CN107743521B

CN107743521B - 核酸的分离

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Publication number: CN107743521B
Application number: CN201680028490.3A
Authority: CN
Inventors: 斯蒂芬·约翰·敏特; 乔尔乔斯·派特索斯
Original assignee: Moorlodge Biotech Ventures Ltd
Current assignee: Moorlodge Biotech Ventures Ltd
Priority date: 2015-03-17
Filing date: 2016-03-17
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2036-03-17
Also published as: PL3277809T3; HRP20201452T1; HUE051568T2; PT3277809T; LT3277809T; JP2018508239A; ES2819903T3; AU2016231944B2; US10934539B2; EP3277809A1; CY1123363T1; RS60850B1; GB201504459D0; AU2016231944A1; EP3277809B1; WO2016147004A1; DK3277809T3; SI3277809T1; US20180066246A1; AU2016231944A8

Abstract

公开了从生物材料分离包含DNA的核酸的方法。所述方法包括使用水性组合物产生裂解的组合物的裂解步骤，所述水性组合物包含浓度为0.05‑1.0M的锂、螯合剂和表面活性剂。在存在浓度为0.05‑2M的溶解的离液剂和25体积％‑60体积％的C_1‑3链烷醇的条件下，将所述裂解的组合物用能够固定DNA的固体载体处理。然后将所述载体用包含溶解在C_1‑3链烷醇中的锂的第一洗涤溶液洗涤。随后，将所述载体用包含至少80体积％的C_1‑3链烷醇的液体洗涤。然后，从所述载体上洗脱包含DNA的核酸。

Description

核酸的分离

本发明涉及从生物材料(例如，细胞)中分离包含DNA的核酸，其利用裂解工序并且处理裂解物而分离包含DNA的核酸。更具体地，本发明包括将来自裂解的生物材料的包含DNA的核酸固定在固体载体上，纯化在所述载体上的包含DNA的核酸，然后从所述载体上洗脱所述包含DNA的核酸以用于收集。本发明的具体目的是提供一种相对快速且直接实施的并且以良好的产率产生高纯度的包含DNA的核酸的方法。本发明还涉及用于所述裂解工序的组合物。

在众多领域中，例如，研究和临床诊断中，从生物材料(例如，细胞)分离纯的、完整的包含DNA的核酸是重要的。由此，纯粹通过举例的方式，临床上来自患者的包含细胞的样品可以进行工序处理(包括细胞裂解的步骤)，以分离包含DNA的核酸，然后将其通过本领域公知的工序进行分析。这样的分析可以是用于鉴定来自特定细菌的DNA的目的(以确定所述患者是否已被所述细菌感染)或可以是用于所述患者的DNA是否具有一种或多种造成医学病况的点突变的目的。

US-A-8 598 338公开了使用固体载体从生物材料(例如，细胞)分离DNA的组合物和方法。所述方法包括至少下述步骤：

(a)用缓冲的裂解组合物裂解所述生物材料，所述裂解组合物包含：(i)锂盐，例如，氯化锂，浓度为至少1M，但是优选高得多的浓度(多至10M)，(ii)表面活性剂，其可以是浓度为0.05至0.2％的SDS，但是优选地是以高得多的浓度(例如，至少5％)存在的非离子表面活性剂，和(iii)任选的螯合剂；

(b)将来自(a)的组合物与“DNA掺加溶液”混合，所述DNA掺加溶液可以是(i)无水醇(例如，甲醇、乙醇或最优选地是异丙醇)，或(ii)浓度为10-15M的锂盐溶液；

(c)使得到的混合物与固体载体接触，从而固定来自裂解的材料的DNA；

(d)用包含醇的洗涤液洗涤所述载体，并且

(e)洗脱所述DNA。

尽管US-A-8 598 338的总公开内容没有排除，但是高度优选的是，其工序不使用离液剂(例如，胍盐)实施。实施例4和5中所述的工序按照上述教导进行，并且使用6M LiCl裂解溶液和10M LiCl“DNA掺加溶液”。

US-A-8 598 338的工序具有下述缺点：在所述裂解组合物和“DNA掺加溶液”中所用的高锂盐浓度具有锂盐污染所分离的DNA的风险。在这一点上，已知30Mm的LiCl抑制PCR反应，参见作者为Ganaie等人的以“Inhibition of Polymerase Chain Reaction byLithium Chloride(借助氯化锂的聚合酶链式反应的抑制)”为题的文献(InternationalJournal of Life Science&Pharma Research，Vol.2/Issue 4，2012年10-12月，第L1-L5页)。因此，LiCl污染可能影响下游应用。

因此，本发明的一个目的是避免或减轻上述缺点。

根据本发明的第一方面，提供从生物材料分离包含DNA的核酸的方法，所述方法包括下述步骤：

(i)用水溶液实施所述生物材料的裂解，以产生水性的裂解的组合物，所述水溶液包含浓度为0.05-1.0M的锂、螯合剂和表面活性剂，

(ii)在存在浓度为0.05-2M的溶解的离液剂和25体积％-60体积％的溶解的C_1-3链烷醇液体的条件下，用固体载体处理所述裂解的组合物，所述固体载体能够固定DNA，

