KR101745455B1 - 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법 - Google Patents

수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질과 혼합되어 오염된 세포 밖 소포체를 수용액 이상계를 이용한 다단계 정제방법을 통하여 짧은 시간 안에 고순도로 많은 양을 분리 및 정제할 수 있는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법 및 장치에 관한 것으로, 95 % 이상의 단백질을 제거할 수 있으며, 고순도의 세포 밖 소포체를 획득할 수 있어 종래의 기술에 비하여 매우 높은 효율을 갖는다. 특히 초고속 원심분리 장치나 항체와 같은, 고가의 장비나 재료가 필요 없기에, 비용이 적게 들어 경제적이므로, 경쟁력을 높일 수 있는 방법이다. 또한, 이렇게 분리 및 정제된 세포 밖 소포체는 RT-PCR이나 western blot과 같은 분석 방법에 이용할 수 있어, 이를 이용한 연구 분야 및 질병 진단에도 활용할 수 있다.

Description

수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법{Multistage purification method of extracellular vesicles by aqueous two-phase system}
본 발명은 단백질과 혼합되어 오염된 세포 밖 소포체를 수용액 이상계를 이용한 다단계 정제방법을 통해 짧은 시간 안에 고순도로 많은 양을 분리 및 정제 과정을 수행할 수 있는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법및 장치에 관한 것이다.
세포 밖 소포체에는 엑소좀(exosomes) 또는 마이크로베지클(microvesicles) 등이 있으며 크기는 50 ~ 1000 nm 정도로, 원래의 세포가 가지고 있던 특성들을 가지고 있기 때문에 질병의 진단 마커로 주목받고 있다.
종래의 세포 밖 소포체를 분리하는 기술로는 초고속원심분리법, 항체분리법, 미세유체 기술 및 고분자를 이용한 침전법이 있다. 이 중에서, 초고속원심분리법은 세포 밖 소포체를 분리하는데 가장 널리 쓰이는 방법이고, 원리가 간단하여 가장 신뢰성 있는 분리 방법이다.
하지만, 이러한 초고속원심분리법을 이용해서 세포 밖 소포체를 분리할 경우에는 세포 밖 소포체의 수율이 낮고, 분리하는데 시간이 많이 소요되며, 비싼 기기가 필요하다는 단점이 있다.
항체분리법은 항원항체 반응을 이용한 분리 방법으로, 높은 선택성을 가지지만 소포체에 붙은 항체를 제거하는 데 어려움이 있고 항체의 높은 가격으로 인하여 대량생산에 적합하지 않다.
미세유체 기술은 상기의 항체분리법과 미세유체 칩을 접목시켜 적은 양의 샘플에서도 빠르게 소포체를 분리시킬 수 있는 방법이지만, 항체를 미세유체칩에 접목시키는 데 많은 준비과정이 필요하다.
고분자를 이용한 침전법은 간단하게 소포체를 분리할 수 있는 방법이지만, 샘플에 존재하고 있는 모든 물질을 침전시키기에 단백질과 같은 불순물 또한 같이 분리된다는 단점이 있다.
이러한 종래기술의 문제점을 극복하고자 본 발명자들은 공개특허 제2014-0050465호에서 세포 밖 소포체를 분리하는 미세유체 칩에 관한 기술을 제시한 바 있다. 상기 특허문헌에 기재된, 항체로 코팅된 미세유체 칩을 이용해서 세포 밖 소포체를 혈청으로부터 분리해내는 방법은 세포 밖 소포체의 분리에 따른 소요시간이 적고, 연구실이 따로 필요하지 않아 경제적인 면에서 유리하다는 장점이 있으나, 이 방법 역시 수율이 낮다는 점에서 실용적이면서도 경제적인 진단 방법으로 활용하기에는 여전히 개선해야할 문제점들이 존재한다.
