CN108982498A - 利用痰液间接检测气道表面液pH值的方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用痰液间接检测气道表面液pH值的方法、用途及装置。将痰液与水或中性水溶液混合，通过吸附材料吸附滤除痰液中的粘稠异物及杂色干扰，然后通过pH检测装置指示pH值；其中吸附材料吸附痰液中的粘稠异物及杂色干扰，同时又不会与痰液发生反应，或者影响痰液的pH值。该方法省去了痰液常规检测过程中的痰液液化步骤，排除了液化试剂、痰液粘蛋白、标本变质、异物杂色等干扰因素的影响，检测结果能反映痰液带出的源于气道表面液的pH值，可用于判断气道表面液pH值相关的肺部生理或病理状态或痰液相关的其它检测分析。本发明的装置能够在5分钟内完成痰液pH值的显色测定，并能通过密封防止潜在病原体扩散污染环境的问题。

Description

利用痰液间接检测气道表面液pH值的方法及装置

技术领域

本方法属于用于医学检测的样本预处理和检测技术领域，涉及一种利用痰液间接检测气道表面液pH值的方法、用途及装置，关键技术为稀释过滤检测未经液化的痰液的pH值。

背景技术

气道表面液(Airway surface liquids,ASL)是覆盖在呼吸道上皮表面很薄的液体层，分为水相和黏液相两层，是呼吸道上皮与外界接触的第一道屏障，在维持呼吸道湿化、上皮细胞功能、呼吸道防御等方面有重要作用。气道表面液的pH值对维持呼吸道的生理状态有重要意义。pH值降低可导致上皮细胞与基底膜分离，诱发咳嗽，抑制纤毛运动。目前已有研究证实，气道表面液的pH值变化与呼吸道感染、肺癌、哮喘、囊状纤维化等多种疾病有关。当患者呼吸系统感染病原微生物时，病原微生物常产生酸性或碱性代谢物使得患者气道表面液呈现酸性或碱性特性。一些慢性肺部疾病患者由于肺部细胞表面离子通道的变化使得其气道表面液pH值也发生相应变化。此外，肺癌患者的气道表面液pH值较健康人偏低，原因如下：①缺氧是癌细胞微环境的一个主要特征。癌细胞生长繁殖速度快，血管内的氧气无法弥散到距离较远的肿瘤组织，故导致癌细胞缺氧。在氧气匮乏的情况下，癌细胞进行无氧呼吸，产生大量CO₂和乳酸。另一方面，大量研究证实，即使在供氧充足的情况下，癌细胞仍以无氧糖酵解为主来获取能量，仍会产生CO2和乳酸，此即为“Warburg效应”；②肺癌的发生和发展进程中存在一种跨膜电导调节因子(CFTR,transmembrane conductanceregulator)的调节机制，在肺癌细胞中CFTR的表达量减少，导致胞外的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)减少；③肺癌的发生和发展进程中还存在另一种V型质子转移ATP酶(V-ATPase)调节机制，在肺癌细胞中V-ATPase被过表达，导致胞外氢离子(H⁺)增多。这三种机制综合作用使得肺癌患者的气道表面液酸性化。

痰液为人体呼吸道的分泌物，它是通过支气管纤毛运动上皮纤毛的运动，从肺部向上呼吸道推动，最后，通过人的正常咳嗽反射从气管内咳出排出体外。由痰液的产生和排出机制可知，痰液会携带部分气道表面液排出体外，因此通过检测痰液中气道表面液的pH值可用于判断气道表面液pH值相关的呼吸道及肺部生理或病理状态，如呼吸道感染、肺癌、哮喘、囊状纤维化等疾病。当人吸入刺激性气体、尘埃、致病细菌、病毒等有害微生物时，上呼吸道就可能发生炎症；或者肺部发生疾病，如支气管扩张、肺脓肿、肺癌等，呼吸道就会分泌增加，痰量就会增加，而痰的性质也会发生变化，可以由粘痰变成干酪痰、血痰、黄脓痰等。根据痰液产生和排出机制可知，痰液中包含多种病原微生物、各类炎症细胞、脱落坏死的黏膜上皮细胞以及肿瘤细胞等。痰液样本检测在临床上具有重要意义。目前在临床上，痰液样本主要用于痰液细胞学检测以及呼吸道病原体检测。此外，从肺癌高危人群及肺癌患者的痰液样本中提取核酸，可用于早期肺癌的预测以及肺癌患者的基因突变检测和治疗监测。

痰液样本具有粘度大、蛋白多、成分复杂等特点，痰液包含粘蛋白和其他多种蛋白(如免疫蛋白)、多种酶类、脱落细胞、微生物及其他吸入杂质等。由于痰液粘稠度大，不便于直接检测，痰液pH值的传统检测方法需要对痰液进行液化处理，目的是释放黏蛋白，降低痰液粘度。常见的痰液液化方法为氢氧化钠法、DTT(二硫苏糖醇)法以及蛋白酶法。然而，痰液经常规液化处理后检测的pH值不能反映源于气道表面液的真实pH值，原因如下：①液化剂本身会干扰痰液pH值，如氢氧化钠具有强碱性，DTT溶液显酸性且具有一定缓冲能力，严重干扰pH值；②液化处理后的痰液粘蛋白表面离子组成发生变化从而干扰pH值；③液化过程会使细胞破裂，其释放的物质也会影响痰液pH值。

痰液样本不易保存，室温条件下痰液样本中的细胞易破裂而释放可能会影响pH值的物质；痰液样本中携带的微生物会因为繁殖代谢等活动影响痰液的pH值。其次，部分痰液(尤其是带血痰液)存在杂色干扰，不可直接通过pH试纸或指示剂等简单方法来检测pH值。此外，一般受检者，即使是处于发病期的患者，也不是随时能咳出足够量的痰液，多半患者在晨起后痰液量较多，却无法及时收集并检测痰液。因此，痰液pH值检测还需要一种可以随时收集痰液并快速且准确获得检测结果的方法。

