CN105586033A - 一种含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含有谷氨酸结构的罗丹明<b>pH</b>荧光探针，即<b>Rh-pH</b>荧光探针，所述的<b>Rh-pH</b>荧光探针的结构通式如<b>（</b><b>I)</b>所示。本发明的含有氨基酸结构的罗丹明pH荧光指示剂，该pH指示剂因具有快速响应、高灵敏度。在pH？3.2-pH8.5范围内呈现出较宽的pH响应。用于在一个密封容器中进行血液、体液等细菌培养的过程实时监测，从而及时反映细菌的繁殖参数变化，为临床提供医疗数据支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种含谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针及其应用。
背景技术
在微生物细胞生长领域，pH值是一个重要的指示参数。细胞在生长的过程中会排出大量的二氧化碳，例如：在一个密封的容器里对带有细菌的血液、痰液、体液培养过程中，其pH也会出现波动。借助于荧光指示剂高度敏的特性测量生长过程中pH的变化值，可以实时掌握细菌生长的整个过程。
理想的pH荧光指示剂应该对pH值的变化范围具有较宽的pH响应范围，即具有较宽的响应窗口。目前国内pH荧光指示剂，pH值范围大概都在(6.8-7.4)和pH值(4.5-6.0)之间。而具有较大范围的pH(3-8)荧光指示剂却很少，因此需要一种具有高灵敏度、高选择性及具有较宽的pH响应窗口的荧光指示剂。
目前国内和国际上有关罗丹明类的PH荧光探针和荧光指示剂种类繁多。而用于监测微生物培养过程的却比较少。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针及其应用。
本发明的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针，即Rh-pH荧光探针，其特征在于，所述的Rh-pH荧光探针的结构通式如(I)所示：
其中，
R1＝R2＝R3＝R4＝H；
或R1＝R4＝H，R2＝—CH2CH3，R3＝—CH3；
或R1＝R2＝—CH3，R3＝R4＝H；
或R1＝R2＝—CH2CH3，R3＝R4＝H；
或R1＝R2＝R3＝R4＝—(CH2)3—。
所述的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
1)将罗丹明类化合物与三氯氧磷加入到乙腈中，保温反应3-5小时，冷却至室温后，加入氨基酸类化合物的乙腈溶液和三乙胺的乙腈溶液，室温下反应3-5小时，反应液用乙酸乙酯和水萃取，取有机层，干燥，浓缩，降温，析晶，得到白色固体；
2)将该白色固体溶于水中，加入氢氧化钠溶液，加热至50-60℃，反应过夜，降至室温，加入稀盐酸溶液，搅拌，再加入二氯甲烷溶液萃取，取有机层，干燥，浓缩，得到目标产物Rh-pH荧光探针。
所述罗丹明类化合物为罗丹明110、罗丹明6G、四甲基罗丹明TMR、罗丹明B或罗丹明101，所述氨基酸类化合物为谷氨酸二甲酯。
所述罗丹明类化合物、三氯氧磷、氨基酸类化合物与三乙胺的摩尔比为1:(3-6):1:(3-6)。
本发明的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针作为荧光指示剂在监测微生物培养过程中pH值变化的应用。
本发明的含有氨基酸结构的罗丹明pH荧光指示剂，该pH指示剂因具有快速响应、高灵敏度。在pH3.2-pH8.5范围内呈现出较宽的pH响应。用于在一个密封容器中进行血液、体液等细菌培养的过程实时监测，从而及时反映细菌的繁殖参数变化，为临床提供医疗数据支撑。
附图说明
图1是实施例1制备的罗丹明pH荧光探针对pH变化的荧光光谱扫描图。
图2是实施例2制备的罗丹明pH荧光探针对pH变化的荧光光谱扫描图。
图3是实施例3制备的罗丹明pH荧光探针对pH变化的荧光光谱扫描图。
图4是实施例4制备的罗丹明pH荧光探针对pH变化的荧光光谱扫描图。
图5是实施例5制备的罗丹明pH荧光探针对pH变化的荧光光谱扫描图。
图1-图5是在日本岛津荧光光谱仪上得到的扫描图。
具体实施方式
实施例1制备含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针
本实施例的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
第一步：将0.002摩尔的罗丹明110与0.012摩尔的POCl3加入到20ml乙腈中，氮气保护下，加热到60度，保温反应3-5个小时，TLC监控至反应完全，原料消失。降至室温，缓慢加入0.002摩尔的谷氨酸二甲酯和0.006摩尔的三乙胺的乙腈(10ml)溶液,室温反应三个小时，TLC监控至酰氯完全消失。把反应液浓缩至干，加入30ml乙酸乙酯和20ml水，萃取分层，水层用20ml水萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩至液体体积剩余一半，停止浓缩，降温，析晶，得白色固体。LCMS结果：489.2.4(M+2),488.2(M+1)。
第二步：将上一步所得白色固体溶于20ml水中，加入10ml30％氢氧化钠溶液，加热至50-60度，反应过夜，TLC监控至原料完全消失。降至室温，加入25ml10％稀HCl溶液，搅拌0.5h.加入80ml二氯甲烷溶液萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩至干，得本实施例的目标产物。LCMS结果：460.9(M+2),459.9(M+1)。
