KR101590544B1

KR101590544B1 - 핵산 분리법 및 그를 위한 키트

Info

Publication number: KR101590544B1
Application number: KR1020127020774A
Authority: KR
Inventors: 파니 쿠마르 풀렐라; 물라카푸라트 나라야난 마노즈; 산토쉬 쿠마르 간다발라; 밋첼 프리탐 핀토; 챤드라세카르 바스카란 나이르; 필라리세티 벤카타 수바라오
Original assignee: 빅텍 프라이빗 리미티드
Priority date: 2010-01-07
Filing date: 2011-01-06
Publication date: 2016-02-18
Also published as: EP2521780A1; CN102725407B; US8986976B2; HUE034870T2; PL2521780T3; SG182372A1; PT2521780T; SI2521780T1; NO2521780T3; DK2521780T3; ES2652335T3; EP2521780A4; HRP20171823T1; EP2521780B1; CN102725407A; RS56636B1; LT2521780T; WO2011083429A1; JP2013516186A; EA022842B1

Abstract

본 발명은 코튼을 이용하여 고체 또는 액체 샘플로부터 천연 또는 인공 핵산 예컨대 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 펩타이드 핵산(PNA)를 분리하는 방법을 제공한다. 충전된 코튼은 핵산을 함유하는 용액이 이 코튼을 통과하면, 결합에 최적인 매질 중에서 용액 중의 핵산이 코튼에 결합하게 된다. 결합된 핵산이 물을 함유하는 액체에 의한 다중 세척을 견질 수 있도록 코튼에 핵산이 결합되어 있고 수성 완충액 중에서 용출되며, 용출된 핵산은 PCR 또는 기타 생화학적 또는 분자생물학적 필요에 따른 시험에 바로 사용할 수 있다.

Description

핵산 분리법 및 그를 위한 키트{A METHOD FOR ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS AND A KIT THEREOF}

본 발명은 핵산의 분리 및 정제에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 코튼(솜: cotton) 또는 그의 유도체를 이용한 핵산의 분리 및 정제를 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.

핵산 추출 프로토콜은 크게 실리카계 프로토콜과 비실리카계 프로토콜로 나눌 수 있다. 기존의 실리카계 및 비실리카계 프로토콜은 비핵산 성분을 제거하는데 수세를 이용할 수 없기 때문에 그 안에 알코올이 몇 퍼센트 함유된 물에 의한 세척이 요구된다. 그러나 용출된 핵산 용액 중에 알코올이 존재할 경우 폴리머라제 연쇄반응 (PCR: polymerase chain reaction)이 억제되고, 이에 따라, 상기 두 가지 프로토콜 모두 고속 스피닝을 필요로 하거나 또는 잔류 알코올을 제거하기 위한 다른 방법 및 실온 또는 고온 수성 완충액으로 핵산을 용출할 것을 필요로 한다. 몇몇 경우에 있어서, 이들 두가지 프로토콜은 모두 폴리에틸렌 글리콜 또는 수성 알코올 세척과 함께 높은 염분 농도를 필요로 한다. 고농도 염과 수성 알코올의 사용으로 인하여, 핵산이 용출되기 전에 이들 성분들을 완벽히 제거할 것이 요구되거나 또는 원심분리 등이 요구된다는 제약이 가해진다. 따라서, 기존의 실리카계 또는 비실리카계 프로토콜 중 어느 것도 현장에서(POC: point of care) 사용할 수 없는데 이는 원심분리가 에어로졸을 발생시키기 때문이다. 문헌상으로 보고된 비실리카계 프로토콜 중 몇몇은 다음과 같다:

US 7264927: 이 문헌은 핵산을 완충액 또는 탈이온수 중에서 결합시키고 마지막으로 용출하기 위하여, 고염 농도 및 폴리알킬렌 글리콜을 사용하는, 셀룰로스 또는 셀룰로스 페이퍼의 사용을 설명하고 있다.

US 6084091: 이 문헌은 핵산 분리를 위한 셀룰로스 가루 (감자 전분같은)를 사용하는 방법을 설명하고 있다.

US 5804684: 이 문헌은 핵산 추출을 위하여 여과지를 사용하는 방법을 개시하고 있는데, 이 방법에서는 여과지를 지지하기 위한 배리어 또는 필터로서 부드러운 티슈 페이퍼 또는 코튼 조각 등을 이용하여 플라스틱 팁과 같은 물질 내에 여과지를 내장하는 방법이 설명되어 있다.

전술한 모든 방법들은 최종 핵산 분리를 위한 시중에서 구입가능한 실리카 컬럼을 이용하거나 또는 보다 긴 샘플 프로세싱 시간(30분 이상)을 필요로 하거나 원심분리 등을 이용하거나 또는 매트릭스 세척 동안 고농도로 염분을 사용하는 것을 필요로 한다. 셀룰로스계 핵산 추출법 중 어느 것도 핵산을 100% 수성 완충액 또는 물을 이용하여 추출하지 않으며 보통은 알코올이나 폴리올을 몇 퍼센트 함유하는 화합물을 이용한다.

따라서, 본 발명은 (a) 핵산을 함유하는 샘플에 (세포) 용해 완충액 (Lysis Buffer)를 첨가하여 세포 용해된 용액을 얻거나, (b) 용해 완충액을 결합 완충액과 조합하여 샘플에 첨가함으로써 세포 용해된 용액을 얻고, (c) 결합 완충액을 단계 (a)의 용액에 첨가하여 핵산을 매트릭스에 결합시키거나 또는 단계 (b)의 용액을 매트릭스에 직접 결합시키고 (d) 매트릭스에 결합된 핵산을 세척 및 용출시켜 핵산을 분리 및 정제하는, 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법; 및 샘플로부터 핵산을 분리하기 위한 키트에 관한 것으로, 여기서 상기 키트는 매트릭스와 완충액을 포함한여 이루어지는 것이다.

본 발명의 일부 형태에 관한 첨부된 도면을 참조로 본 발명을 이하에 더욱 상세히 설명한다. 본 발명의 범위가 발명의 상세한 설명, 도면 및 청구범위에 설명된 예시적인 구체예들로 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 제시된 정신과 범위를 벗어남이 없이, 다른 구체예도 이용가능하며, 다른 변화도 가해질 수 있다. 본 발명의 상세한 설명과 첨부된 도면에 일반적으로 제되된 측면들이 광범위하게 응용될 수 있고, 이들 모두 본 발명의 일부를 이루고 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 개시 내용은 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

(a) 용해 완충액(용해 완충액)을 핵산을 함유하는 샘플에 첨가하여 용해된 용액(lysed solution)을 얻는 단계; 또는

(b) 용해 완충액을 결합 완충액과 조합하여 샘플에 첨가하여 용해된 용액을 얻는 단계;

(c) 단계 (a)의 용액에 결합 완충액을 첨가하여 핵산을 매트릭스에 결합시키거나 단계 (b)의 용액을 매트릭스에 직접 결합시키는 단계; 및

(d) 매트릭스 결합된 핵산을 세척 및 용출시켜 핵산을 분리 및 정제하는 단계

를 포함하여 이루어진다.

본 발명의 한가지 구체예에서, 핵산은 DNA, RNA 및 PNA를 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 샘플은 생물학적 또는 비생물학적 샘플이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 가래, 혈청, 타액 또는 조직 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되고 비생물학적 샘플은 화학적으로 합성된 PNA를 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 용해 완충액은 구아니딘 티오시아네이트, 구아니딘 염산염, EDTA, 트리스, 세제, 폴리올, IA 양이온을 함유하는 또는 일가염 또는 IIA 양이온을 함유하는 이가염 및 단백질 분해 효소 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되고 임의로 우레아가 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, EDTA는 약 10 mM 내지 약 300 mM, 좋기로는 약 100 mM의 농도 범위로 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 구아니딘 티오시아네이트 또는 구아니딘 염산염은 약 0.1 M 내지 약 7 M의 농도로 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 우레아는 약 0.01 M 내지 약 7 M의 농도 범위로 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 트리스(Tris)는 약 0.01 mM 내지 약 100 mM, 좋기로는 약 20 mM의 농도 범위로 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 폴리올은 약 0.01% 내지 약 30% (v/v)의 농도 범위로 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 세제는 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 도데실 설페이트, Triton X-100, Tween 20 및 NP-40 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며 여기서 단백질 분해 효소는 프로테이나제 K이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 결합 완충액은 물이며 임의로 폴리올 또는 비폴리올(non-polyol)이 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 폴리올은 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 수용성 폴리올 화합물을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 비폴리올은 산, 아민, 알코올, 페놀, 아미드 또는 에스테르를 관능기들 중 하나로서 갖는 수용성 액체, 또는 메탄올, 에탄올, 프로판올로 이루어진 알코올; 또는 그의 조합을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 세척 및 용출은 각각 세척 완충액과 용출 완충액을 이용하여 수행된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 세척은 약 1% 내지 약 99% (v/v), 좋기로는 약 30% 내지 약 70% (v/v) 및 임의로 약 50% (v/v)의 수성 알코올을 포함하는 세척 완충액을 이용하여 1차 세척한 다음 100% 물을 함유하는 세척 완충액으로 다중 세척하는 것을 포함하여 이루어진다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 수성 알코올은 메탄올, n-프로판올, 2-프로판올, 글리세롤, PEG, PPG, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 물은 탈이온수, DNase 자유수, RNase 자유수, MilliQ 워터, 여과된 물, 수돗물 및 지하수 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 세척 완충액은 임의로 MgCl₂, CaCl₂, NaCl 및 KCl을 포함하는 군으로부터 선택된 염을 임의로 포함하거나 또는 완충액은 pH 범위가 약 5 내지 약 12인 바이신(bicine), 트리신(tricine), Tris, HEPES, CHAPS, 포스페이트, 아세테이트, MES, 피리딘, 피페라진, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, 보레이트, TAPS, CHES, CAPS, 에탄올아민 및 피페리딘을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 용출 완충액은 온도가 약 45℃ 내지 90℃인 온수와 약 8 내지 약 11의 pH 범위를 갖는 완충액을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 물은 탈이온수, DNase 자유수, RNase 자유수, MilliQ 워터, 여과된 물, 수돗물 및 지하수 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 완충액은 pH가 약 5 내지 약 12이거나 pKa가 약 7 내지 약 10의 범위인 바이신, 트리신, Tris, HEPES, CHAPS, 포스페이트, 아세테이트, MES, 피리딘, 피페라진, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, 보레이트, TAPS, CHES, CAPS, 에탄올아민 및 피페리딘 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 염은 MgCl₂, CaCl₂, NaCl 및 KCl 또는 이들의 조합으로부터 선택되며 그 농도는 약 0.01 mM 내지 약 100 mM, 좋기로는 약 5mM 내지 약 50 mM의 범위이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 매트릭스는 코튼, 코튼 유도체 및 코튼의 블렌드를 갖는 합성 폴리머 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 코튼은 천연 코튼, 탈지면, 임상등급 코튼, 시판되는 코튼, 스펀 코튼(spun 코튼), 수세 코튼, 산 또는 염기 세척 코튼, 오토클라브 처리된 코튼, pH가 약 1 내지 약 14 범위인 완충액 처리된 코튼, 염 용액으로 처리된 코튼, 유기 용매로 처리된 코튼, 압착 코튼 및 가공된 코튼을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명은 샘플로부터 핵산을 분리하기 위한 키트에 관한 것으로 상기 키트는 매트릭스와 버퍼를 포함하여 이루어지는 것이다.