目前已报道的文献研究中,气道表面液pH值的检测方法主要包括比率型pH荧光探针法(如SNARF-1)和微电极法，这些方法操作复杂且设备条件要求高，仅作为科学研究使用。痰液pH值检测方法以氢氧化钠法和二硫苏糖醇液化法为主，未查询到检测未经液化的痰液pH值的方法。目前已公开的相近中国专利的技术核心分别针对痰液收集和痰液液化，尚未有检测未经液化的痰液pH值的发明技术。例如：中国专利申请文件CN206289244U，公开了一种痰液收集检验盒，该装置配有过滤和密封装置，可作为检验用的痰液收集装置，但该专利技术只涉及痰液收集，无痰液处理和检测过程。中国专利申请文件CN1694726A，公开了一种用于液化粘液或痰液的产品和方法，该专利技术涉及痰液液化处理的技术和方法，不涉及有效的痰液收集装置，也无检测技术。

发明内容

针对痰液样本成分复杂不易保存以及目前缺乏测定痰液带出的源于气道表面液的pH值的方法和装置等问题，本发明提供了一种方便携带可随时收集并快速检测痰液pH值的方法和装置。该方法省去了痰液常规检测过程中的痰液液化步骤，能够更迅速准确地测定痰液带出的源于气道表面液的pH值，避免液化试剂、痰液蛋白、标本变质、异物杂色等干扰因素的影响，可用于判断气道表面液pH值相关的肺部生理或病理状态或痰液相关的其它检测分析。

本发明的技术方案是：

本发明提供一种利用痰液检测气道表面液的pH值的方法，将痰液与水或中性水溶液混合，通过吸附材料吸附滤除痰液中的粘稠异物及杂色干扰，然后通过pH检测装置指示pH值；

其中吸附材料吸附痰液中的粘稠异物及杂色干扰，同时又不会与痰液发生反应，或者影响痰液的pH值；

所述pH检测装置为pH计、pH指示试剂、pH试纸中的一种或多种。

进一步，所述吸附材料为皂土、活性炭、硅藻土、滤纸中的一种或多种。

进一步，所述中性水溶液为质量分数0.85-0.9％的氯化钠溶液。

本发明还提供一种利用痰液检测气道表面液的pH值的装置，所述装置包括收集管、检测棒，其中收集管为可密闭容器，内部置有痰液稀释试剂；检测棒为中空棒，中空棒内部含有指示条和过滤器，其中指示条可指示pH值，过滤器内设吸附材料，所述吸附材料吸附痰液中的粘稠异物及杂色干扰，同时又不会与痰液发生反应，或者影响痰液的pH值；检测棒底部至少要接触痰液稀释试剂。

进一步，所述吸附材料为皂土、活性炭、硅藻土、滤纸中的一种或多种；所述吸附材料包裹在过滤包内，所述过滤包的包裹材料为可供液体透过的材料。

进一步，所述痰液稀释试剂为水或中性溶水液。

进一步，所述中性水溶液为质量分数0.85-0.9％的氯化钠溶液。

进一步，收集管中设有收集管固定器，所述收集管固定器卡在收集管壁上，中间设有容纳检测棒穿过的通孔，检测棒可穿过通孔并实现垂直固定。

本发明还提供一种利用痰液检测气道表面液的pH值的装置，所述收集管设有可密封的盖子，盖子上端设有一个小旋盖，小旋盖内部下方紧密连接检测棒；小旋盖与盖子之间放置一个可自由取出的安全垫圈；检测棒上端与小旋盖内部连接，下端伸入收集管中并与收集管底部保留一段固定距离，与检测棒最下端正中央相对的收集管底部设有一个顶针，顶针底部与收集管底部固定相连，针尖正对检测棒底部；检测棒最底部设有防水薄膜；当抽出安全垫圈后，针尖将防水薄膜刺穿。

此外，本发明还提供一种利用痰液检测气道表面液的pH值的装置，所述装置包括一个收集容器，收集容器为可封闭容器，收集容器内内装有痰液稀释试剂；收集容器内部隔断出一个独立的检测室，检测室内设有指示条，检测室底部与收集容器主体内部呈U型连通，连通处设有防水膜和过滤器；装置设有防水膜刺破装置，当触发对应开关时，可刺破防水膜，使得痰液稀释试剂从收集容器主体经过连通处进入检测室。

本方法具体内容为：将痰液收集在收集管(离心管)或大的收集容器(采痰杯)中，不限于此二种容器，其他能够容纳保护剂和痰液的容器均可；加入一定体积(≤20ml)的水或0.85％-0.9％的氯化钠中性水溶液或其他中性水溶液，充分混合0.5-5分钟；加入皂土、硅藻土、活性炭等直接搅拌再简单用滤纸等过滤，或者将这些介质制作成滤饼/滤层/滤包等过滤装置，将混合后的样本通过滤层等，或直接用多层滤纸过滤，从而达到吸附滤除痰液粘稠异物及杂色干扰的目的；利用pH计或pH指示试剂或pH试纸检测过滤后的样本pH值。