(iii)将所述固体载体与液体分离，

(iv)用包含浓度为0.05-1M的锂盐的第一洗涤溶液处理所述固体载体，所述第一洗涤溶液包含20体积％-90体积％的溶解的C_1-3链烷醇，

(v)将所述固体载体与所述第一洗涤液分离，

(vi)用第二洗涤液处理所述固体载体，所述第二洗涤液包含至少80体积％的C_1-3链烷醇，如果存在余量的话，余量为水，

(vii)将所述固体载体与所述第二洗涤溶液分离，和

(viii)从所述固体载体上洗脱包含DNA的核酸。

在本说明书的附录1中限定了可以以任意组合使用的本发明优选的特征。

通过本发明的方法分离的包含DNA的核酸可以结合RNA，并且可以是总核酸。

本发明提供包含DNA的核酸的分离方面的优异的结果。与US-A-8 598 338的教导相反，裂解工序使用相对低浓度的锂盐，并且还使用离液剂(优选胍盐)。分离的包含DNA的核酸是高纯的，由于在本发明的方法中使用相对低量的锂盐，因此存在很少被锂盐污染的风险。本发明的方法得到基本上纯的且基本上完整的包含DNA的核酸的分离。

本发明第二方面的方法可以用于从宽范围的生物来源的包含DNA的样品中分离包含DNA(特别是基因组DNA)的核酸。要从中分离DNA的样品可以是，或可以包含，细胞，例如，动物(包括哺乳动物)细胞、植物细胞、细菌细胞或酵母或其他真菌细胞。备选地，要从中分离DNA的样品可以是，或可以包含，一种或多种病毒。要从中分离包含DNA的核酸的细胞、一种或多种病毒或其他包含DNA的样品可以来源于或已经存在于组织样品或体液中，如血液、痰、尿液或CSF中。

在某些实施方案中(例如，关于革兰氏阴性细菌的裂解)，本发明的方法可以无需使用蛋白酶(例如，蛋白酶K)处理细胞和无需加热步骤而实施。在其他实施方案中(例如，关于组织(如用于裂解全血细胞目的的血液)处理和关于革兰氏阳性细菌的裂解)，样品可以另外用蛋白酶(例如，蛋白酶K)处理。在后一些实施方案中，用蛋白酶(蛋白酶K)处理可以与用包含锂的裂解溶液处理同时起作用。

通过本发明的方法得到的包含DNA的核酸是足够纯的，足以用于通过本领域公知的技术进行其他分析的目的。例如，DNA可以用于研究目的或在需要时用于医学病症的诊断。

本发明的方法可以便利地在要裂解的生物材料(例如细胞)的球粒上实施。所述球粒可以通过使用本领域公知的技术将包含所述生物材料的液体样品离心而产生。

在本发明用于从生物材料(例如细胞)样品分离包含DNA的核酸的方法的步骤(i)中，将所述材料用水性组合物裂解，所述水性组合物包含浓度为0.05-1.0摩尔/升的锂(由锂盐提供)、螯合剂和表面活性剂。所述组合物可以包含所述的成分，可以基本上由所述的成分组成，或由这些成分组成。

锂盐优选地是卤化锂，最优选是氯化锂，并且优选地，以0.05至小于1摩尔/升、优选0.1-0.9摩尔/升、更优选0.6-0.9摩尔/升、甚至更优选0.75-0.85摩尔/升并且最优选约0.8摩尔/升的浓度存在于所述组合物中。

所述螯合剂，最优选是EDTA或其盐，如碱金属(例如，钠)盐，优选地以1-20mM/L，更优选8-15毫摩尔/升、更优选9-11毫摩尔/升并且最优选约10毫摩尔/升的浓度存在于所述组合物中。

所述表面活性剂可以是非离子表面活性剂，但是更优选是阴离子表面活性剂，最优选是SDS。

所述裂解溶液可以具有7-8的pH，但是不必须缓冲至该范围内的pH。因此，所述裂解溶液可以是无缓冲型组合物。

在实施本发明方法的第一实施方案中，要裂解的材料(例如，以球粒形式)可以用裂解溶液处理，所述裂解溶液包含本发明方法步骤(i)中限定的成分，基本上由本发明方法步骤(i)中限定的成分组成或由本发明方法步骤(i)中限定的成分组成。所述材料(例如细胞)与所述组合物彻底混合(例如，通过移液)，并且在环境温度实施裂解持续适当的时间段。通常，15-25分钟，例如约20分钟的时间段是合适的。

根据该第一实施方案，然后可以将裂解物与离液剂溶液混合，所述离液剂溶液优选地由胍盐(例如，胍氯化物，也称为盐酸胍(guanidinium hydrochloride或guanidinehydrochloride))提供，胍盐溶液具有0.05-1M、优选0.1-1M、更优选0.5-0.9M、并且最优选0.6-0.7M范围内的浓度。然后将得到的组合物再次彻底混合。然后可以在混合的情况下并且以一定的量加入乙醇(或其他C_1-3链烷醇，例如，异丙醇)，以使溶液变澄清。通常，乙醇(或其他链烷醇)的量为35体积％-45体积％，最优选35体积％-40体积％。再次进行彻底的混合。根据在本说明书后续描述中更充分描述的工序，然后使得到的混合物与固体载体接触，。

在本发明方法的备选的第二实施方案中，所述水性裂解溶液可以包含水和所述方法步骤(i)和(ii)中限定的其他成分，基本上由水和所述方法步骤(i)和(ii)中限定的其他成分组成，或由水和所述方法步骤(i)和(ii)中限定的其他成分组成。在该实施方案中，所述水性裂解溶液可以包含下述，基本上由下述组成，或由下述组成：水、浓度为0.2-0.3M的氯化锂、浓度为1-5mM的EDTA或其钠盐、浓度为0.6-0.7M的胍氯化物、0.2-0.4重量％的量的SDS和35-40体积％的乙醇或其他C_1-3链烷醇(例如，异丙醇)。