본 발명의 한가지 구체예에서, 매트릭스는 코튼, 코튼 유도체 및 코튼의 블렌드를 갖는 합성 폴리머 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 완충액은 전술한 바와 같은 용해 완충액, 결합 완충액, 세척 완충액 및 용출 완충액을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 샘플은 생물학적 또는 비생물학적 샘플을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 가래, 혈청, 타액 또는 조직 추출물을 포함하는 군으로부터 선택되고 비생물학적 샘플은 화학적으로 합성된 PNA를 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명은 코튼을 이용하여 핵산 추출 시스템을 구축하는 방법에 관한 것이다. 핵산 추출물 중에 언급된 모든 용액이 코튼과 상호반응하도록 하는 방식으로 코튼을 내장한다.

본 발명에서 사용된 다양한 물질들은 다음에 설명되는 바와 같다:

코튼, 코튼 유도체, 코튼 및 코튼 유사 물질을 함유하는 물질: 솜털같은 코튼을 목화 식물의 면실 주변의 볼(boll: 면화의 씨앗이 든 꼬투리)로서 수득한다. 핵산 추출에 있어서 코튼은 매트릭스로서 바람직한 물질이다. 코튼의 형태는 천연 코튼, 탈지면, 임상등급 코튼, 시판되는 코튼, 스펀 코튼, 수세 코튼, 산 또는 염기 세척 코튼, 오토클라브 처리된 코튼, 완충액 (pH 1 - 14) 처리된 코튼, 염 용액으로 처리된 코튼, 유기 용매로 처리된 코튼, 압착 코튼 및 가공된 코튼인 것이 적절히 이용될 수 있다. 여하한 종류의 코튼 직물 또는 코튼이나 코튼 함유 물질의 혼합물과의 합성 폴리머 또는 코튼의 여러 형태들을 핵산 추출에 사용할 수 있다. 울, 실크, 캐시미어 등과 같이 코튼과 유사한 섬유 역할을 하는 재료들 역시도 본 발명에 사용될 수 있다. 유기농 생산된 코튼 또는 살충제나 농약을 사용하여 생산된 코튼 역시도 본 발명의 일부를 구성한다. 세계 여러 곳에서 생산된 코튼은 그 조성, 구조, 색상 및 품질 측면에서 약간씩 상이할 수 있으나, 전세계 전역에서 재배된 모든 코튼이 본 발명에 포함된다. 코튼 유래의 모든 제품 또는 제조시 코튼을 사용하는 물질 역시 본 발명에 일부를 구성하며 핵산 추출에 이용될 수 있다.

용해 완충액 (Lysis Buffer): 용해 완충액은 핵산을 코튼에 결합시킬 수 있도록 하고, 여러 종류의 샘플들(혈액, 가래, 혈청, 타액, 조직 추출물 등)을 핸들링할 수 있도록 고농도의 EDTA를 함유한다. 염들의 구성을 달리할 수 있으며 EDTA의 사용은 일례에 지나지 않으므로 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아님을 이해하여야 한다. 전형적으로, 음하전된 고농도의 분자는 용액 중에서 핵산을 밀어낼 수 있으며 코튼에 대한 결합을 증강시킨다. 용해 완충액은 구아니딘 티오시아네이트 또는 구아니딘 염산염, EDTA, Tris, 세제 및 임의로 우레아, 폴리올, IA족 양이온 함유 일가 염 및/또는 IIA족 양이온 함유 이가 염, 및 프로테이나제 K 또는 단백질 분해 효소를 포함한다. 구아니딘 티오시아네이트 또는 구아니딘 염산염의 농도는 0.1 내지 7 M일 수 있다. 구아니딘 티오시아네이트는 몇몇 적용의 경우 구아니딘 염산염 또는 우레아로 대체될 수 있고 그의 농도 역시 0.1 내지 7 M 사이일 수 있다. 우레아는 단백질을 변성시키는데 사용되며 구아니딘 염의 기능을 보완하는 역할을 하고 그 농도는 0 내지 7 M이다. 일반적으로, 대다수의 문헌에서 혈액의 용해 프로토콜은 EDTA를 1-20 mM로 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 용해 완충액은 EDTA를 이와 전혀 다른 양으로, 좋기로는 10-300 mM, 더욱 좋기로는 약 100 mM 범위로 사용한다. EDTA 농도는 RNA 및 PNA와 같은 다른 핵산에 대하여 인위적으로 조작될 수 있으나, 일반적으로 EDTA 농도가 높을수록 PCR 및 RT-PCR의 시그널 강도와 사이클 시간(Ct: cycle times)을 향상시키는데 도움이 되는 것으로 밝혀졌다. 상기한 현저히 다른 농도의 EDTA는 헤모글로빈 (혈액의 경우)에 존재하는 철을 포획하여, DNase & RNase 활성을 방지하며, 핵산이 코튼에 결합할 수 있는 고도로 네가티브한 분위기를 조성하는데 도움을 준다. 이것의 중요한 측면은, 이 구체예가 매트릭스에 대한 DNA 결합을 염기성 조건 하에서 실시한 첫번째 예라는 것이다. 용액의 결합 pH는 코튼에 대한 DNA/RNA 결합에 유의적인 효과를 미친다는 것이 중요하며, 따라서, 8-10의 pH가 결합에 바람직하지만, 7.1-12의 pH도 이용가능하다. RNase 활성을 탈활성화시키기 위하여 마그네슘 클로라이드가 일반적으로 사용되며, 따라서, DNA 용해 프로토콜에서, 이것은 부재하거나 최소량으로 (20 mM의 농도로) 사용된다. 또한, EDTA의 사용 역시 RNase를 탈활성화시키며 MgCl2의 사용은 반드시 필요한 것은 아니고 어떠한 핵산 응용에서건 임의적이다. Tris는 용해에 사용가능한 완충액이며, 본 발명자들은 0-100 mM의 농도로 사용가능하고 일반적으로 약 20 mM이 최적임을 발견하였다. 본 발명의 용해 완충액애서, Tris는 용해를 돕기 위한 역할을 하며, 다른 적절한 완충액에 의해 대체될 수 있음을 인식하여야 한다. 결합 완충액 중 폴리올의 사용은 절단 및 변성된 단백질의 용해도를 증가시키기 위함이다. 결합 완충액 중의 폴리올 백분율은 0-30% (v/v)이다. 몇가지 적용예에서는 별도의 결합 완충액을 첨가하지 않고, 용해 후, 핵산을 매트릭스에 직접 결합시켰다. 이들 모든 완충액들은 일반적으로 탈이온화수에서 만들어지며, RNA 적용의 경우, 물을 DEPC로 처리하여 오토클라브 처리할 수 있다. 혈액, 가래, 타액, 정액 등에 대한 전술한 용해 완충액의 첨가에 앞서서 프로테이나제 K 분해를 수행할 수 있으며 임의로 용해 완충액을 이용하여 수행할 수 있다. 프로테이나제 K 처리는 전술한 용해 완충액에서 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이러한 처리는 핵산을 함유하는 모든 종류의 액체 샘플에 있어서 용해 완충액 첨가 전에 실시하거나 또는 용해 완충액 첨가와 함께 실시할 수 있다. 용해 완충액 중에 사용된 세제는 SLS (소듐 라우릴 설페이트), SDS, Triton X-100, Tween 20, 또는 그 밖에 기술 분야에 알려져 있는 기타의 이온계, 비이온계 세제를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