공개특허 제2014-0050465호 (2014년 4월 29일, 공개됨)
본 발명의 목적은 이러한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 세포밖 소포체를 포함한 수용액에서 세포 밖 소포체를 분리 및 정제시, 수용액 이상계를 이용한 다단계 정제방법을 사용함으로써, 불순물인 단백질을 제거하고 고순도의 세포 밖 소포체를 획득하는 것을 그 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법은 (a) 체액 또는 세포 밖 소포체가 존재하는 수용액에 제1물질과 제2물질을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합물을 상층액과 하층액으로 상분리시켜 수용액 이상계를 제조하는 단계; (c) 상기 수용액 이상계 중, 제1물질이 포함된 상층액을 제거하는 단계; (d) 잔류하는 하층액에 제1물질을 포함하는 새로운 상층액을 공급하여 혼합하는 단계; 및 (e) 상기 (b) 내지 (d)단계를 적어도 한번 또는 두번 이상 수행한 후, 상기 하층액으로부터 세포 밖 소포체를 회수하는 단계;를 포함한다.
이때, 제1물질은 물, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐 알코올 또는 피콜 중에서 선택되는 것이며, 제2물질은 EOPO(ethylene oxide propylene oxide), 덱스트란(dextran), 고농도염, 레반, Poly(vinyl methyl ethyl ether), 황산암모늄, 황산나트륨, 황산마그네슘, 인산칼륨 또는 탄산나트륨 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
더욱 상세하게는 제1물질이 물일 경우, 제2물질은 EOPO이고, 제1물질이 폴리에틸렌 글라이콜일 경우, 제2물질은 덱스트란, 레반, Poly(vinyl methyl ethyl ether), 황산암모늄, 황산나트륨, 황산마그네슘, 인산칼륨, 탄산나트륨 중에서 선택될 수 있다. 또한 제1물질이 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐 알코올 또는 피콜 중에서 선택될 경우에는, 제2물질로 덱스트란인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 제1물질은 폴리에틸렌 글리콜이고, 제2물질은 덱스트란인 것이다.
한편, (a)단계 이후 및 (b)단계 이전에, 상기 수용액 이상계에 첨가제를 추가하여 수용액 이상계 내 분자들 사이의 인력 또는 반발력을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 (b)단계에서 수용액 이상계의 상 분리는 500 ~ 2,000 × g-force의 원심분리법을 수행하는 단계를 더 포함하여 가속화할 수 있으며, 상기 수용액 이상계에 초음파 조사 혹은 미세 기포를 주입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 체액은 전혈(whole blood), 혈청, 복강액, 모유 및 소변으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
이렇게 본 발명의 수용액 이상계를 사용하여 다단계 정제 방법으로 분리된 세포 밖 소포체는 ELISA, RT-PCR, western blot, proteomics 또는 genomics 등의 분석 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 수용액 이상계를 이용하여 세포 밖 소포체를 분리하는 장치는 수용액 이상계를 형성하는 제1물질 및 제2물질을 주입하는 주입부(10); 체액 또는 세포밖 소포체가 포함된 수용액을 투입하는 투입부(20); 상기 주입부 및 투입부와 연결되어 체액 또는 세포 밖 소포체가 포함된 수용액과 제1물질 및 제2물질을 원심분리하여 상 분리하는 본체(30); 상기 상 분리 후 제1물질이 포함된 상층액을 제거하는 제거부(40); 및 상기 본체(30)에서 획득되는 세포 밖 소포체를 회수하는 회수부(50);를 포함한다.
주입부(10)는 제1물질과 제2물질이 각각 주입될 수 있도록 제1주입부(10a)와 제2주입부(10b)로 분리될 수 있으며, 주입부(10)와 투입부(20) 사이에 체액 또는 세포 밖 소포체가 포함된 수용액과 제1물질 및 제2물질을 혼합하는 혼합부(60)를 더 포함할 수 있다. 이때 상기 혼합부(60)에 진동장치가 장착되어 있는 것이 바람직하다. 또한 본체(30)에는 초음파 조사 장치 또는 미세 기포 발생장치가 더 포함될 수 있으며, 이러한 본체(30)의 형상은 원통형이거나 호리병형인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법은 95 % 이상의 단백질을 제거할 수 있으며, 고순도의 세포 밖 소포체를 획득할 수 있는 것으로, 종래의 기술에 비하여 매우 높은 효율을 가진다. 특히 초고속 원심분리 장치나 항체와 같은 고가의 장비나 재료가 필요 없으므로, 비용이 적게 들어 경제적이다. 따라서 경쟁력이 매우 높은 다단계 정제방법 및 장치에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 의해 분리 및 정제된 세포 밖 소포체는 RT-PCR이나 western blot과 같은 분석 방법에 이용할 수 있어, 이를 이용한 연구 분야 및 질병 진단에도 활용할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 상분리 횟수에 따른 세포 밖 소포체 및 단백질의 회수율을 나타내는 그래프이다.