对于本发明第二方面的方法的其他实施方案，裂解步骤可以在存在固体载体的条件下实施。由此，例如，上文限定的任一种裂解溶液可以与所述固体载体接触，然后加入生物材料。

用于本发明的方法的固体载体可以是二氧化硅或基于二氧化硅的材料。所述二氧化硅或基于二氧化硅的材料可以是玻璃，优选硼硅酸盐玻璃。所述载体可以包含纤维材料，并且优选地包含二氧化硅或基于二氧化硅的材料的纤维。过滤器优选地包含硼硅酸盐玻璃纤维。优选地，所述载体是纤维片或膜的形式，其中所述纤维是硼硅酸盐玻璃。命名为POREXF的可用的类型的过滤器适合用于本发明。便利地，所述固体载体作为本领域公知类型的离心管中的过滤器(以片或膜的形式)提供。如所示，离心管中的过滤器优选是包含硼硅酸盐纤维的片或膜。优选地，在离心管中提供多于一个此类过滤器或片。更优选地，在离心管中存在四个此类膜式或片式过滤器(以面对面的关系存在)。在所述片式或膜式过滤器包含作为POREX F的可用的材料的情况下，获得特别好的结果。

可以将由所述方法的步骤(ii)(其可以与步骤(i)同时实施)得到的组合物引入到离心管中，然后离心。在离心期间，包含DNA(其是最终要分离的)的核酸与所述固体载体结合，并且大部分杂质(蛋白等)通过所述固体载体(过滤器)，并且收集在上清液中，然后可以将所述上清液弃掉。

在所述方法的下一步骤中，洗涤所述固体载体，以去除任何残留的杂质，并且使基本上纯的包含DNA的核酸固定在所述载体上。洗涤以两个阶段实施。在第一洗涤阶段，用第一洗涤液处理所述固体载体，所述第一洗涤液包含浓度为0.05-1M(优选0.3-1M，例如，0.3-0.6M，或0.6-1M)的锂盐(优选卤化锂，最优选氯化锂)和45-55体积％的量的乙醇(或其他C_1-3链烷醇，例如，异丙醇)。例如，所述第一洗涤液可以通过将适量的锂盐溶解在例如50％乙醇(或其他C_1-3链烷醇，例如，异丙醇)水溶液中而制备。所述第一洗涤液优选地基本上由锂盐、乙醇(或其他C_1-3链烷醇，例如，异丙醇)和水组成，并且更优选地由锂盐、乙醇(或其他C_1-3链烷醇，例如，异丙醇)和水组成。我们已经发现锂盐(优选氯化锂)和乙醇(或其他C_1-3链烷醇，例如，异丙醇)的组合作为第一洗涤液是特别有效的。最优选的是，所述第一洗涤液包含在50％乙醇(或其他C_1-3链烷醇，例如，异丙醇)水溶液中浓度为约400mM-800mM(例如，约400mM或约800mM)的氯化锂。

如果分离工序在离心管中进行，那么将所述第一洗涤液添加到所述离心管中，然后将所述离心管离心使得所述第一洗涤液通过所述过滤器，并且去除至少一些残留的杂质以用于将其收集在上清液中，然后将所述上清液弃掉。

然后使用第二洗涤液实施第二且通常是最后的洗涤步骤，所述第二洗涤液包含至少80体积％的乙醇或其他C_1-3链烷醇(例如，异丙醇)，如果存在余量的话，余量为水。所述第二洗涤液优选地包含(或基本上由其组成或由其组成)约90体积％的乙醇或其他C_1-3链烷醇(例如，异丙醇)。

在使用离心管实施所述方法的情形中，将第二洗涤液添加到离心管中，然后将所述离心管离心以迫使第二洗涤液通过过滤器并且去除残留的杂质以用于将其收集在上清液中，然后将所述上清液弃掉。

在该阶段，需要的包含DNA的核酸以基本上纯的形式固定在固体载体上，并且可以用洗脱溶液洗脱下来。所述洗脱溶液可以包含(基本上由其组成或由其组成)EDTA或其盐的缓冲溶液。一种特别适用的洗脱溶液包含浓度为约10mM的Tris-HCl、浓度为约0.5mM的EDTA二钠盐二水合物，该溶液具有9的pH。

在本发明的方法用包含过滤器的离心柱实施的情形中(所述包含DNA的核酸固定在所述过滤器上)，可以将洗脱溶液添加到所述离心柱中，然后离心，使得所述洗脱溶液将包含DNA的核酸从所述固体载体上洗脱下来以用于收集。

然后，可以将收集的包含DNA的核酸按照需要进行进一步的分析。

如上文所示，本发明的方法优选地使用离心管实施。进行本发明的方法的典型方案在下文列出：

至此，已经特别关于分离包含DNA的核酸的方法和用于所述方法的溶液的组合物描述了本发明。本发明进一步提供可以用于实施所述方法以得到包含DNA的核酸的试剂盒。

根据本发明另一个(第三)方面，提供用于从细胞提取基因组DNA的试剂盒，所述试剂盒包括下述组合：

(i)水溶液，所述水溶液包含下述、基本上由下述组成或由下述组成：水，浓度为0.7-0.9摩尔/升的氯化锂，浓度为5-15mM的EDTA或其钠盐和0.9-1.1重量％的SDS，