本发明的原理为：①痰液在产生和排出过程中携带有肺部脱落细胞及肺呼吸道局部内表面液，检测痰液带出的源于气道表面液的pH值可用于判断气道表面液pH值相关的肺部生理或病理状态或痰液相关的其它检测分析。②本发明省去了痰液常规检测过程中的痰液液化步骤，仅利用水或0.85％-0.9％的氯化钠中性水溶液稀释痰液，溶出痰液样本中源于气道表面液的离子，不破坏粘蛋白结构和表面离子组成；0.85％-0.9％的氯化钠中性水溶液稀可在较长时间内(20分钟)维持一定的渗透压防止细胞破裂释放干扰物质；稀释液为中性水溶液，不影响样本pH值。③以皂土、硅藻土、活性炭或滤纸等具有吸附作用且不影响溶液pH值的物质，吸附滤除痰液粘稠异物及杂色干扰，从而准确检测样本pH值。④以pH计或pH指示试剂或pH试纸显色指示pH值，经过实验验证，这些方法均可准确测定样本pH值。⑤本发明的中空检测棒具有毛细虹吸功能，可使稀释后的样本溶液快速顺着中空检测棒上升至检测试纸并显色。本发明中的检测棒兼具搅拌或促进液体混合的功能。⑥本发明将痰液完整收集在收集容器中，在密封条件下完成检测和结果判读，可有效防止潜在病原体扩散污染环境的问题。

本发明的有益效果是：本方法提供了一种可随时收集并快速稀释检测痰液pH值的方法用途和装置。本方法省去了痰液常规检测过程中的痰液液化步骤，能够更迅速准确地测定痰液带出的源于气道表面液的pH值，避免液化试剂、标本变质、异物杂色等干扰因素的影响，可用于判断气道表面液pH值相关的肺部生理或病理状态或痰液相关的其它检测分析。本装置由收集管、痰液稀释试剂、检测棒等组分组成，其中检测棒同时具有促进混合作用、过滤作用及显色功能。该装置能够在5分钟内完成痰液pH值的显色测定，并能通过密封防止潜在病原体扩散污染环境的问题。本发明的装置简单且成本低廉，使用方便，非常适合在临床广泛使用。

附图说明

图1为实施例7中利用痰液检测气道表面液的pH值的装置示意图。

图2为图1中第一种检测棒的示意图。

图3为图1中第二种检测棒的示意图。

图4为图1中第三种检测棒的示意图。

图5为图4中检测棒固定器的俯视图。

图6为第一种指示条示意图。

图7为第二种指示条示意图。

图8为实施例8的利用痰液检测气道表面液的pH值的装置结构示意图。

图9为实施例9的利用痰液检测气道表面液的pH值的装置结构示意图。

具体实施方式

为了验证本方法比传统痰液液化法更能准确测定源于气道表面液的痰液pH值，以氢氧化钠法和二硫苏糖醇液化法为参照，设置对比实验。其次，设置一系列验证实验说明本方法或装置中关键技术参数的设定和选择。此外，通过检测一定数量的临床样本验证肺癌等肺部疾病患者痰液pH值较正常人偏低。以下实施例中所用到的痰液样本由浙江今复康生物科技有限公司委托浙江大学医学院附属第一医院呼吸内科按临床标准取痰程序采集，参照《中国结核病防治规划·痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》，通过目测，黄色、灰色、铁锈色、血性、脓性、稠厚，呈现团块状的标本为接收标准。肺癌阳性痰液由临床确诊的肺癌患者采集得到。肺癌细胞中含有的端粒酶赋予了肺癌细胞无限增殖的能力，而端粒酶由肺癌细胞的hTERT mRNA翻译合成，因此hTERT mRNA是肺癌细胞的特征标志物。正常人的肺癌组织中无hTERTmRNA表达。在痰液的产生和咳出过程中，脱落的肺癌细胞混合在痰液中被咳出。因此在肺癌患者的痰液中能够检测到hTERT mRNA。核酸检测采用浙江今复康生物科技有限公司开发的“端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，该试剂盒可检测痰液样本中的hTERT mRNA。当PCR扩增结果为Ct值＜33时，表明检测结果为阳性即表示样本中含有hTERT mRNA；当PCR扩增结果为Ct值≥33或No Ct时，表明检测结果为阴性即表示样本中无hTERTmRNA。

实施例1：健康人与肺部疾病患者痰液pH值比较

通过实验比较健康人与肺部疾病患者的痰液pH值，证明肺部感染及肺癌等肺部疾病患者痰液pH值较正常人偏低。

步骤1：准备30例从医院收集得到的健康人以及肺部疾病患者痰液样本，分别编号1-30；

步骤2：分别向1-30号样本中加入适量0.9％的氯化钠水溶液，振荡管体0.5-1分钟，使得痰液与水溶液充分混合；

步骤3：分别向各样品管中加入0.5g活性炭，充分搅拌，再用单层滤纸简单过滤，取滤液备用；

步骤4：分别使用pH试纸和pH计检测各样本滤液的pH值。检测结果见下表。结果表明，肺部感染及肺癌患者痰液pH值≤7，健康人痰液pH值＞7，检测结果符合预期，证明肺部感染及肺癌等肺部疾病患者痰液pH值较正常人偏低，该结果与文献报道结果基本相符。本方法可用于判断气道表面液pH值相关的肺部生理或病理状态或痰液相关的其它检测分析。

