JP3018802B2

JP3018802B2 - 全血液検体からのｄｎａ抽出方法及び抽出キット

Info

Publication number: JP3018802B2
Application number: JP4350818A
Authority: JP
Inventors: ▲ろう▼ 王; 勝己石澤; 一成平安
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd; Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1992-12-04
Filing date: 1992-12-04
Publication date: 2000-03-13
Anticipated expiration: 2015-03-13
Also published as: JPH06205676A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の利用分野】本発明は全血液からのＤＮＡ鎖の抽
出方法及び抽出キットに関する。

【発明の背景】遺伝子疾患の出生前診断や保因子の発
見、ＤＮＡの多型或は遺伝病や癌などＤＮＡの異常に起
因する疾病の原因領域の究明のために、ヒトの遺伝子を
抽出、分析する研究が行われている。また、例えばＢ型
肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイスル等のウイルス性
疾患、腫瘍、血友病等の遺伝疾患の診断を、ＤＮＡを分
析して行う方法が最近盛んになりつつある。また、ヒト
・ゲノム・プロジェクトに代表されるように、ヒトの全遺
伝情報を解析する研究も盛んに行われているが、遺伝子
を分析するには傷をつけずに高分子の状態を保ったまま
ゲノムＤＮＡを調製する必要がある。しかしながら原核
生物と異なり、真核生物、特にヒトに代表される高等生
物のＤＮＡ分子は巨大で、攪拌操作等によって容易に切
断されてしまうため、十分注意を払っても、全く損傷を
与えることなくＤＮＡ分子を抽出することは不可能であ
る。またクロマチン等の核蛋白質が強固にＤＮＡ分子と
結合しているため、これら核蛋白質の除去操作も必要で
あり、完全なＤＮＡを精製することはできない。

【０００２】従来の方法は、例えば細胞を物理的に、又
は界面活性剤等で処理して破壊後、水飽和フェノールや
クロロホルム等の有機溶媒を用いて不純物を除去し、次
いでアルコールで溶液中のＤＮＡ鎖を沈殿させる方法、
更にカラムクロマトグラフィーにより精製する方法が一
般的である（生化学実験講座２,「核酸の化学Ｉ」,74
〜80頁,262〜270頁,1975年,東京化学同人、「遺伝子操
作マニュアル」,20〜23頁,1985年,講談社、他）。しか
し、これらの方法ではフェノール、クロロホルムを使用
する必要があり、有機溶媒層とＤＮＡ層を分離操作する
手間或はカラムクロマトグラフィーを行う手間を要する
といった欠点を持っている。また、操作が煩雑なため、
ＤＮＡ鎖に傷をつける可能性が高い。また抽出操作中に
何回もＤＮＡ層を別の容器に移し変えるので、使用容器
が細菌等に汚染されていたりすると、試料以外の、これ
ら細菌等の外来ＤＮＡが混入してしまう危険性がある。
また、これらのこともＤＮＡ鎖の抽出効率を悪くしてい
る。更に、抽出操作に用いられるフェノールには、従来
毒性があり、且つ強い蛋白質変性剤であるため、皮膚
に接触すると薬傷を引き起こす、また保存中にフェノ
ールが変性して二価フェノール、キノン等のフェノール
性酸化物が生成した場合には、これら酸化物がホスホジ
エステル結合又はＤＮＡ鎖の架橋結合を開裂させて、核
酸鎖の変性を引き起こしたりする、等の問題点が、ま
た、クロロホルムやジエチルエーテルには麻酔作用があ
るため、使用時に中毒を起こす可能性があるという問題
点が、更にはフェノールや上記有機溶媒を含む溶液は廃
棄の際に制約を受けるという問題点がある。

【０００３】一方、イオン半径の大きな１価の陰イオン
を出すカオトロピック剤が蛋白変性剤の一つとして知ら
れていた。カオトロピック剤は水に溶解してカオトロピ
ックイオンを放出し、疎水結合を弱めることが知られて
おり、蛋白質の変性や、膜蛋白質の抽出に用いられてき
た。しかしながら、従来は、フェノールには前記した如
き種々の問題点があるにも関わらず、血液中のＤＮＡ抽
出にはこれを蛋白変性剤として用いる方法が一般的であ
り、カオトロピック剤を血液検体からのＤＮＡ抽出に用
いようとする試みは今までなされていなかった。