도 2에서 (a)와 (b)는 각각 초고속원심분리법 및 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 다단계 정제방법으로 획득한 세포 밖 소포체의 TEM(transmission electron microscope) 이미지이다.
도 3에서 (a)와 (b)는 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 다단계 정제방법 및 초고속원심분리법으로 획득한 세포 밖 소포체를 western blot 분석을 통해 이미지화한 결과이다.
도 4는 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 다단계 정제방법으로 획득한 세포 밖 소포체의 mRNA인 MelanA를 RT-PCR을 실행하고 이미지화한 결과이다.
도 5는 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제장치에 대한 이미지이다.
도 6은 도 5에서 혼합부가 더 포함된 장치에 대한 이미지이다.
도 7은 도 6에서 주입부가 두 개로 분리된 장치에 대한 이미지이다.
도 8은 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제장치에서 본체의 형상이 호리병 형인 장치에 대한 이미지이다.
이하에서는 본 발명의 기술적 특징을 좀 더 구체적으로 살펴보기 위해 실시예와 도면을 참조하여 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 발명의 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명은 (a) 체액 또는 세포 밖 소포체가 존재하는 수용액에 제1물질과 제2물질을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합물을 상층액과 하층액으로 상분리시켜 수용액 이상계를 제조하는 단계; (c) 상기 수용액 이상계 중, 제1물질이 포함된 상층액을 제거하는 단계; (d) 잔류하는 하층액에 제1물질을 포함하는 새로운 상층액을 공급하여 혼합하는 단계; 및 (e) 상기 b) 내지 (d)단계를 적어도 한번 또는 두번 이상 수행한 후, 상기 하층액으로부터 세포 밖 소포체를 회수하는 단계;를 포함하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법에 관한 것이다.
본 발명에서 세포 밖 소포체란 세포에서 생성되어 세포 밖으로 분비되는 소포체로써, 엑소좀(exosome), 마이크로베지클(microvesicle) 및 마이크로파티클(microparticle) 등을 포함하나, 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 수용액 이상계를 형성하는 제1물질과 제2물질의 조합(제1물질/제2물질)은, 물/EOPO(ethylene oxide propylene oxide), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)/덱스트란(dextran), 폴리에틸렌 글리콜/고농도 염, 폴리에틸렌 글리콜/레반(levan), 폴리비닐피로리돈(polyvinylpyrrolidone)/덱스트란, 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol)/덱스트란, 피콜(ficoll)/덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜/Poly(vinyl methyl ethyl ether), 폴리에틸렌 글리콜/황산암모늄(ammonium sulfate), 폴리에틸렌 글리콜/황산나트륨(sodium sulfate), 폴리에틸렌 글리콜/황산마그네슘(magnesium sulfate), 폴리에틸렌 글리콜/인산칼륨(potassium phosphate) 및 폴리에틸렌 글리콜/탄산나트륨(sodium carbonate) 중에서 어느 하나인 것이 바람직하나, 특별히 이들로 제한되는 것은 아니며, 수용액 이상계를 형성하는 제1물질과 제2물질의 다양한 조합이 사용될 수 있다.
한편, 상기 수용액 이상계를 형성하기 위한 서로 혼화되지 않는 두 가지 물질은 폴리에틸렌 글리콜/덱스트란인 것이 가장 바람직하며, 세포 밖 소포체는 덱스트란 상에 농축이 되는 특징이 있고, 상기 덱스트란 상에 농축된 세포 밖 소포체는 피펫 등의 분리방법을 통해 분리될 수 있다.