(ii)胍盐的水溶液(优选约2M的储备浓缩液，其350μl可以用于1050μl的终体积)，

(iii)任选地，但是优选乙醇或其他C_1-3链烷醇(例如，异丙醇)，

(iv)任选地，但是优选第一洗涤液，所述第一洗涤液包含浓度为0.3-0.6M的氯化锂，所述第一液体包含量为45体积％-55体积％的乙醇或其他C_1-3链烷醇(例如，异丙醇)，

(v)任选地，但是优选第二洗涤液，所述第二洗涤液包含至少80重量％的乙醇或其他C_1-3链烷醇(例如，异丙醇)，如果存在余量的话，余量为水，

(vi)任选地，但是优选洗脱缓冲液，和

(vii)离心柱，所述离心柱具有用于固定包含DNA的核酸的过滤器。

本发明第三方面的试剂盒包括至少(i)、(ii)和(vii)。其他试剂可以分别由使用者提供。然而，为了便利，所述试剂盒优选地还包括至少第一洗涤液。另外，所述试剂盒优选地还包括至少洗脱缓冲液。另外，所述试剂盒优选地还包括至少第二洗涤液。另外，所述试剂盒优选地还包括乙醇或其他C_1-3链烷醇(例如，异丙醇)，其可以是无水乙醇或其他C_1-3链烷醇。所述试剂盒的试剂和成分可以如上文更充分地描述。

在本发明第三方面的试剂盒的改良中，所述改良的试剂盒可以包括胍盐的乙醇(或其他C_1-3链烷醇)水溶液(即，组合上述(ii)和(iii))。

根据本发明第四方面，提供用于从细胞提取包含DNA的基因组核酸的试剂盒，所述试剂盒包含下述组合：

(i)水溶液，所述水溶液包含下述、基本上由下述组成或由下述组成：浓度为0.2-0.3摩尔/升的氯化锂，浓度为1-5毫摩尔/升的EDTA或其钠盐，量为0.2-0.4重量％的SDS，具有0.6-0.7M的浓度的胍盐和量为35-45体积％的乙醇或其他C_1-3链烷醇(例如，异丙醇)，

(ii)任选地，但是优选包含浓度为0.3-0.6M的氯化锂的第一洗涤液，所述第一液体包含量为45体积％-55体积％的乙醇，

(iii)任选地，但是优选第二洗涤液，所述第二洗涤液包含至少80重量％的乙醇或其他C_1-3链烷醇(例如，异丙醇)，如果存在余量的话，余量为水，

(iv)任选地，但是优选洗脱缓冲液，和

(v)离心柱，所述离心柱具有用于固定包含DNA的核酸的过滤器。

本发明第四方面的试剂盒包括至少(i)和(v)。其他试剂可以分别由使用者提供。然而，为了便利，所述试剂盒优选地还包括至少第一洗涤液。另外，所述试剂盒优选地还包括至少洗脱缓冲液。另外，所述试剂盒优选地还包括至少第二洗涤液。所述试剂盒的试剂和成分可以如上文更充分地描述。

根据本发明第五方面，提供水性裂解组合物，其包含下述、由下述组成或基本上由下述组成：包含浓度为0.5-1.0M的锂盐、螯合剂和表面活性剂的水溶液。

现在参考下述非限制性实施例1-5和附图的图1-5举例说明本发明。

在实施例1-4中，参考“方法_A”。这是根据本发明的工序，并且根据下述方案实施。

(a)通过离心使细胞球粒化并且弃掉上清液

(b)加入300μl裂解溶液(800mM LiCl，10mM EDTA二钠盐二水合物，1％SDS)并且通过移液良好混合

(c)在室温下温育20分钟

(d)加入350μl 2M盐酸胍，并且通过倒置管或移液进行混合

(e)加入400μl EtOH，并且通过倒置管或移液进行混合

(f)在离心柱(具有4个POREX F过滤器)中放入600μl并且以8,000rpm离心1分钟

(g)将剩余的裂解物放入离心柱并且以8,000rpm离心1分钟

(h)加入500μl第一洗涤液(400mM LiCl，50％EtOH)并以8,000rpm离心1分钟

(i)加入500μl第二洗涤液(400mM LiCl，90％EtOH)并以14,000rpm离心3分钟

(j)以14,000rpm离心1分钟

(k)加入200μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl，0.5mM EDTA二钠盐二水合物，pH9.0)，并且以8,000rpm洗脱1分钟

实施例1

IVD应用

开发方法_A用于体外诊断(IVD)应用，主要是靶向STI’s，如淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoea)(NG)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(CT)，但不限于STIs或仅是NG和CT。

通过使用检测NG和CT二者的存在的BD Viper系统(数字表示患者鉴别)，用于验证方法_A的IVD潜力的临床样品已被诊断为NG-阳性的、CT-阳性的或针对NG和CT二者为阴性的(NEG)。将大约10ml临床尿液样品在密封的离心桶中以5000x g离心30分钟，并且将球粒用方法_A处理。将DNA提取物用作所用的定量(q)和数字化小滴(digital droplet,dd)PCR实验的模板。在两个实验中，使用方法_A得到的诊断与BD Viper系统的诊断相匹配(表1)。

表1.源自临床尿液样品的方法_A DNA提取物证实使用qPCR和ddPCR的初始诊断。Ct值代表循环阈值qPCR值。

实施例2

提取的DNA回收百分数

将大约10⁸个淋病奈瑟氏球菌(NG)实验室培养细胞根据方法_A处理，以提取包含DNA的核酸，在两个独立的实验中一式三份进行。通过Nanodrop定量法评估每次重复的浓度和纯度。然后，利用每个实验的平均浓度和A260/A280比值计算两个实验的平均值和StDev。发现在评估方法_A的DNA回收潜力方面用作输入值的DNA纯度良好地在接受的标准值之内(表2)。

