CN107904232B - 一种从痰液中快速提取核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从痰液中快速提取核酸试剂及方法，所述试剂包括前处理液和核酸抽提剂，其中前处理液包括以下成分：1‑5mM 2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸，1‑5mM乙酸钠或1‑20mg/ml蛋白酶K，5‑15％β‑巯基乙醇，3‑7M盐酸胍，0.01‑0.1％Triton；核酸抽提剂为氯仿、水饱和酚、异丙醇的一种或多种。本发明该方法将盐酸胍和氯仿结合同时用于痰液处理及核酸抽提，仅需少量试剂即可完成痰液液化和灭活核酸酶，最大程度地降低核酸的降解和损失。该方法不仅能够一步法完成痰液液化、细胞裂解以及核酸抽提过程，简化核酸提取步骤，节省操作时间，还能有效降低核酸的降解和损失，提高痰液核酸的提取效率。

Description

一种从痰液中快速提取核酸的方法

技术领域

本方法属于用于医学检测的样本核酸提取技术领域，涉及一种从痰液中快速提取核酸的方法，技术关键在于一步法完成痰液液化、细胞裂解以及核酸抽提过程。

背景技术

痰是人体呼吸道的分泌物，它是通过支气管纤毛运动，从肺部向上呼吸道推动，最后通过人的正常咳嗽反射从气管内咳出排出体外。当人吸入刺激性气体、尘埃、致病细菌、病毒等有害微生物时，上呼吸道就可能发生炎症；或者肺部发生疾病，如支气管扩张、肺脓肿、肺癌等，呼吸道就会分泌增加，痰量就会增加，而痰的性质也会发生变化，可以由粘痰变成干酪痰、血痰、黄脓痰等。根据痰液产生和排出机制可知，痰液中包含多种病原微生物、各类炎症细胞、脱落坏死的黏膜上皮细胞以及肿瘤细胞等。通过检测痰液样本中病原体的核酸来鉴定病原体的种类是目前最精准且最快速的呼吸道病原体诊断方法。可引起急性呼吸道感染的病原体中，病毒占主要地位，其次才是细菌、支原体、霉菌、原虫等。在原发的急性上呼吸道感染中，病毒感染高达90％以上。常见的呼吸道病原体有：结核分枝杆菌、呼吸道合胞病毒、腺病毒、EB病毒、流感病毒、肺炎支原体、风疹病毒、链球菌、葡萄球菌、肺炎衣原体、细小病毒B19、巨细胞病毒以及冠状病毒等。传统的病原体诊断方法是分离培养或者血清学检测，分离培养耗时长、操作复杂，不适用于临床急症的诊断；血清学检测很难在疾病做到早期诊断。随着荧光定量PCR以及多重PCR技术在病原体检测领域的快速发展，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测迅速、检出率高等特点，该技术已逐渐在临床诊断领域占据重要地位。此外，从肺癌高危人群及肺癌患者的痰液样本中提取核酸，可用于早期肺癌的预测以及肺癌患者的基因突变检测和治疗监测。综上，痰液样本中核酸检测在临床上具有重要意义。

由于痰液样本具有粘度大、蛋白多、不易液化、易成团等特点，痰液样本的核酸检测常规至少需要经历3步前处理过程：痰液液化、细胞裂解以及核酸抽提。常规前处理过程主要存在以下不足：(1)单独的痰液液化过程由于要求保存细胞的完整性而不添加强变性剂，故极易造成样本中的RNA被RNA酶催化降解，从而导致样本核酸损失。(2)常规的痰液液化常用巯基类试剂，且加入的试剂体积多为5-10倍痰液体积，导致最终的样品体积较大，从而极易发生核酸降解和损失；(3)操作过程较为复杂耗时；分别为氢氧化钠法、DTT(二硫苏糖醇)法以及蛋白酶法。氢氧化钠法是最常用的痰液液化方法，该方法比较简单，利用主成分为一定浓度的氢氧化钠溶液在60-80℃(也可在室温条件下)液化痰液，该方法用于核酸检测时其强碱性环境易造成核酸损失。DTT(二硫苏糖醇)法的原来是利用含巯基(-SH)的DTT(二硫苏糖醇)断裂痰液中导致粘稠的主要成分粘蛋白，以PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)提供生理缓冲，通常还会加入乙醇等固定细胞。该方法使用的DTT(二硫苏糖醇)成本较高，且该方法易造成RNA损失，不适合大批量处理临床痰液样本。蛋白酶法的原理是利用蛋白酶消化痰液黏蛋白，该方法的酶解反应耗时较长，所需蛋白酶成本较高，且黏蛋白消化效率低。