实施例2：稀释液选择水或0.9％的氯化钠中性水溶液的对比

步骤1：准备2例从医院收集得到的体积为4-5ml的肺癌患者痰液，编号1-2,分别将每例样本均分两份；

步骤2：分别向每例样本的两个小份中加入5ml水和5ml 0.9％的氯化钠溶液，密封振荡0.5-1分钟，使得痰液与稀释试剂充分混合；

步骤3：加入0.5g活性炭，充分搅拌，再用单层滤纸简单过滤，取滤液备用；

步骤4：利用pH计检测各样本的pH值，再将各样本室温放置5分钟、10分钟、20分钟后再次检测各样本的pH值，检测结果见下表。

结果表明，使用水或0.9％的氯化钠中性水溶液稀释痰液完全可以实现痰液pH值的检测；其次，分别使用水和氯化钠溶液稀释检测痰液样本，在短时间内(5分钟)，二者检测结果无差别，当超过10分钟后，水稀释样本的pH值逐渐升高，而氯化钠溶液稀释样本的pH值保持稳定。出现此种现象的原因可能是样本中的细胞在水的长时间作用下因渗透压不均衡而破裂，胞内细胞质的pH较胞外更高，从而使得检测的pH值升高；而0.9％的氯化钠溶液维持细胞的等渗环境，可防止细胞破裂，从而保持痰液pH值的稳定。本方法可实现快速(5分钟内)检测样本pH值，因此本方法的稀释液使用水或氯化钠中性水溶液均可。当稀释和检测过程耗时较长时，推荐0.85％-0.9％的氯化钠中性水溶液作为更优的稀释液。水或中性水溶液作为痰液稀释液，无缓冲作用，不影响样本pH值，无毒、无刺激性、无不适气味。

实施例3：不同过滤吸附介质与不同检测方法的比较

步骤1：准备皂土、活性炭、硅藻土、滤纸；准备5-7例从医院收集得到的带血的痰液样本，充分混合，再分别取2ml加入到离心管中，编号1-7；

步骤2：分别向1-7号管中加入5ml水，振荡管体0.5-1分钟，使得痰液与水充分混合；

步骤3：分别向1-3号管中加入0.5g皂土、活性炭、硅藻土，充分搅拌，再用单层滤纸简单过滤，取滤液备用；分别利用双层、三层、四层滤纸直接过滤4-6号样品，取滤液备用；7号样品不做任何处理；

步骤4：分别使用pH试纸和pH计检测上步得到的滤液或样品。检测结果见下表。皂土、活性炭、硅藻土的除色和除粘稠杂物效果均较好；三层、四层滤纸除粘稠杂物效果较好，但除色效果均不理想，其中四层滤纸的过滤速度十分缓慢，检测耗时较长；双层滤纸的除色和除粘稠杂物效果均不理想。对比pH试纸和pH计两种检测方法可知，pH试纸受样本杂色干扰较大，易被染色而无法判读；pH计检测法受杂色干扰作用不明显，但样本过于粘稠或有团状粘稠物包裹检测探头时，会影响其检测结果。pH试纸用于pH检测的优点是操作简单，成本低，体积小，无电源要求，可装配在简单的检测装置中使用。pH计检测法只能应用于配备有pH计的实验室、检验室等专业场所，其优点是操作简单且结果精确度高。在本发明的装置中，配备pH试纸判读检测结果。

实施例4：以氯化钠溶液为稀释液，皂土为过滤吸附介质检测痰液样本

步骤1：准备5例从医院收集得到的体积不超过5ml的痰液样本，分别编号1-5；

步骤2：分别向1-5号样本中加入5ml 0.9％的氯化钠水溶液，振荡管体0.5-1分钟，使得痰液与水溶液充分混合；

步骤3：分别向各样品管中加入0.5g皂土，充分搅拌，再用单层滤纸简单过滤，取滤液备用；分别使用pH试纸和pH计检测各样本滤液的pH值。检测结果见下表。结果表明，在本发明方法中，以氯化钠溶液为稀释液，皂土为过滤吸附介质可以顺利且准确检测痰液样本pH值。

实施例5：利用含有市售pH试纸的检测棒检测痰液样本

步骤1：利用市售的检测范围在pH5.5-9.0左右的精密pH试纸制作检测棒3，再装配成如图1所示的装置，共装备4组备用；准备4例从医院收集得到的人痰液样本，分别编号1-4；

步骤3：打开痰液收集管的旋盖(注意避免将管内液体倒出)，分别向检测装置的收集管内缓慢加入痰液，将检测棒3竖直放入收集管至底部，盖紧旋盖；振荡管体0.5-1分钟，使得痰液与稀释试剂充分混合；

步骤4：将收集管正立静置0.5-1分钟，观察试纸的颜色变化，获取检测结果，同时利用pH计检测稀释后样本的pH值进行比对。检测结果见下表。结果表明，利用市售精密pH试纸可以准确判读痰液pH。

实施例6：利用含有自制指示条(溴百里酚蓝)的检测棒检测痰液样本

步骤1：配置溴百里酚蓝溶液(0.5％，溶剂为20％乙醇)，将裁减成细条状的滤纸浸入溴百里酚蓝溶液中，密封室温放置24小时。取出浸泡后的试纸置于40℃烘箱中烘干。经过测试，此试纸的变色范围为7.4-8.1-10.5(黄绿-绿-蓝).

步骤2：利用此试纸制作检测棒3，再装配成如图1所示的装置，共装备4组备用；准备4例从医院收集得到的人痰液样本，分别编号1-4；

步骤3：打开痰液收集管的旋盖(注意避免将管内液体倒出)，分别向检测装置的收集管内缓慢加入痰液，将检测棒3竖直放入收集管至底部，盖紧旋盖；振荡管体0.5-1分钟，使得痰液与稀释试剂充分混合；

步骤4：将收集管正立静置0.5-1分钟，观察试纸的颜色变化，获取检测结果，同时利用pH计检测稀释后样本的pH值进行比对。检测结果见下表。结果表明，自制的含单一指示剂的指示纸质可以反映痰液样本的大致pH值范围，且结果与pH计检测结果相符。

实施例7

本实施例提供的利用痰液间接检测气道表面液pH值的装置如图1所示。

该检测装置包括收集管1、盖子2，检测棒,4、痰液稀释试剂3。

收集管1为50ml旋转盖尖底PP管、50ml旋转盖圆底PP管、50ml旋转盖平底PP管(可立式)，不限于以上3种，其他能够容纳保护剂和痰液的可密闭且便于携带的容器均可。盖子2

