CN112304930B

CN112304930B - 二硫键检测方法及含二硫键的痰液检测试剂盒

Info

Publication number: CN112304930B
Application number: CN202010311902.2A
Authority: CN
Inventors: 陈燃; 徐逸丽
Original assignee: Zhejiang Jfk Biological Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Jfk Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-04-20
Filing date: 2020-04-20
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2040-04-20
Also published as: CN112304930A

Abstract

本发明提供了一种二硫键的检测方法及含二硫键的痰液检测试剂盒。其中二硫键的检测方法为将待测样品与缓冲体系及铁粉混合；然后利用铁氰化钾显色检测样品中的二硫键；其中缓冲体系为二价阳离子的缓冲溶液，缓冲体系的pH值为5.8‑6.4。本发明方法简便易行，可在10分钟之内完成检测，结果清晰易判断，灵敏度高、特异性和可重复性好，所用试剂均为常规试剂，具有很好的安全性。本发明试剂盒可长期存放和便于携带使用，使用后可密封处理保护环境，适用于痰液即时收集和快速即时检测(POCT)。

Description

二硫键检测方法及含二硫键的痰液检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，涉及一种简便易用、安全性好的二硫键铁粉还原检测方法及痰液检测试剂盒。

背景技术

二硫键(S-S键)是一种重要的共价键官能团，存在于各类天然小分子化合物和生物体蛋白质结构中。这些物质所含的二硫键通常可还原断裂生成巯基(-SH)，并可与巯基相互转化以动态平衡的方式存在于人体的体液内，通过巯基/二硫键氧化还原酶的催化而实现，其含量的变化往往与特定的病理状态和疾病相关，使得共同成为评价疾病风险和检测疾病状态的重要标志物。蛋白质包含的二硫键来自于其半胱氨酸形成的胱氨酸。二硫键的形成使蛋白质肽链的空间结构更为紧密，二硫键经还原反应形成巯基后，蛋白质构象变得松散，可通过巯基与其它巯基化合物，如：同型半胱氨酸(Hcy)，形成二硫键结合。Hcy，又称高半胱氨酸，是一种血管损伤性含硫氨基酸。大部分(约80％)的Hcy在血液中通过二硫键与蛋白质结合，只有小部分(约20％)以游离形式存在。研究表明，血Hcy总水平异常升高与心脑血管疾病(脑卒中、脑梗死、动脉粥样硬化、心肌梗死、肺栓塞，等)、糖尿病、肾病、宫颈癌、乳腺癌、胃癌等疾病发生具有显著相关性。通过断裂二硫键检测血Hcy的总量，可以作为这些疾病发生风险及病情进展的监测诊断指标。二硫键的断裂检测也可以应用于其它含二硫键的小分子化合物药物的检测。由于肿瘤细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)的含量比正常血液环境高1000倍以上，基于二硫键的氧化还原响应性药物传递系统能够特异性地释放抗肿瘤药物，即将二硫键引入到前体药物结构中，能达到更特异的肿瘤治疗效果。截至2019年7月，在药渡数据库中登录的二硫键化学药多达112个，其中已上市34个。二硫键药物还可以应用于营养性疾病、肿瘤、心脑血管疾病、内分泌和代谢疾病、泌尿生殖系统疾病等治疗领域。

肺部疾病严重危害人类健康。代表性的肺部疾病包括慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺， COPD)和感染性肺炎如新冠肺炎(COVID-19)等。慢阻肺是一组以气流不完全可逆受限为特征的下呼吸道疾病，主要包括慢性支气管炎和肺气肿。慢阻肺发病率高、病死率高，控制率低，严重危害人类健康，给患者和家庭及社会造成沉重的经济负担。国际权威医学期刊《柳叶刀》发表的大规模人群研究“中国成人肺部健康研究”显示，中国20岁及以上成人的慢阻肺患病率为8.6％，40岁以上患病率达13.7％，60岁以上患病率已超过27％。慢阻肺的重要发病因素包括吸烟、空气污染等。吸烟人群患病率比非吸烟人群高10倍以上。重度吸烟人群慢性支气管炎的患病率可以高达75.3％。慢阻肺起病隐匿，主要症状是咳嗽、咳痰和气喘。患者可能长时期内没有症状或仅有轻微症状，若没有及时发现而未接受系统正规的治疗，病情将呈进行性发展，发生肺功能不可逆损害，并引发一系列心、肺疾病乃至呼吸衰竭危及生命。调查研究发现，超过70％的慢阻肺患者属于早期患者，约42％的慢阻肺患者无症状，约15％的患者肺功能损害已达中、重度但仍无明显症状。许多患者吸烟多年，平时常有咳嗽、咳痰，却认为是正常现象而忽视，来医院就诊时往往已达晚期，已错过治疗时机。早期发现、早期诊断，是慢阻肺有效防治的关键。肺功能检查是诊断慢阻肺急性加重的金标准，但是专业性很强，接受度不高。我国国民慢阻肺知晓率低，肺功能检查率低，诊断率低，尤其是早期诊断率非常低。发展便捷、易推广、易接受的痰液检查手段，对于慢阻肺的早期发现和及时诊断非常重要。

新冠肺炎感染后最初症状表现为发热和咳嗽等，与流感症状类似，重症可发展成ARDS(急性呼吸窘迫综合征)、脓毒症和脓毒性休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。新冠病毒感染潜伏期一般小于14天，个别患者可达一个月左右，患者中大部分为轻症患者，但重症患者死亡率高，《柳叶刀呼吸病学》发表论文指出重症死亡率为61.5％。Nature发文指出30％-60％的新冠感染者无症状或者症状轻微，但传播病毒的能力并不低，而且，潜伏期的无症状感染者也有传染性。新冠病毒核酸检测的主要样品为咽拭子，咽拭子检测假阴性较高易造成漏检，且对采集样品人员具有较高风险。咽拭子平均病毒载量较低为7.99×10⁴拷贝/毫升。检测效果最佳为肺泡灌洗液，但需进行肺泡灌洗，从灌洗液提取样品，此操作过程比较复杂，专业要求高，且可能给受检者造成较大损伤和风险，不利于普及推广应用。痰液平均病毒载量为7.52×10⁵拷贝/毫升，为咽拭子10倍，为除肺泡灌洗液外检测效果最佳的样品。然而，目前痰液核酸检测的灵敏度波动较大，一个重要的限制性因素为：新冠肺炎患者大多为干咳，咳痰量少且时间不定，少量痰液易混入口水中并与口水混淆而造成误判，导致不合格的痰液标本可能被用于核酸检测，而合格的痰液可能被误丢弃而造成病毒传播扩散。痰液标本的采集鉴别及保存技术的进步有助于提高新冠肺炎痰液核酸检测成功率和防范病毒传播扩散。

咳痰是各种肺部疾病早期的重要症状。唾液是由口腔唾液腺所分泌的液体，因与痰液同为咳嗽后吐出的液体，而俗称为口水和痰，但并不具有痰液的病理意义。医学定义上的痰液，是由气管、支气管和细小支气管等下呼吸道在病理刺激的情况下过量产生的分泌物。人体处于健康状态下，正常支气管黏膜仅常规分泌少量粘液，一般并不咳痰，当下呼吸道发生炎症病变时，下呼吸道局部过度产生和分泌粘液，同时诱发纤毛摆动汇聚形成痰液。痰液通过支气管纤毛运动从下呼吸道向上推动，引发人正常咳嗽反射从气管咳出体外。流感等上呼吸道感染、吸入刺激性物质、哮喘等虽也可诱发咳痰，后续经过核酸检测，即可进一步地鉴别，不会造成错判。痰液中以MUC5AC为主的黏蛋白通过大量的二硫键交叉联接在一起形成凝胶网，而唾液中二硫键含量很低，粘度较低，二者本有明显差异，但唾液经常混入痰液中同时咳出，造成混淆掩盖和忽视咳痰症状，因此，临床上痰液检测主要依靠专业人士逐一指导教育患者通过清水漱口清除唾液，深咳收集咳出液，再目测判断样品是否为合格痰液，耗费大量时间精力，大大降低了痰液检测的通量性、顺应性和适用性。同时，即使按规程漱口后深咳采集，仍有较大几率收集到即时分泌的唾液，与混有痰液的咳出液性状区分不明显，性状目测容易出现误判，需要进一步对咳出液取样涂片进行显微镜检查计数，若鳞状上皮细胞数量＞20％，提示标本主要来源于口腔而非气管或支气管，不属于合格痰液。该过程比较繁琐，普及程度不高。在尚未出现明显病症的情况下，患者咳痰多属于偶发，常直接吐掉而不送检，且多并不身处在专业机构，也不便于收集送检。这些情况阻碍了痰液检测应用，容易造成误诊、延误治疗、传染扩散等不良后果。即时收集咳出液并通过断裂检测二硫键快速辨别有否咳痰，有助于及时发现和诊断新冠肺炎、慢阻肺等肺部疾病，具有重要的应用价值。