결합 완충액 : 핵산과 코튼과의 결합을 개시하기 위하여 용해(lysis) 후에 첨가되는 결합 완충액은 그 조성과 pH 측면에서 매우 가변적인 것으로 밝혀졌다. 결합 완충액은 너무나 가변적이기 때문에, 단지 물만 첨가해도 용해 완충액 중의 염의 농도를 희석하는데 충분하며 코튼에 대한 핵산의 우수한 결합이 관찰되었다. 용해가 일어나는 동안 또는 결합 완충액 첨가 후 코튼을 첨가하여 주어진 샘플로부터 핵산을 추출할 수 있다. 실무성의 목적에서, 결합 완충액 조성물의 pH 범위는 4 내지 12, 좋기로는 7-10의 범위일 수 있다. 혈액, 가래 또는 타액과 같은 복합 샘플의 경우, 결합 완충액은 PEG, 글리세롤, PPG, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등과 같은 수용성 폴리올 화합물을 일정 백분율로 함유할 수 있다. PEG 및 PPG의 분자량은 200-200,000의 범위일 수 있고, 모든 실질적인 목적에서, 1000 내지 20,000일 수 있다. 결합 완충액 중의 폴리올 화합물의 백분율은 50%(v/v) 이하일 수 있으나, 모든 실질적인 목적상, 1-30% (v/v)가 될 것이다. 폴리올 화합물은 용해된 성분들의 혼화성(miscibility)을 보장하기 위하여 사용되며 프로테이나제 K 용해가 완전할 경우, 폴리올 백분율은 1%까지 저감될 수 있다. 종래기술 분야에 알려진 완충액으로는 바이신, 트리신, Tris, HEPES, CHAPS, 포스페이트, 아세테이트, MES, 피리딘, 피페라진, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, 보레이트, TAPS, CHES, CAPS, 에탄올아민, 피페리딘 등의 pH 5-12, 좋기로는 7-10 범위의 것들을 결합 완충액 제조시 사용할 수 있으며 완충액의 존재가 필수적인 것은 아니지만, 샘플 유형, 샘플 부피, 온도, 용해 완충액의 조성에 따라, 사용되거나 사용되지 않을 수 있다. 만일 완충염(buffering salts)이 사용될 경우, 이들의 농도는 1-200 mM, 좋기로는 1-100 mM, 및 가장 좋기로는 5- 50 mM일 수 있다. 전술한 농도는 결합 용액의 농도이며 용해 완충액에 첨가 후 그 농도는 용해 완충액의 조성에 따라 변할 것이다. 또한, 상기 정의된 pH는 결합 완충액이 제조되었을 때의 pH 이며 용해 완충액에 첨가시, 혼합 용액(용해 완충액 + 결합 완충액)의 pH는 변할 수 있다. 메탄올, 에탄올 및 프로판올과 같은 알코올은 폴리올이 아니지만, 이들 역시도 결합 완충액 제조시 이용가능하다. 일반적으로, 산, 아민, 알코올, 페놀, 아미드, 에스테르 등과 같은 관능기를 관능기들중 하나로서 갖는 수용성 액체를 이용할 수 있다.

세척 완충액 : 세척 완충액은 코튼으로부터 핵산이 아닌 성분, 즉 비핵산 성분들을 선택적으로 세척하는 용액이다. 임상적 샘플이 혈액인 경우, 결합 후, 코튼은 갈색이 될 것이며 색상을 제거하기 위해 세척 완충액 (세척 완충액 1) 중의 에탄올의 백분율을 구하는 것이 도움이 되었다. 특히 제1 세척은 1-99% (v/v), 좋기로는 30-70% (v/v), 더욱 좋기로는 50% (v/v) 에탄올을 함유하는 물 또는 완충액을 이용하여 수행되었다. 필요하다면 비핵산 성분들의 제거를 위하여 에탄올 수용액을 이용한 세척을 수차례 수행할 수 있으며 이는 샘플에 따라 달라진다. 세척 용액 중 에탄올 대신 메탄올, n-프로판올, 2-프로판올, 글리세롤, PEG, PPG, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 기타 수용성 알코올을 사용할 수 있다.

세척 완충액 1과 함께 일가 또는 이가 양이온이 그의 조성으로서 존재할 경우 세척 완충액 2를 사용할 수 있다. 또한 세척 완충액 1 및 2는 동일 조성을 가질 수 있으며 물, 알코올 및 일가 또는 이가 양이온으로 구성될 수 있다. 세척 완충액 1 & 2로 코튼을 세척하는 횟수는 0-10회이며 이상적으로는 1-3회의 범위가 좋다. 그 후의 세척은 대개 탈이온수를 이용하여 수행하며 세척 횟수는 0 내지 10회, 좋기로는 2 내지 5회, 더욱 좋기로는 3-5회이다. 세척 단계에 사용되는 탈이온수는 DNase, RNase 자유수, 또는 MilliQ 워터 또는 여과된 물 또는 수돗물 또는 지하수로 대체될 수 있다. 본 발명자들은 초기 세척에 알코올 수용액을 이용할 경우 비핵산 성분들의 대부분이 제거되고 이어서 수차례 수세 (100% 물)함으로써 잔류 알코올을 제거할 수 있음을 관찰하였다. 얻어진 핵산을 수세함으로써 PCR 억제제가 전혀 없거나 최소량으로 존재하게끔 PCR에 적당한 상태로 준비시킬 수 있다. 세척 완충액은 임의로 MgCl2, CaCl2, NaCl, KCl과 같은 염, 또는 바이신, 트리신, Tris, HEPES, CHAPS, 포스페이트, 아세테이트, MES, 피리딘, 피페라진, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, 보레이트, TAPS, CHES, CAPS, 에탄올아민, 피페리딘 등과 같은 pH 5-12의 완충액을 함유할 수 있다. 완충액이나 염 또는 이들의 조합은 1-1000 mM, 좋기로는 20-200 mM 및 더욱 좋기로는 약 100 mM의 농도로 사용될 수 있다.

용출 완충액 (Elution Buffer): 따뜻한(45-99℃) 완충 수용액이면 어느 것이든 코튼으로부터 핵산을 용출시킬 수 있다. 용출 pH가 중요하며 좋기로는 8-11이 바람직하고 핵산의 완전한 회수를 위하여는 45-99℃의 온도 범위가 적합하다. 용출 단계에서 완충액을 만드는데 사용되는 탈이온수는 DNase, RNase 자유수, 또는 MilliQ 워터 또는 여과된 물 또는 수돗물이나 지하수로 대체될 수 있다. 기술 분야에 알려진 완충액으로서 pH 5-12 범위의 바이신, 트리신, Tris, HEPES, CHAPS, 포스페이트, 아세테이트, MES, 피리딘, 피페라진, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, 보레이트, TAPS, CHES, CAPS, 에탄올아민, 피페리딘 등을 용출에 사용할 수 있으며, 가장 좋은 것들은 pKa가 7-10의 범위인 것이다. 결합된 핵산을 용출하는데 코튼이 사용될 경우에는 항상, 용출 완충액은 따뜻해야 하며 실무적 관점에서 그 온도는 45-99℃ 범위이다. 이것은 용출을 탈이온수를 이용하여 따뜻한 조건에서 수행하지만, 코튼에 결합된 핵산들이 따뜻한 물로는 완전히 용출되지 못하므로 완충액 또는 염의 존재가 필수적이라는 종래 기술에서 보고된 방법과는 명확히 대조되는 것이다. 염은 MgCl2, CaCl2, NaCl, KCl, 등일 수 있고 그 농도는 0-100 mM, 좋기로는 5-50 mM의 범위일 수 있다. 완충액은 바이신, 트리신, Tris, HEPES, CHAPS, 포스페이트, 아세테이트, MES, 피리딘, 피페라진, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, 보레이트, TAPS, CHES, CAPS, 에탄올아민, 피페리딘으로 된 군으로부터 선택될 수 있다.

핵산의 회수: 본 발명의 시스템에서, 핵산 회수는 용해 완충액, 결합 완충액, 세척 완충액 및 용출 완충액과 이들의 조합에 의존한다. 조합에 따라, 핵산 회수는 실리카계 핵산 추출 시스템과 필적할 수 있다. 또한 저역가 샘플의 경우, 본 발명의 코튼계 핵산 추출 접근법의 효율이 실리카를 이용한 경우보다 더 우수한 것으로 관찰되었다.

코튼의 양: 코튼의 양은 임상적 샘플의 부피에 따라 다르며 1-300 μl의 범위의 경우, 5-30 mg의 코튼이 적절한 것으로 밝혀졌다. 샘플 부피가 밀리리터 범위인 경우, 50 mg 이상의 코튼이 필수적이다. 모든 임상적, 환경적 또는 필드 샘플로부터 핵산을 추출하는데 있어서 전체적으로 1 밀리그램 내지 10 그램의 코튼이면 충분하다.

각 어세이의 비용: 이 프로토콜에 사용되는 코튼은 시중 약국이나 소매점에서 구입할 수 있으므로 (오토클라브 처리된 것이거나 정제 처리된 코튼일 수 있다), 각각의 핵산 추출의 비용은 최소한도이며 이제까지 문헌상 보고된 방법 중 가장 저렴한 방법이라 할 수 있다. 거듭 설명하지만, 핵산 용출물 중에 뜻하지 않게 존재하는 PCR 억제제의 제거를 감안하면, POC 용도과 관련한 이 방법의 간편성 및 적응성은 어느 방법보다도 우수하며 덧붙여 저렴한 추출 단가는 보너스라고 할 수 있다.

용액의 성분 및 처분 안전성: 코튼에 기초한 핵산 추출 시스템은 대부분 수계 완충액을 사용하므로 그 폐기물 역시 당업자가 안전하고도 효과적으로 처분할 수 있다. 코튼을 카트리지에 충전하고 모든 용해, 결합, 세척 용액을 POC 용도의 카트리지에 트래핑시키므로, 건강한 작업자나 분석자가 폐기물을 처분할 필요가 없어 카트리지는 자급자족형이다.

추출된 핵산의 사용: 이 구체예에 설명된 코튼 프로토콜을 이용하여 추출된 핵산은 PCR 또는 RT-PCR에 바로 사용할 수 있다. 설명된 코튼 프로토콜의 또 다른 용례로서 추가의 생물학적 및 분자생물학적 용도를 위한 자료축적, 보관을 위하여, 임상적 샘플로부터 핵산을 회수하는 것을 들 수 있다. 추출된 핵산은 당업자가 상정할 수 있는 어떠한 생화학적 또는 분자 생물학적 용도로든 사용될 수 있다.