目前已公开的相似发明专利：中国专利申请文件CN104263721A公开的《一种保护痰液中核酸(DNA和RNA)的痰纸及核酸提取方法》以及中国专利申请文件CN106065400A公开的《一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法》，主要存在以下不足：(1)加入的痰液处理试剂较多且痰液处理步骤较多，易造成核酸损失；(2)操作步骤多且较为繁琐，操作耗时；(3)使用的试剂种类较多，核酸提取成本高。此外，目前已公开的用于提取组织或细胞样本中核酸的发明专利较多，但是这些专利技术由于不含痰液液化过程，因此无法处理痰液样本。

发明内容

为了解决目前临床上从痰液样本中提取核酸存在操作复杂耗时且核酸易损失等问题，本发明提供了一种从痰液中快速提取核酸的方法，不仅能够快速液化痰液，简化痰液核酸提取过程，节省操作时间，最大程度地减少核酸损失，还能降低核酸提取成本。

本发明的技术方案是：

本发明提供一种从痰液中快速提取核酸的试剂，包括前处理液和核酸抽提剂，其中前处理液包括以下成分：1-5mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(pH6.5-pH7.5)，1-5mM乙酸钠，5-15％β-巯基乙醇(w/vol)，3-7M盐酸胍，0.01-0.1％TritonX-100(w/vol)；核酸抽提剂为氯仿、水饱和酚、异丙醇的一种或多种。

进一步，前处理液包括以下成分：1-5mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(pH6.5-pH7.5)，1-20mg/ml蛋白酶K，5-15％β-巯基乙醇(w/vol)，3-7M盐酸胍，0.01-0.1％曲拉通X-100(w/vol)。

进一步，前处理液包括以下成分：1mM2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH7.5)，1-2mg/ml蛋白酶K，10％β-巯基乙醇，7M盐酸胍，0.05％Triton X-100。

优选的，所述前处理液中蛋白酶K的浓度为1mg/ml。

本发明的原理如下：发明人创新性地将盐酸胍和氯仿同步用于预处理痰液样本，盐酸胍与氯仿结合最突出的优势是极易促进痰液液化，此外还能除去脂肪，使蛋白质变性分层，使得核酸进入上层水相，同时还能彻底抑制核酸酶。该方法打破了常规痰液核酸提取必须分步骤进行的传统，最大程度上简化操作步骤。所述前处理液可进一步处理痰液并破裂细胞，释放出核酸，同时抑制核酸酶(包括：DNase和RNase)。其中2-(N-吗啡啉)乙磺酸提供的缓冲环境有利于维持核酸的稳定性，Triton X-100可充分破裂细胞，β-巯基乙醇和盐酸胍可变性蛋白并抑制核酸酶。所述前处理液可最大程度上释放并保护核酸，配方较为简单且成本适中。所述核酸抽提试剂可将核酸抽提至上层清液中，从而达到提取痰液样本核酸的目的。

本方法还提供一种从痰液中快速提取核酸的方法，所述方法包括：

(1)取2-5ml的痰液样本，加入0.5-2g盐酸胍，加入等体积的氯仿、1/10-1/5体积的前处理液，充分震荡后在50℃～60℃条件下保温10-20min；

(2)将上步得到的样品以转速≥12000r/min离心1-5min，观察上清液和中间层的情况，若中间层无明显固体杂质且上清液不粘稠，则直接取上清液(含样本核酸)备用；若中间层有明显固体杂质或上清液粘稠，则继续以等体积的氯仿反复抽提至中间层不明显且上清液不粘稠，取上清液(含样本核酸)备用。