现有还原断裂检测二硫键的方法，基本上都是采用二步法，首先通过还原剂将二硫键还原为巯基，然后利用高效液相色谱分析测定巯基。例如，中国专利申请文件CN110045031 A公开的《同型半胱氨酸浓度检测方法》以及中国专利申请文件CN 104237439 B公开的《一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法》。由于巯基在溶液中易被氧化而重新形成二硫键，因此利用还原剂拆开二硫键时，往往进一步用碘乙酰胺、氯化苄、N-乙基丁烯二亚酰胺和对氯汞苯甲酸等试剂与巯基作用，将其保护起来，防止其重新氧化。该类方法设备昂贵、专业性强、操作复杂耗时。巯基检测有磷钼酸/磷钨酸、铁氰化钾-Fe³⁺等氧化性体系利用巯基还原性反应显色分析的快速便捷的方法，但传统的二硫键还原断裂反应多采用巯基试剂(如：DTT、巯基乙醇、半胱氨酸)和碱性环境，带入较高巯基本底。其它能还原断裂二硫键的可溶性还原剂，如维生素C(VC)、三羧乙基膦(TCEP)等，也同样会给铁氰化钾-Fe³⁺等氧化性体系显色分析造成本底干扰，不利于痰液、血液、尿液、药物二硫键快速检测等普及应用。

综上所述，当前缺乏一种简便快速、能够实现即时检测(POCT)的二硫键的检测方法和产品。

发明内容

为此，本发明提供操作简便、快速、准确的二硫键的检测方法和基于本发明方法的便携式痰液即时检测试剂盒。

实现本发明目的的技术方案为：

本发明提供一种二硫键的检测方法，将待测样品与缓冲体系及铁粉混合；然后利用铁氰化钾显色检测样品中的二硫键；

其中缓冲体系为二价阳离子的缓冲溶液，缓冲体系的pH值为5.8-6.4。

进一步，缓冲体系的pH值为6.2。

进一步，所述二价阳离子为钙离子和锌离子中的一种或两种。本发明的不同实施方式中，所述二价阳离子采用氯化钙、氯化锌中的一种或两种。

进一步，所述缓冲体系中的缓冲剂为2-(N-吗啉)乙磺酸、3-(N-吗啉基)丙磺酸、双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷盐酸盐、乙酸-乙酸钠中的一种或多种。

进一步，样品溶液与缓冲体系的体积比为1:1；铁粉与缓冲体系的比例为每1mL缓冲体系对应1g铁粉。

进一步，利用铁氰化钾试纸条显色指示；试纸条上干燥有5-10μL，浓度1.00-1.09M的铁氰化钾。

具体的，本发明一种实施方式中，所述二硫键快速检测方法，具体操作步骤为：用取样勺采集一勺样品，加入到容量管中，倒入缓冲液和铁粉，以取样勺充分搅拌混合2-5分钟，将试纸条下端浸入样品液中接近但不超过样品控制线(试纸条下端相距约1mm的双线条)，然后静置约1-2分钟，观察铁氰化钾线(试纸条中部的单线条)附近是有否呈现蓝色条带。出现蓝色条带，为阳性结果，指示样品中二硫键的含量不低于0.5mM，即不低于1.2×10^- ⁴g/mL胱氨酸样品中二硫键的含量，否则，为阴性结果，指示样品中二硫键的含量低于0.3mM，即低于7×10^-5 g/mL胱氨酸样品中二硫键的含量。

以上结果均为95％可信区间。本方法检测结果有5％的可能性落在0.3mM-0.5mM之间。

上面所述的取样勺用于采集样品及搅拌混合，其特征组成为一次性使用的塑料勺，容量约为1mL，勺身显著小于容量管直径，总体长度等于或略小于容量管内高度，总体长度也可以大于容量管内高度，但可折叠，折叠后小于容量管内高度。

上面所述的容量管用于容纳样品及缓冲液，其特征组成为容量大于3mL、直径显著大于取样勺勺身、高度不小于取样勺折叠后长度的洁净可密封的塑料管。

上面所述的缓冲液用于溶解或悬浮样品，由二价阳离子和缓冲剂组成，提供适合的pH和2价阳离子条件，其pH为5.8-6.2，所含2价阳离子为Zn²⁺和Ca²⁺。二价阳离子溶液具体但不限于100-200mM氯化钙、10-20mM氯化锌(ZnCl₂)，缓冲剂具体但不限于1.0-10.0mM 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、5.0mM 3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、5.0mM双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷盐酸盐(Bis-Tris HCl)、2.0mM乙酸乙酸钠。该缓冲液不含二硫键，不含巯基，能长时间放置备用。

优选的，缓冲液为pH为6.2的15mM氯化锌、100mM氯化钙，10mM MES。

上面所述的铁氰化钾试纸条，用于吸滤样品反应液进行二硫键测定，其特征组成为干燥有 5μL-10μL，浓度1.00M-1.09M的铁氰化钾，具体特征描述如下：其为长度显著大于容量管高度、宽度显著小于容量管直径的滤纸条；其下端约2-5mm处，标有双线条的样品控制线，指示浸入样品液的方向和深度；其上方5-15mm处，标有虚线条的铁氰化钾线，为铁氰化钾点样区域，干燥有5μL-10μL，浓度1.00M-1.09M的铁氰化钾，样品控制线与铁氰化钾线之间为结果指示区；铁氰化钾线上方10mm处标有短线条，其上方为质控指示区。在试纸条使用前，该区域不显示颜色，在使用后显示黄色，指示操作正常，结果可靠。若在试纸条使用前，该区域已经显示颜色，说明试纸条已经变质，不建议继续使用。若在试纸条使用后，该区域仍不显示颜色，说明操作不当，结果不可靠。

作为一种改进，上面所述的试纸条在背部贴合塑料底板条，以利于将试纸条更平直地放在容量管内。

作为一种改进，上面所述的试纸条在顶端可设计为可折叠，以便于将试纸条挂在容量管内。

作为一种改进，上面所述的试纸条可以密封包装保存，室温稳定性可达12个月以上。

进一步地，本方法可配置蓝色梯度比色卡，用于比对指示样品二硫键含量的多少。

进一步地，当样品为体液或其它低浓度二硫键样品溶液时，本方法可以使用浓缩剂按阈值需求配比吸水浓缩提高检测灵敏度，该阈值为能够明确区分正常与异常的显色浓度。所述的浓缩剂可以为变色硅胶、高吸水树脂中的一种或两种组合。

本发明的原理是：在本发明方法的条件下，铁粉还原性较为适中，能够被胱氨酸、痰液等富含二硫键的样品氧化生成Fe²⁺，Fe²⁺随溶液上行与试纸条上的铁氰化钾络合沉淀，反应十分迅速灵敏，呈现清晰的蓝色条带，而唾液、BSA、脱脂奶粉、甲硫氨酸、维生素C(VC)、2-巯基乙醇等二硫键含量较低或不含二硫键的样品，不显现蓝色。