【０００４】

【発明の目的】本発明は上記欠点を解決し、ＤＮＡ鎖を
高分子のままで高精度に且つ容易に抽出する方法及び抽
出キットを提供することを目的とする。

【発明の構成】本発明は、全血液検体に界面活性剤を接
触させて血球細胞の細胞膜を破壊し、露出した細胞核を
集め、更に界面活性剤と蛋白質分解酵素で処理して核膜
及び核蛋白質を破壊した後、カオトロピック剤と接触さ
せてＤＮＡ鎖を遊離させ、該遊離されたＤＮＡ鎖を含む
溶液にアルコール類を加えてＤＮＡ鎖を沈澱させること
を特徴とするＤＮＡ鎖抽出方法の発明である。また、本
発明は細胞膜を破壊するための界面活性剤、核膜及
び核蛋白質を破壊するための界面活性剤、蛋白分解酵
素、カオトロピック剤及びアルコール類を含んで成
ることを特徴とする、全血液検体からのＤＮＡ鎖抽出キ
ットの発明である。

【０００５】即ち本発明者等は、血液検体から核酸鎖を
有効に抽出する方法について鋭意研究の結果、ＤＮＡ鎖
抽出の過程に於て、従来のフェノール，クロロホルム等
の有機溶媒を用いる代わりにカオトロピック剤を用いる
ことが可能なことを見出し、更に、カオトロピック剤を
使用することにより、その後の有機溶媒を除去する過程
を省略することができるので、操作手順が簡略化される
こと、ＤＮＡ層を何回も別の容器に移し変えることなく
初めから終わりまで同じ容器で抽出操作が行えるので、
ＤＮＡ鎖抽出過程に於けるＤＮＡ鎖の損傷、汚染の危険
性を最小限に止められること、更にその結果、従来のフ
ェノールを用いた抽出法に比べて高分子のＤＮＡ鎖を高
精度で抽出できることを見い出し、本発明を完成するに
到った。

【０００６】本発明に於て用いられる界面活性剤として
は、一般に細胞、細菌等から核酸鎖抽出の際に用いられ
るものであれば、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界
面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等、
特に限定されることなく挙げられるが、具体的には例え
ばドデシルトリメチルアンモニウムブロミド，ドデシル
トリメチルアンモニウムクロリド，セチルトリメチルア
ンモニウムブロミド等の陽イオン性界面活性剤、ドデシ
ル硫酸ナトリウム(以下、ＳＤＳと略記する。)，コール
酸ナトリウム，デオキシコール酸ナトリウム、N-ラウロ
イルサルコシンナトリウム等の陰イオン性界面活性剤、
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（例えば
ロームアンドハース社商品名：トリトンＸ-100等），
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（例えば
花王(株)商品名：トゥイーン20等），ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノオレエート（例えば花王(株)商品名：
トゥイーン80等），n-オクチル-β-D-グルコシド等の非
イオン界面活性剤、例えば3-[(3-コラミドプロピル)ジ
メチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート、ホスフ
ァチジルエタノールアミン等の両性界面活性剤が好まし
く挙げられる。中でも、特に例えば血球細胞を破壊する
際にはポリオキシエチレンオキチルフェニルエーテル等
の非イオン性界面活性剤が、例えば蛋白質分解酵素と共
に核膜及び核蛋白質を破壊する際にはＳＤＳ等の陰イオ
ン性界面活性剤が好ましく用いられる。これらの使用濃
度としては、使用する界面活性剤の種類により多少異な
るが、例えば血球細胞を破壊する界面活性剤の場合に
は、溶液中の濃度として、通常0.1〜３％の濃度範囲が
挙げられる。また、蛋白質分解酵素と共に核膜及び核蛋
白質を破壊する界面活性剤の場合には、溶液中の濃度と
して、通常0.1〜３％の濃度範囲が挙げられる。

【０００７】本発明に於て用いられる蛋白質分解酵素と
しては、例えばプロティナーゼＫ、プロナーゼ又はリゾ
チーム等が挙げられるが特にこれらに限定されない。ま
た、これらの使用濃度としては、通常１〜10mg/mlの範
囲で用いられる。本発明に於て用いられるカオトロピッ
ク剤としては、一般にカオトロピック剤として知られて
いるような、水溶液に添加した際にカオトロピックイオ
ン（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生成し、疎
水性分子の水溶性を増加させる作用を有しているもので
あれば特に限定されることなく挙げられるが、具体的に
は例えばよう化アルカリ、チオシアン酸グアニジン、過
塩素酸のアルカリ金属塩、トリフルオロ酢酸のアルカリ
金属塩、トリクロロ酢酸のアルカリ金属塩、及びチオシ
アン酸のアルカリ金属塩等が挙げられる。これらアルカ
リ金属塩或はよう化アルカリに於けるアルカリ金属の例
としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム等が
挙げられる。これらカオトオピック剤の使用濃度は、用
いるカオトロピック剤の種類により多少異なるが、一般
に溶液中の濃度として２〜６Ｍの範囲で用いられる。特
に、よう化ナトリウムを使用する場合には、溶液中の濃
度が約3.5〜５Ｍの範囲となるように使用するのが好ま
しい。