表2.用作DNA回收百分数评估的样品的浓度产量和纯度。

对于两个实验中的每一个，汇集一式三份。每份汇集物用于2、4和6g DNA的等分试样，将其用于DNA回收百分数实验。更详细地，每份汇集物用于产生两组一式三份试样，随后用于每份汇集物的两个实验。简短来说，纯化的DNA样品通过方法_A提取方案，并且利用Nanodrop提取前和提取后的值计算方法_A系统的DNA回收百分数。利用四个独立实验每一个的平均回收百分数值计算所有实验的平均值和StDev。总之，方法_A DNA回收高(80-90％)，这取决于输入DNA的总浓度。尽管DNA回收百分数随DNA量的增加而减少，但是用于该实验的浓度范围(2-6g)相对于来源于临床样品的预期DNA浓度是良好的(数百纳克；数据未显示)(表3和图1)。

表3.方法_A DNA回收百分数。

实施例3

针对DNeasy的提取的DNA表型、产量和纯度比较

将大约0.5x 10⁸个NG实验室培养细胞根据方法_A处理，以提取包含DNA的核酸，一式四份进行，比较方法_A(20分钟裂解)与DNeasy(1小时裂解)(使用方案的革兰氏阴性菌提取部分)。选择DNeasy作为比较标准，是因为其被视为是市场上最佳产量的DNA提取试剂盒。通过琼脂糖凝胶电泳判断，使用两种方法提取的DNA产生非常相似的表型(图2)。另外，方法_A产生比DNeasy更大产量的较低分子量DNA种类。纯度(A260/A280)和产量通过Nanodrop定量法评估(表4)。方法_A的更多读数可以主要通过较低分子量条带的数量的差异来解释。根据菌株供应商：NCTC(Public Health England)，凝胶上底部的两个条带是NG的隐蔽性质粒及其超螺旋衍生物。因此，方法_A系统在分离细菌质粒方法特别有效。细菌质粒是非常重要的诊断靶标，即，在血清变型之间是保守的NG抗生素抗性、和沙眼衣原体(CT)隐蔽性质粒。另外，质粒编码的抗微生物抗性是多种细菌物种的广泛表型——例如，参见P.M.Bennett作为作者的题目为“Plasmid Encoding Antibiotic Resistance:andTransfer of Antibiotic Resistance Genes in Bacteria(质粒编码的抗生素抗性：以及抗生素抗性基因在细菌中的转移)”的论文(British Journal of Pharmacology(2008)153，S347-S357)。

表4.方法_A和商业DNeasy之间的DNA产量和纯度比较。

实施例4

灵敏性

为了检测方法_A的灵敏性，将NG实验室培养细胞在300,000个HeLa上皮细胞的背景下滴定，这是用于真实尿液样品的非常大量的有核细胞(预计每ml尿液有～7000个人有核细胞)。滴定通过将NG细胞从巧克力琼脂平板上(过夜(O/N)NG培养物)刮下然后将细菌悬浮在1x PBS中而进行。一式四份制备细菌储液的1/100、1/1000、1/10,000、1/100,000和1/1,000,000滴定液，并且与HeLa细胞一起离心，由此将300,000个HeLa细胞与不同数量的NG细胞掺加在一起。将两份重复物用于提取DNA，另外两份在巧克力琼脂平板上生长过夜(O/N)，用于总存活物计数(TVC)。将5 1每种提取物(200 1洗脱物的总提取物)用作PCR反应的模板(NG特异性引物)。将3 1扩增子在2％琼脂糖凝胶上运行(图3)。琼脂糖凝胶电泳不能用于PCR扩增输出物的可靠定量，因此利用TVC值与-外切核酸酶测定的组合(如在PCT专利申请号PCT/GB2015/052561中所公开的)计算存活的NG细胞的数量，将存活的NG细胞针对每个稀释度裂解并且将其与可定量的测定输出值关联。由于对于大部分稀释液，巧克力琼脂平板都被NG细胞菌苔覆盖，仅对1/1,000,000平板和1/100,000稀释度平板计数，并且基于这些计数，外推关于其余稀释度的细胞数量。1/1,000,000和1/100,000稀释度分别产生～30和300个NG细胞的平均数，由此利用这些值来外推关于其余的稀释度的细胞数量。

另外，-外切核酸酶测定是高度特异性的等温扩增酶学测定，其可以接受PCR扩增子作为分析物。该测定的输出直接与分析物的初始量成比例，如通过对荧光平板读取仪的实时读数所监测的。由于其高特异性，定量仅与靶序列相关，而不与非特异性的扩增序列、引物二聚体等相关。以该具体的测定，查询扩增子中可能存在的NG保守区(图4)。在37C温育30分钟后，在平板读取仪上读取RFU值，从所有样品中减去背景荧光(空白PCR样品)。总之，方法_A系统可以用于针对高背景的人有核细胞从数十个至数百个(约～30至300个的较低灵敏度)细菌细胞提取可进行PCR的DNA。