이때, 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 0.2 ~ 600 kDa이고, 농도는 1 ~ 20 wt%이며, 덱스트란의 분자량은 15 ~ 2,000 kDa이고, 농도는 1 ~ 20 wt%인 것이 바람직하다. 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란의 농도가 상기 범위보다 낮으면 수용액 이상계가 형성되지 않고, 상기 농도 범위보다 높으면 이들 고분자를 녹이기 위해 많은 시간이 필요할 뿐 아니라 이상계 사이의 표면 장력이 너무 높아져서 체액과 같은 제 3의 용질이 녹아들기 어렵다.
(a)단계 이후 및 (b)단계 이전에, 수용액 이상계에 첨가제를 추가함으로써, 수용액 이상계 내 분자들 사이의 인력 또는 반발력을 조절할 수 있고, 이를 통해 세포 밖 소포체의 분리효율을 높일 수 있다. 특히 염을 추가함으로써 수용액 이상계의 전위를 조절하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.05 mol K3PO4를 추가할 수 있다.
(b)단계에서 수용액 이상계는 500 ~ 2,000 × g-force로 5 ~ 15분간 원심분리하여 상 분리 현상을 더욱 촉진할 수 있는데, 500 × g-force 미만인 경우 분리 시 시간이 많이 소요되어 원심분리를 하는 의미가 없으며, 2,000 × g-force 부터는 중력 가속도(g)를 올려도 분리 시 소요되는 시간에 큰 변화가 없으므로 바람직하지 않다.
또한 상기 수용액 이상계에 초음파를 조사하거나, 혹은 미세 기포를 주입하는 단계를 더 포함할 수 있는데, 두 개의 상 사이의 경계면에 트랩(trap)되어 있는 세포 밖 소포체 및 단백질을 더욱 효과적으로 분리해낼 수 있다.
상기 초음파 조사는 용액에 직접 또는 간접적으로 초음파를 가할 수 있으며, 200 W ~ 400 W의 강도에서 20 ~ 240 분 동안 수행하는 것이 바람직하다. 초음파의 강도가 400 W를 초과하는 경우에는 수용액의 온도가 급상승하여 세포 밖 소포체 및 단백질이 변성될 수 있고, 초음파의 강도가 200 W 미만인 경우에는 경계면에 트랩되어 있는 세포 밖 소포체 및 단백질의 분리가 잘 되지 않는 문제점을 초래한다. 또한 초음파 처리 시간의 경우, 240 분을 초과하는 시점부터는 처리 시간이 길어져도 분리 정도가 더 이상 증가하지 않으며, 20 분 미만인 경우 그 효율이 떨어진다.
이와 같은 방법으로 상분리된 수용액 이상계에서 상층액을 제거하고 다시 불순물이 섞이지 않은 새로운 상층액을 혼합하는 과정을 반복하여 세포 밖 소포체를 분리해낸다. 이러한 과정을 반복할수록 세포 밖 소포체의 순도가 높아지지만, 회수율은 줄어들기에 바람직한 반복회수는 2 ~ 4회이다.
본 발명은 단백질에 의해 오염된 세포 밖 소포체의 순도를 손쉽게 보다 효율적으로 높일 수 있으며, 질병의 진단, 백신 연구 및 치료 등 다양한 분야에 응용될 수 있는 장점이 있다. 더욱 상세하게는, 체액으로부터 세포 밖 소포체를 분리한 후 세포 밖 소포체에 존재하는 유전자 발현량을 측정하여 질병을 진단할 수 있다. 이때 상기 체액은 전혈(whole blood), 혈청, 복강액, 모유, 또는 소변으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 질병은 암, 패혈증, 동맥경화증 및 류마티스 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 수용액 이상계를 사용하여 다단계 정제 방법으로 분리된 세포 밖 소포체는 ELISA, RT-PCR, western blot, proteomics 또는 genomics 등의 분석 방법에 사용될 수 있다.
세포 밖 소포체 내에 존재하는 유전자의 발현량 측정 시, 상기 유전자는 자극에 대해 발현 차이를 보이는 mRNA이며, 유전자의 분리 과정은 세포나 조직에서 유전자를 분리하는 종래의 방법과 동일하다. 더욱 상세하게는, 상기 유전자는 oligo(dT)를 이용하여 cDNA로 합성된 뒤에 real time PCR을 수행하나, real time PCR을 수행하는데 사용되는 주형이 cDNA에 제한되는 것은 아니다.