传统的二硫键的检测方法，首先使用可溶性还原性物质将二硫键转化为巯基，然后再对巯基进行检测，属于利用巯基间接进行检测的二步法。与之相比，本发明方法具有以下优点：(1) 灵敏度高、特异性和可重复性好。体液样品中大多混杂有巯基、VC等可溶性还原物质，对传统的二步法形成竞争性干扰，影响测定的灵敏度、特异性和可重复性。本发明方法使用铁粉作为不溶性还原剂，其不会随着溶液上升到试纸条上干扰Fe²⁺-铁氰化钾显色反应，并且，在本发明方法的条件下，Fe的还原性强于巯基、VC等体液中经常存在的可溶性还原物质，能优先与二硫键反应，快速还原样品中的二硫键而自身被氧化生成Fe²⁺，排除了可溶性还原物质的竞争性干扰；同时，在本发明方法的条件下，Fe的还原性较为适中，不与H⁺发生快速反应，避免了弱酸性环境的本底干扰。(2)反应快速，结果清晰易判断。溶解性和流动性欠佳的高分子蛋白质样品，如，痰液MUC5AC，在二硫键断裂后，溶解性和流动性仍较差，而产生的巯基基团固定在蛋白质中，给基于巯基检测的方法造成了很大的阻碍，本发明方法产生的Fe²⁺具有良好的溶解性和流动性，由Fe²⁺沿试纸条上升与铁氰化钾结合显色，在试纸条上快速形成特异的Fe²⁺-铁氰化钾蓝色条带，凝聚，不扩散，易判断。(3)稳定性好，便于携带使用。本发明方法将铁粉、缓冲液分别密封保存在塑料袋中，铁氰化钾干燥固定在可密封保存的试纸条上，具有很好的室温稳定性，可长期存放和便于携带使用。(4)操作简单、安全性好，可即时检测(POCT)。本发明方法不需要使用专业仪器设备，不需要具备专业操作能力，全部检测过程可在5分钟之内完成。所用试剂均为常规试剂，不含毒性较大的含汞试剂；在使用后，可将用过的取样勺、试纸条及样品盖紧密封在容量管内部，有利于保护环境，具有很好的安全性，可用于POCT。

本发明还提供一种含二硫键的痰液快速检测试剂盒，包括收集管、管盖、检测杆，收集管为可密闭的透明离心管；检测杆为中空棒，内置铁氰化钾试纸条，检测棒还设有结果指示窗和质控指示窗；收集管中可事先放置缓冲体系和还原剂铁粉，也可在加入待测样品后加入缓冲体系和铁粉。

进一步，收集管靠近底部标有样品控制线。

进一步，检测杆下端设有过滤层。本发明一种实施方式，所述过滤层为皂土。

进一步，所述缓冲体系为二价阳离子的缓冲溶液，缓冲体系的pH值为5.8-6.4。

进一步，所述缓冲体系为pH 6.2的15mM氯化锌、100mM氯化钙和10mM 2-(N-吗啉)乙磺酸溶液。

根据本发明方法建立的一种痰液快速检测试剂盒，主要特征组成包括收集管、管盖、检测杆、缓冲液A，还原剂B。检测杆上端与收集管管盖可拆卸连接固定。检测杆内固定置有铁氰化钾试纸条，试纸条的大小根据检测杆的大小来确定。

检测杆下端置有过滤层，功能是过滤除去样品溶液中的不溶性异物以及吸附样品本身颜色，排除对检测的干扰。检测杆上与试纸条结果指示区域以及质控指示区域的相应位置设有结果指示标识窗口。在结果指示区域是一条5mm长度的铁氰化钾区域。

该试剂盒主要用于检测咳出液中有无痰液成分，具体使用步骤为：(1)打开管盖，向收集管中吐入一口咳出液(约2mL)，(2)打开缓冲液A和还原剂B，将内容物全部倒入收集管中，(3)将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5分钟，(4)静置，观察结果指示窗，出现蓝色条带为阳性，指示有咳痰症状。否则，为阴性，指示无咳痰症状。

所述缓冲液A即前述缓冲体系，还原剂B即铁粉。

上面所述的收集管为透明塑料离心管，口径：0.8cm高度：10cm，可立，带有管盖，可旋紧密封。在样品检测完成后，试剂盒整体与样品溶液一起处于盖紧密封状态，避免污染环境。

上面所述的检测杆和管盖采用可拆卸连接，其在生产装配时处于相互分离状态，便于将试纸条和过滤层装入到检测杆中；其在检测使用过程中处于相互连接状态，便于利用管盖旋紧固定检测杆的位置。

所述检测杆上部设置有一个直径略小于收集管内部直径的固定环，所述固定环和检测杆之间连接设置有多根连接杆；固定环的存在使得检测杆始终与收集管平行且位于管内正中央，防止检测杆在检测过程中掉落。

所述管盖朝向收集管内部一侧凹陷设置有与检测杆顶部形状相匹配的凹槽，通过将检测杆顶部插入凹槽内对检测杆进行固定；采用嵌入的方式进行固定，操作方便，且固定效果好。

所述收集管和盖通过螺旋固定，螺旋固定较扣盖制作成本小，生产技术成熟，密封性好。

所述的检测杆的过滤层由厚度为1厘米的过滤嘴海绵及皂土组成。

检测杆内置的铁氰化钾试纸条由尺寸(长×宽)为20mm×5mm滤纸条及背部支撑塑料条组成。在距试纸条下端12mm处，干燥有5μL饱和铁氰化钾溶液(1.09M)。

在检测杆中距过滤层上端9mm处设有宽2mm结果指示窗，此窗口与试纸条结果指示区对应。若样品含有痰液，则检测完成后在此窗口观察到明显蓝色条带。在检测杆距过滤嘴上端约16mm处设有宽约2mm质控指示窗，与试纸条质控指示区对应。在检测使用前，该区域不显示颜色，在使用时显示由过量的铁氰化钾迁移形成的黄色，指示样品和操作合格，结果可靠。若在使用前，该区域已经显示颜色，说明检测杆试纸条已经变质，不建议继续使用。若在检测使用后，该区域仍不显示颜色，说明样品或操作不合格，结果不可靠。

上面所述缓冲液A为2mL pH 6.2的15mM氯化锌、100mM氯化钙、10mM MES，还原剂B为2.0g铁粉。

本发明的有益效果在于：

本发明方法简便易行，可在10分钟之内完成检测，结果清晰易判断，灵敏度高、特异性和可重复性好，所用试剂均为常规试剂，不含毒性较大的含汞试剂，安全性好，适用于体液尤其是痰液二硫键的快速检测。本发明试剂盒操作简单，检测结果易判读，能快速检测出咳出液标本中被唾液掩盖的痰液，检出率高于传统性状目测及镜检法。本试剂盒能实现标准化生产，成品体积较小、可长期存放，便于携带使用，使用后可密封处理保护环境，能满足快速、简便、安全、低成本的要求，适用于痰液即时收集、快速即时检测(POCT)，适于推广普及使用。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明：

图1为试纸条示意图。

图2为试纸条成品以及检测结果示意图。

图3为管盖的俯视图。

图4为检测杆和固定圈、管盖结合的立体图。

图5为试剂盒的爆炸图。

图6为试剂盒一体化设计示意图。

图7A和图7B分别是实施例16中染料染色后的溶液图以及相对应的溶液用试纸条测试后的试纸条图。

1：收集管；2：管盖；4：检测杆；6：凸杆；7：凹槽；8：缓冲液A和还原剂B的混合物；9：样品量控制线；5：固定环；41：过滤层；42：试纸条；43：结果检测窗；44：质控指示窗。

421：结果指示区，422：铁氰化钾线，423铁氰化钾点样区域，424：质控指示区，425：样品控制线。

具体实施方式

以下以具体实施例对本发明作进一步的详细说明。应当理解的是，具体实施例仅是对本发明做出更清楚的说明，而不是对本发明的限制。本文所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。

实施例中使用的手段，如无特别说明，均使用本领域常规手段。

实施例中所采用的试剂，如无特别说明，均为市场购买得到。

图1为试纸条示意图。本实施例的试纸条42上设有结果指示区421，在该区域内能出现蓝色则表明样品为阳性；铁氰化钾线422，铁氰化钾区域的最下端，在此线附近出现出现蓝色，为阳性；铁氰化钾点样区域423，此区域内滴加铁氰化钾；质控指示区424，在试纸条使用前，该区域已经显示颜色，说明试纸条已经变质，不建议继续使用。若在试纸条使用后，该区域仍不显示颜色，说明操作不当，结果不可靠；和样品控制线425，样品体积不能超过此线。