实施例5

本实施例使用下述工序(“方法_B”)来从球粒化的细胞提取包含DNA的核酸。

1.向球粒中加入300μL裂解溶液(0.8M LiCl，10mM EDTA，1％SDS)并彻底移液。

2.加入20μL蛋白酶K(20mg/mL储备溶液)并涡旋5秒。

3.在56℃温育20分钟。

4.加入350μL(2M盐酸胍)并涡旋5秒。

5.加入400μL乙醇并涡旋5秒。

6.将600μL得到的溶液加入到离心柱中。

7.以8,000-11,000rpm离心1分钟。

8.弃掉流过液。

9.将剩余的样品加入到离心柱中。

10.以8,000-11,000rpm离心1分钟。

11.弃掉流过液。

12.向离心柱中加入500μL第一洗涤液(在50％乙醇中的0.8M LiCl)。

13.以8,000rpm离心1分钟。

14.弃掉流过液。

15.向离心柱中加入500μL第二洗涤液(90％乙醇)。

16.以14,000rpm离心3分钟。

17.弃掉流过液。

18.将离心柱以14,000rpm离心1分钟。

19.弃掉流过液。

20.向离心柱中加入100-200μL洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH9.0)。

21.在室温下温育1分钟。

22.以8,000rpm洗脱1分钟，洗脱到1.5mL Eppendorf管中。

上样速率可以根据样品密度而变化(8000-11000rpm)。

EB洗脱体积可以根据提取物需要被怎样浓缩而变化(100-200μL)。

利用方法_B从10⁹个大肠杆菌(Escherichia coli)细胞中提取包含DNA的核酸，并且将5μl提取物与Hind III梯一起上样到1％溴乙啶琼脂糖凝胶上。结果显示在图5中。所有的重复都显示出高分子量基因组DNA条带以及典型的RNA表型。

还将2ml提取物通过nanodrop分光光度法定量，结果显示在下表5中。

重复数	核酸浓度(ng/μl)	A260/A280	A260/A230
				1	179.5	2.06	2.28
2	95.5	2.12	2.71
				3	107.7	2.04	2.23

表5

附录

本发明的各个实施方案限定在下述段落中。

1.从生物材料分离包含DNA的核酸的方法，所述方法包括下述步骤：

(iii)将所述固体载体与液体分离，

(iv)用包含浓度为0.05-1M的锂的第一洗涤液处理所述固体载体，所述第一洗涤溶液包含20体积％-90体积％的溶解的C_1-3链烷醇，

(v)将所述固体载体与所述第一洗涤液分离，

(vii)将所述固体载体与所述第二洗涤溶液分离，和

(viii)从所述固体载体上洗脱包含DNA的核酸。

2.如实施方案1定义的方法，其中所述裂解溶液包含浓度为0.1-0.9M的锂。

3.如实施方案2定义的方法，其中所述裂解溶液包含浓度为0.2-0.9M的锂。

4.如实施方案1-3中任一项定义的方法，其中所述裂解溶液包含浓度为1-20mM的螯合剂。

5.如实施方案1-4中任一项定义的方法，其中所述表面活性剂是阴离子表面活性剂。

6.如实施方案5定义的方法，其中所述阴离子表面活性剂以0.05-2.5重量％的量存在于所述裂解溶液中。

7.如实施方案6定义的方法，其中所述阴离子表面活性剂以0.1-1.5重量％的量存在于所述裂解溶液中。

8.如实施方案1-7中任一项定义的方法，其中所述裂解溶液基本上由水、锂盐、所述离液剂和所述螯合剂组成。

9.如实施方案1-8中任一项定义的方法，其中所述裂解溶液由水、锂盐、所述离液剂和所述螯合剂组成。

10.如实施方案8或9定义的方法，其中所述裂解溶液包含浓度为0.7-0.9M的锂。

11.如实施方案8-10中任一项定义的方法，其中所述裂解溶液包含浓度为1-20mM的螯合剂。

12.如实施方案8-11中任一项定义的方法，其中所述裂解溶液包含量为0.8-1.2重量％、优选约0.9-1.1重量％、最优选约1重量％的表面活性剂。

13.如实施方案1-12中任一项定义的方法，其中所述离液剂以0.1-1M、优选0.5-0.9M并且更优选0.6-0.7M的浓度存在。

14.如实施方案1-13中任一项定义的方法，其中在(ii)中，所述链烷醇以30-50体积％、优选35体积％-45体积％并且更优选35体积％-40体积％的量存在。

15.如实施方案1-7中任一项定义的方法，其中所述裂解溶液基本上由水、锂盐、所述螯合剂、所述表面活性剂、所述离液剂和所述链烷醇组成。

16.如实施方案1-7中任一项定义的方法，其中所述裂解溶液由水、锂盐、所述螯合剂、所述表面活性剂、所述离液剂和所述链烷醇组成。

17.如实施方案15或16定义的方法，其中所述锂以0.1-0.4M、优选0.2-0.3M的浓度存在于所述裂解溶液中。

18.如实施方案15-17中任一项定义的方法，其中所述表面活性剂是阴离子表面活性剂，并且以0.1-0.5重量％、优选0.2-0.4重量％的量存在于所述裂解溶液中。

19.如实施方案15-18中任一项定义的方法，其中所述螯合剂以1-5mM的浓度存在于所述裂解溶液中。

20.如实施方案15-19中任一项定义的方法，其中所述离液剂以0.1-1M、优选0.5-0.9M并且更优选0.6-0.7M的浓度存在。

21.如实施方案15-20中任一项定义的方法，其中在(ii)中，所述链烷醇以30-50体积％、优选35体积％-45体积％并且更优选35体积％-40体积％的量存在。