【０００８】本発明に於て用いられる抽出溶液中からＤ
ＮＡ鎖を沈澱させる方法としては、例えばＤＮＡ鎖抽出
溶液に、イソプロパノール、エタノール等のアルコール
類を添加し、ＤＮＡ鎖を特異的に沈澱させることにより
ＤＮＡ鎖を回収する方法等が挙げられる。本発明に於て
抽出溶液中からＤＮＡ鎖を沈殿させる際に用いられるア
ルコール類としては、ＤＮＡ鎖を特異的に沈殿し得る性
質を有するものであれば特に限定することなく挙げられ
るが、具体的には例えばイソプロパノール、エタノール
等のアルコール類が挙げられ、特にイソプロパノールが
好ましく用いられる。またカオトロピック剤としてよう
化ナトリウムを用いる場合には、特にイソプロパノール
を用いてＤＮＡ鎖の沈殿を行うことがより好ましい。こ
れらの使用濃度としては、ＤＮＡ鎖が水溶液から沈殿す
るような濃度であればよく、特に限定されない。

【０００９】本発明に於て用いられる、例えば緩衝剤等
の試薬類としては、従来この分野で用いられているもの
の中から適宜選択して用いればよく、その使用濃度も通
常この分野で用いられる範囲から適宜選択すれば足り
る。例えば緩衝剤としては、例えばリン酸塩、クエン酸
塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（以下、ト
リスと略記する。）、グリシン等が好ましく挙げられ、
その使用濃度としてはＤＮＡの遊離を妨げない範囲であ
れば特に限定されないが、通常１〜500ｍＭの範囲が好
ましく挙げられる。また、抽出操作に於て用いられる水
（緩衝液も含む）のpＨとしては、ＤＮＡ鎖の遊離を妨
げない範囲であれば特に限定されないが、通常２〜12の
範囲、好ましくは７〜９の範囲から適宜選択される。更
に、本発明の抽出方法に於て用いられる緩衝液等の水溶
液中には、ＤＮＡ鎖の分離効率を良くするために、例え
ば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、
塩化リチウム等の塩類等が添加されていても良い。これ
らの該水溶液中の濃度としては、ＤＮＡ鎖の遊離を妨げ
ない範囲であれば特に限定されないが、該水溶液中の濃
度として通常１〜500mMの範囲で必要に応じて添加され
る。

【００１０】尚、本発明は通常例えばエチレンジアミン
四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略記する。）等のＤＮａｓｅ
の阻害剤の共存下で実施することが好ましい。これら阻
害剤の使用濃度としては、阻害剤の種類により異なる
が、例えばＥＤＴＡを用いる場合には、一連の操作に於
ける各溶液中の濃度として通常１〜200mMの範囲が好ま
しく挙げられる。

【００１１】本発明に係るＤＮＡ鎖の抽出方法を具体的
に示すと、例えば下記の如くになる。採取した血液試料
を全血のまま（ＥＤＴＡ，ヘパリン等の抗血液凝固剤を
含んでいてもよい）ポリオキシエチレンオクチルフェニ
ルエーテル等の界面活性剤を含む溶液に懸濁して血液細
胞を破壊した後、遠心分離を行い、核画分を含む沈殿物
を得る。続いて得られた核画分を含む沈殿物にＳＤＳ等
の界面活性剤及びプロティナーゼＫ等のプロテアーゼを
加えて一定時間処理し、核膜、核蛋白質等を破壊する。
続いてよう化ナトリウム等のカオトロピック剤を加えて
混合した後、イソプロパノール等のアルコール類を加え
てＤＮＡ鎖を沈殿、精製する。本発明の方法は、例え
ば、細胞膜を破壊するための界面活性剤、核膜及び
核蛋白質を破壊するための界面活性剤、蛋白分解酵
素、カオトロピック剤及びアルコール類をを組み合
わせて成る試薬キットを用いて実施することができる。