이때 상기 유전자는 EDN1(Endothelin 1), VCAM1(Vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1(Intercellular adhesion molecule 1), SELE(Selectin E), NOS3(Nitric oxide synthase 3), BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VWF(Von Willebrand factor), MPZ(Myelin protein zero), IRF1(Interferon regulatory factor 1), TNF(Tumor necrosis factor), IL32(Interleukin 32), CFLAR(CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10(Chemokine(C-X-X motif) ligand 10), IL6(Interleukin 6), ICK(Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8(Rho GTPase activating protein 8) 및 F3(Coagulation factor Ⅲ) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 수용액 이상계를 이용하여 세포 밖 소포체를 다단계로 분리 및 정제하는 장치는 도 5와 같으며, 더욱 상세하게는 주입부(10)를 통하여, 수용액 이상계를 형성하는 제1물질 및 제2물질이 주입되고, 투입부(20)를 통하여 체액 또는 세포 밖 소포체가 포함된 수용액이 투입된다. 상기 제1물질, 제2물질 및 체액 또는 세포 밖 소포체가 포함된 수용액은 주입부(10) 및 투입부(20)와 연결되어 있는 본체(30)로 들어가 원심분리를 통하여 상 분리가 되며, 상 분리 후 제1물질이 포함된 상층액은 제거부(40)를 통해 제거되고, 한번 또는 두번 이상의 다단계 분리정제 후 획득되는 세포 밖 소포체는 회수부(50)를 통해 회수된다.
주입부(10)와 투입부(20) 사이에는 도 6과 같이, 체액 또는 세포 밖 소포체가 포함된 수용액과 제1물질 및 제2물질의 혼합이 용이할 수 있도록 혼합부(60)를 더 포함할 수 있으며, 상기 혼합부(60)에는 진동장치가 장착되어 혼합이 효율적으로 될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
본체(30)에 초음파 조사 장치 또는 미세 기포 발생 장치가 더 포함되는 것이 바람직하며, 상기 장치는 상 분리 후 두 개의 상 사이의 경계면에 트랩되어 있는 세포 밖 소포체 및 단백질을 효과적으로 분리해내기 위하여 초음파를 조사하거나 미세 기포를 발생시키는 장치이다.
주입부(10)는 도 7과 같이 제1물질과 제2물질이 각각 주입될 수 있도록 제1주입부(10a)와 제2주입부(10b)로 분리되는 것이 바람직하며, 수용액 이상계 제조 시 제1물질 및 제2물질의 농도를 각각의 폴리머 및 체액의 종류에 따라 조절할 수 있다.
또한 본체(30)의 형상은 원통형일 수도 있고, 도 8과 같이 호리병형일 수 도 있다. 본체(30)가 호리병형인 경우, 오목하게 들어간 부위에 수용액 이상계의 경계면이 형성되는 데, 이 경우 경계면이 좁기 때문에 트랩된 세포 밖 소포체의 두께가 두껍게 형성되어 분리가 용이해진다는 장점이 있다.
이하에서는 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 분리방법에 대하여 구체적인 실시예를 중심으로 설명하고자 한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 발명의 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
세포 밖 소포체 분리 및 정제를 위한 수용액 이상계 준비
수용액 이상계를 만들기 위해 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란을 인산 완충 식염수(PBS, Phosphate buffered saline)에 녹여 각각 10.5 wt% 및 4.5 wt% 의 농도로 준비하였다. 이후 세포 밖 소포체를 포함하는 수용액에 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란 혼합 수용액을 혼합하여 4 ℃에서 3 시간 동안 쉐이커를 사용하여 교반하였다.
수용액 이상계에서 세포 밖 소포체 정제
실시예 1에 의해 제조된 세포 밖 소포체를 포함한 수용액 이상계를 1,000 × g-force로 4 ℃에서 10분 간 원심분리를 하여 폴리에틸렌 글리콜 상 및 덱스트란 상으로 상 분리를 가속화시켰다. 상 분리 후 경계층을 제외한 상층액인 폴리에틸렌 글리콜 상을 제거한 후 제거한 부피와 동일한 양의 새로운 폴리에틸렌 글리콜을 넣고 실시예 1에서와 같은 방법으로 교반하고 상 분리 과정을 수행하였다.