22.如实施方案1-21中任一项定义的方法，其中所述裂解溶液中的锂由卤化锂提供。

23.如实施方案22定义的方法，其中所述裂解溶液中的卤化锂是氯化锂。

24.如实施方案1-23中任一项定义的方法，其中所述离液剂由胍盐提供。

25.如实施方案24定义的方法，其中所述胍盐是胍氯化物。

26.如实施方案1-25中任一项定义的方法，其中所述裂解溶液中的螯合剂是EDTA或其碱金属盐。

27.如实施方案1-26中任一项定义的方法，其中用于(ii)的所述链烷醇是乙醇。

28.如实施方案1-28中任一项定义的方法，其中所述表面活性剂是SDS。

29.如实施方案1-28中任一项定义的方法，其中所述第一洗涤液基本上由水和所述第一洗涤液的所述锂与所述链烷醇组成。

30.如实施方案29定义的方法，其中所述第一洗涤液由水和所述第一洗涤液的所述锂与所述链烷醇组成。

31.如实施方案29或30定义的方法，其中所述锂以0.1-0.8M的浓度存在于所述第一洗涤液中。

32.如实施方案31定义的方法，其中所述锂以0.3-0.6M、优选约0.4M、或0.6M-1M、优选约0.4-0.8M的浓度存在于所述第一洗涤液中。

33.如实施方案29-32中任一项定义的方法，其中所述链烷醇以40-60体积％、优选45-55体积％并且更优选约50体积％的量存在于所述第一洗涤液中。

34.如实施方案29-33中任一项定义的方法，其中所述第一洗涤液中的锂由卤化锂提供。

35.如实施方案34定义的方法，其中所述第一洗涤液中的卤化锂是氯化锂。

36.如实施方案29-35中任一项定义的方法，其中所述第一洗涤液中的链烷醇是乙醇。

37.如实施方案1-36中任一项定义的方法，其中所述第二洗涤溶液基本上由水和所述第二洗涤溶液的所述链烷醇组成。

38.如实施方案1-36中任一项定义的方法，其中所述第二洗涤溶液由水和所述第二洗涤溶液的所述链烷醇组成。

39.如实施方案37或38定义的方法，其中所述第二洗涤溶液包含80体积％-95体积％的所述第二洗涤液的链烷醇。

40.如实施方案1-39中任一项定义的方法，其中所述第二洗涤液中的所述链烷醇是乙醇。

41.如实施方案1定义的方法，其中所述裂解溶液基本上由水、浓度为0.7-0.9M的氯化锂、浓度为5-15mM的EDTA或其钠盐和0.9-1.1重量％的SDS组成。

42.如实施方案41定义的方法，其中在步骤(ii)中，所述离液剂是浓度为0.6-0.7M的胍氯化物并且所述链烷醇是以液体的35-40体积％的量存在的乙醇。

43.如实施方案1定义的方法，其中所述裂解溶液基本上由水、浓度为0.2-0.3M的氯化锂、浓度为1-5mM的EDTA或其钠盐、浓度为0.6-0.7M的胍氯化物、量为0.2-0.4重量％的SDS和35-40体积％的乙醇组成。

44.如实施方案41-43中任一项定义的方法，其中所述第一洗涤液基本上由水、浓度为0.3-0.6M的氯化锂和45体积％-55体积％的乙醇组成。

45.如实施方案41-44中任一项定义的方法，其中所述第二洗涤液基本上由80体积％-95体积％的乙醇和水组成。

46.如实施方案1-45中任一项定义的方法，其中所述固体载体包含二氧化硅。

47.如实施方案1-46中任一项定义的方法，其中步骤(iii)在离心管中实施，其中所述固体载体是过滤器，并且步骤(iii)、(v)、(vii)和(viii)通过离心实施。

48.如实施方案47定义的方法，其中所述过滤器包括硼硅酸盐玻璃纤维。

49.如实施方案48定义的方法，其中在所述离心管中提供多个所述过滤器。

50.如实施方案49定义的方法，其中提供四个过滤器。

51.如实施方案1-50中任一项定义的方法，其自始至终在环境温度下实施。

52.如实施方案1-51中任一项定义的方法，其不经涡旋而实施。

53.如实施方案1-52中任一项定义的方法，其中要从中分离包含DNA的核酸的所述生物材料包括细胞。

54.如实施方案53定义的方法，其中所述细胞是球粒的形式。

55.用于从细胞提取包含DNA的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括下述组合：

(i)水溶液，所述水溶液包含下述、基本上由下述组成或由下述组成：水，浓度为0.05-1.0M的锂，螯合剂，和表面活性剂，

(ii)离液剂(优选胍盐)的溶液，

(iii)任选地，但是优选C_1-3链烷醇，例如，乙醇，

(iv)任选地，但是优选第一洗涤液，所述第一洗涤液包含浓度为0.05-1M的锂和20体积％-90体积％的溶解的C_1-3链烷醇，

(v)任选地，但是优选第二洗涤液，所述第二洗涤液包含至少80体积％的C_1-3链烷醇，优选乙醇，如果存在余量的话，余量为水，

(vi)任选地，但是优选洗脱缓冲液，和

(vii)具有用于固定DNA的过滤器的离心柱。

56.用于从细胞提取包含DNA的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括下述组合：

(i)水溶液，其包含下述、基本上由下述组成、或由下述组成：浓度为0.05-1.0M的锂，螯合剂，表面活性剂，离液剂(例如，胍盐)和溶解的C_1-3链烷醇(优选乙醇)，

