)，将5％的洗脱体积用于实时PCR检测。将使用QIAamp CNA试剂盒分离的ccf DNA用作对照。

实施例27：从血清富集ccfDNA

在这个实验中，比较了在从血清和血浆样品结合后ccf DNA的回收。如上所述对4ml血浆或血清样品进行手动处理。在结合后，不进行清洗步骤。将从血浆获得的上清液保存用于进一步分析。使用100mM Tris+154mM NaCl(pH 8.5)，将结合于珠子的DNA洗脱在1ml洗脱体积中。使用QIAamp CNA试剂盒对洗脱液和上清液进行处理，并将DNA洗脱在60μl洗脱体积中。将10％的洗脱体积用于双重18SDNA测定法中。将使用QIAamp CNA试剂盒分离的ccfDNA用作参比。

图28显示，ccf DNA可以从血浆被完全结合，并且也可以从珠子洗脱并因此回收。此外，也可以从血清样品回收ccf DNA。

Claims (18)

1.一种通过将细胞外核酸结合于带有阴离子交换基团的固相以从样品分离所述细胞外核酸的方法，所述方法包括下列步骤：

a.酸化所述样品以建立结合条件，并在结合混合物中将所述细胞外核酸结合于所述固相，所述结合混合物具有允许所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的≤6.5的第一pH，其中使用磁性粒子作为所述固相；

b.分离带有所述被结合的细胞外核酸的所述固相；

c.任选地清洗所述细胞外核酸；

d.在比用于将所述细胞外核酸结合于所述固相的第一pH更高的第二pH下，从所述固相洗脱细胞外核酸；

e.从洗脱液分离所述细胞外核酸；

其中所述样品是通过分离从体液移除细胞而获得的无细胞或贫细胞的样品。

2.权利要求1的方法，其包含下列步骤：

a.酸化所述样品以建立结合条件，并在结合混合物中将所述细胞外核酸结合于所述固相，所述结合混合物具有允许所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的≤6.5的第一pH；其中所述样品占所述结合混合物体积的至少85％，其中使用磁性粒子作为所述固相；

b.分离带有所述被结合的细胞外核酸的所述固相；

c.任选地清洗所述细胞外核酸；

d.在比用于将所述细胞外核酸结合于所述固相的第一pH更高的第二pH下，从所述固相洗脱细胞外核酸；

e.从洗脱液分离所述细胞外核酸。

3.权利要求1或2的方法，其中步骤a至d用作预处理流程以便为后续步骤e从所述样品浓缩所述细胞外核酸，任选地其中在步骤e中使用至少一种离液剂和/或至少一种醇来分离所述核酸。

4.权利要求2或3的方法，其包含下列步骤：

a.酸化所述样品以建立所述结合条件，并在结合混合物中将所述细胞外核酸结合于所述固相，所述结合混合物具有允许所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的≤6.5的第一pH，其中所述样品占所述结合混合物体积的至少85％，并且其中所述固相由带有叔氨基的磁性粒子提供；

b.分离带有所述被结合的细胞外核酸的所述固相；

c.任选地清洗所述细胞外核酸；

d.从所述固相洗脱细胞外核酸，其中被洗脱的核酸的长度和保持结合于所述阴离子交换基质的核酸的长度通过调整洗脱条件来控制，其中长度为约1000nt或更长、700nt或更长、或500nt或更长的核酸在所述洗脱步骤中绝大多数保持结合于所述固相；

e.从洗脱液分离所述细胞外核酸。

5.权利要求4的方法，其中在步骤d.中，通过调整所述固相表面上正电荷的浓度，使得在步骤d.期间只有较长的核酸分子保持结合于所述固相，而较小的核酸被洗脱，来实现短核酸的选择性洗脱，其中截止值通过选择在洗脱期间使用的pH值来控制。

6.权利要求1的方法，其中在步骤d.中，细胞外核酸按照它们的尺寸被选择性洗脱，其中所述尺寸分级洗脱步骤包括在高于所述第一pH的第二pH下洗脱一部分结合于所述固相的细胞外核酸，其中在这一步骤中从所述固相洗脱的核酸的平均长度短于保持结合于所述固相的核酸的平均长度。

7.权利要求2的方法，其通过将细胞外核酸结合于带有阴离子交换基团的固相，用于从通过分离从体液移除细胞而获得的贫细胞或无细胞样品、任选为血浆或血清分离所述细胞外核酸，其中所述固相由磁性粒子提供，所述方法包括下列步骤：

a.酸化所述样品以建立所述结合条件，并在结合混合物中将所述细胞外核酸结合于所述固相，所述结合混合物具有允许所述细胞外核酸结合于所述固相的所述阴离子交换基团的≤6的第一pH，其中所述样品占所述结合混合物体积的至少85％；

b.分离带有所述被结合的细胞外核酸的所述固相；

c.任选地清洗所述细胞外核酸；

d.从所述固相洗脱细胞外核酸，其中在步骤d.中，细胞外核酸按照它们的尺寸被选择性洗脱，其中所述尺寸分级洗脱步骤包括在高于所述第一pH并≥8的第二pH下洗脱一部分结合于所述固相的细胞外核酸，其中在这一步骤中从所述固相洗脱的核酸的平均长度短于保持结合于所述固相的核酸的平均长度，并且其中长度为约1000nt或更长、700nt或更长、或500nt或更长的核酸在所述洗脱步骤中绝大多数保持结合于所述固相；