收集管1底部放置痰液稀释试剂3，所述体积为≤20ml的水或0.85％-0.9％的氯化钠中性水溶液或其他中性水溶液。

检测棒4为内含指示条5和过滤器6的中空棒，可以为玻璃棒或塑料棒，不限于以上两种，其他能够容纳指示条5和过滤器6且具有毛细虹吸功能的中空棒亦可。

本发明中检测棒4可以为多种设计，如图2中的的竖直型、图3中的直角型和图4中的竖直固定型。

竖直型的检测棒4具有简易且成本低廉的优点，但易发生倾斜问题，对检测速度稍有影响；直角型的检测棒可一定程度上解决倾斜问题。

图4中的直角固定型设有检测棒固定器7。所述检测棒固定器7可以为一圆形薄板式结构。图5为图4中检测棒固定器7的俯视图，如图5所示，检测棒固定器7的中心位置设有一个与检测棒尺寸相匹配的固定孔71。检测棒固定器7的外径尺寸与收集管1相应位置尺寸相匹配，检测棒6可穿过固定孔7，然后两者一起放入收集管1中，使得检测棒6的下端没入痰液稀释试剂3中适当位置。本发明的适当位置为痰液稀释试剂的液面要超过过滤器的最上方，且达到指示条最下方。

检测棒固定器7的外壁刚好卡在收集管1上部合适的位置处，从而实现检测棒6的固定，不存在倾斜问题。

指示条5为含有pH指示剂(可产生明显可辨别的显色反应)的滤纸或其他强吸水性且可吸附指示剂的材料。

本发明的指示条5可如如图6和图7所示，其中图6设有一条参照带51，一条检测带一52。图7设有一条参照带51，和两条检测带，检测带一52和检测带二53。

pH指示剂包括溴百里酚蓝、溴甲酚紫、甲酚红、酚红、百里酚蓝、对二甲基酚蓝等可产生明显可辨别显色反应的pH指示剂。pH指示剂包括单一指示剂或多种指示剂的组合。

过滤器6可为包裹皂土、活性炭、硅藻土、滤纸等具有吸附作用且不影响溶液pH值的过滤包，包裹材料为无纺布、滤纸等。过滤器的作用是吸附滤除痰液粘稠异物及杂色干扰。

本实施例检测装置的使用方法如下：打开痰液收集管的旋盖(注意避免将管内液体倒出)，向管内缓慢吐入痰液(注意避免将痰液吐到管外)，将检测棒竖直放入收集管至底部，盖紧旋盖；振荡管体0.5-5分钟，使得痰液与稀释试剂充分混合；将收集管正立静置0.5-1分钟，观察参照带和检测带的颜色变化。通过与检测结果对比卡进行颜色比对，获取检测结果。

实施例8

本实施例提供的利用痰液间接检测气道表面液pH值的装置如图8所示。

本实施例的检测装置包括：收集管1，收集管1带有的可密封的盖子2。

其中收集管1可以为一个杯形PP材质容器。

盖子2的一端嵌入一个小旋盖10，小旋盖10下方紧密连接一个检测棒4，检测棒4可塞入小旋盖10的下方。小旋盖10与盖子2之间放置一个可自由取出的安全垫圈11。检测棒4上端与小旋盖10内部紧密连接，下端伸入收集管1中并与收集管1底部保留一段固定距离，与检测棒4最下端正中央相对的收集管1底部设有一个圆锥形顶针9，该顶针9底部与收集管1底部紧密相连，顶针9的针尖正对检测棒4底部。检测棒4如图1所示，不同之处是最底部有防水薄膜8。该装置的优点是省去自行插入检测棒的步骤，减少痰液暴露时间，但成本略高。

本实施例使用方法如下：打开收集管的盖子(注意避免将管内液体倒出)，向管内缓慢吐入痰液(注意避免将痰液吐到管外)，盖紧旋盖；振荡管体0.5-5分钟，使得痰液与稀释试剂充分混合；将收集管正立静置0.5-1分钟，抽出安全垫圈，再旋紧小旋盖，使得检测棒最下端与顶针接触，并刺破检测棒下端薄膜；待液面上升浸湿指示条，观察参照带和检测带的颜色变化。通过对比卡进行颜色比对，获取检测结果。

实施例9

检测装置包括：收集管1，收集管1带有的可密封的盖子2。

所述收集管1为一个盒型的PP材质容器。容器底部含有痰液稀释试剂3。容器的一侧通过分隔板12隔断出一个独立的检测室，检测室内不含有痰液稀释试剂3。

检测室底部与容器内部呈现“U”型连通，连通处设有防水膜8和过滤器6，在防水膜8完好的时候检测室底部和容器内部不连通，当防水膜8被刺破时，两者才真正连通。

防水膜8和过滤器6并排设置，其中防水膜8靠近容器主体一侧，过滤器6放入本装置设有防水膜刺破装置13，当触发对应开关时，可刺破防水膜，使得液体从容器左侧经过连通处进入检测室。检测室中含有指示条5，指示条5的设计可以参考实施例7。

本实施例装置的使用方法如下：打开装置的盖子(注意避免将管内液体倒出)，向容器内缓慢吐入痰液(注意避免将痰液吐到管外)，盖紧旋盖；振荡管体0.5-5分钟，使得痰液与稀释试剂充分混合；将收集管正立静置0.5-1分钟，触发防水膜刺破开关，使得液体从容器左侧经过连通处进入检测室；待液面上升浸湿指示条，观察参照带和检测带的颜色变化。通过对比卡进行颜色比对，获取检测结果。