(ii)任选地，但是优选第一洗涤液，所述第一洗涤液包含浓度为0.05-1M的锂和20体积％-90体积％的溶解的C_1-3链烷醇，

(iii)任选地，但是优选第二洗涤液，所述第二洗涤液包含至少80体积％的C_1-3链烷醇，优选乙醇，如果存在余量的话，余量为水，

(iv)任选地，但是优选洗脱缓冲液，和

(v)具有用于固定DNA的过滤器的离心柱。

57.实施方案55或56定义的试剂盒，其中所述过滤器包含至少一个硼硅酸盐纤维片。

58.实施方案57定义的试剂盒，其中所述过滤器包括四个硼硅酸盐纤维片。

59.水性裂解组合物，所述水性裂解组合物包含下述、由下述组成或基本上由下述组成：包含浓度为0.5-1.0M的锂盐、螯合剂和表面活性剂的水溶液。

60.实施方案59定义的裂解，其如实施方案2-28中任一项所定义。

Claims

(i)用水溶液实施所述生物材料的裂解，以产生水性的裂解的组合物，所述水溶液包含浓度为0.05-1.0M的锂盐、螯合剂和表面活性剂，

(iii)将所述固体载体与液体分离，

(v)将所述固体载体与所述第一洗涤液分离，

(vii)将所述固体载体与所述第二洗涤溶液分离，和

(viii)从所述固体载体上洗脱DNA。

2.权利要求1所述的方法，其中，在包含浓度为0.05-1.0M的锂盐、螯合剂和表面活性剂的所述水溶液中，所述锂盐的浓度小于1.0M。

3.权利要求2所述的方法，其中，在包含浓度为0.05-1.0M的锂盐、螯合剂和表面活性剂的所述水溶液中，所述锂盐的浓度为0.2-0.9M。

4.权利要求2所述的方法，其中，在包含浓度为0.05-1.0M的锂盐、螯合剂和表面活性剂的所述水溶液中，所述锂盐的浓度为0.2-0.8M。

5.权利要求1所述的方法，其中步骤(i)所述的水溶液基本上由下述组成：水，浓度为0.7-0.9M的氯化锂，浓度为5-15mM的EDTA或其钠盐和0.9-1.1重量％的SDS。

6.权利要求5所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述离液剂是浓度为0.6-0.7M的胍氯化物，并且所述链烷醇是以所述液体的35-40体积％的量存在的乙醇。

7.权利要求1所述的方法，其中步骤(i)所述的水溶液基本上由下述组成：水，浓度为0.2-0.3M的氯化锂，浓度为1-5mM的EDTA或其钠盐，浓度为0.6-0.7M的胍氯化物，量为0.2-0.4重量％的SDS和35-40体积％的乙醇。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤液基本上由下述组成：水，浓度为0.3-0.6M的氯化锂和45体积％-55体积％的乙醇。

9.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤液基本上由下述组成：水，浓度为0.6-1M的氯化锂和45体积％-55体积％的乙醇。

10.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第二洗涤液基本上由80体积％-95体积％的乙醇和水组成。

11.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述固体载体包含二氧化硅。

12.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(iii)在离心管中实施，在所述离心管中，所述固体载体是过滤器，并且步骤(iii)、(v)、(vii)和(viii)通过离心实施。

13.权利要求12所述的方法，其中所述过滤器包括硼硅酸盐玻璃纤维。

14.权利要求13所述的方法，其中在所述离心管中提供多个所述过滤器。

15.权利要求14所述的方法，其中提供四个过滤器。

16.权利要求1-7中任一项所述的方法，所述方法自始至终在环境温度下实施。

17.权利要求1-7中任一项所述的方法，所述方法不经涡旋而实施。

18.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中要从中分离包含DNA的核酸的所述生物材料包括细胞。

19.权利要求18所述的方法，其中所述细胞是球粒的形式。

20.用于从细胞提取包含DNA的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括下述组合：

(i)水溶液，所述水溶液包含下述、基本上由下述组成、或由下述组成：水，浓度为0.7-0.9摩尔/升的氯化锂，浓度为5-15mM的EDTA或其钠盐，和0.9-1.1重量％的SDS，

(ii)胍盐的水溶液，

(iii)乙醇，

(iv)包含浓度为0.3-0.6M的氯化锂的第一洗涤液，所述第一液体包含量为45体积％-55体积％的乙醇，

(v)第二洗涤液，所述第二洗涤液包含至少80体积％的乙醇，如果存在余量的话，余量为水，

(vi)洗脱缓冲液，和

(vii)具有用于固定DNA的过滤器的离心柱。

21.权利要求20所述的试剂盒，其中在所述胍盐的水溶液中所述胍盐的浓度为2M。

22.用于从细胞提取包含DNA的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括下述组合：

(i)水溶液，所述水溶液包含下述、基本上由下述组成、或由下述组成：浓度为0.2-0.3摩尔/升的氯化锂，浓度为1-5毫摩尔/升的EDTA或其钠盐，量为0.2-0.4重量％的SDS，具有0.6-0.7M的浓度的胍盐，和量为35-45体积％的乙醇，

(ii)包含浓度为0.3-0.6M的氯化锂的第一洗涤液，所述第一液体包含量为45体积％-55体积％的乙醇，

(iii)第二洗涤液，所述第二洗涤液包含至少80体积％的乙醇，如果存在余量的话，余量为水，

(iv)洗脱缓冲液，和

(v)具有用于固定DNA的过滤器的离心柱。

23.权利要求20或22所述的试剂盒，其中所述过滤器包含至少一个硼硅酸盐纤维片。

24.权利要求23所述的试剂盒，其中所述过滤器包含四个硼硅酸盐纤维片。