本发明中所述“体积”、“等体积”中均指相对应的痰液样本体积。

作为本发明一种实施方式，上述痰液核酸的提取方法为：

(1)取2-5ml的痰液样本，加入0.5-2g盐酸胍、等体积氯仿，50℃～60℃震荡保温10-20min；

(2)以转速≥12000r/min离心1-5min，取上清，加入1/10-1/5体积的前处理液，50℃～60℃震荡保温8-15min，再以转速≥12000r/min离心8-15min；

(3)加入1/3体积的异丙醇，混匀，以转速≥12000r/min离心8-15min，取上清液备用。

本发明另一种实施方式，上述痰液核酸的提取方法为：

(1)取2-5ml的痰液样本，加入0.5-2g盐酸胍、等体积氯仿、20-80μl的β-巯基乙醇，50℃～60℃震荡保温10-20min；

(2)以转速≥12000r/min离心1-5min，取上清，加入1/2-1.5倍体积的异丙醇，以转速≥12000r/min离心10-15min，弃上清；

(3)将上步的沉淀重悬合并在300-500μl前处理液、300-800μl水饱和酚、80-200μl氯仿中，剧烈震荡，以最高转速≥12000r/min离心1-5min，取上清液备用。

本发明的有益效果是：

该方法将盐酸胍和氯仿结合同时用于痰液处理和核酸抽提，仅需少量试剂即可完成痰液液化和灭活核酸酶，最大程度地降低核酸的降解和损失。该方法不仅能够一步法完成痰液液化、细胞裂解以及核酸抽提过程，从而简化痰液核酸提取过程，节省操作时间，还能有效降低核酸的降解和损失，提高痰液核酸的提取效率。通过实验验证(详见实施例5)，与本方法相比，第一步单独利用盐酸胍或氯仿进行痰液处理和核酸提取，其核酸提取效率较低。此外，利用传统的DTT(二硫苏糖醇)法结合酚-氯仿抽提法行痰液处理和核酸提取，其核酸提取效率也较低。

综上，本发明公开的一种从痰液中快速提取核酸的方法，仅需少量试剂即可完成痰液液化和灭活核酸酶，最大程度地降低核酸的降解和损失。该方法不仅能够一步法完成痰液液化、细胞裂解以及核酸抽提过程，还减去试剂酚在核酸抽提步骤中的使用，从而简化痰液核酸提取过程，节省操作时间，同时降低核酸提取成本。本方法可应用于临床或科研等领域，实现快速提取和检测痰液核酸的目标。

附图说明

图1为具体实施方案中实施例1中电泳法检测痰液样本中的核酸的电泳图谱，从左至右依次为1号、2号、3号、4号、Marker。

图2为具体实施方案中实施例3中电泳法检测痰液样本中的核酸的电泳图谱，从左至右依次为1号、2号、3号、4号、Marker。

图3为具体实施方案中实施例5中电泳法检测痰液样本中的核酸的电泳图谱，从左至右依次为1号、2号、3号、4号、Marker。

具体实施方式

实施例中所用到的痰液样本由浙江今复康生物科技有限公司委托浙江大学医学院附属第一医院呼吸内科按临床标准取痰程序采集，参照《中国结核病防治规划·痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》，通过目测，黄色、灰色、铁锈色、血性、脓性、稠厚，呈现团块状的标本为接收标准。肺癌阳性痰液由临床确诊的肺癌患者采集得到。肺癌细胞中含有的端粒酶赋予了肺癌细胞无限增殖的能力，而端粒酶由肺癌细胞的hTERT mRNA翻译合成，因此hTERT mRNA是肺癌细胞的特征标志物。在痰液的产生和咳出过程中，脱落的肺癌细胞混合在痰液中被咳出。因此在肺癌患者的痰液中能够检测到hTERT mRNA。核酸检测采用浙江今复康生物科技有限公司开发的“端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，该试剂盒可检测痰液样本中的hTERT mRNA。当PCR扩增结果为Ct值＜33时，表明检测结果为阳性即表示样本中含有hTERT mRNA；当PCR扩增结果为Ct值≥33或NoCt时，表明检测结果为阴性即表示样本中无hTERT mRNA。