实施例10

利用含有自制指示条(溴百里酚蓝和溴甲酚紫)的检测棒检测痰液样本

步骤1：配置溴百里酚蓝溶液(0.5％，溶剂为20％乙醇)和溴甲酚紫溶液(0.04g,0.01mol/LNaOH7.4ml,蒸馏水92.6ml)。将裁减成细条状的滤纸分别浸入两种溶液中，密封室温放置24小时。取出浸泡后的试纸置于40℃烘箱中烘干。经过测试，溴甲酚紫试纸的变色范围为5.8-7.2(黄-紫)。将这两种试纸裁减成宽约0.5厘米的小片段(片段1和片段2)，并列粘贴于空白条状滤纸上(注意两个试纸间适当留空)，制成组合指示条。

步骤2：利用此试纸制作检测棒3，再装配成如图1所示的装置，共装备4组备用；将实施例4中的4组检测后装置的检测棒其取出，留下检测样本备用；

步骤3：将上步制备的检测棒3竖直放入收集管至底部，盖紧旋盖；振荡管体0.5-1分钟；

步骤4：将收集管正立静置0.5-1分钟，观察试纸的颜色变化，获取检测结果。检测结果见下表。结果表明，自制的含有两种组合指示剂的指示纸质可以进一步确定痰液样本的pH值范围，且结果与pH计检测结果相符。

实施例8：利用含有自制指示条(溴百里酚蓝、溴甲酚紫及甲酚红)的检测棒检测痰液样本

步骤1：配置溴百里酚蓝溶液(0.5％，溶剂为20％乙醇)、溴甲酚紫溶液(0.04g,0.01mol/LNaOH7.4ml,蒸馏水92.6ml)以及甲酚红溶液(0.05％，溶剂为95％乙醇)。将裁减成细条状的滤纸分别浸入三种溶液中，密封室温放置24小时。取出浸泡后的试纸置于40℃烘箱中烘干。经过测试，甲酚红试纸的变色范围为8.3-9.5(黄-紫红)。将这三种试纸裁减成宽约0.5厘米的小片段(片段1、片段2、片段3)，并列粘贴于空白条状滤纸上(注意两个试纸间适当留空)，制成组合指示条。

步骤2：利用此试纸制作检测棒3，再装配成如图1所示的装置，共装备4组备用；将实施例5中的4组检测后装置的检测棒其取出，留下检测样本备用；

步骤3：将上步制备的检测棒3竖直放入收集管至底部，盖紧旋盖；振荡管体0.5-1分钟；

步骤4：将收集管正立静置0.5-1分钟，观察试纸的颜色变化，获取检测结果。检测结果见下表。结果表明，自制的含有三种组合指示剂的指示纸质可以缩小痰液样本的预估pH值范围，且结果与pH计检测结果相符。

实施例9：稀释液体积的选择

步骤1：准备例从医院收集得到的不同体积的痰液样本，按照下表制备不同体积的痰液样本，加入不同体积的稀释液(水)，振荡管体0.5-1分钟，使得痰液与水充分混合，观察并记录各样本稀释后性状；

步骤2：每个样本中加入适量皂土，充分搅拌，再用单层滤纸简单过滤，取滤液备用；

步骤3：分别利用pH试纸和pH计检测各样本滤液的pH值。检测结果见下表。结果表明，稀释液体积直接影响痰液稀释效果，关系是否能顺利完成pH值检测，稀释液体积过少或稀释液体积小于痰液体积时，易造成样本体积过小或粘稠度过大而干扰检测，无法取得准确的检测结果。经过多次实验，稀释液体积不少于痰液样本体积时基本可以顺利检测。但是，当痰液体积较大(大于等于5ml)或粘稠度偏大时，需要体积更大的稀释才能较顺利地完成过滤与检测过程。综合多例痰液样本的统计结果，绝大多数人一口痰的体积在2-5ml，极少数痰液体积超过6ml，统计最大体积为8ml，本实验中稀释液最大体积为20ml。综合痰液收集容器的容量以及成本等因素考虑，本方法的稀释液体积选择范围为≤20ml。

实施例10：不同装置的对比实验

步骤1：配置图1所示的内含5ml水的装置3组，再分别配置检测棒1、检测棒2、检测棒3，以上检测棒均内含活性炭过滤包和精密pH试纸；再各配置1组如图8、图9所示的装置，装置中的稀释液为5ml水，检测棒内含活性炭过滤包和精密pH试纸；以上5组装置分别编号1-5；

步骤2：准备4-8例从医院收集得到的痰液样本，充分混合备用；

步骤3：打开1-3号装置的痰液收集管的旋盖(注意避免将管内液体倒出)，分别向收集管内缓慢加入2ml混合痰液，将检测棒竖直放入收集管至底部，盖紧旋盖；振荡管体0.5-1分钟，使得痰液与稀释试剂充分混合；打开4号装置的收集管的盖子(注意避免将管内液体倒出)，向管内加入入2ml混合痰液，盖紧旋盖。振荡管体0.5-1分钟，使得痰液与稀释液充分混合；将1-3号装置正立静置0.5-1分钟，观察试纸的颜色变化；将4号装置正立静置0.5-1分钟，抽出安全垫圈，再旋紧小旋盖，使得检测棒最下端与顶针接触，并刺破检测棒下端薄膜；打开5号装置的盖子(注意避免将管内液体倒出)，向容器内缓慢吐入痰液(注意避免将痰液吐到管外)，盖紧旋盖；振荡管体0.5-5分钟，使得痰液与稀释试剂充分混合；将收集管正立静置0.5-1分钟，触发防水膜刺破开关，使得液体从容器左侧经过连通处进入检测室；

步骤4：各组装置的待液面上升浸湿指示条，观察参照带和检测带的颜色变化。通过对比卡进行颜色比对，获取检测结果。同时利用pH计检测稀释后样本的pH值进行比对。检测结果见下表。