이러한 상 분리 과정을 각각 1회, 3회 및 5회 실시하였으며, 각각의 다단계 정제가 끝난 후 단백질과 세포 밖 소포체의 회수율을 아래의 식(1)에 따라 계산하였으며, 그 결과는 도 1과 같다.
이때 단백질의 양은 브래드포드 방법을 이용하였고 세포 밖 소포체는 RNA양을 이용하여 그 값을 구하였다.
Figure 112015028692412-pat00001
(1)
도 1에 따르면, 1회, 3회, 5회의 다단계 정제 후 세포 밖 소포체의 회수율은 각각 77.9%, 77.4% 및 74.7%으로 다단계 정제의 횟수가 반복될수록, 세포 밖 소포체의 회수율은 큰 차이 없이 근소하게 감소하였지만, 단백질의 회수율은 각각 29.4%, 3.6% 및 2.4%로 다단계 정제의 횟수가 반복될수록 크게 감소하였다. 따라서 다단계 정제의 횟수가 반복될수록 세포 밖 소포체의 순도가 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있다.
정제된 세포 밖 소포체의 분석
실시예 2에 따라 정제된 세포 밖 소포체와 종래의 기술인 초고속원심분리법을 이용하여 얻은 세포 밖 소포체의 동일성을 비교하고, 분석 방법에 사용하여 assay를 수행할 수 있는지 확인하기 위해서 아래와 같이 TEM, western blot, RT-PCR 분석을 시행하였다.
a. 분리된 세포 밖 소포체의 동일성 비교( TEM )
실시예 2에서 정제된 세포 밖 소포체와 초고속원심분리법으로 획득한 세포 밖 소포체를 투과전자현미경(TEM, Transmission Electron Microscopy)을 이용하여 관찰하였고 그 결과는 도 2과 같다.
도 2의 결과를 보면 초고속원심분리기로 얻은 세포 밖 소포체와 본 발명에 의해 정제된 세포 밖 소포체의 형태는 동일함을 확인할 수 있다.
b. Western blot 분석
세포 밖 소포체에 존재하는 CD81 마커를 이용하여 Western blot을 수행하였다.
도 3(a)에서 STD는 standard로서 PBS에 세포 밖 소포체를 혼합한 것이며, Ultra는 초원심분리법, Ultra*5는 초원심분리법으로 얻은 샘플의 5배 부피를 뜻하고, ATPS-1, ATPS-3 및 ATPS-5는 실시예 2에서 나타난 바와 같이 상 분리를 각각 1회, 3회 및 5회 하여 얻은 샘플이다. 이때 세포 밖 소포체의 회수율을 알아보기 위하여 동일한 부피의 샘플을 로딩하였으며, 따라서 총 단백질량은 각 샘플별로 모두 상이하다.
도 3(b)에서는 세포 밖 소포체의 순도를 알아보기 위하여 총 단백질량이 동일한 샘플을 로딩하였으며, 따라서 각 샘플의 부피는 모두 상이하다.
도 3(a)와 도 3(b)에 따라 초원심분리법과 본 발명의 다단계 정제방법을 비교해보면, 초원심분리법으로 획득한 세포 밖 소포체의 경우 순도는 더 높지만, 회수율에서 매우 낮은 효율을 가지므로 바람직하지 못하다. 또한 본 발명의 다단계 정제방법에서 상 분리 횟수가 1회, 3회, 5회로 증가하여도 세포 밖 소포체의 회수율은 크게 변화가 없지만, 순도의 경우 상 분리 횟수가 증가할수록 높아지게 된다.
c. RT- PCR 분석
본 발명의 다단계 정제방법으로 RNA의 손상없이 세포 밖 소포체를 분리 및 정제할 수 있음을 아래와 같은 방법으로 확인하였다.
멜라노마(melanoma)에서 얻은 세포 밖 소포체에 혈청단백질을 섞어서 생체유체와 유사하게 단백질에 의해 오염된 세포 밖 소포체 샘플을 제조하였다. 이후, 상기 세포 밖 소포체 샘플을 다단계 정제방법으로 분리 및 정제하고, Melan A라는 mRNA를 추출하여 RT-PCR(reverse transcription PCR)을 실행하였으며, 이를 항존 유전자인 GAPDH의 RT-PCR 결과와 비교하였다.