핵산 추출에 적합한 형태의 코튼의 사용: 이 구체예는 원심분리 또는 기타 스피닝 장치와 같은 최소한도의 장치 요구성을 가지고 코튼을 사용하여 'PCR 즉성 사용 형태'로 핵산을 추출하기 위한 것이다. 샘플의 양, 샘플의 특성 및 샘플의 기원에 따라, 핵산 추출에 적합한 형태로 코튼을 충전시킬 수 있다좋기로는 핵산을 용액 또는 에멀젼으로서 수득하여 이를 전술한 바와 같은 용해(lysis), 결합, 세척 및 용루 시스템으로 처리한다. 따라서, 코튼의 충전(코튼 packing)은 핵산 추출에 있어서 필수불가결한 부분이며 핵산을 함유하는 용액과 코튼이 접촉되는 것과 관련한 모든 특성이 본 발명의 일부를 구성하는 것으로 간주된다. 도 1-3은 코튼을 충전할 수 있는 몇가지 구체예를 도시한 도면으로서, 이들로 본 발명이 한정되는 것은 물론 아니다. 간단히 설명하면, 핵산 함유 용액이 코튼과 접촉하도록 또는 코튼이 액체와 접촉되도록 코튼을 충전하며 이것은 모두 본 발명의 일부이다.

또 다른 구체예에서, 코튼은 변형된 플라스틱 1 mL 피펫 팁, 변형된 플라스틱 2mL 피펫 팁, 15 mL 팔콘 튜브, 50 mL 팔콘 튜브, 1.5 mL 에펜도르프 튜브, 2 mL 에펜도르프 튜브, 5 mL 붕규산 유리 시험관, 4 mL 스크류 캡 플라스틱 바이알, 3 mL 플라스틱 파스퇴르 피펫, 유리제 파스퇴르 피펫, 고무 벌브가 구비된 유리제 파스퇴르 피펫, 고무 벌브가 구비된 플라스틱 파스퇴르 피펫, 벌브 부분으로서 고무 및 플라스틱 몰드를 갖는 유리제 피펫, 플라스틱 캡이 구비된 2 mL 유리 바이알, 일회용 및 오토클라브 처리된 10 mL 플라스틱 시린지, 5 mL 시린지에 부착된 플라스틱 몰드, 50 mL 시린지에 부착된 일회용 유닛 등에 충전죌 수 있다. 코튼은 또한 면봉 (코튼 swab) 형태로 만들어질 수 있고 면봉은 사람이 만든 것이거나 기계로 만들어진 것일 수 있다. 도 3 [e]에 도시된 면봉은 비스코스로 만들어진 것인데, 그 밖에도 코튼과 혼합된 폴리머 (1 내지 100%), 또는 이화학적으로 변형된 코튼 (1 내지 100%) 역시 모두 본 발명에 포괄된다.

임상 샘플을 보관하기 위한 코튼의 사용: 샘플에 코튼을 직접 노출시켜 흡수하도록 할 수 있다. 코튼은 샘플을 안정화시켜 안전한 형태로 샘플을 보관할 수 ㅇ있게 해준다. 이러한 안전한 형태는 첨가된 샘플의 핵산 함량이 유의적으로 줄어들지 않도록 하는 수단인 것으로 정의된다. 결합은 가역적인 방식으로 일어날 수 있는데, 즉, 이 구체예에 설명된 핵산 추출 프로토콜을 이용하여 핵산을 추출할 수 있다. 임의로 코튼에 안정화제를 내장하면, 안정화제가 샘플 및 샘플 성분들의 안정성을 향상시켜준다. 필요에 따라, 코튼을 이 프로토콜에 보고된 효소 또는 화학적 또는 용해 완충액이나 프로테이나제 K를 함유하는 용해 완충액 또는 안정화 완충염과 함께 프로테이나제 K에 침지시킬 수 있다. 코튼은 EDTA로 처리하거나, 소듐 아자이드로 처리하거나, 염기 처리, 산 처리, 용해 완충액 처리, 꿀 처리 또는 항균제 처리, 항진균제 처리, 항바이러스 화합물에 의해 처리되거나 또는 EDTA 및 소듐 아자이드, 항균, 항미생물, 항바이러스, 항응집제, 기술 분야에 알려진 임상 샘플의 안정화제, 꿀, 또는 이들의 조합으로 처리될 수 있다. 코튼에 첨가되는 보관하고자 하는 샘플의 부피에는 제한이 없으나, 실무 목적 상, 1 μl 내지 20 mL의 범위일 수 있고, 코튼의 사용량 역시도 특별한 제한은 없으나 실무 목적 상 1 mg 내지 10 그램의 범위가 될 것이다. 샘플의 수집은 용해 완충액에 함침된 코튼을 이용하여 수행될 수 있으며 이 또한 본 발명의 일부로서 간주된다.

핵산 추출을 위한 코튼 충전 시스템의 사용방법: 이 구체예에 설명된 보고된 핵산 추출 프로토콜을 이용하여 도 1-3에 예시된 바와 같은 장치에 코튼을 충전하였다. 이 구체예에 설명된 용해, 결합, 세척 및 용출 시스템과 코튼과의 상호반응 메카니즘은 가열, 진탕, 보텍싱, 교반, 지속적인 움직임, 피펫팅 또는 교체와 ㅇ애액체가 상호반응하도록 하는 여타 모든 수단일 수 있다. 기본적으로는, 핵산을 함유하는 액체를 코튼 섬유와 접촉시키는 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 이제까지 문헌상 기록된 어떠한 추출 프로토콜보다도 가장 간단하고 가장 유연한 핵산 추출 프로토콜 중 하나이다. 문헌에 기록된 거의 모든 방법은 내용물을 회전에 의해 침전시키기 위하여 원심분리시키거나 본래의 위치(intact position)에 자성 입자들을 유지시키기 위해 자석을 필요로 하거나 또는 양자 모두를 필요로 하는데 반하여 본 발명의 구체예에 보고된 방법은 원심분리나 자석을 전혀 필요로 하지 않는다. 기존의 핵산 프로토콜은 샘플의 부피에 제약이 있거나 큰 부피의 샘플의 경우 수차례 프로세싱 하여야만 하였다. 본 발명의 프로토콜은 하나의 일회용 추출 시스템을 이용하여 거의 동시에 실제로 샘플의 분량과 관계없이 (실무상 1 μl 내지 20 mL) 어떠한 양이든 프로세스할 수 있게 해준다. 본 발명의 방법에 의하여 추가 특징화 실험 및 다운스트림 프로세싱, 예컨대 PCR, 서열결정 또는 블로팅과 같은 추가 처리에 즉시 사용가능한 핵산을 얻을 수 있다. 이 시스템은 매우 간편하기 때문에 현장 검사 (POC: point of care) 또는 수립된 실험, 문헌에 보고된 표준법과 동등하게 적합하다.

이 구체예에 설명된 코튼 프로토콜은 원심분리 사용 필요성의 제거, 사용자간 다양성의 최소화, 실리카 프로토콜에 필적할만한 효율성, 기존의 어떠한 핵산 프로토콜과 비교하여도 뒤지지 않는 사용 간편성, 어떠한 양의 샘플이든 처리할 수 있는 능력, 핵산의 적절한 회수, 저역가 샘플을 검출할 수 있는 능력, 자동화 용이성, 확립된 병원 설비 및 현장 셋업에 대한 적합성 및 핵산의 회수 및 품질과 관련한 높은 품질 유지력과 관련한 뛰어난 특성을 갖는다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에 설명된 방법은 PCR 또는 역전사효소-PCR (RT-PCR) 또는 서열결정 또는 즉성 블로팅 포맷으로, 생물학적 기원을 갖는 실제로 모든 임상적 또는 분석적 샘플로부터 핵산을 추출하기 위해 코튼과 같은 섬유상 재료를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 핵산을 코튼에 용해, 결합시켜, 핵산이 결합된 코는을 수용액으로 세척하고, KCl과 같은 염과 함께 완충액 중에서 핵산을 용출시키는 방법이다. 실리카 또는 비실리카 프로토콜에서 전형적인 용해 완충액은 혈액 중의 철과 결합하는, EDTA(킬레이팅제)와 같은 4가 또는 2가 염기 이온을 함유한다. 본 발명의 프로토콜에서는, 고농도의 EDTA(10-300 mM)를 첨가하여 모든 핵산이 코튼에 결합하도록 하는 선택성을 갖는 환경을 창출한다. 대개 용해 완충액의 pH는 6으로 조정하여 매트릭스(실리카 또는 비실리카)에 결합하도록 하며, 단백질 및 기타 성분 대부분은 전하적으로 중성이거나 양전하를 띄는데 반하여 핵산은 여전히 음전하를 띄므로 매트릭스와 상호반응하게 된다. 본 발명의 시스템에서, 결합 pH는 염기성(pH 8-11)이어야 하며 과량의 음하전된 EDTA (10-300 mM)는 그 자체가 완충액으로서 작용하여 pH를 8 부근으로 만들어준다. 본 발명의 프로토콜은 핵산이 용해되어 염기성 pH에서 매트릭스와 결합할 수 있게 하여주는 최초의 프로토콜이다. 결합 완충액은 물, pH가 3-11인 범위인 여하한 수성 완충액 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG, 1-30%) 또는 글리세롤 (1-30%) 또는 폴리프로필렌 글리콜 (PPG, 1-30%) 또는 에틸렌 글리콜 (1-50%) 또는 프로필렌 글리콜 (1-50%)을 함유하는 물 또는 모든 수용성 알코올 또는 이들의 조합일 수 있다. 결합 완충액은 용해 완충염의 희석을 돕고, EDTA가 풍부한 환경에서의 핵산 결합을 증가시키며 용해된 입자들을 가용화시켜주는 역할을 한다. 본 발명에 보고된 프로토콜은 다양한 결합 pH를 갖는 광범위한 완충액을 사용할 수 있으며 결합 완충 pH 또는 조성이 이처럼 유연한 것은 문헌상 보고된 바 없다. 핵산 정량화 가능성이 낮다는 것과 샘플 부피에 대한 제약을 부과하는 긴 샘플 처리 시간은 FTA 카드와 관련한 단점인데, 이러한 단점이 코튼을 이용한 본 발명의 구체예에 보고된 핵산 추출 프로토콜에는 존재하지 않는다. 마지막으로, 문헌상 보고된 모든 프로토콜들은 실온 또는 고온에서 물 또는 수성 완충액 중에서 용출을 수행하는데, 본 발명의 핵산 세척은 실온의 물을 이용하여 수행하며 고온(50-99℃)에서 용출을 실시한다. 이 구체예에 정의된 프로토콜 및 매트릭스를 사용하면, 뜨거운 탈이온수가 결합된 핵산을 모두 용출시키지 않으며 완충액이나 염 또는 이들의 조합의 존재가 필수적이다. 이것 역시, 뜨거운 탈이온수에서 결합된 핵산을 매트릭스로부터 용출할 수 있는, 문헌상의 핵산 추출 프로토콜과 날카로운 대조를 이루는 것이다 (실리카 및 비실리카 프로토콜 모두 핵산의 열수 용출을 가능케 한다). 용출 완충액의 pH는 8-10 사이이면 무방한데, 이는 용출 pH가 가변적이며 KCl과 같은 염의 어떤 농도가 결합된 핵산을 코튼으로부터 효율적으로 용출시키는데 효과적임을 가리키는 것이다.