检测结果表明，本发明的5种装置均能稳定且准确地测定痰液pH值。对比总结这5种装置：图1装置中的检测棒1的优点是简易成本低，不足之处是在检测过程会出现检测棒倾斜靠管壁的现象，使得样本溶液上升速度受限，对检测速度稍有影响。图1装置中的检测棒2相对检测棒1，可一定程度上解决检测棒倾斜问题，只需简单改变检测棒制作工艺即可实现，但检测棒2仍有一定概率出现倾斜问题。图1装置中检测棒3相对检测棒1和2，通过增加一个固定装置完全解决了检测棒倾斜问题，样本溶液上升快，从而加快检测过程，但由于额外增加固定装置使得此装置的成本略高。图8装置的优点是将检测棒固定于收集器内，省去自行插入检测棒的步骤，减少痰液暴露时间，但此装置成本偏高。图9装置将检测棒转化为检测室，并在装置最边缘设置指示条，更便于准确判读结果，此装置的成本也较高。

实施例11：使用配检测棒3(内含活性炭过滤包)的图1装置(稀释液为0.9％氯化钠溶液)检测痰液样本

步骤1：准备5组配检测棒3(内含活性炭过滤包)的图1装置(稀释液为0.9％氯化钠溶液)，准备5例从医院收集得到的痰液样本，分别编号1-5；

步骤2：打开痰液收集管的旋盖(注意避免将管内液体倒出)，分别向检测装置的收集管内缓慢加入痰液，将检测棒1竖直放入收集管至底部，盖紧旋盖；振荡管体0.5-1分钟，使得痰液与稀释试剂充分混合；

步骤3：将收集管正立静置0.5-1分钟，观察试纸的颜色变化。通过与检测结果对比卡进行颜色比对，获取试纸比色判读结果，同时利用pH计检测稀释后样本的pH值进行比对。检测结果见下表。结果表明，液面顺利地通过毛细虹吸上升并浸湿指示条再显色，说明使用本装置可以快速且顺利地检测痰液pH值。

实施例12：使用图8的装置(内含皂土过滤包，稀释液为0.9％氯化钠溶液)检测痰液样本

步骤1：准备5组如图8所示的装置(内含皂土过滤包，稀释液为0.9％氯化钠溶液)，准备5例从医院收集得到的痰液样本，分别编号1-5；

步骤2：打开痰液收集管的盖子(注意避免将管内液体倒出)，向管内加入痰液，盖紧旋盖。振荡管体0.5-1分钟，使得痰液与稀释液充分混合。

步骤3：将收集管正立静置0.5-1分钟，抽出安全垫圈，再旋紧小旋盖，使得检测棒最下端与顶针接触，并刺破检测棒下端薄膜。待液面上升并浸湿指示条后立刻观察试纸的颜色变化。通过与检测结果对比卡进行颜色比对，获取试纸比色判读结果，同时利用pH计检测稀释后样本的pH值进行比对。检测结果见下表。结果表明，液面顺利地通过毛细虹吸上升并浸湿指示条再显色，说明使用本装置可以快速且顺利地检测痰液pH值。

实施例13：使用图9的装置(内含活性炭过滤包，稀释液为0.9％氯化钠溶液)检测痰液样本

步骤1：准备5组如图9所示的装置(内含活性炭过滤包，稀释液为0.9％氯化钠溶液)，准备5例从医院收集得到的痰液样本，分别编号1-5；

步骤2：打开装置的盖子(注意避免将管内液体倒出)，向容器内加入痰液(注意避免将痰液吐到管外)，盖紧旋盖；振荡管体0.5-5分钟，使得痰液与稀释试剂充分混合；将收集管正立静置0.5-1分钟，触发防水膜刺破开关，使得液体从容器左侧经过连通处进入检测室；:

步骤3：各组装置的待液面上升浸湿指示条，观察参照带和检测带的颜色变化。通过对比卡进行颜色比对，获取检测结果。同时利用pH计检测稀释后样本的pH值进行比对。检测结果见下表。结果表明，液面顺利地通过毛细虹吸上升并浸湿指示条再显色，说明使用本装置可以快速且顺利地检测痰液pH值。

实施例14：本方法与常规液化法的对比

通过对比实验验证本方法比常规液化法更能准确测定痰液pH值。

步骤1：准备6例从医院收集得到的以及肺部疾病患者痰液样本，编号1-6，要求每例痰液样本体积不少于5ml，分别将每例样本均分三份；

步骤2：分别向1-6例样本的三份小样本中加入两倍体积的氢氧化钠溶液(0.1mol/L)、二硫苏糖醇溶液(2％)、氯化钠溶液(0.9％)；加入氢氧化钠溶液的样本充分振荡10分钟，加入二硫苏糖醇溶液的样本充分振荡5分钟，加入氯化钠溶液的样本充分振荡0.5分钟；

步骤3：加入0.5g活性炭，充分搅拌，再用单层滤纸简单过滤，取滤液备用；

步骤4：利用pH计检测液化或测稀释后样本的pH值并进行比对，检测结果见下表。结果表明，使用氢氧化钠和二硫苏糖醇液化后的痰液样本pH值明显受到液化剂的干扰，健康人及肺部疾病患者的痰液pH值基本无差异，且结果与理论值相差甚远；而使用本方法检测健康人及肺部疾病患者的痰液pH值存在差异，符合预期，与前期实验结果以及文献报道结果基本相符。此实验证明常规痰液液化法(氢氧化钠法及二硫苏糖醇法)不适用于检测痰液pH值，本方法能够准确测定原始痰液pH值。

编号	1号	2号	3号	4号	5号	6号
							肺部患病情况	健康	健康	肺部感染	肺癌	肺癌	肺癌
氢氧化钠法	12.04.	11.89	11.77	11.94	11.68	11.99
							二硫苏糖醇法	5.84	5.94	5.98	5.74	5.88	5.92
本发明方法	7.58	7.29	6.93	6.88	6.47	6.79