图2为试纸条成品以及检测结果示意图，421：结果指示区，422：铁氰化钾线，423铁氰化钾点样区域，424：质控指示区，425：样品控制线。

用取样勺采集一勺样品，加入到容量管中，倒入缓冲液和铁粉，以取样勺充分搅拌混合 2-5分钟，将试纸条下端浸入样品液中接近但不超过样品控制线(试纸条下端相距约1mm的双线条)，然后静置约1-2分钟，观察铁氰化钾线(试纸条中部的单线条)附近是有否呈现蓝色条带。出现蓝色条带，为阳性结果，指示样品中二硫键的含量不低于0.5mM，即不低于1.2×10^-4 g/mL胱氨酸样品中二硫键的含量，否则，为阴性结果，指示样品中二硫键的含量低于0.3mM，即低于7×10^-5g/mL胱氨酸样品中二硫键的含量。

如图3－图6所示，根据本发明方法建立的一种痰液快速检测试剂盒，主要包括收集管1、管盖2、检测杆4。

本发明一个实施例中收集管1为透明塑料离心管，口径：0.8cm高度：10cm，可立，带有管盖，可旋紧密封。在样品检测完成后，试剂盒整体与样品溶液一起处于盖紧密封状态，避免污染环境。本实施例中，所述收集管1和管盖2通过螺旋固定，螺旋固定较扣盖制作成本小，生产技术成熟，密封性好。

检测杆4上端与收集管的管盖2可拆卸连接固定。检测杆4内固定置有试纸条42，试纸条42的大小根据检测杆的大小来确定。本发明的试纸条42为铁氰化钾试纸条。

检测杆4和管盖2采用可拆卸连接，其在生产装配时处于相互分离状态，便于将试纸条 42和过滤层43装入到检测杆4中；其在检测使用过程中处于相互连接状态，便于利用管盖2 旋紧固定检测杆4的位置。

一个实施例中，管盖2朝向收集管1内部一侧凹陷设置有与检测杆4顶部形状相匹配的凹槽7，通过将检测杆4顶部插入凹槽7内对检测杆4进行固定。采用嵌入的方式进行固定，操作方便，且固定效果好。

所述检测杆4上部设置有一个直径略小于收集管内部直径的固定环5，固定环5的存在使得检测杆4始终与收集管1平行且位于管内正中央，防止检测杆4在检测过程中掉落。

所述固定环5和检测杆4之间连接设置有多根凸杆6；所述凸杆6位于固定环内侧壁上，径向向内延伸。凸杆6均匀设置，本实施例中设有三根，可以更好的卡住检测杆4。

收集管1在检测时还需要加入缓冲液A和还原剂B，如图6所示，收集管1中加入缓冲液A和还原剂B的混合物8。本实施例中，所述缓冲液A为2mL pH 6.2的15mM氯化锌、 100mM氯化钙、10mM MES，还原剂B为2.0g铁粉。

检测杆4下端置有过滤层41，过滤层41功能是过滤除去样品溶液中的不溶性异物以及吸附样品本身颜色，排除对检测的干扰。本发明一个实施例中所述过滤层41由总厚度为1厘米的过滤嘴海绵中间填充皂土组成。

本实施例中试纸条42放置在检测杆4内，可不设置样品控制线。

本实施例中，检测杆4内置的试纸条42由尺寸(长×宽)为20mm×5mm滤纸条及背部支撑塑料条组成。在距试纸条下端12mm处，干燥有5μL饱和铁氰化钾溶液(1.09M)。

检测杆4上与试纸条42结果指示区域以及质控指示区域的相应位置设有结果指示窗口和质控指示窗。在结果指示区域是一条5mm长度的铁氰化钾区域。

在检测杆4中距过滤层上端9mm处设有宽2mm结果指示窗43，此窗口与试纸条的结果指示区421对应。若样品含有痰液，则检测完成后在此窗口观察到明显蓝色条带。

在检测杆距过滤嘴上端约16mm处设有宽约2mm质控指示窗44，与试纸条的质控指示区424对应。在检测使用前，该区域不显示颜色，在使用时显示由过量的铁氰化钾迁移形成的黄色，指示样品和操作合格，结果可靠。若在使用前，该区域已经显示颜色，说明检测杆的试纸条已经变质，不建议继续使用。若在检测使用后，该区域仍不显示颜色，说明样品或操作不合格，结果不可靠。

以上实施例中的各种结构的尺寸均不构成对本发明的唯一限定，可根据样品的检测需要和检测产品的形状性能等选择合适的尺寸。

收集管1靠近底部设有样品量控制线9，用于控制添加的样品量，不能超过该样品量控制线9.

该试剂盒主要用于检测咳出液中有无痰液成分，具体使用步骤为：(1)打开管盖，向收集管中吐入一口咳出液(约2mL)，(2)打开缓冲液A和还原剂B，将内容物全部倒入收集管1中，(3)将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5分钟，(4)静置，观察结果指示窗，出现蓝色条带为阳性，指示有咳痰症状。否则，为阴性，指示无咳痰症状。

实施例1检测试纸上铁氰化钾浓度

(1)实验试剂及样品

还原剂：2.0g还原铁粉

缓冲溶液：100mM氯化钙，1.2mM MES溶液，pH 6.2。

阳性样品：2mL 0.05g/mL的胱氨酸溶液；阴性样品：2mL 0.05g/mL的甲硫氨酸溶液

试纸条：在结果指示区滴加5μL铁氰化钾，浓度分别为0.2/0.4/0.6/0.8/1.0/1.09M。

(2)样品试验

分为12组，分别将6组阳性样品和6组阴性样品转移至收集管，加入2mL缓冲溶液，和 2g铁粉。震荡离心管5min，静置1min将不同组的试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

结果三次实验结果显示均相同，如下表所示：

表1铁氰化钾浓度优化结果

参见表1，试纸条中铁氰化钾浓度越高，显色效果越好。铁氰化钾浓度为1.00～1.09M，显色效果最佳。

实施例2试纸上铁氰化钾滴加体积优化

(1)实验试剂及样品

还原剂：2.0g还原铁粉

缓冲溶液：100mM氯化钙，1.2mM MES溶液，pH 6.2。

试纸条：在结果指示区滴加1/3/5/7/10μL铁氰化钾，浓度为1.09M。

(2)样品试验

分为10组，分别将阳性样品和阴性样品转移至收集管，加入2mL缓冲溶液，和2g铁粉。晃动离心管5min，静置1min将不同组的试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

结果三次实验结果显示均相同，如下表所示：

表2铁氰化钾体积优化结果

参见表2，铁氰化钾溶液滴加量≥5μL时，显色效果已能达到最佳，继续滴加更大体积，并不能增强显示效果，反而可能会导致显色区域扩散，所以滴加体积选定在5μL。

实施例3金属还原剂的选择对二硫键检测的影响

(1)实验试剂及样品

本二硫键的检测方法包括还原剂和缓冲溶液。

还原剂：不同的金属还原剂(铁粉、锌粉、锡粉)

缓冲溶液：100mM氯化钙，1.2mM MES溶液，pH 6.2。

铁氰化钾试纸条：裁出尺寸(长×宽)为20mm×5mm的滤纸条。距试纸条底部约11mm，标有虚线条的铁氰化钾线，虚线及上方约5mm区域滴加5μL饱和铁氰化钾溶液并干燥，在铁氰化钾线上方约5mm处，标有短线条的质控指示线。其中结果指示区为距离试纸条底部约 9-11mm的试纸条区域，质控指示区为试纸条底部约16-20mm试纸条区域.