도 4의 RT-PCR 결과에 따르면, Melan A와 GAPDH는 동일함을 확인할 수 있는데, 이는 본 발명에 따른 세포밖 소포체의 다단계 분리 및 정제 방법을 통해서 분리된 세포 밖 소포체가 RNA의 손상 없이 분리되었음을 의미한다(도 4의 Negative는 세포 밖 소포체가 없는 경우이며, 이때 세포 밖 소포체가 포함된 시료 대신 DW(distilled water)를 사용하였다).
이상과 같이 실시예 1 내지 3의 실험결과를 통해, 본 발명의 다단계 정제방법은 RNA 손상없이 세포 밖 소포체를 분리 및 정제할 수 있으며, 종래의 초고속원심분리법과 비교하였을 때, 동일한 세포 밖 소포체를 고순도로 얻을 수 있어 효율적이다. 또한 다단계 정제 시, 상 분리 횟수가 반복될수록 세포 밖 소포체의 회수율은 약간 줄어들지만, 단백질의 회수율은 크게 줄어들어, 세포 밖 소포체의 순도는 점점 높아지는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (18)

  1. (a) 단백질을 포함하는 체액; 또는 단백질과 혼합되어 오염된 세포 밖 소포체;를 포함하는 수용액에 제1물질과 제2물질을 혼합하는 단계;
    (b) 상기 혼합물을 상층액과 하층액으로 상분리시켜 수용액 이상계를 제조하는 단계;
    (c) 상기 수용액 이상계 중, 제1물질이 포함된 상층액을 제거하는 단계;
    (d) 잔류하는 하층액에 제1물질을 포함하는 새로운 상층액을 공급하여 혼합하는 단계; 및
    (e) 상기 (b) 내지 (d)단계를 적어도 두번 이상 수행한 후, 상기 하층액으로부터 세포 밖 소포체를 회수하는 단계;를 포함하고,
    상기 체액은 전혈(whole blood), 혈청, 복강액, 모유 및 소변으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1물질은 물, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐 알코올 또는 피콜 중에서 선택되는 것이며,
    상기 제2물질은 EOPO(ethylene oxide propylene oxide), 덱스트란, 레반, Poly(vinyl methyl ethyl ether), 황산암모늄, 황산나트륨, 황산마그네슘, 인산칼륨 또는 탄산나트륨 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1물질은 물이고, 상기 제2물질은 EOPO인 것을 특징으로 하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 제1물질은 폴리에틸렌 글라이콜이고, 상기 제2물질은 덱스트란, 레반, Poly(vinyl methyl ethyl ether), 황산암모늄, 황산나트륨, 황산마그네슘, 인산칼륨, 탄산나트륨 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 제1물질은 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐 알코올 또는 피콜 중에서 선택되는 것이고, 상기 제2물질은 덱스트란인 것을 특징으로 하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 제1물질은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)이며, 상기 제2물질은 덱스트란(dextran)인 것을 특징으로 하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (a)단계 이후 및 (b)단계 이전에,
    상기 수용액 이상계에 첨가제를 추가하여 수용액 이상계 내 분자들 사이의 인력 또는 반발력을 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (b)단계의 상 분리는 500 ~ 2,000 × g-force의 원심분리법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (b)단계에서,
    상기 수용액 이상계에 초음파 조사 혹은 미세 기포를 주입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법.