实施例15：本发明可有效处理粘痰、血痰、脓痰、稠厚痰、黄色痰、灰色痰、铁锈色痰

步骤1：准备七7组如图8所示的装置，分别编号1-7；

步骤2：取健康人痰液且性状分别为粘痰、血痰、脓痰、稠厚痰、黄色痰、灰色痰、铁锈色痰各一例；

步骤3：打开痰液收集管的盖子(注意避免将管内液体倒出)，向管内加入痰液，盖紧旋盖。振荡管体0.5-1分钟，使得痰液与稀释试剂充分混合。

步骤4：将收集管正立静置0.5-1分钟，抽出安全垫圈，再旋紧小旋盖，使得检测棒最下端与顶针接触，并刺破检测棒下端薄膜。待液面上升并浸湿指示条后立刻观察试纸的颜色变化。通过与检测结果对比卡进行颜色比对，获取试纸比色判读结果，同时利用pH计检测稀释后样本的pH值进行比对。检测结果见下表。结果表明，粘痰、血痰、脓痰、稠厚痰、黄色痰、灰色痰、铁锈色痰液样本经处理后粘度均降低稀释后，液面顺利通过毛细虹吸上升并浸湿指示条，同时痰液杂色被去除，不干扰试纸显色，说明使用本装置可以检测粘痰、血痰、脓痰、稠厚痰、黄色痰、灰色痰、铁锈色痰液pH值。

实施例16：与端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒配合检测肺癌患者痰液

步骤1：准备8组如图1所示的装置(配检测棒3)，准备8例从医院收集得到的经临床确诊的肺癌患者痰液，分别编号1-8；

步骤2：打开痰液收集管的旋盖(注意避免将管内液体倒出)，分别向检测装置的收集管内缓慢加入痰液，将检测棒竖直放入收集管至底部，盖紧旋盖；振荡管体0.5-1分钟，使得痰液与稀释试剂充分混合；

步骤3：将收集管正立静置0.5-1分钟，观察试纸的颜色变化。通过与检测结果对比卡进行颜色比对，获取试纸比色判读结果，同时利用pH计检测稀释后样本的pH值进行比对。

步骤4：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤3得到的痰液样品进行检测，经过前处理、杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果表明，用本发明处理的肺癌患者痰液中均能检测到hTERT mRNA，证明痰液处理过程中无hTERT mRNA损失，本发明可与端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒配合使用检测痰液样本中hTERT mRNA。

Claims (10)

1.一种利用痰液检测气道表面液的pH值的方法，其特征在于，将痰液与水或中性水溶液混合，通过吸附材料吸附滤除痰液中的粘稠异物及杂色干扰，然后通过pH检测装置指示pH值；

其中吸附材料吸附痰液中的粘稠异物及杂色干扰，同时又不会与痰液发生反应，或者影响痰液的pH值；

所述pH检测装置为pH计、pH指示试剂、pH试纸中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的利用痰液检测气道表面液的pH值的方法，其特征在于，所述吸附材料为皂土、活性炭、硅藻土、滤纸中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的利用痰液检测气道表面液的pH值的方法，其特征在于，所述中性水溶液为质量分数0.85-0.9％的氯化钠溶液。

4.一种利用痰液检测气道表面液的pH值的装置，其特征在于，所述装置包括收集管、检测棒，其中收集管为可密闭容器，内部置有痰液稀释试剂；检测棒为中空棒，中空棒内部含有指示条和过滤器，其中指示条可指示pH值，过滤器内设吸附材料，所述吸附材料吸附痰液中的粘稠异物及杂色干扰，同时又不会与痰液发生反应，或者影响痰液的pH值；检测棒底部至少要接触痰液稀释试剂。

5.根据权利要求4所述的利用痰液检测气道表面液的pH值的装置，其特征在于，所述吸附材料为皂土、活性炭、硅藻土、滤纸中的一种或多种；其特征在于，所述吸附材料包裹在过滤包内，所述过滤包的包裹材料为可供液体透过的材料。

6.根据权利要求4所述的利用痰液检测气道表面液的pH值的装置，其特征在于，所述痰液稀释试剂为水或中性溶水液。

7.根据权利要求6所述的利用痰液检测气道表面液的pH值的装置，其特征在于，所述中性水溶液为质量分数0.85-0.9％的氯化钠溶液。

8.根据权利要求4所述的利用痰液检测气道表面液的pH值的装置，其特征在于，收集管中设有收集管固定器，所述收集管固定器卡在收集管内壁上，中间设有容纳检测棒穿过的通孔，检测棒可穿过通孔并实现垂直固定。

9.根据权利要求4所述的利用痰液检测气道表面液的pH值的装置，其特征在于，所述收集管设有可密封的盖子，盖子上端设有一个小旋盖，小旋盖内部下方紧密连接检测棒；小旋盖与盖子之间放置一个可自由取出的安全垫圈；检测棒上端与小旋盖内部连接，下端伸入收集管中并与收集管底部保留一段固定距离；与检测棒最下端正中央相对的收集管底部设有一个顶针，顶针底部与收集管底部固定相连，针尖正对检测棒底部；检测棒最底部设有防水薄膜；当抽出安全垫圈后，针尖将防水薄膜刺穿。

10.一种利用痰液检测气道表面液的pH值的装置，其特征在于，所述装置包括一个收集容器，收集容器可密闭，内部装有痰液稀释试剂；收集容器内部隔断出一个独立的检测室，检测室内设有指示条，检测室底部与收集容器主体内部呈U型连通，连通处设有防水膜和过滤器；装置设有防水膜刺破装置，当触发对应开关时，可刺破防水膜，使得痰液稀释试剂从收集容器主体经过连通处进入检测室。