또 다른 구체예에서, 후술하는 방법에서, 코튼으로부터 핵산을 용출시키기 위한 독특한, 특정한 용해, 결합, 세척 및 용출 조건 하에서 핵산을 정량적으로 추출하는데 있어서, 코튼과 기타 코튼 기제의 섬유상 재료를 사용하였다. 한가지 측면에서 본 발명의 개시내용은 코튼을 이용하여, 여하한 모든 환경적, 임상적, 세균, 진균 및 동물 기원의 샘플로부터 핵산을 신속하게 분리하는 시스템을 제공한다. 샘플은 세포 용해물, 체액, 식물, 조직 및 세균 세포 및 세포 용해물일 수 있다. 코튼과 비스코스는 각각 천연 및 인공적으로 수득되는 섬유 물질로서, 특정한 조건 하에서 핵산과 결합하는 것으로 밝혀졌다. 핵산 결합 및 코튼 상의 선택적인 핵산 체류 및 특정 용출 조건 하에서의 핵산 방출 프로세스를 DNA와 RNA를 이용하여 예시한다.

또 다른 구체예에서, 혈액과 같은 임상적 샘플로부터 일반적인 DNA 추출시, 혈액을 구아니딘 티오시아네이트, EDTA, Tris와 같은 완충액, triton X-100와 같은 세제, 및 임의로 우레아와 함께, 폴리올, IA족 양이온을 함유하는 일가염 및/또는 IIA족 양이온을 함유하는 이가염, 및 프로테이나제 K와 같은 단백질 분해효소를 포함하는 용해 완충액을 이용하여 혈액을 용해시켰다. 구아니딘 티오시아네이트는 0.1 내지 7M의 농도이면 무방하다. 몇몇 용례에서는 구아니딘 티오시아네이트 대신 구아니딘 염산염을 사용할 수 있으며 그의 농도 역시 1 내지 6 M이어야 한다. 우레아는 단백질을 변성시키기 위해 사용되며 구아니딘 염의 기능을 보완해주고 그 농도는 0 내지 7M 사이일 수 있다. 일반적으로 대부분의 문헌은 20 mM 범위로 EDTA를 함유하는 혈액용 용해 프로토콜을 보고하고 있다. 본 발명의 용해 완충액은 코튼에 대한 효율적인 핵산 결합을 위해 10-300 mM, 좋기로는 약 100 mM 범위의 상당히 고농도의 EDTA를 관용할 수 있다. EDTA 농도는 RNA 및 PNA와 같은 다른 핵산에 대하여 적절히 조정할 수 있으나, 일반적으로, PCR과 RT-PCR에 있어서 사이클 시간(Ct)와 시그널 강도의 개선 측면에서 고농도의 EDTA가 유리한 것으로 밝혀졌다. 유의적으로 높은 농도의 EDTA를 사용할 경우 헤모글로빈 (혈액에 있어서) 중에 존재하는 철을 포획하고, DNase 활성을 모두 막아주며, 핵산이 코튼에 결합할 수 있도록 고도로 음하전된 분위기를 조성해준다. 이것의 중요한 측면은, 완충액에 유의적으로 고농도의 EDTA를 첨가할 경우 완충액의 pH가 염기성으로 된다는 것인데, 본 발명자들이 아는 한, 이 구체예는 매트릭스에 대한 핵산 결합이 염기성 조건 하에서 수행되는 최초의 예이다. 용액의 결합 pH는 핵산이 코튼에 결합하도록 하기 위하여 염기성이어야만 하는데, 이는 매우 산성인 pH에서는, EDTA가 용해 완충액 외로 석출될 가능성이 있기 때문에, 결합에는 pH 8 이상이 바람직하다. RNase 활성을 불활성화시키기 위해 고농도의 염화마그네슘이 일반적으로 사용되므로, 핵산 용해 프로토콜에서도 이것을 사용할 수 있다. Tris를 용해용 완충액으로 선택할 수 있으며, 본 발명자들은 0-100 mM의 농도가 사용가능하고, 일반적으로 20 mM 정도의 농도가 최적임을 발견하였다. 용해 완충액 또는 결합 완충액 중에 폴리올을 사용하면 프로테이나제 K의 활성을 증대시켜, 분해된 단백질의 가용성을 높여준다. 용해 완충액 중의 폴리올 백분율은 0-30% (v/v)이다. 이러한 모든 완충액은 탈이온수 중에 만들어지며 RNA 적용의 경우, 물을 DEPC로 처리하여 오토클라브 처리할 수 있다. 프로테이나제 K의 용해는 혈액, 가래, 타액 등에 사용되는 전술한 용해 완충액 및 뇨, 땀 등에 사용되는 용해 완충액의 첨가에 앞서서 수행될 수 있다. 프로테이나제 K의 처리는 전술한 용해 완충액에서 효과적인 것으로 밝혀졌고, 따라서, 이 처리는 용해 완충액 첨가에 앞서서 행해지거나 또는 핵산을 함유하는 모든 임상적 샘플용 용해 완충액을 이용하여 수행될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 코튼과 핵산과의 결합을 개시하기 위하여 용해 후에 첨가된 결합 완충액은 그 조성 측면에서 매우 다양할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 결합 완충액은 매우 가변적임으로 해서, 물의 첨가만으로도 용해 완충액 중의 염 농도를 희석하는데 충분하며 코튼에 대한 핵산의 결합이 우수하게 이루어진 것으로 관찰되었다. 용해가 일어나는 동안 또는 결합 완충액 첨가 후, 코튼을 첨가하여 상호반응하게 할 수 있다. 결합 완충액 조성은 pH 5 내지 12, 좋기로는 7-10의 범위일 수 있다. 혈액, 가래 또는 타액과 같은 복합 샘플의 경우, 결합 완충액은 PEG, 글리세롤, PPG, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등과 같은 폴리올 화합물을 특정 백분율로 함유할 수 있다. 에탄올 또는 에탄올 수용액과 같은 전통적으로 사용되는 결합 용액 (실리카계 핵산 시스템의 경우)은 코튼에 대한 핵산의 결합 친화력을 감소시키는 것으로 발견되었다. 즉, 결합 단계 중에 에탄올이 존재할 경우 코튼에 대한 핵산 결합 효율이 저하되는 것으로 밝혀졌다.

또 다른 구체예에서, 세척 완충액은 코튼으로부터 비핵산 성분들을 선택적으로 세척해내는 용액이다. 임상적 샘플이 혈액이면, 결합 후, 코튼은 갈색을 띄게 되고, 결합 후, 코튼은 갈색이 될 것이며 색상을 제거하기 위해 세척 완충액 (세척 완충액 1) 중의 에탄올의 백분율을 구하는 것이 도움이 되었다. 특히 제1 세척은 10-99%, 좋기로는 30-70%, 더욱 좋기로는 50% 에탄올을 함유하는 물 또는 완충액을 이용하여 수행되었다. 세척 용액 중 에탄올 대신 메탄올, n-프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, PEG, PPG, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 기타 수용성 알코올을 사용할 수 있다. 세척 완충액 1과 함께 일가 또는 이가 양이온이 그의 조성으로서 존재할 경우 세척 완충액 2를 사용할 수 있다. 또한 세척 완충액 1 및 2는 동일 조성을 가질 수 있으며 물, 알코올 및 일가 또는 이가 양이온으로 구성될 수 있다. 세척 완충액들로 코튼을 세척하는 횟수는 0-10회이며 이상적으로는 1-3회의 범위가 좋다. 그 후의 세척은 대개 탈이온수를 이용하여 수행하며 세척 횟수는 0 내지 10회, 좋기로는 2 내지 5회, 더욱 좋기로는 3-5회이다. 세척 단계에 사용되는 탈이온수는 DNase, RNase 자유수, 또는 MilliQ 워터 또는 여과된 물 또는 수돗물 또는 지하수로 대체될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 어떠한 수성 완충액을 이용해서든, 코튼으로부터 핵산을 용출할 수 있다. 완충액 농도는 용출 완충액 중 1-200 mM, 좋기로는 5- 50mM, 더욱 좋기로는 30-70 mM이어야 한다. 기술분야에 알려진 완충액에는 바이신, 트리신, Tris, HEPES, CHAPS, 포스페이트, 아세테이트, MES, 피리딘, 피페라진, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, 보레이트, TAPS, CHES, CAPS, 에탄올아민, 피페리딘 등과 같이 pH가 5-12, 좋기로는 7-10, 더욱 좋기로는 8-10인 완충액이 포함되며, 뜨거운 조건 하에서 코튼으로부터 핵산을 용출하는데 이용될 수 있다. 코튼으로부터의 핵산 용출은 50 내지 100℃, 좋기로는 70 내지 95℃, 더욱 좋기로는 85℃의 온도에서 수행될 필요가 있다.