实施例1：利用本方法检测1-5ml痰液样本中的核酸

步骤1：取若干肺癌阳性痰液充分混匀制备成10ml的肺癌阳性痰液样本，分别取1ml、2ml、3ml、5ml痰液样本至1-4号离心管中；

步骤2：加入1g盐酸胍、等体积的氯仿、1/5体积的前处理液(组成为：1mM2-(N-吗啡啉)乙磺酸(pH7.5)，1mM乙酸钠，10％β-巯基乙醇(w/vol)，7M盐酸胍，0.05％曲拉通X-100(w/vol))，，充分震荡后在50℃～60℃条件下保温10分钟；

步骤3：将上步得到的样品以转速≥12000r/min离心1分钟，观察上清液和中间层的情况，若中间层无明显固体杂质且上清液不粘稠，则直接取上清液(含样本核酸)备用；若中间层有明显固体杂质或上清液粘稠，则继续以等体积的氯仿反复抽提至中间层不明显且上清液不粘稠，取上清液(含样本核酸)备用；

步骤4：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤3得到的样品进行检测，经过杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示本方法可提取1-5ml痰液样本中的核酸：

样品编号	1号	2号	3号	4号
					Ct值	20.73	24.44	22.06	24.21
实验结果	阳性	阳性	阳性	阳性

步骤5：利用电泳法检测样本中的核酸。将步骤3得到的上清液上核酸分离柱，12000r/min离心1min；取700μl洗涤液(10mM MES pH6.0，35％乙醇)洗涤2次；将柱子置于干净的1.5ml离心管上，向柱子膜中间位置加30μl TE溶液，60℃保温3min；12000r/min离心1min，收集流出液，取15μl流出液进行凝胶电泳，电泳结果见图1。结果显示，1-4号样本经电泳后均可见清晰的核酸条带，证明对应的样本中含有完整性良好的核酸。

实施例2：本方法适用于粘痰/血痰/脓痰/稠厚痰/黄色痰/灰色痰/铁锈色痰

步骤1：取肺癌阳性且性状分别为粘痰、血痰、脓痰、稠厚痰、黄色痰、灰色痰、铁锈色痰各一例，分别置于1-7号离心管中；

步骤2：加入1g盐酸胍、等体积的氯仿、1/5体积的前处理液，充分震荡后在50℃～60℃条件下保温10分钟；

步骤3：将上步得到的样品以转速≥12000r/min离心1分钟，观察上清液和中间层的情况，若中间层无明显固体杂质且上清液不粘稠，则直接取上清液(含样本核酸)备用；若中间层有明显固体杂质或上清液粘稠，则继续以等体积的氯仿反复抽提至中间层不明显且上清液不粘稠，取上清液(含样本核酸)备用；

步骤4：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤3得到的痰液样品进行检测，经过杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示本方法可提取粘痰、血痰、脓痰、稠厚痰、黄色/灰色/铁锈色痰中的核酸：

样品编号

1号

2号

3号

4号

5号

6号

7号

Ct值

23.47

25.64

28.01

31.21

25.44

21.22

23.48

实验结果

阳性

阳性

阳性

阳性

阳性

阳性

阳性

实施例3：使用1/10体积的前处理液即可完成核酸提取

步骤1：取若干肺癌阳性痰液充分混匀制备成8ml的肺癌阳性痰液样本，分别取2ml痰液样本至1-4号离心管中；

步骤2：加入1g盐酸胍、等体积的氯仿，再分别向1-4号管中加入1/2、1/5、1/10、1/20体积的前处理液，充分震荡后在50℃～60℃条件下保温10分钟；

步骤3：将上步得到的样品以转速≥12000r/min离心1分钟，观察上清液和中间层的情况，若中间层无明显固体杂质且上清液不粘稠，则直接取上清液(含样本核酸)备用；若中间层有明显固体杂质或上清液粘稠，则继续以等体积的氯仿反复抽提至中间层不明显且上清液不粘稠，取上清液(含样本核酸)备用；