实施例2制备含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针
本实施例的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
第一步：将0.002摩尔的罗丹明6G与0.01摩尔的POCl3加入到20ml乙腈中，氮气保护下，加热到60度，保温反应3-5个小时，TLC监控至反应完全，原料消失。降至室温，缓慢加入0.002摩尔的谷氨酸二甲酯和0.008摩尔的三乙胺的乙腈(10ml)溶液,室温反应三个小时，TLC监控至酰氯完全消失。把反应液浓缩至干，加入30ml乙酸乙酯和20ml水，萃取分层，水层用20ml水萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩至液体体积剩余一半，停止浓缩，降温，析晶，得白色固体。LCMS结果：601.4(M+2),600.4(M+1)。
第二步：将上一步所得白色固体溶于20ml水中，加入10ml30％氢氧化钠溶液，加热至50-60度，反应过夜，TLC监控至原料完全消失。降至室温，加入25ml10％稀HCl溶液，搅拌0.5h.加入80ml二氯甲烷溶液萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩至干，得本实施例的目标产物。LCMS结果：573.15(M+2),572.1(M+1)。
实施例3制备含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针
本实施例的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
第一步：将0.002摩尔的四甲基罗丹明TMR与0.008摩尔的POCl3加入到20ml乙腈中，氮气保护下，加热到60度，保温反应3-5个小时，TLC监控至反应完全，原料消失。降至室温，缓慢加入0.002摩尔的谷氨酸二甲酯和0.01摩尔的三乙胺的乙腈(10ml)溶液,室温反应三个小时，TLC监控至酰氯完全消失。把反应液浓缩至干，加入30ml乙酸乙酯和20ml水，萃取分层，水层用20ml水萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩至液体体积剩余一半，停止浓缩，降温，析晶，得白色固体。LCMS结果：552.8(M+2),551.8(M+1)。
第二步：将上一步所得白色固体溶于20ml水中，加入10ml30％氢氧化钠溶液，加热至50-60度，反应过夜，TLC监控至原料完全消失。降至室温，加入25ml10％稀HCl溶液，搅拌0.5h.加入80ml二氯甲烷溶液萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩至干，得本实施例的目标产物。LCMS结果：524.6(M+2),523.6(M+1)。
实施例4制备含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针
本实施例的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
第一步：将0.002摩尔的罗丹明B与0.006摩尔的POCl3加入到20ml乙腈中，氮气保护下，加热到60度，保温反应3-5个小时，TLC监控至反应完全，原料消失。降至室温，缓慢加入0.002摩尔的谷氨酸二甲酯和0.012摩尔的三乙胺的乙腈(10ml)溶液,室温反应三个小时，TLC监控至酰氯完全消失。把反应液浓缩至干，加入30ml乙酸乙酯和20ml水，萃取分层，水层用20ml水萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩至液体体积剩余一半，停止浓缩，降温，析晶，得白色固体。LCMS结果：601.4(M+2),600.4(M+1)。
第二步：将上一步所得白色固体溶于20ml水中，加入10ml30％氢氧化钠溶液，加热至50-60度，反应过夜，TLC监控至原料完全消失。降至室温，加入25ml10％稀HCl溶液，搅拌0.5h.加入80ml二氯甲烷溶液萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩至干，得本实施例的目标产物。LCMS结果：573.15(M+2),572.1(M+1)。
实施例5制备含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针
本实施例的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
第一步：将0.002摩尔的罗丹明101与0.009摩尔的POCl3加入到20ml乙腈中，氮气保护下，加热到60度，保温反应3-5个小时，TLC监控至反应完全，原料消失。降至室温，缓慢加入0.002摩尔的谷氨酸二甲酯和0.009摩尔的三乙胺的乙腈(10ml)溶液,室温反应三个小时，TLC监控至酰氯完全消失。把反应液浓缩至干，加入30ml乙酸乙酯和20ml水，萃取分层，水层用20ml水萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩至液体体积剩余一半，停止浓缩，降温，析晶，得白色固体。LCMS结果：649.4(M+2),648.4(M+1)。