(2)样品试验

分成8组，分别将4组阳性样品和4组阴性样品移至收集管，每组各加入2mL缓冲溶液，分别加入2.0g铁粉、锌粉、或锡粉，或不加还原剂。每组用相同速率震荡5min，静置1min。将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

结果三次实验结果显示均相同，如表所示：

表3不同还原剂检测结果

还原剂	胱氨酸	甲硫氨酸
			无还原剂	-	-
铁粉	+++	-
			锌粉	-	-
锡粉	-	-

参见表3，在本实验条件下，铁粉还原能够检测胱氨酸所含的二硫键，锌粉和锡粉无显色作用。三种金属还原剂对阴性样品(甲硫氨酸)均无显色作用。

实施例4铁粉用量优化

(1)实验试剂及样品

本二硫键的检测方法包括还原剂和缓冲溶液。

还原剂：铁粉

缓冲溶液试纸条同实施例3。

(2)样品试验

分成10组，分别将5组阳性样品和5组阴性样品转移至收集管，每组各加入2mL缓冲溶液，阳性和阴性样品分别加入0、0.25、0.50、1.0、1.5g/ml铁粉。每组用相同速率震荡5min，静置1min。将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

结果三次实验结果显示均相同，如下表所示：

表4铁粉用量优化结果

铁粉用量(g/ml)	胱氨酸	甲硫氨酸
			0	-	-
0.25	+	-
			0.50	++	-
1.0	+++	-
			1.5	+++	+

参见表4，当还原铁粉用量达到1.0g/ml时，阳性样品的能达到清晰明确的阳性检测结果。继续增加铁粉用量，阳性检测结果显色程度未见明显变化。因此，铁粉用量与缓冲溶液的比例为1.0g：1mL，能达到最佳检测效果。

实施例5缓冲液阳离子条件的确定

(1)实验试剂及样品

还原剂：2.0g铁粉

阳离子缓冲溶液：2mL 10mM的氯化镁/氯化钠/氯化钙/氯化锌溶液，pH6.2

试纸条同实施例3。

(2)样品试验

分成10组，将5组阳性样品和5组阴性样品转移至收集管，每组分别加入2mL浓度为10 mM的氯化钙/氯化钠/氯化镁/氯化锌pH6.2缓冲溶液和不额外添加阳离子的pH6.2缓冲溶液，每组加入2g铁粉。以相同速率震荡5min，静置1min。将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

结果三次实验结果显示均相同，如小表所示：

表5阳离子条件优化结果

缓冲液	胱氨酸	甲硫氨酸
			无阳离子	-	-
氯化钙	+++	-
			氯化镁	+	-
氯化钠	-	-
			氯化锌	+	-

参见表5，二价阳离子缓冲液可以促进铁粉还原二硫键的显色效果，其中氯化钙显色效果最佳，氯化锌与氯化镁次之。具体观察显色条带形态，氯化钙与氯化镁体系的显色条带形态不规则，持续浸泡易呈现扩散和漂移，而氯化锌的显色条带呈平直的细线形，且并不扩散或漂移，显示具有固定作用。因此，我们选择继续深入测试氯化钙和氯化锌体系，并组合氯化钙与氯化锌进行测试，以利用氯化钙的高灵敏度和氯化锌的固定作用。

实施例6缓冲液氯化钙浓度优化

(1)实验试剂及样品

缓冲溶液：0/50/100/150/200/250/300mM氯化钙溶液，0.1g/L MES溶液调pH值为6.2。

铁粉、试纸条同实施例5。

(2)样品试验

分成14组，将7组阳性样品和7组阴性样品转移至收集管，每组分别加入2mL氯化钙浓度为0/50/100/150/200/300mM的缓冲溶液，每组加入0.5g还原铁粉和0.001g皂土。每组以相同速率震荡5min，静置1min。将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

三次实验结果显示均相同，如下表所示：

表6氯化钙浓度优化结果

氯化钙浓度/(mM)	胱氨酸	甲硫氨酸
			0	-	-
50	++	-
			100	+++	-
150	+++	-
			200	+++	-
250	++	-
			300	++	-

参见表6，在检测阳性样品中，当氯化钙浓度过低(＜100mM)时，二硫键还原效果较差；在检测阴性样品中，当氧化钙浓度过高(＞300mM)时，结果指示区显色。综上所述，当氯化钙浓度在100～300mM范围内检测效果最佳。

实施例7：氯化锌浓度优化

缓冲溶液：0/5/10/15/20/25mM氯化锌溶液，0.1g/L MES溶液调pH值为6.2。

铁粉、试纸条同实施例5。

(2)样品试验

分成12组，将6组阳性样品和6组阴性样品转移至收集管，每组分别加入2mL氯化锌浓度为0/5/10/15/20/25mM的缓冲溶液，每组加入0.5g还原铁粉和0.001g皂土。每组以相同速率震荡5min，静置1min。将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

三次实验结果显示均相同，如下表所示：

表7氯化锌浓度优化结果

氯化锌浓度/(mM)	胱氨酸	甲硫氨酸
			0	-	-
5	+	-
			10	+	-
15	++	-
			20	+	-
25	++	-

参见表6，在检测阳性样品中，当氯化锌浓度15mM时，显色最深，且相对集中且清晰。

实施例8：氯化钙与氯化锌混合缓冲液测试

(1)实验试剂及样品

缓冲溶液：0/50/100/150/200mM氯化钙溶液，分别与0/5/10/15/20mM氯化锌溶液混合，0.1g/L MES溶液调pH值为6.2。

铁粉、试纸条同实施例5。

(2)样品试验

分成10组，将5组阳性样品和5组阴性样品转移至收集管，每组分别加入2mL(1)中缓冲溶液，每组加入0.5g还原铁粉和0.001g皂土。每组以相同速率震荡5min，静置1min。将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

三次实验结果显示均相同，如下表所示：

表8氯化锌与氯化钙混合缓冲液测试结果

参见表8，在检测阳性样品中，当氯化锌浓度在15mM与氯化钙浓度100mM混合缓冲液显色最为明显且条带最为清晰整齐。

实施例9缓冲溶液pH值优化

(1)实验试剂及样品

缓冲溶液：0/50/100/150/200mM氯化钙溶液，分别与0/5/10/15/20mM氯化锌溶液混合，0.1g/L MES溶液调pH值为5.8/6.0/6.2/6.4/6.6

铁粉、试纸条同实施例5。

(2)样品试验

分成10组，将5组阳性样品和5组阴性样品转移至收集管，每组分别加入2mL pH值为 5.6/5.8/6.0/6.2/6.4/6.6的缓冲溶液，每组加入0.5g还原铁粉和0.001g皂土。以相同速率震荡5min，静置1min。将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

三次实验结果显示均相同，如下表所示：

表9缓冲液pH值优化结果

pH值	胱氨酸	甲硫氨酸
			5.6	+++	+
5.8	+++
			6.0	+++	-
6.2	++++	-
			6.2	+++	-
6.4	++	-
			6.6	+	-

参见表9，当缓冲液pH较高(>6.2)时，阳性样品检测的显色效果会变弱，当缓冲液pH较高时(<5.8)时，阴性样品检测的显色结果会有微蓝。综上所述，当缓冲液pH在5.8-6.4时，检测效果较好。

实施例10缓冲剂的优化

(1)实验试剂及样品

缓冲溶液：

15mM氯化锌与100mM氯化钙混合缓冲液，10mM MES溶液，pH 6.2。

15mM氯化锌与100mM氯化钙混合缓冲液，用pH＝4.0，1M乙酸-乙酸钠溶液调pH值为6.2。

15mM氯化锌与100mM氯化钙混合缓冲液，1mM MOPS溶液，pH 6.2。

15mM氯化锌与100mM氯化钙混合缓冲液，2.0mM Bis-Tris HCL溶液，pH 6.2。

铁粉、试纸条同实施例5。

(2)样品试验

分成4组，将2组阳性样品和2组阴性样品转移至收集管，每组各加入2mL氯化钙浓度为140mM的缓冲溶液，2g铁粉。分别以相同速率震荡5min，静置1min。将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

三次实验结果显示均相同，如下表所示：

表10缓冲剂优化结果

缓冲剂	胱氨酸	甲硫氨酸
			MES	+++	-
乙酸-乙酸钠	++	-
			MOPS	++	-
Bis-Tris HCL	++	-

参见表10，四种缓冲剂都有效果，但是MES作为缓冲剂时，检测效果最佳。

实施例11反应时间对二硫键检测的影响

(1)实验试剂及样品

缓冲溶液配制：10ml缓冲液体系中，100mM氯化锌取1.5ml，1M氯化钙取1ml，1M MES取100μl，NaOH调节pH至6.2，用水补足体积至10ml。