e.从洗脱液分离所述细胞外核酸。

8.权利要求1的方法，其中执行洗脱步骤d)以及其中在步骤d)中，所述核酸按照它们的尺寸被选择性洗脱，其中截止值由在所述洗脱期间使用的pH值和/或盐浓度来控制。

9.权利要求1的方法，其中将所述样品分拆，将所述样品部分平行地进行处理，并将洗脱液或洗脱之前的阴离子交换材料重新合并。

10.权利要求1的方法，其中步骤a)具有一个或多个下述特征：

i)向所述样品加入至少一种酸化试剂和/或化合物以调整所述第一pH，其中任选地使用酸溶液；

ii)所述第一pH≤6；

iii)所述第一pH在选自4至6.5、4.5至6.5、5至6.5和5至6的范围内；和/或

iv)所述样品占所述结合混合物体积的至少90％、至少95％或至少97％。

11.权利要求1或10的方法，其中所述样品具有下述特征中的一个：

a)它是通过分离从体液移除细胞而获得的无细胞或贫细胞的样品，其中所述体液选自全血、血浆、血清、淋巴液、尿液、液剂、脑脊液、腹水、乳液、支气管灌洗液、唾液、羊水、精液、体液、身体分泌物、鼻分泌物、阴道分泌物、伤口分泌物和排泄物；

b)它选自血浆和血清；

c)它是血浆；

d)它是稳定化的样品；和/或

e)它是稳定化的血浆样品。

12.权利要求11的方法，其中所述被分离的细胞外核酸具有下述特征中的一个：

a)它们作为从所述样品分离的总核酸的一部分而被分离；

b)它们主要包含DNA；

c)它们主要包含RNA；

d)它们包含DNA和RNA的混合物；

e)它们包含循环的细胞外核酸；

f)它们包含疾病相关的核酸；

g)它们包含肿瘤相关或肿瘤来源的核酸；

h)它们包含炎性相关的核酸；

i)它们包含胎儿核酸；

j)它们包含病毒核酸；

k)它们包含病原性核酸；和/或

l)它们包含哺乳动物细胞外核酸。

13.权利要求1的方法，其具有一个或多个下述特征：

i)洗脱在≥8的第二pH下进行，其中任选地，所述第二pH在≥8至≤14范围内；

ii)在步骤d中使用洗脱溶液；

iii)在步骤d中，细胞外核酸按照它们的尺寸被选择性洗脱，并且其中所述尺寸分级洗脱步骤包含下列步骤：

aa)在高于所述第一pH的第二pH下将一部分结合于所述固相的细胞外核酸从其上洗脱，其中在这个步骤中从所述固相洗脱的核酸的平均长度短于保持结合于所述固相的核酸的平均长度；

bb)任选地，将在步骤aa)中保持结合于所述固相的细胞外核酸从所述固相洗脱，所述洗脱任选地在高于所述第二pH的第三pH下进行。

14.权利要求1的方法，其中用于结合所述细胞外核酸的所述固相具有一个或多个下列特征：

(i)所述固相带有在所述第一pH下带正电荷的阴离子交换基团类型；

(ii)所述固相带有包含可质子化基团的阴离子交换基团类型，并且其中任选地，所述可质子化基团的pKa值在8至12、或9至11的范围内；

(iii)所述固相带有包含氮原子的阴离子交换基团类型；

(iv)所述阴离子交换基团为氨基；

(v)所述阴离子交换基团为叔氨基，任选为二烷基氨基；

(vi)所述固相带有在所述第一pH下不强烈结合于核酸的惰性配体，其中所述惰性配体为不带电荷的配体，任选是包含至少一个羟基的配体，并且其中任选地，所述配体包含2,3-二羟基丙基；

(vii)所述固相携带的所述阴离子交换基团与惰性配体的比例在约1:1至约1:10、约1:2至约1:5的范围内，或为约1:3；和/或

(viii)所述固相的表面用包含所述阴离子交换基团的硅烷化合物修饰，并且不用另一种硅烷化合物修饰。

15.权利要求1的方法，其具有一个或多个下列特征：

(i)所述样品是通过分离从稳定化的体液移除细胞而获得的无细胞或贫细胞的样品；

(ii)在步骤a)之前通过分离从所述体液样品移除细胞，从而提供包含细胞外核酸的贫细胞或无细胞的样品；

(iii)所述方法包括在步骤a)之前通过分离从体液样品移除细胞，从而提供包含细胞外核酸的贫细胞或无细胞的样品。

16.权利要求1的方法，其中在所述结合步骤a)之前将所述固相用聚合物进行预处理。

17.权利要求16的方法，其中所述聚合物是聚酸，任选为聚丙烯酸。

18.权利要求1的方法，其中对所述被分离的细胞外核酸进行处理和/或分析；以及任选地进行：

aa)修饰；

bb)与至少一种酶相接触；

cc)扩增；

dd)反转录；

ee)克隆；

ff)测序；

gg)与探针相接触；

hh)检测；

ii)鉴定；和/或

jj)定量。

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