步骤4：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤3得到的痰液样品进行检测，经过杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示本方法使用1/10体积的前处理液即可完成核酸提取：

样品编号	1号	2号	3号	4号
					Ct值	19.11	25.43	27.93	No Ct
实验结果	阳性	阳性	阳性	阴性

步骤5：利用电泳法检测样本中的核酸。将步骤3得到的上清液上核酸分离柱，12000r/min离心1min；取700μl洗涤液(10mM MES pH6.0，35％乙醇)洗涤2次；将柱子置于干净的1.5ml离心管上，向柱子膜中间位置加30μl TE溶液，60℃保温3min；12000r/min离心1min，收集流出液，取15μl流出液进行凝胶电泳，电泳结果见图2。结果显示，1-3号样本经电泳后均可见清晰的核酸条带，证明对应的样本中含有完整性良好的核酸；4号样本经电泳后未见核酸条带，证明对应的样本中不含有完整性良好的核酸。

实施例4：利用最优提取方法提取痰液核酸

步骤1：取若干肺癌阳性痰液充分混匀制备成8ml的肺癌阳性痰液样本，分别取2ml痰液样本至1-4号离心管中；

步骤2：加入1g盐酸胍、等体积氯仿，50℃～60℃震荡保温10-20min；

步骤3：以转速≥12000r/min离心1-5min，取上清，加入1/10-1/5体积的前处理液(含蛋白酶K)，50℃～60℃震荡保温8-15min；

步骤4：加入1/3体积的异丙醇，混匀，以转速≥12000r/min离心8-15min，取上清液(含样本核酸)备用；

步骤5：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤4得到的痰液样品进行检测，经过杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示利用最优提取方法提取可实现痰液样本的核酸提取：

样品编号	1号	2号	3号	4号
					Ct值	21.11	22.13	21.91	22.06
实验结果	阳性	阳性	阳性	阳性

实施例5：单独利用盐酸胍或氯仿提取核酸以及与传统方法的比较

步骤1：取若干肺癌阳性痰液充分混匀制备成8ml的肺癌阳性痰液样本，分别取2ml痰液样本至1-4号离心管中；

步骤2：1号样品按照实施例4的方法进行核酸提取的操作；

步骤3：向2号样品管中加入1g盐酸胍、1/5体积的前处理液(组成为：1mM2-(N-吗啡啉)乙磺酸(pH7.5)，1mg/ml蛋白酶K，10％β-巯基乙醇(w/vol)，7M盐酸胍，0.05％曲拉通X-100(w/vol))，充分震荡后在50℃条件下保温15min；加入1/3体积的异丙醇，混匀，以转速≥12000r/min离心10min，取上清液(含样本核酸)备用；

步骤4：向3号样品管中加入等体积氯仿、1/5体积的前处理液(组成为：1mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(pH7.5)，1mg/ml蛋白酶K，10％β-巯基乙醇(w/vol)，7M盐酸胍，0.05％曲拉通X-100(w/vol))，充分震荡后在50℃条件下保温15min；加入1/3体积的异丙醇，混匀，以转速≥12000r/min离心10min，取上清液(含样本核酸)备用；

步骤5：向4号样品管中加入5倍体积的DTT(二硫苏糖醇)液(组成为：0.1％的DTT+PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液))，震荡液化20min；

步骤6：利用经典的酚-氯仿抽提法提取4号样品的核酸：加入等体积的饱和酚，震荡5min，以转速≥12000r/min离心10min，取上层清液，加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，震荡5min，以转速≥12000r/min离心10min，取上清液(含样本核酸)备用；