【００１２】本発明は、カオトロピック剤を用いること
により上記種々の問題点を有する有害な有機溶媒を使用
する必要がなくなり、しかも有機溶媒除去操作が不要に
なったために操作手順が簡略化し、ＤＮＡ鎖損傷の危険
性を最小限に止め、短時間に高分子のＤＮＡ鎖を高収率
で得ることができる。本発明の抽出方法に於ては、血液
細胞から有核細胞を分離したものも試料にできることは
勿論であるが、全血を用いることができるため、血液試
料を各細胞成分に分離する繁雑さが解消し、採取後短時
間に血液試料を処理することができる点に於ても極めて
優れた発明である。また、本発明の方法により抽出した
ＤＮＡ鎖は例えばＰＣＲ法（Polymeraze chain reactio
n）を用いた臨床診断の分野はもちろん、制限酵素切断
反応、サザンブロットによる分析等の分野でも利用する
ことができる。

【００１３】

【実施例】

実施例１．ヒト新鮮全血0.5mlにサッカロースを0.32M、
塩化マグネシウムを５mM、ポリオキシエチレンオクチル
フェニルエーテルを１％、アジ化ナトリウムを0.2％含
む10mMトリス−塩酸緩衝液（pＨ7.5）を0.5ml加えて混
合した。その後、12,000rpm，20秒，４℃で遠心分離し
た。ペリットに上記の溶液を１ml加えて、マイクロチュ
ーブミキサー（MT-360，トミー精工製）にて攪拌した。
再度遠心分離を行い、上清を取り除いた。更にこの洗浄
操作を１回繰り返した。続いて得られたペリットに１％
ＳＤＳ、１mM ＥＤＴＡを含む10mMトリス−塩酸緩衝液
（pＨ8.0）200μlと20mg／mlのプロティナーゼＫ 10μl
を添加した後、37℃で60分間反応させた。その後、最終
濃度4.5Mのよう化ナトリウムを加え混合した後、0.5ml
イソプロパノールを加え混合した。12,000rpmにて、10
分間遠心分離し、ＤＮＡを沈澱させた。上清を捨て、沈
澱に40％イソプロパノールを１ml添加して洗浄した後乾
燥処理し、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液
（ＥＤＴＡを１mM含む、10mMトリス−塩酸緩衝液、pＨ
8.0）に再度溶解して、得られた溶液の260nmに於ける吸
光度を測定しＤＮＡの抽出効率を算出した。また、この
溶液をパルスフィールド電気泳動にかけて、得られたＤ
ＮＡの分子量を測定した。結果を表１示す。尚、ＤＮＡ
の抽出効率は、

【式１】によって求めた。註）ヒト細胞(白血球)１個当りの全ＤＮＡ量は６ピコグ
ラムである。

【００１４】比較例１．従来法（フェノールを用いた方
法）ヒト新鮮全血試料（ＥＤＴＡ添加）0.5mlに、サッカロ
ースを64mM、塩化マグネシウムを10mＭ、ポリオキシエ
チレンオクチルフェニルエーテルを２％（w/v）含む20m
Ｍトリス-塩酸緩衝液（pＨ7.8）を0.5ml加えた。次いで
蒸留水で２倍に希釈した上記緩衝液0.3mlを加え、穏や
かに攪拌した。氷水中で５分間インキュベートした後、
2000rpmで30分間、４℃で遠心分離して核画分を含むペ
リットを得た。ペリットにNaClを75mＭ含む24mM ＥＤＴ
Ａ溶液を0.1ml加えて再懸濁させた。更に上記ＥＤＴＡ
溶液を 0.1ml加えて懸濁後、別の容器に移した。試料に
20％ＳＤＳを10μl、次いで0.1mgの固形プロティナーゼ
Ｋを加え、攪拌後、37℃で２時間反応させた。0.21mlの
水飽和フェノールを加えて混合後、2000rpmで10分間遠
心分離し、水層を別の容器に移した。上記フェノール抽
出操作を再度繰り返し行った。得られた抽出物につい
て、水飽和フェノール−クロロホルム（=１:１(v/v)）
で２回、水飽和クロロホルムで３回、抽出操作を行っ
た。次いで常法に従いエタノールを加えてＤＮＡを沈殿
させた後、遠心分離して、目的のＤＮＡを得た。得られ
たＤＮＡをＴＥ緩衝液に再度溶解して、得られた溶液の
260nmに於ける吸光度を測定し、得られたＤＮＡ量を測
定して、上記算出式よりＤＮＡの抽出効率を算出した。
また、この溶液をパルスフィールド電気泳動にかけて、
得られたＤＮＡの分子量を測定した。結果を表１に併せ
て示す。