또 다른 구체예에서, 정제된 핵산은 10-100% 순수할 수 있으며, 대체로 바로 PCR 처리 가능하다. 핵산의 순도는 용해, 결합, 세척 및 용출 완충액 및 정제용 매트릭스(코튼 또는 코튼 유도체 또는 코튼-혼합형 물질)의 최적 조합에 따라 달라진다. 본 발명자들은, 이러한 완충액 조합 하에서는 FTA 카드 또는 셀룰로스 결합 입자들 또는 셀룰로스계 여과지가 효율적이지 않음을 발견하였는데, 이는, 핵산과의 상호반응 관점에서 코튼이 셀룰로스의 다른 형태와는 상이함을 가리키는 것이다. 관련된 방법에서, 본 발명은 다음의 일반적 프로토콜을 이용하여 고체 매트릭스로서 코튼 또는 코튼 유도체 또는 코튼-혼합형 물질을 이용하여 핵산 함유 샘플로부터 핵산을 분리하는 수단을 제공한다.

a) 핵산을 함유하는 샘플을 용해 완충액에 첨가하였다. 용해 완충액은 구아니딘 티오시아네이트, EDTA, Tris, 세제 및 임의로 우레아, 폴리올, IA족 양이온을 함유하는 일가 염 및/또는 IIA족 양이온을 함유하는 이가 염, 및 프로테이나제 K을 포함하여 이루어진다. 핵산 샘플 및 용해 완충액을 혼합하여 50-95℃에서 1-20분간 가열하였다.

b) 전술한 용액에 결합 완충액을 첨가하며 이것은 물, pH 4-11인 완충액 또는 폴리올을 함유하는 용액일 수 있다. 결합 완충액의 부피는 용해 완충액 부피의 0.1-10배일 수 있다.

c) 전술한 용액을 좋기로는 실온에서 수초 내지 수분간 코튼과 상호반응하도록 하였다.

d) 이어서 코튼을 물 단독 또는 알코올 수용액을 포함하는 세척 완충액으로 특수 세척하였다 (1차 세척).

e) 이어서 상기 코튼을 잔류 알코올이 코튼으로부터 제거될 때까지 물 또는 완충액으로 세척하였다.

f) KCl과 같은 염 (IA족 또는 IIA족 양이온 함유 염)을 포함하는 완충액 및/또는 바이신과 같은 완충액으로 핵산을 용출하였으며, 용출된 핵산은 일반적으로 바로 PCR 또는 RT-PCR에 사용가능하였다.

다음에 표에 제시된 바와 같이 본 발명에 사용된 방법과 종래 기술에 사용된 방법을 구체적으로 비교함으로써 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 하기 표는 핵산 분리에 사용되는 방법들의 특징화에 사용된 다양한 방법과 중요한 몇가지 측면들을 상호 비교한 것이다.

첨부된 도면을 참고로 다음의 상세한 설명과 특허청구범위로부터 본 발명의 특성이 보다 명확히 이해될 수 있을 것이다. 첨부된 도면은 단지 본 발명의 개시에 따른 몇가지 특정 구체예만을 들어 설명한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니며, 첨부된 도면에 더하여 부가적인 특성과 상세 내용을 참조로 본 발명이 더욱 구체적으로 설명될 것이다.
도 1: [a] 시린지 [b] 시린지 바늘 [c] 시린지에 부착된 플라스틱 몰드 [d] 스크류 캡 플라스틱 보틀 [e] 유리 시험관 [f] 스크류 캡 유리 바이알 내에 충전된 코튼.
도 2: [a] 일회용 플라스틱 드로퍼 [b] 성형된 파스퇴르 플라스틱 피펫 [c] 유리제 파스퇴르 피펫 [d] 고무 헤드가 구비되니 플라스틱 드로퍼 [e] 면봉 [f] 성형된 플라스틱 피펫 내에 충전된 코튼.
도 3: [a] 에펜도르프 튜브 [b] 스크류 캡 유리관 [c] 성형된 플라스틱 1mL 팁 [d] 고무 헤드가 구비된 눈금이 매겨진 일회용 유리제 피펫 [e] 비스코스 스왑 [f] 플라스틱 및 고무 헤드가 구비된 유리 피펫에 충전된 코튼.
도 4: 여러가지 프로토콜에 의해 정제된 DNA 샘플들을 PCR에 의해 증폭시켰다. 레인 1: 분자량 마커, 레인 2: 1 mL 피펫 팁에 충전된 비스코스, 레인 3: 시판되는 비스코스 스왑, 레인 4: 1 mL 피펫 팁에 충전된 코튼, 레인 5: 시판되는 실리커 컬럼, 레인 6: 시판되는 면봉을 이용하여 정제된 DNA, 레인 7: 증폭되지 않은 DNA, 레인 8: 워터 블랭크.
도 5: 여러가지 프로토콜에 의하여 정제된 DNA 샘플을 PCR에 의해 증폭시켰다. 레인 1: 1 mL 피펫 팁에 충전된 코튼, 레인 2: 워터 블랭크, 레인 3: 2 mL 시시린지에 충전된 코튼, 레인 4: 시판되는 실리카 컬럼, 레인 5: 분자량 마커.
도 6: 여러가지 프로토콜에 의하여 정제된 DNA 샘플을 PCR에 의해 증폭시켰다. 레인 1: 분자량 마커, 레인 2: 시판되는 실리카 프로토콜, 레인 3: 1 mL 피펫 팁에 충전된 코튼, 레인 4: 피펫 팁에 충전된 Whatman No 1 여과지, 레인 5: FTA 카드 프로토콜.
도 7: 여러가지 프로토콜에 의하여 정제된 30 ct RNA 샘플을 RT-PCR에 의해 증폭시켰다. 레인 1: 분자량 마커, 레인 2: 탈지면(Surgical 코튼), 레인 3: 오토클라브 처리된 코튼, 레인 4: 수산화나트륨으로 세척된 코튼, 레인 5: 염산으로 세척된 코튼, 레인 6: 흡수용 코튼, 레인 7: Qiagen 실리카 컬럼, 레인 8: FTA 카드
도 8: 자동화된 핵산 추출을 위한 코튼 충전된 카트리지 부품.

본 발명의 기술을 다음 실시예를 들어 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예의 범위로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

일반적인 방법론: 핵산 함유 용액을 좋기로는 실온에서 코튼과 접촉시키고 비핵산 성분들을 알코올 수용액과 물을 포함하는 일련의 세척액을 이용하여 코튼으로부터 세척하였다. 고온에서 염을 포함하는 수성 완충액을 이용하여 코튼으로부터 핵산을 용출시켰다. 용출된 핵산은 PCR 또는 추가 프로세싱에 즉시 사용가능하다. 다음의 예들은 실험 연구실에서 흔히 사용되는 1 mL 피펫 팁 중에 충전된 코튼을 이용하는 것이다. 그러나 당업자라면 코튼과 액체가 접촉가능한 경우라면 다른 형태로도 코튼을 충전할 수 있음을 인식할 것이다. 기본적으로, 입구와 출구가 구비된 것으로 코튼이 충전될 수 있는 것이면 어느 것이든 본 발명의 범위에 포괄된다.

실시예 1: 혈액으로부터의 DNA 추출

a) 50 μl 혈액을 75 μL 용해 완충액 (30 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 60℃로 가열하고 그 온도에서 3분간 방치하였다. 이어서 용액을 85℃에서 2분간 가열하였다.

b) 150 μL의 결합 완충액 (0.1 g/mL의 PEG 6000과 물)을 상기 용액에 첨가하였다.

c) 8 mg 코튼이 충전된 1 mL 플라스틱 드로퍼(코튼 드로퍼, 도 2[a]에 도시된 바와 같음)를 상기 용액과 상호반응시켰다.

d) 이어서, 코튼 드로퍼를 각각 2 mL씩의 세척 완충액 1 (50% 에탄올) 및 세척 완충액 2 (100 mM MgCl₂를 함유하는 50% 에탄올)로 세척하였다.

e) 코튼 팁을 물로 세척하였다 (3 X 1mL).

f) 핵산을 95℃에서 100 uL 용출 온충액 (10 mM 바이신, 10 mM KCl, pH 9.8)에서 용출시켰다.

실시예 2: 혈액으로부터의 DNA 추출

a) 100 μl 혈액을 150 μL 용해 완충액 (40 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100)에 첨가하였다. 얻은 용액을 60℃로 가열하고 이 온도에서 3분간 방치하였다. 이어서 용액을 85℃로 2분간 가열하였다.

b) 300 μL의 결합 완충액 (0.1 g/mL의 PEG6000과 물)을 상기 용액에 첨가하였다.

c) 10 mg 코튼 (코튼 팁, 도 3[c]에 도시된 바와 같음)으로 충전된 1 mL의 성형된 피펫 팁을 상기 용액과 상호반응시켰다.

d) 이어서 코튼 팁을 1 mL 세척 완충액 1 (50% 에탄올) 및 2 mL의 세척 완충액 2 (100 mM MgCl₂를 함유하는 50% 에탄올)으로 세척하였다.

e) 코튼 팁을 물로 세척하였다 (3 X 1mL).

f) 핵산을 95℃에서 200 uL 용출 완충액 (10 mM 바이신, 10 mM KCl, pH 9.8)에 용출시켰다.

실시예 3: 혈액으로부터의 DNA 추출

a) 100 μl 말라리아 (피. 팔시파룸: p. falciparum) 기생충을 함유하는 혈액은 150 μL 용해 완충액(40 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 60℃로 가열하고 이 온도에서 3분간 방치시켰다. 이어서 용액을 85℃에서 2분간 가열하였다.

c) 10 mg 코튼이 충전된 1 mL 성형 피펫 팁 (코튼 팁, 도 3[c]에 도시된 바와 같음)을 상기 용액과 상호반응시켰다.

d) 이어서 코튼 팁을 1 mL의 세척 완충액 1 (50% 에탄올)로 세척하였다.

e) 코튼 팁을 2 mL의 세척 완충액 2 (100 mM MgCl₂를 함유하는 50% 에탄올)로 세척하였다.

f) 코튼 팁을 물로 세척하였다. (3 X 1mL).

g) 핵산을 95℃에서 200 uL 용출 완충액 (10 mM 바이신, 10 mM KCl, pH 9.8)에 용출시켰다.