第二步：将上一步所得白色固体溶于20ml水中，加入10ml30％氢氧化钠溶液，加热至50-60度，反应过夜，TLC监控至原料完全消失。降至室温，加入25ml10％稀HCl溶液，搅拌0.5h.加入80ml二氯甲烷溶液萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩至干，得本实施例的目标产物。LCMS结果：621.2.2(M+2),620.2(M+1)。
实施例6测定罗丹明pH荧光探针对pH变化的荧光的光谱响应
本实施例的试验采用实施例1-5制备的pH荧光指示剂进行。
荧光光谱的测定方法：配制浓度为5X10-5mol/L的含有30％乙醇的PH荧光指示剂水溶液，该指示剂溶液分别用氢氧化钠和盐酸调节pH，分别制备pH范围在3.2-8.5不同pH值的溶液，测试荧光光谱。
实施例1的罗丹明pH荧光探针对pH变化的荧光的光谱响应结果如图1所示：图1中每条线分别代表不同pH值的测试结果，最下端的线代表pH为8.5时的荧光光谱曲线，往上pH值依次降低，依次为pH为8.0、7.0、6.2、5.5、5.0、4.5、4.0、3.2时的荧光光谱曲线，最上端的曲线对应的pH值为3.2，结果表明，随着pH值的降低，荧光强度不断增强。荧光指示剂在pH处于3.2—8.5范围内较为敏感，其荧光强度增强约60倍。由图1可以看出，其最强发射波长在640-650um。
实施例2的罗丹明pH荧光探针对pH变化的荧光的光谱响应结果如图2所示：图2中每条线分别代表不同pH值的测试结果，最下端的线代表pH为8.5时的荧光光谱曲线，往上pH值依次降低，依次为pH为8.0、7.0、6.2、5.5、5.0、4.5、4.0、3.2时的荧光光谱曲线，最上端的曲线对应的pH值为3.2，结果表明，随着pH值的降低，荧光强度不断增强。荧光指示剂在pH处于3.2—8.5范围内较为敏感，其荧光强度增强约60倍。由图2可以看出，其最强发射波长在560um左右。
实施例3的罗丹明pH荧光探针对pH变化的荧光的光谱响应结果如图3所示：图3中每条线分别代表不同pH值的测试结果，最下端的线代表pH为8.5时的荧光光谱曲线，往上pH值依次降低，依次为pH为8.0、7.0、6.2、5.5、5.0、4.5、4.0、3.2时的荧光光谱曲线，最上端的曲线对应的pH值为3.2，结果表明，随着pH值的降低，荧光强度不断增强。荧光指示剂在pH处于3.2—8.5范围内较为敏感，其荧光强度增强约60倍。由图3可以看出，其最强发射波长在540-550um左右。
实施例4的罗丹明pH荧光探针对pH变化的荧光的光谱响应结果如图4所示：图4中每条线分别代表不同pH值的测试结果，最下端的线代表pH为8.5时的荧光光谱曲线，往上pH值依次降低，依次为pH为8.0、7.0、6.2、5.5、5.0、4.5、4.0、3.2时的荧光光谱曲线，最上端的曲线对应的pH值为3.2，结果表明，随着pH值的降低，荧光强度不断增强。荧光指示剂在pH处于3.2—8.5范围内较为敏感，其荧光强度增强约60倍。由图4可以看出，其最强发射波长在560-570um左右。
实施例5的罗丹明pH荧光探针对pH变化的荧光的光谱响应结果如图5所示：图5中每条线分别代表不同pH值的测试结果，最下端的线代表pH为8.5时的荧光光谱曲线，往上pH值依次降低，依次为pH为8.0、7.0、6.2、5.5、5.0、4.5、4.0、3.2时的荧光光谱曲线，最上端的曲线对应的pH值为3.2，结果表明，随着pH值的降低，荧光强度不断增强。荧光指示剂在pH处于3.2—8.5范围内较为敏感，其荧光强度增强约60倍。由图5可以看出，其最强发射波长在560-570um左右。
综上所述，上述实施例1-5的罗丹明PH荧光探针根据在不同的PH值下荧光强度都能够增强到60-70倍，不同发射波长在生物培养领域中将非常广泛。其中图1所在荧光发射范围和荧光强度更佳。
Claims (4)
1.一种含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针，即Rh-pH荧光探针，其特征在于，所述的Rh-pH荧光探针的结构通式如(I)所示：
其中，
R1＝R2＝R3＝R4＝H；
或R1＝R4＝H，R2＝—CH2CH3，R3＝—CH3；
或R1＝R2＝—CH3，R3＝R4＝H；
或R1＝R2＝—CH2CH3，R3＝R4＝H；
或R1＝R2＝R3＝R4＝—(CH2)3—。
2.如权利要求1所述的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将罗丹明类化合物与三氯氧磷加入到乙腈中，保温反应3-5小时，冷却至室温后，加入氨基酸类化合物的乙腈溶液和三乙胺的乙腈溶液，室温下反应3-5小时，反应液用乙酸乙酯和水萃取，取有机层，干燥，浓缩，降温，析晶，得到白色固体；
2)将该白色固体溶于水中，加入氢氧化钠溶液，加热至50-60℃，反应过夜，降至室温，加入稀盐酸溶液，搅拌，再加入二氯甲烷溶液萃取，取有机层，干燥，浓缩，得到目标产物Rh-pH荧光探针，
所述罗丹明类化合物为罗丹明110、罗丹明6G、四甲基罗丹明TMR、罗丹明B或罗丹明101，所述氨基酸类化合物为谷氨酸二甲酯。
3.根据权利要求2所述的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的罗丹明类化合物、三氯氧磷、氨基酸类化合物与三乙胺的摩尔比为1:(3-6):1:(3-6)。
4.如权利要求1所述的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针作为荧光指示剂在监测微生物培养过程中pH值变化的应用。
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