铁粉、试纸条同实施例3。

(2)样品试验

分成12组，将6组阳性样品和6组阴性样品转移至收集管，每组各加入2mL氯化钙浓度为140mM的缓冲溶液和2g铁粉。分别以相同速率震荡1/2/3/4/5/10min，静置1min。将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

三次实验结果显示均相同，如下表所示：

表11反应时间测试结果

反应时间/min	胱氨酸	甲硫氨酸
			1	-	-
2	+	-
			3	++	-
4	++	-
			5	+++	-
10	+++	-

参见表11，当反应时间达到5min时，二硫键检测的显色效果较好，并且阴性样品的检测结果不受反应时间影响。继续延长反应时间并没有增加显色效果。综上所述，反应时间5min 检测效果最佳。

实施例12缓冲液体积对二硫键检测的影响

(1)实验试剂及样品

铁粉、试纸条、缓冲溶液同实施例11。

(2)样品试验

分成8组，将4组阳性样品和4组阴性样品转移至收集管，每组各加入0.5/1/2/4mL缓冲溶液，每组加入1g/ml还原铁粉。分别以相同速率震荡5min，静置1min。将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

三次实验结果显示均相同，如下表所示：

表12缓冲液体积测试结果

缓冲溶液体积/mL	缓冲液与样品体积比	胱氨酸	甲硫氨酸
				0.5	1:4	+	-
1	1:2	++	-
				2	1:1	+++	-
3	2:1	++	-

参见表12，缓冲溶液与样品溶液的体积比为1:1时，二硫键还原效果较好。比例较高或较低都会对显色结果造成影响。

实施例13本发明二硫键的检测方法的重复性

(1)实验试剂及样品

铁粉、试纸条、缓冲溶液同实施例11。

(2)样品试验

分为2组，分别将阳性样品和阴性样品转移至收集管，加入2mL缓冲溶液，和2g铁粉。震荡离心管5min，静置1min将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。重复上述实验三次。

实验结果如下表所示：

表13试纸条重复测试结果

样品	胱氨酸	甲硫氨酸
			1	+++	-
2	+++	-
			3	+++	-

观察以上重复试验结果，其阳性样品结果指示区显色都为“+++”，阴性样品结果指示区显色都为“-”，证明本二硫键的检测方法可以达到良好的重复性。

实施例14本方法对胱氨酸浑浊液参考品检测的线性范围

阳性样品：2mL 0.001/0.01/0.05/0.1g/mL的胱氨酸溶液；阴性样品：2mL 0.001/0.01/0.05/0.1g/mL的甲硫氨酸溶液。其它试剂材料同实施例11。

(2)样品试验

分为8组，分别将4组不同浓度的阳性样品和4组不同浓度的阴性样品转移至收集管，加入2mL缓冲溶液，和2g铁粉。震荡离心管5min，静置1min。将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

结果如表所示：

表14参考品线性范围检测结果

样品浓度(g/mL)	胱氨酸	甲硫氨酸
			0.001	+	-
0.01	++	-
			0.05	+++	-
0.1	+++	-

参见表14，，三次实验结果显示均相同，结果指示区的显色随着胱氨酸浓度增加而明显，胱氨酸浑浊液浓度过低时，试纸条显色区域仍会显色，但是显色比较微弱。二硫键的检测方法对不同浓度的阴性样品均不显色。二硫键线性范围在4～200mM，相当于0.001～0.05g/ml的胱氨酸。

实施例15本方法的特异性

(1)实验试剂及样品

对照样品：2mL 0.05g/mL的胱氨酸溶液分别加入0.1g的维生素C/牛血清蛋白(BSA) /脱脂奶粉溶液和0.1mLβ-巯基乙醇溶液；阳性对照：2mL 0.05g/mL的胱氨酸溶液。其它试剂材料同实施例11。

(2)样品试验

分为5组，分别将1组空白样品和4组对照样品转移至收集管，加入2mL缓冲溶液，和2g铁粉。震荡离心管5min，静置1min将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

结果如表所示：

表15特异性测试结果

样品	空白	维生素C	BSA	脱脂奶粉	β-巯基乙醇
						检测结果	+++	-	-	-	--

参见表15，三次实验结果显示均相同，除了胱氨酸以外的其他物质通过二硫键的检测方法均不显色，说明该方法对二硫键是否存在具有分辨能力。

实施例16颜色干扰试验

(1)实验试剂及样品

阳性样品：2mL 0.05g/mL的胱氨酸溶液。其它试剂材料同实施例11。

(2)样品试验

分为5组。将5组阳性样品转移至2mL离心管，分别加入2mL缓冲溶液，和2g铁粉。震荡离心管5min，静置1min。之后4组分别加入0.05g苏木精、溴甲酚紫、中性红、亚甲基蓝，另一组不加染料。将试纸条竖直插入液面下0.5cm，静置1-2分钟后观察试纸条结果指示区显色变化。

实验结果如图7A及图7B，可知，颜色的干扰基本不影响试纸条检测。后期通过加入过滤嘴过滤溶液再用试纸条检测，颜色的干扰影响基本可以消除。

实施例17本发明痰液快速检测试剂盒的生产

生产组分：收集管、管盖、检测杆、缓冲液A，还原剂B

痰液收集管为可密闭的透明塑料离心管，近底部标有样品控制线；

试纸条按实施例3制作。

检测杆为中空棒，设有结果指示窗和质控指示窗，与内置的铁氰化钾试纸条上的结果指示区、质控指示区分别对应，检测杆下端内置过滤层；

缓冲液A的配制：2000ml体系，100mM氯化锌取300ml，1M氯化钙取200ml，1M MES取20ml，NaOH调pH至6.2，用水补足体积至2000ml。缓冲液A按2ml/管分装。

还原剂B：天平称取2g铁粉，分装至管内，共1000只。

研制生产批号：202001001

质量检测：

(1)性状：包装完好，组分齐全；盛装试剂的离心管及缓冲液、铁粉无泄漏，无破损；品名、批号和有效期清楚；标签字迹清晰；说明书清晰完整。

(2)密封性：随机抽取20个产品进行产品密封性测定，每个产品的密封性均良好。

(3)阴阳性符合率：随机抽取20个产品，对阴性参考品和阳性参考品分别进行10次检测。阴性符合率为100％，符合阴性参考品的检测结果均为阴性的要求。阳性符合率为100％，符合阳性参考品的检测结果均为阳性的要求。

(4)检测限和精密度：以胱氨酸浑浊液制备C95、C50、C5参考品，浓度分别为0.12g/L、 0.1g/L、0.08g/L，分别含有0.48mM、0.40mM、0.32mM的二硫键。从每批次产品中随机抽取60个产品，对C95、C50、C5参考品各进行20次检测。C95的检出率为95％，符合≥95％的要求，C50的检出率为50％，符合＝50％±15％的要求，C5的检出率为5％，符合≤5％的要求。

实施例18阴性参考品

(1)试剂盒及阴性参考品制备：

唾液标本：无吸烟史，年龄在20-50岁的健康志愿者。用饮用水漱口后收集分泌的唾液。

实验试剂盒由实施例17生产的痰液快速检测试剂盒提供

(2)检测方法及标准：将阴性参考品转移至收集管，打开缓冲液A和还原剂B，将内容物全部倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5分钟，静置，观察结果指示窗。共进行10组测试，结果指示区均无蓝色，阴性符合率为100％。

实施例19阳性参考品

(1)试剂盒及阳性参考品制备：

痰液标本：志愿者提供。志愿者为年龄大于40周岁，吸烟年限超过10年，有慢性咳嗽和咳痰历史的志愿者。按取痰标准方法漱口后深咳收集。

实验试剂盒由实施例17生产的痰液快速检测试剂盒提供

(2)检测方法及标准：将阳性参考品转移至收集管，打开缓冲液A和还原剂B，将内容物全部倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5分钟，静置，观察结果指示窗。共进行10组测试，结果指示区均显蓝色，阳性检出率为100％。

实施例20精密度检测

(1)实验试剂及样品

实验试剂盒由实施例17生产的痰液快速检测试剂盒提供

精密度参考品：C5/C50/C95分别为2mL的8×10^-5/1×10^-4/1.2×10^-4g/mL胱氨酸(含有 0.32/0.40/0.48mM二硫键)