실시예 4: 혈액으로부터의 RNA 추출

a) 50 μl 치쿤구니야 양성 (chikungunya positive) 혈액을 75 μL 용해 완충액 (30 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 60℃로 가열하고 이 온도에서 3분간 방치하였다. 이어서 용액을 85℃로 2분간 가열하였다.

b) 150 μL의 결합 완충액 (0.1 g/mL의 PEG6000와 물)을 상기 용액에 첨가하였다.

c) 10 mg 코튼이 충전된 1 mL 피펫 팁을 상기 용액과 상호반응시켰다.

d) 이어서 코튼 팁을 1 mL 세척 완충액 1 (50 mM MgCl₂을 함유하는 50% 에탄올)로 특수 세척하였다.

d) 코튼 팁을 물 (3 X 1mL)로 세척하였다.

e) 핵산을 95℃에서 200 uL 용출 완충액 (10 mM 바이신, 10 mM KCl, pH 9.8)에 용출시켰다.

실시예 5: 타액으로부터의 DNA 추출

a) 50 μl 타액을 100 mL 용해 완충액 (10 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트 , 200 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 60℃에서 가열하고 이 온도에서 3분간 방치시켰다. 이어서 용액을 85℃에서 2분간 가열하였다.

b) 250 μL의 결합 완충액 (물 중 10% 글리세롤)을 상기 용액에 첨가하였다.

c) 코튼이 충전된 1 mL의 성형 피펫 팁 (코튼 팁, 도 3[c]에 도시된 바와 같음)을 상기 용액과 상호반응시켰다.

d) 이어서 코튼 팁을 3 mL 세척 완충액 1 (200 mM MgCl₂)을 함유하는 50% 에탄올)로 특수 세척하였다.

e) 코튼 팁을 각각의 세척 동안 액체를 피펫팅 함으로써 3회 물로 세척하였다 (3 X 1mL).

f) 핵산을 95℃에서 250 μL 용출 완충액 (10 mM 바이신, 50 mM KCl, pH 9.8)에 용출시켰다.

실시예 6: 혈액으로부터의 RNA 추출

a) 100 μl 치쿤구니야 양성 혈액을 150 μL 용해 완충액 (40 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 60℃로 가열하고 이 온도에서 3분간 방치하였다. 이어서 용액을 85℃에서 2분간 가열하였다.

b) 300 μL의 결합 완충액 (0.1 g/mL의 PEG 6000과 물)을 상기 용액에 첨가하였다.

c) 10 mg 코튼이 충전된 1 mL 성형 피펫 팁 (코튼 팁, 도3[c]에 도시된 바와 같음)을 상기 용액과 상호반응시켰다.

d) 이어서 1 mL 세척 완충액 1 (50% 에탄올) 및 2 mL의 세척 완충액 2 (50 mM MgCl₂를 함유하는 50% 에탄올)으로 코튼 팁을 특수 세척하였다.

e) 코튼 팁을 물로 세척하였다 (2 X 1mL).

f) 핵산을 95℃에서 100 uL 용출 완충액 (10 mM 바이신, 10 mM KCl, pH 9.8)에 용출시켰다.

실시예 7: 혈액으로부터의 RNA 추출

a) 50 μl 치쿤구니야 양성 혈액을 75 μL 용해 완충액 (40 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 80 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 55℃로 가열하고 이 온도에서 3분간 ㅂ방치시켰다. 이어서 용액을 70℃에서 2분간 가열하였다.

b) 150 μL의 결합 완충액 (0.1 g/mL의 PEG 8000과 물)을 상기 용액에 첨가하였다.

c) 10 mg 코튼으로 충전된 2.5 mL 시린지(코튼 시린지, 도 1[a]에 도시된 바와 같음)을 상기 용액과 상호반응시켰다.

d) 이어서 코튼 팁을 1 mL 세척 완충액 1 (50% 에탄올) 및 2 mL의 세척 완충액 2 (50 mM MgCl₂를 함유하는 50% 에탄올)로 특수 세척하였다.

e) 코튼 시린지를 물로 세척하였다 (3 X 1mL).

f) 핵산을 95℃에서 100 uL 용출 완충액 (10 mM 바이신, 10 mM KCl, pH 9.8) 중에 용출시켰다.

실시예 8: 가래로부터의 DNA 추출

a) 100 μl 가래를 150 mL 용해 완충액 (40 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 60℃로 가열하고 이 온도에서 5분간 방치시켰다. 이어서 용액을 75℃에서 2분간 가열하였다.

c) 10 mg 코튼이 충전된 5 mL 벨로우 피펫 (코튼 벨로우, 도 2[b]에 도시된 바와 같음)을 상기 용액과 반응시켰다.

d) 이어서, 코튼 팁을 1 mL 세척 완충액 1 (50% 에탄올) 및 세척 완충액 2 (50 mM MgCl₂를 함유하는 50% 에탄올)으로 특수 세척하였다.

e) 코튼 벨로우를 물로 세척하였다 (3 X 1mL).

f) 핵산을 95℃에서 100 uL 용출 완충액 (10 mM 트리신, 10 mM KCl, pH 9.8) 중에 용출시켰다.

실시예 9: 혈청으로부터의 DNA 추출

a) 50 μl 혈청을 75 μL 용해 완충액 (60 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 60℃로 가열하고 이 온도에서 3분간 방치시켰다. 이어서 용액을 85℃에서 2분간 가열하였다.

c) 10 mg 코튼이 충전된 1 mL 성형된 피펫 팁 (코튼 팁, 도 3[c]에 도시된 바와 같음)을 코튼과 상호반응시켰다.

d) 이어서 코튼 팁을 1 mL의 세척 완충액 1 (50% 에탄올) 및 2 mL의 세척 완충액 2 (50 mM MgCl₂를 함유하는 50% 에탄올)로 특수 세척하였다.

e) 코튼 팁을 물로 세척하였다 (3 X 1mL).

실시예 10: 혈청으로부터의 RNA 추출

a) 100 μl 치쿤구니야 양성 혈청을 150 μL 용해 완충액 (40 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 60℃로 가열하고 이 온도에서 3분간 방치시켰다. 이어서 용액을 85℃로 2분간 가열하였다.

d) 이어서 코튼 팁을 3 mL 세척 완충액 1 (50 mM MgCl₂을 함유하는 50% 에탄올)로 특수세척하였다.

e) 코튼 팁을 물로 세척하였다 (3 X 1mL).

실시예 11: 가래로부터의 DNA 추출

a) 50 μl 가래를 150 μL 용해 완충액 (40 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100, pH 9.5)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 60℃로 가열하고 이 온도에서 3분간 방치시켰다. 이어서 용액을 85℃에서 6분간 가열하였다.

c) 10 mg 코튼을 상기 용액과 상호반응시켰다.

d) 이어서 코튼을 3 mL 세척 완충액 1 (50 mM MgCl₂을 함유하는 50% 에탄올)로 특수세척하였다.

e) 코튼을 물로 세척하였다 (3 X 1mL).

실시예 12: 가래로부터의 DNA 추출

a) 50 μl 가래를 75 μL 용해 완충액 (40 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100, pH 9.5)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 60℃로 가열하고 이 온도에서 5분간 방치시켰다.

c) 10 mg 코튼을 상기 용액과 반응시켰다.

d) 이어서 코튼을 3 mL 세척 완충액 1 (100 mM MgCl₂을 함유하는 50% 에탄올)로 특수 세척하였다.

e) 코튼을 물로 세척하였다 (3 X 1mL).

실시예 13: 조직으로부터의 RNA 추출

a) 50 μl 광견병 양성 조직을 175 μL 용해 완충액 (40 mL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100, pH 9.5)에 첨가하고, 7분간 보텍스처리한 다음 상등액을 튜브에 옮겼다. 얻어진 용액을 60℃로 가열하고 상기 온도에서 3분간 정치시켰다. 이어엇 용액을 75℃에서 3분간 가열하였다.

b) 350 μL의 결합 완충액 (0.1 g/mL의 PEG 6000과 물)을 상기 용액에 첨가하였다.

c) 20 mg 코튼을 상기 용액과 상호반응시켰다.

d) 이어서 코튼을 3 mL 세척 완충액 1 (100 mM MgCl₂를 함유하는 50% 에탄올)로 특수 세척하였다.

e) 코튼을 물로 세척하였다 (3 X 1mL).

실시예 14: 혈액으로부터의 RNA 추출

a) 용해 완충액, 결합 완충액, 세척 완충액 및 용출 완충액을 DEPC 물 중에 제조하였다.

b) 50 μL의 치쿤구니야 혈액을 50 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K 및 250 μL 용해 완충액 (5.6 M 구아니딘 티오시아네이트, 20 mM EDTA, 20 mM Tris, 100 mM MgCl2, 0.1% triton X-100)에 첨가하였다. 튜브를 60℃로 가열하고 상기 온도에서 3분간 방치시켰다. 이어서 튜브를 80℃에서 2분간 가열하였다.

c) 1 mL의 결합 완충액 (10% PEG 6000)을 상기 용액에 첨가하였다.

d) 코튼이 충전된 3 mL 시린지 (코튼 시린지, 도 1[a]에 도시된 바와 같음)을 시린지 레버를 5회 앞뒤로 잡아당겼다 놓았다 하여 용액과 상호반응시켰다.

e) 이어서 시린지 레버를 7회 앞뒤로 잡아당겼다 놓았다 함으로써 코튼 시린지를 3 mL 세척 완충액 1 (100mM MgCl₂를 함유하는 50% 에탄올)로 특수 세척하였다.

f) 각각의 세척 동안 액체와 함께 시린지 레버를 3회 앞뒤로 잡아당겼다 놓았다 함으로써 코튼 시린지를 물로 세척하였다 (3 X 2 mL).

g) 액체와 함께 시린지 레버를 2회 앞뒤로 잡아당겼다 놓았다 함으로써 핵산을 95℃에서 200 μL 용출 완충액 (10 mM 바이신, 10 mM KCl, pH 9.8)에 용출시켰다.

h) 혈액 중에 존재하는 핵산이 PCR에 즉석 이용가능한 형태로 얻어졌으며 총 프로토콜에 걸린 시간은 약 9분이었다.