  10. 삭제
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 통해 분리 및 정제된 세포 밖 소포체로 ELISA, RT-PCR, western blot, proteomics 또는 genomics으로 assay를 수행하는 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020105928A1 (ko) * 2018-11-19 2020-05-28 포항공과대학교 산학협력단 수용액 이상계 나노필터 및 이를 이용한 분리방법

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6932529B2 (ja) * 2017-03-27 2021-09-08 シスメックス株式会社 細胞外小胞の濃縮方法及び細胞外小胞濃縮用試薬
CN108362535B (zh) * 2018-02-02 2021-01-15 北京恩泽康泰生物科技有限公司 一种基于双水相系统提取体液中胞外囊泡的方法
KR102308738B1 (ko) * 2018-12-18 2021-10-05 한국과학기술연구원 신규 세포외 소포체의 분리방법
KR102294264B1 (ko) * 2019-08-07 2021-08-26 포항공과대학교 산학협력단 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 바이오 나노 입자의 분리 방법
KR102359540B1 (ko) * 2019-12-06 2022-02-10 포항공과대학교 산학협력단 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 질병 진단 방법
KR102583914B1 (ko) * 2020-07-03 2023-09-27 광운대학교 산학협력단 Atps 특성을 이용한 생체 시료 분리 장치

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130273544A1 (en) * 2012-04-17 2013-10-17 Life Technologies Corporation Methods and compositions for exosome isolation

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100194075B1 (ko) 1996-04-08 1999-06-15 박종헌 수성 2상계를 이용한 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈의 정제방법
US6979307B2 (en) 1997-06-24 2005-12-27 Cascade Medical Enterprises Llc Systems and methods for preparing autologous fibrin glue
US6855296B1 (en) * 1998-11-13 2005-02-15 Optime Therapeutics, Inc. Method and apparatus for liposome production
WO2003070898A2 (en) * 2002-02-19 2003-08-28 Choicepoint Asset Company Selective extraction of dna from groups of cells
JP4385084B2 (ja) 2002-03-26 2009-12-16 川澄化学工業株式会社 血液成分の分離方法及び血液成分の分離装置
KR100836171B1 (ko) 2007-01-19 2008-06-09 인하대학교 산학협력단 분배 향상 물질이 접합된 생물물질을 이용한 수성이상계추출법에서의 친화성 분리 방법
KR100863466B1 (ko) 2007-08-09 2008-10-16 고려대학교 산학협력단 동물세포로부터 세포막 단백질의 분리 방법
KR101061875B1 (ko) 2007-12-17 2011-09-02 인하대학교 산학협력단 초음파 미립화를 이용한 이온성 액체의 회수방법
WO2010080062A1 (en) * 2009-01-08 2010-07-15 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Separation method using single polymer phase systems
EP2589391B1 (en) * 2010-07-01 2018-11-14 Rosetta Exosome Co., Ltd. Bacterial cell-derived microvesicles for use in a method of treating cancer
KR101704828B1 (ko) 2011-03-31 2017-02-09 포항공과대학교 산학협력단 체액 내 세포밖 소포체의 단백질 또는 유전자 분석을 통한 염증성 질환 진단 방법
KR20120132183A (ko) * 2011-05-27 2012-12-05 포항공과대학교 산학협력단 종양 조직에서 유래한 나노소포체 및 이를 이용한 암 백신
CN113355321A (zh) * 2011-09-26 2021-09-07 凯杰有限公司 用于分离细胞外核酸的快速方法
US9005888B2 (en) * 2012-06-14 2015-04-14 System Biosciences, Llc Methods for microvesicle isolation and selective removal
US20140004539A1 (en) * 2012-06-15 2014-01-02 The Regents Of The University Of Michigan Systems and methods for multiplex solution assays
US9422354B2 (en) * 2012-06-19 2016-08-23 Indian Institute Of Technology Delhi Process for purification of recombinant granulocyte colony stimulating factor (rHu GCSF)
KR20140050465A (ko) 2012-10-19 2014-04-29 포항공과대학교 산학협력단 다공성 중합체 모노리드 필터를 포함하는 체액으로부터 세포밖 소포를 분리하기 위한 장치

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130273544A1 (en) * 2012-04-17 2013-10-17 Life Technologies Corporation Methods and compositions for exosome isolation

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020105928A1 (ko) * 2018-11-19 2020-05-28 포항공과대학교 산학협력단 수용액 이상계 나노필터 및 이를 이용한 분리방법
CN113056319A (zh) * 2018-11-19 2021-06-29 浦项工科大学校产学协力团 水溶液双相系纳米过滤器及利用其的分离方法
CN113056319B (zh) * 2018-11-19 2022-11-22 浦项工科大学校产学协力团 水溶液双相系纳米过滤器及利用其的分离方法

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