【表１】表１より、本発明を用いたＤＮＡ鎖の抽出法では、従来
のフェノールを用いた精製法と比較して、より短時間
に、高分子量のＤＮＡ鎖が高収率で得られることが分か
る。また、OD 260/280の値が1.8〜２であれば蛋白質の
混入が少ないことを示すが（遺伝子工学入門,43〜44頁,
1986年,南山堂等）、表１の結果より、本発明を用いた
方法によると、従来のフェノールを用いた精製法よりも
蛋白質の混入の少ない精製度の高いＤＮＡ鎖が得られる
ことが分かる。

【００１５】

【発明の効果】本発明によれば、全血試料へのタンパク
質変性剤及びアルコールの添加とその後の遠心分離操作
のみで高分子のＤＮＡを得ることができる。また、本発
明の全工程を１つの容器内で行うことで外来ＤＮＡの混
入を軽減することができる。更に、フェノールなどの有
機溶媒を使わないため溶媒除去の操作が不要で、試料の
損失が少なく、従って高い収率でＤＮＡ鎖を抽出するこ
とが可能である。また、本発明では更に、有機溶媒抽出
操作中のピペットによるＤＮＡ鎖の機械的切断を回避す
ることでゲノムＤＮＡを高分子のまま回収することが可
能になっている。本発明は上記の点に於て、特に優れた
発明であり、斯業に貢献するところ極めて大なる発明で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】全血液検体に界面活性剤を接触させて血球
細胞の細胞膜を破壊し、露出した細胞核を集め、更に界
面活性剤と蛋白質分解酵素で処理して核膜及び核蛋白質
を破壊した後、カオトロピック剤と接触させてＤＮＡ鎖
を遊離させ、該遊離されたＤＮＡ鎖を含む溶液にアルコ
ール類を加えてＤＮＡ鎖を沈澱させることを特徴とする
ＤＮＡ鎖抽出方法。
【請求項２】細胞膜を破壊するための界面活性剤が非イ
オン性界面活性剤である、請求項１に記載のＤＮＡ鎖抽
出方法。
【請求項３】非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレ
ンオクチルフェニルエーテルである、請求項２に記載の
ＤＮＡ鎖抽出方法。
【請求項４】核膜及び核蛋白質を破壊するための界面活
性剤が陰イオン性界面活性剤である、請求項１〜３の何
れかに記載のＤＮＡ鎖抽出方法。
【請求項５】陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナト
リウム（以下、ＳＤＳと略記する。）である、請求項４
に記載のＤＮＡ鎖抽出方法。
【請求項６】蛋白質分解酵素がプロティナーゼＫであ
る、請求項１〜５の何れかに記載のＤＮＡ鎖抽出方法。
【請求項７】カオトロピック剤がよう化ナトリウムであ
る、請求項１〜６の何れかに記載のＤＮＡ鎖抽出方法。
【請求項８】アルコール類がイソプロパノールである、
請求項１〜７の何れかに記載のＤＮＡ鎖抽出方法。
【請求項９】細胞膜を破壊するための界面活性剤、
核膜及び核蛋白質を破壊するための界面活性剤、蛋白
分解酵素、カオトロピック剤及びアルコール類を含
んで成ることを特徴とする、全血液検体からのＤＮＡ鎖
抽出キット。
【請求項１０】細胞膜を破壊するための界面活性剤が非
イオン性界面活性剤である、請求項９に記載のＤＮＡ鎖
抽出キット。
【請求項１１】非イオン性界面活性剤がポリオキシエチ
レンオクチルフェニルエーテルである、請求項１０に記
載のＤＮＡ鎖抽出キット。
【請求項１２】核膜及び核蛋白質を破壊するための界面
活性剤が陰イオン性界面活性剤である、請求項９〜１１
の何れかに記載のＤＮＡ鎖抽出キット。
【請求項１３】陰イオン性界面活性剤がＳＤＳである、
請求項１２に記載のＤＮＡ鎖抽出キット。
【請求項１４】蛋白質分解酵素がプロティナーゼＫであ
る、請求項９〜１３の何れかに記載のＤＮＡ鎖抽出キッ
ト。
【請求項１５】カオトロピック剤がよう化ナトリウムで
ある、請求項９〜１４の何れかに記載のＤＮＡ鎖抽出キ
ット。
【請求項１６】アルコール類がイソプロパノールであ
る、請求項９〜１５の何れかに記載のＤＮＡ鎖抽出キッ
ト。