(2)样品试验

分为三组，向收集管内分别加入2mL三种浓度梯度的精密度参考品，打开缓冲液A和还原剂B，将内容物全部倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5 分钟，静置，观察结果指示窗。重复实验20次，统计阳性(显示蓝色条带)次数及检出率。

结果如下表所示：

表16精密度检测结果

精密度参考品	C5	C50	C95
				检测次数	20	20	20
阳性次数	1	11	19
				检出率	5％	55％	95％

C95的检出率为95％，符合≥95％的要求，C50的检出率为55％，符合＝50％±15％的要求， C5的检出率为5％，符合≤5％的要求。

实施例21样品稳定性测试

(1)实验试剂及样品

实验试剂盒由实施例17生产的痰液快速检测试剂盒提供

样品：2mL室温/4℃/-20℃放置0/1/3天的痰液

(2)样品试验

分为6组，分别将6组不同的样品转移至收集管，打开缓冲液A和还原剂B，将内容物全部倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5分钟，静置，观察结果指示窗。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

结果三次实验结果显示均相同，如下表所示，

表17样品稳定性测试结果

根据表17可知，痰液直接检测效果最佳，在室温下保存3天会影响检测效果，在4℃和 -20℃环境中放置3天检测效果不变。

实施例22健康人群咳出液检测

(1)实验试剂及样品

痰液快速检测试剂盒按实施例17研制生产提供。

咳出液样本：无吸烟史，年龄在20-50岁的健康志愿者。收集即时分泌的咳出液。

性状判断。性状判断由专业医生指导进行。首先通过目测性状进行判断，较透明且无粘稠的标本直接判断为唾液，当目测难以判断时，通过涂片显微镜检查，选择3个区域进行细胞计数，鳞状上皮细胞数量＞20％细胞总数，判断为唾液。

样本由20位志愿者提供，每位志愿者连续提供3次咳出液。通过性状判断，判断均为唾液，即阴性样品。

(2)样品试验

分别将60组咳出液样本分别转移至收集管，打开缓冲液A和还原剂B，将内容物全部倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5分钟，静置，观察结果指示窗。检测结果分别用“-”和“+”表示阴性和阳性。

表18健康人群咳出液检测结果

样本	体积	结果	样本	体积	结果	样本	体积	结果	样本	体积	结果
												1	3.1	-	16	2.6	-	31	2.3	-	46	2.8	-
2	2.6	-	17	2.4	-	32	2.5	-	47	2.6	-
												3	2.5	-	18	2.8	-	33	2.1	-	48	2.4	-
4	2.1	-	19	1.7	-	34	2.2	-	49	3.8	-
												5	1.8	-	20	2.6	-	35	2.8	-	50	2.7	-
6	2.6	-	21	2.8	-	36	2.7	-	51	2.8	-
												7	2.1	-	22	2.6	-	37	2.6	-	52	2.3	-
8	2.3	-	23	2.3	-	38	2.3	-	53	2.2	-
												9	2.2	-	24	2.4	-	39	2.4	-	54	2.4	-
10	2.6	-	25	2.9	-	40	2.9	-	55	1.9	-
												11	2.9	-	26	2.7	-	41	2.7	-	56	2.8	-
12	2.7	-	27	2.2	-	42	3.2	-	57	2.5	-
												13	3.3	-	28	2.5	-	43	2.6	-	58	2.6	-
14	3.4	-	29	2.2	-	44	2.3	-	59	2.4	-
												15	2.8	-	30	3.0	-	45	2.2	-	60	2.7	-

采集自健康人群的60份咳出液标本，通过本发明痰液快速检测试剂盒检测的结果是全部为阴性，与性状判断结果一致。

实施例23慢阻肺患者人群咳出液试剂盒检测

(1)实验试剂及样品

痰液快速检测试剂盒按实施例17研制生产提供。

咳出液样本：年龄在40-65周岁的慢阻肺患病志愿者。按取痰标准方法漱口后深咳收集。

性状判断。性状判断由专业医生指导进行。首先通过目测性状进行判断，不透明且呈粘稠的标本直接判断为痰液，当目测难以判断时，通过涂片显微镜检查，选择3个区域进行细胞计数，鳞状上皮细胞数量≤20％细胞总数，判断为痰液。

样本由20位志愿者提供，每位志愿者连续提供3次咳出液。通过性状判断均为痰液，即阳性样品。

(2)样品试验

分为60组，分别将60组咳出液样本转移至收集管，通过目测其粘稠度来判断是否存在痰液，分别用“-”和“+”表示阴性和阳性；打开缓冲液A和还原剂B，将内容物全部倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5分钟，静置，观察结果指示窗，出现蓝色条带判断为阳性(+)，无蓝色条带为阴性(-)。

表19慢阻肺患者咳出液检测结果

样本	体积	结果	样本	体积	结果	样本	体积	结果	样本	体积	结果
												1	2.8	+	16	2.5	+	31	2.3	+	46	3.8	+
2	2.6	+	17	2.9	+	32	2.5	+	47	2.6	+
												3	2.7	+	18	3.1	+	33	2.1	+	48	2.4	+
4	3.1	+	19	1.9	+	34	2.2	+	49	2.8	+
												5	2.1	+	20	4.2	+	35	2.8	+	50	1.7	+
6	2.8	+	21	2.8	+	36	2.7	+	51	2.8	+
												7	2.5	+	22	2.6	+	37	3.1	+	52	2.3	+
8	3.5	+	23	2.3	+	38	2.6	+	53	2.2	+
												9	1.9	+	24	2.4	+	39	2.5	+	54	2.4	+
10	2.6	+	25	2.9	+	40	2.1	+	55	2.9	+
												11	2.9	+	26	2.7	+	41	1.8	+	56	2.8	+
12	2.7	+	27	3.2	+	42	2.6	+	57	2.5	+
												13	2.3	+	28	2.5	+	43	2.1	+	58	2.6	+
14	3.4	+	29	2.2	+	44	2.3	+	59	2.4	+
												15	1.8	+	30	2.0	+	45	2.2	+	60	2.7	+

采集自慢阻肺患者的60份咳出液标本，通过本发明痰液快速检测试剂盒检测的结果是全部为阳性，与性状判断结果一致。

实施例24重度吸烟人群咳出液的检测和比对

(1)实验试剂及样品

实验试剂盒由实施例17生产的痰液快速检测试剂盒提供

咳出液样本：志愿者为年龄大于40周岁，吸烟年限超过10年，每天吸烟数量≥20支，有慢性咳嗽和咳痰历史的志愿者。按取痰标准方法漱口后深咳收集。样本由50位志愿者提供，每位志愿者连续提供3次咳出液。

性状判断。性状判断由专业医生指导进行。首先进行目测判断，不透明且呈粘稠的标本直接判断为痰液(阳性，+)，较透明且无粘稠的标本直接判断为唾液(阴性，-)；当目测难以判断时，通过涂片显微镜检查，选择3个区域进行细胞计数，鳞状上皮细胞数量≤20％细胞总数，判断为痰液(阳性，+)，否则判断为唾液(阴性，-)。

(2)样品试验

表20两种方法对150例重度吸烟人群咳出液检测结果

表21本试剂盒VS.性状判断

根据表21计算，

P_o＝(92+42)/150＝0.893

P_e＝(92×108+58×42)/150×150＝0.550

Kappa＝(P_o-P_e)/(1-P_e)＝0.762

运用kappa法验证两种方法的具有高度的一致性，两种方法的检测结果一致性较高。

实施例25本发明与镜检法对唾液痰液混合样品的检测比对

(1)实验试剂及样品

实验试剂盒由实施例17生产的痰液快速检测试剂盒提供

唾液标本：无吸烟史，年龄在20-50岁的健康志愿者。收集即时分泌的唾液。

痰液标本：年龄在40-65周岁的慢阻肺患病志愿者。按取痰标准方法漱口后深咳收集。

痰液唾液混合液标本：取痰液与唾液，分别按1:5、1:3、1:2、1:1的比例混合，按约2mL/ 份进行分装，制备每种比例的混合液标本各50份。

(2)样品检验

本发明试剂盒：分为5组，将5组不同痰液比例的阳性样品和1组阴性样品转移至收集管，取样做痰液镜检。打开缓冲液A和还原剂B，将内容物全部倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5分钟，静置，观察结果指示窗，出现蓝色条带判断为阳性(+)，无蓝色条带为阴性(-)。