步骤7：利用电泳法检测样本中的核酸。将上述步骤得到的1-4号上清液上核酸分离柱，12000r/min离心1min；取700μl洗涤液(10mM MES pH6.0，35％乙醇)洗涤2次；将柱子置于干净的1.5ml离心管上，向柱子膜中间位置加30μlTE溶液，60℃保温3min；12000r/min离心1min，收集流出液，取15μl流出液进行凝胶电泳，电泳结果见图3。结果显示，1号样本经电泳后均可见清晰的核酸条带，证明对应的样本中含有完整性良好的核酸。2-4号样本经电泳后的核酸条带较浅，说明对应的样本中核酸含量较少，核酸提取效率较低。

实施例6：利用最优提取方法提取痰液核酸

步骤1：取若干肺癌阳性痰液充分混匀制备成8ml的肺癌阳性痰液样本，分别取2ml痰液样本至1-4号离心管中；

步骤2：加入1g盐酸胍、等体积氯仿、20μl的β-巯基乙醇，60℃震荡保温10min；

步骤3：以转速≥12000r/min离心5min，取上清，加入1倍体积的异丙醇，以转速≥12000r/min离心10min，弃上清；

步骤4：将上步的沉淀重悬合并在350μl前处理液(组成为：1mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(pH7.5)，1mg/ml蛋白酶K，10％β-巯基乙醇(w/vol)，7M盐酸胍，0.05％曲拉通X-100(w/vol))、500μl水饱和酚、100μl氯仿中，剧烈震荡，以最高转速≥12000r/min离心5min，取上清液(含样本核酸)备用；

步骤5：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤4得到的痰液样品进行检测，经过杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示利用最优提取方法提取可实现痰液样本的核酸提取：

样品编号	1号	2号	3号	4号
					Ct值	19.14	19.89	20.33	21.07
实验结果	阳性	阳性	阳性	阳性

Claims (5)

1.一种从痰液中快速提取核酸的试剂，其特征在于，所述试剂包括前处理液和核酸抽提剂，其中前处理液包括以下成分：1-5mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，1-5mM乙酸钠或1-20mg/ml蛋白酶K，5-15％β-巯基乙醇，3-7M盐酸胍，0.01-0.1％Triton X-100；

核酸抽提剂为氯仿、水饱和酚、异丙醇的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的从痰液中快速提取核酸的试剂，其特征在于，前处理液包括以下成分：1mM2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，pH7.5，1-2mg/ml蛋白酶K，10％β-巯基乙醇，7M盐酸胍，0.05％Triton X-100。

3.一种从痰液中快速提取核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取2-5ml的痰液样本，加入0.5-2g盐酸胍，与痰液样本等体积的氯仿，1/10-1/5体积的如权利要求1-2任意一项中所述的前处理液，前处理液体积为痰液样本体积的1/10-1/5，充分震荡后在50℃～60℃条件下保温10-20min；

(2)将上步得到的样品以转速≥12000r/min离心1-5min，观察上清液和中间层的情况，若中间层无明显固体杂质且上清液不粘稠，则直接取上清液备用；若中间层有明显固体杂质或上清液粘稠，则继续以等体积的氯仿反复抽提至中间层不明显且上清液不粘稠，取上清液备用。

4.根据权利要求3所述的从痰液中快速提取核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)取2-5ml的痰液样本，加入0.5-2g盐酸胍、等体积氯仿，50℃～60℃震荡保温10-20min；

(2)以转速≥12000r/min离心1-5min，取上清，加入1/10-1/5体积的前处理液，50℃～60℃震荡保温8-15min，再以转速≥12000r/min离心8-15min；

(3)加入1/3体积的异丙醇，混匀，以转速≥12000r/min离心8-15min，取上清液备用。

5.根据权利要求3所述的从痰液中快速提取核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)取2-5ml的痰液样本，加入0.5-2g盐酸胍、等体积氯仿、20-80μl的β-巯基乙醇，50℃～60℃震荡保温10-20min；

(2)以转速≥12000r/min离心1-5min，取上清，加入1/2-1.5倍体积的异丙醇，以转速≥12000r/min离心10-15min，弃上清；

(3)将上步的沉淀重悬合并在300-500μl前处理液、300-800μl水饱和酚、80-200μl氯仿中，剧烈震荡，以最高转速≥12000r/min离心1-5min，取上清液备用。

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