실시예 15: 펩타이드 핵산 ( PNA ) 추출

a) 50 μl PNA 함유 표준 용액을 75 μL 용해 완충액 (10 μL의 10 mg/mL 프로테이나제 K, 5.6 M 구아니딘 염산염, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0.01% triton X-100, pH 9.5)에 첨가하고, 7분간 보텍스 처리한 다음 상등액을 튜브에 옮겨 담았다. 얻어진 용액을 60℃로 가열하고 이 온도에서 3분간 방치시켰다. 이어서 용액을 75℃에서 3분간 가열하였다.

b) 150 μL의 결합 완충액 (0.1 g/mL의 PEG6000과 물)을 상기 용액에 첨가하였다.

c) 10 mg 코튼을 상기 용액과 상호반응시켰다.

d) 이어서 코튼을 3 mL 세척 완충액 1 (100 mM MgCl₂를 함유하는 50% 에탄올)로 세척하였다.

e) 코튼을 물로 세척하였다 (3 X 1mL).

f) 단백질 핵산을 95℃에서 100 uL 용출 완충액 (10 mM 바이신, 10 mM KCl, pH 9.8)에 용출시켰다.

실시예 16 : PCR 증폭

본 발명에 따른 프로토콜에 의하여 정제된 DNA/RNA 샘플들을 PCR 증폭시킨 다음 겔 전기영동시켰다. 결과물을 도 4, 5 6, 및 7에 도시하였다. 도 4는 비스코스, 시판 비스코스 면봉, 1 ml 피펫 팁에 충전된 코튼, 시판 실리카 컬럼 및 면봉을 이용하여 분리 및 정제된 DNA 샘플들의 비교 밴드들을 나타낸 도면이다. 마찬가지로, 도 5는 서로 다른 프로토콜, 즉, 1 mL 피펫 팁에 충전된 코튼, 2 mL 시린지에 충전된 코튼, 시판 실리카 컬럼 및 분자량 마커에 의해 정제된 DNA 샘플들의 비교 밴드를 도시한 도면이다.

또한 도 6은 서로 다른 프로토콜, 즉 분자량 마커, 시판 실리카 프로토콜, 1 mL 피펫 팁에 충전된 코튼, 피펫 팁에 충전된 와트만(Whatman) No. 1 여과지 및 FTA 카드 프로토콜에 의해 정제된 DNA 샘플들의 비교 밴드를 나타낸다.

또한 도 7은 여러가지 프로토콜에 의해 정제된 RT-PCR에 의해 증폭된 30 ct RNA 샘플의 비교 밴드를 제공한다. 프로토콜은 다양한 기원의 코튼 매트릭스, 즉 탈지면, 오토클라브처리된 코튼, 수산화나트륨 세척된 코튼, 염산 세척된 코튼 및 흡수 코튼을 사용하였다.

이제까지 여러 측면 및 구체예를 설명하였으나, 그 밖의 다른 측면과 구체예도 가능함을 당업자들은 이해할 것이다. 본 발명에 개시된 여러가지 다양한 측면과 구체예들은 어디까지나 설명 목적을 위하여 제공된 것으로 본 발명이 이들 측면이나 구체예들로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 정신과 범위는 첨부된 특허청구범위에 나타낸 바와 같다.

Claims

(a) 핵산을 함유하는 샘플에 염기성 pH를 갖는 용해 완충액을 첨가하여 용해된 용액을 수득하는 단계; 또는
(b) 염기성 pH를 갖는 용해 완충액을 결합 완충액과 조합하여 샘플에 첨가함으로써 용해된 용액을 수득하는 단계
(c) 결합 완충액을 단계 (a)의 용액에 첨가하여 핵산을 코튼 매트릭스에 결합시키거나 또는 단계 (b)의 용액을 코튼 매트릭스에 직접 결합시키는 단계로서 상기 결합이 수행되는 결합 pH는 8 내지 11 범위인 단계; 및
(d) 코튼 매트릭스에 결합된 핵산을 세척 완충액으로 세척하고 용출 완충액으로 용출시켜 핵산을 분리 및 정제하는 단계
만으로 이루어진, 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법으로서,
상기 용해 완충액은 구아니딘 티오시아네이트 또는 구아니딘 염산염, EDTA, Tris, 세제, 폴리올, IA족 양이온을 함유하는 일가 염 또는 IIA족 양이온을 함유하는 이가 염, 단백질 분해 효소, 우레아 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되고 상기 핵산 샘플과 용해 완충액은 혼합되어 50℃ 내지 90℃에서 1-20분간 가열되며, 상기 용해 완충액의 pH 범위는 8 내지 11이고;
상기 결합 완충액은 물, 물과 폴리올과의 혼합물 및 물과 비폴리올과의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되고;
상기 세척 완충액은 물 또는 물과 수성 알코올과의 혼합물을 포함하며;
상기 용출 완충액은 완충액 또는 염과 함께 45℃ 내지 99℃의 온도 범위를 갖는 온수를 포함하되 8 내지 11 범위의 pH를 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산은 DNA, RNA 및 PNA를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플은 생물학적 또는 비생물학적 샘플인 것인 방법.
제3항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액, 가래, 혈청, 타액 또는 조직 추출물을 포함하는 군으로부터 선택되고 비생물학적 샘플은 화학적으로 합성된 PNA를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 EDTA는 10 mM 내지 300 mM의 농도 범위인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 구아니딘 티오시아네이트 또는 상기 구아니딘 염산염은 0.1 M 내지 7 M의 농도 범위인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 우레아는 0.01 M 내지 7 M의 농도 범위인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 Tris는 0.01 mM 내지 100 mM의 농도 범위인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리올은 0.01% 내지 30% (v/v)의 농도 범위인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 세제는 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 도데실 설페이트, Triton X-100, NP-40, Tween 20 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되고 여기서 상기 단백질 분해 효소는 프로테이나제 K인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리올은 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 수용성 폴리올 화합물을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 비폴리올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 산, 아민, 알코올, 페놀, 아미드 또는 에스테르 관능기를 갖는 수용액 액체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 알코올을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 세척은 1% 내지 99% (v/v)의 수성 알코올을 이용한 1차 세척 및 이어서 100% 물을 포함하는 세척 완충액을 이용한 복수회의 세척을 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 수성 알코올은 에탄올, 메탄올, n-프로판올, 2-프로판올, 글리세롤, PEG, PPG, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 또는 제13항에 있어서, 상기 물은 탈이온수, DNase 자유수, RNase 자유수, MilliQ 워터, 여과된 물, 수돗물, 지하수 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 또는 제13항에 있어서, 상기 세척 완충액과 용출 완충액은 MgCl₂, CaCl₂, NaCl 및 KCl을 포함하는 군으로부터 선택된 염, 또는 바이신, 트리신, Tris, HEPES, CHAPS, 포스페이트, 아세테이트, MES, 피리딘, 피페라진, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, 보레이트, TAPS, CHES, CAPS, 에탄올아민 및 피페리딘을 포함하는 군으로부터 선택된 완충액을 더 포함하며 pH가 5 내지 12인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 물은 탈이온수, DNase 자유수, RNase 자유수, MilliQ 워터, 여과된 물, 수돗물, 지하수 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 염은 MgCl₂, CaCl₂, NaCl, KCl 또는 그의 조합으로부터 선택되며 0.01 mM 내지 100 mM의 농도 범위로 사용되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 코튼은 천연 코튼, 탈지면, 임상등급의 코튼, 시판 코튼, 스펀 코튼, 수세 코튼, 산 또는 염기 세척된 코튼, 오토클라브 처리된 코튼, 완충액 처리된 코튼, 염 용액 처리된 코튼, 유기 용매 처리된 코튼, 압착 코튼 및 프로세스된 코튼을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
샘플로부터 핵산을 분리하기 위한 키트로서, 상기 키트는:
a) 용해 완충액으로서, 상기 용해 완충액은 구아니딘 티오시아네이트 또는 구아니딘 염산염, EDTA, Tris, 세제, 폴리올, IA족 양이온을 함유하는 일가 염 또는 IIA족 양이온을 함유하는 이가 염, 단백질 분해 효소, 우레아 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되고 상기 용해 완충액의 pH 범위는 8 내지 11인 용해 완충액;
b) 결합 완충액으로서, 상기 결합 완충액은 물, 물과 폴리올과의 혼합물 및 물과 비폴리올과의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 결합 완충액;
c) 세척 완충액으로서 상기 세척 완충액은 물 또는 물과 수성 알코올과의 혼합물을 포함하는 것인 세척 완충액; 및
d) 용출 완충액으로서, 상기 용출 완충액은 완충액 또는 염과 함께 물을 포함하되 8 내지 11 범위의 pH를 갖는 것인 용출 완충액
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충액과 코튼 매트릭스를 포함하는 것인 키트.
제20항에 있어서, 상기 코튼 매트릭스는 천연 코튼, 탈지면, 임상등급의 코튼, 시판 코튼, 스펀 코튼, 수세 코튼, 산 또는 염기 세척된 코튼, 오토클라브 처리된 코튼, 완충액 처리된 코튼, 염 용액 처리된 코튼, 유기 용매 처리된 코튼, 압착 코튼 및 프로세스된 코튼을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 키트.
제20항에 있어서, 상기 샘플은 생물학적 또는 비생물학적 샘플을 포함하는 것인 키트.
제22항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 가래, 혈청, 타액 또는 조직 추출물을 포함하는 군으로부터 선택되고 비생물학적 샘플은 화학적으로 합성된 PNA를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 키트.
제20항에 있어서, 상기 세척 완충액은 MgCl₂, CaCl₂, NaCl 및 KCl을 포함하는 군으로부터 선택된 염, 또는 바이신, 트리신, Tris, HEPES, CHAPS, 포스페이트, 아세테이트, MES, 피리딘, 피페라진, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, 보레이트, TAPS, CHES, CAPS, 에탄올아민 및 피페리딘을 포함하는 군으로부터 선택된 완충액을 더 포함하며 pH가 5 내지 12인 것인 키트.
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