镜检法：在载玻片上分别滴加一滴生理盐水和样品制成涂片，利用40×显微镜观察痰涂片，若观察视野内鳞状上皮细胞数＞20％，则判定为阴性(-)；若观察视野内鳞状上皮细胞数≤20％，且明显存在白细胞，则判定为阳性(+)。

实验结果如下表所示：

表22痰液唾液混合液样品痰液检出率

样品(痰液唾液混合比)	本试剂盒	镜检法
			1:1	100％(50/50)	100％(50/50)
1:2	100％(50/50)	48％(24/50)
			1:3	100％(50/50)	28％(14/50)
1:5	44％(22/50)	12％(6/50)

参见表22，对不同比例的痰液唾液混合液进行检测比对，当痰液在混合液中比例较高时，本发明试剂盒检测与镜检法均能达到100％检出，但当痰液在混合液中比例低于50％时，本试剂盒检出率显著高于镜检法，因此，我们推断本试剂盒在用于咳出液标本检测时，能达到更好的咳痰检测灵敏度。

实施例26痰液加入不同的干扰物质对检测效果的影响

(1)实验试剂及样品

实验试剂盒由实施例17生产的痰液快速检测试剂盒提供

唾液标本：无吸烟史，年龄在20-50岁的健康志愿者。收集饮用水漱口后分泌的唾液。

阳性样品：加入0.1g脱脂奶粉/维生素C/牛血清蛋白或0.1mLβ-巯基乙醇的2mL痰液

阴性样品：加入0.1g脱脂奶粉/维生素C/牛血清蛋白或0.1mLβ-巯基乙醇的2mL唾液

(2)样品试验

分为10组，分别将5组阳性样品和5组阴性样品加入到收集管中，打开缓冲液A和还原剂B，将内容物全部倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5分钟，静置，观察结果指示窗。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

结果如下表所示：

表23干扰物质测试结果

样品编号	样品	干扰物质	检测结果
				1	阳性	脱脂奶粉	+++
2	阳性	维生素C	+++
				3	阳性	牛血清蛋白	+++
4	阳性	β-巯基乙醇	+++
				5	阳性	无	+++
6	阴性	脱脂奶粉	-
				7	阴性	维生素C	-
8	阴性	牛血清蛋白	-
				9	阴性	β-巯基乙醇	-
10	阴性	无	-

根据表23可知，本实验中阳性样品添加干扰物质后，检测结果仍为阳性；阴性样品添加干扰物质后，检测结果仍为阴性。所测试的干扰物质均不影响样品测试结果。

实施例27试剂盒稳定性测试

(1)实验试剂及样品

实验试剂盒由实施例17生产的痰液快速检测试剂盒提供(分别在室温下放置10/20/30 天)

阳性标本：痰液，志愿者提供。志愿者为年龄大于40周岁，吸烟年限超过10年，有慢性咳嗽和咳痰历史的志愿者。按取痰标准方法漱口后深咳收集。

阴性标本：唾液，志愿者提供。志愿者为无吸烟史，年龄在20-50岁的健康志愿者。收集饮用水漱口后分泌的唾液。

(2)样品试验

分为6组，分别将3组阳性样品和3组阴性样品转移至收集管，打开缓冲液A和还原剂B，将内容物全部倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5分钟，静置，观察结果指示窗。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

结果如下表所示：

表24样品稳定性测试结果

样品编号	样品	试剂盒存放时间	检测结果
				1	阳性	10天	+++
2	阳性	20天	+++
				3	阳性	30天	+++
4	阴性	10天	-
				5	阴性	20天	-
6	阴性	30天	-

根据表24可知，本实验中，痰液快速检测试剂盒存放10/20/30天后，阳性样品检测结果仍为阳性；阴性样品检测结果仍为阴性。放置时间不影响样品测试结果。

实施例28痰液稀释样品pH值对本试剂盒检测结果的影响

(1)实验试剂及样品

痰液的pH值和病变性质等有关，一般中性，或者偏碱，少数情况下可能会呈弱酸性。痰液的pH范围大约在6.0～8.0。本实施例通过利用不同pH值的NaCl溶液稀释痰液标本再取样检测，研究样品pH值对痰液检测效果的影响。

实验试剂盒由实施例17生产的痰液快速检测试剂盒提供

样品：向每份痰液标本按1:1比例加入pH为6.0/6.5/7.0/7.5/8.0的0.9％NaCl溶液，充分混合，各取2mL用于下面测试。

(2)样品试验

分为5组，分别将pH为6.0/6.5/7.0/7.5/8.0的2mL样品转移至收集管，打开缓冲液A 和还原剂B，将内容物全部倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5分钟，静置，观察结果指示窗。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

结果如下表所示：

表25不同pH值的痰液稀释样品的测试结果

样品编号	1	2	3	4	5
						样品pH	6.0	6.5	7.0	7.5	8.0
第1组检测结果	+++	+++	+++	+++	+++
						第2组检测结果	+++	+++	+++	+++	+++
第3组检测结果	+++	+++	+++	+++	+++

参见表25，本试剂盒对pH 6.0-8.0之间的痰液稀释样品的检测结果均为阳性。

实施例29唾液pH对本试剂盒检测结果的影响

唾液的pH值一般中性，或者偏酸，少数情况下可能会呈弱碱性，pH范围大约在6.0～8.0。

本实施例通过利用不同pH值的NaCl溶液稀释唾液标本再取样检测，研究样品pH值对唾液检测效果的影响。

样品：向每份唾液标本按1:1比例加入pH为6.0/6.5/7.0/7.5/8.0的0.9％NaCl溶液，充分混合，各取2mL用于下面测试。

(2)样品试验

分为5组，分别将pH为6.0/6.5/7.0/7.5/8.0的2mL唾液转移至收集管，打开缓冲液A 和还原剂B，将内容物全部倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约5分钟，静置，观察结果指示窗。颜色变化用“-”和“+”表示。“-”为无蓝色，“+”越多蓝色越深。每组实验均重复三次。

结果如下表所示：

表26不同pH值的唾液稀释样品的测试结果

样品编号	1	2	3	4	5
						唾液pH	6.0	6.5	7.0	7.5	8.0
第1组检测结果	-	-	-	-	-
						第2组检测结果	-	-	-	-	-
第3组检测结果	-	-	-	-	-

参见表26，本试剂盒对pH 6.0-8.0之间的唾液稀释样品的检测结果均为阴性。

Claims

1.一种二硫键的检测方法，其特征在于，将待测样品与缓冲体系及铁粉混合；然后利用铁氰化钾显色检测样品中的二硫键；其中缓冲体系为pH 6.2的15mM氯化锌、100mM氯化钙和10mM 2-(N-吗啉)乙磺酸溶液。

2.根据权利要求1所述的二硫键的检测方法，其特征在于，样品溶液与缓冲体系的体积比为1:1；铁粉与缓冲体系的比例为每1mL缓冲体系对应1g铁粉。

3.根据权利要求1所述的二硫键的检测方法，其特征在于，利用铁氰化钾试纸条显色指示；试纸条上干燥有5-10μL，浓度1.00-1.09M的铁氰化钾。

4.一种含二硫键的痰液快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括收集管、管盖、检测杆，收集管为可密闭的透明离心管；检测杆为中空棒，内置铁氰化钾试纸条，检测棒还设有结果指示窗和质控指示窗；收集管中可事先放置缓冲体系和还原剂铁粉，也可在加入待测样品后加入缓冲体系和铁粉，其中缓冲体系为pH 6.2的15mM氯化锌、100mM氯化钙和10mM 2-(N-吗啉)乙磺酸溶液。

5.根据权利要求4所述的含二硫键的痰液快速检测试剂盒，其特征在于，收集管靠近底部标有样品控制线。

6.根据权利要求4所述的含二硫键的痰液快速检测试剂盒，其特征在于，检测杆下端设有过滤层。