CN107011891B - 一种Cu+荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种Cu+荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Cu+荧光探针及其在细胞成像与生物传感中的应用，属于荧光成像及生物传感技术领域。本发明还公开了所述Cu+荧光探针的制备方法，首先合成对Cu+具有高选择性的Cu+配体，然后合成石墨相氮化碳量子点GCNQD，所述GCNQD与Cu+配体结合构建一种新型Cu+荧光探针。当溶液中存在Cu+时，所述Cu+荧光探针可以与Cu+结合形成一种弱荧光的物质，导致探针荧光的猝灭，而探针的双光子荧光和荧光寿命也随之降低，因此，可实现对Cu+在细胞内的定量检测。

Description

一种Cu+荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种检测Cu+的新型荧光探针及其在细胞成像与生物传感中的应用，属于荧光成像及生物传感技术领域。
背景技术
一价铜离子Cu+是生命中的一种必需元素，由于它优秀的氧化还原特性，其可以作为辅酶因子和催化剂来参与生命过程中的能量产生，氧气运输，细胞新陈代谢和信号传导等，这些都显示出它对生命过程是至关重要的。
Cu+在细胞内的失调会引发氧化还原反应失调，引起异常活性氧产生，从而导致氧化应激。氧化应激会扰乱正常的生理学过程并导致细胞死亡，它与年龄老化和许多不同的疾病有密切关系，如门克斯、威尔逊病、神经退行性疾病像阿兹海默症、帕金森症和亨廷顿病，以及导致代谢紊乱引起糖尿病、肥胖等。
目前有很多方法用于Cu+检测，比如紫外-可见吸收光谱法、电化学法、拉曼光谱法和荧光光谱法等。在这些已发展的方法中，荧光法具有高灵敏度、简单并且仪器成本低等特点，使得基于荧光的方法在应用前景方面展现出明显优势。目前用于Cu+检测的探针都是基于单光子激发单通道的探针，而双光子荧光探针可以进行双通道检测，且能对荧光寿命进行定量分析等，这些优点都能避免复杂环境相互干扰。实现应用于细胞、活体中Cu+的精确检测需要探针具有很高的选择性和较低的信号干扰，因此，发展一直能实现细胞、活体中Cu+的精确检测的探针是具有挑战性的。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种检测Cu+的新型荧光探针及其在细胞成像与生物传感中的应用，它具有选择性好、双光子检测、生物相容性高等优点。
本发明提供了一种Cu+荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)Cu+配体的制备
(1-1)在氢溴酸中，式(1)羟乙基硫醚与硫脲进行过夜回流(第一反应)，后加入氢氧化钠进行过夜回流(第二反应)，得到油状物式(2)2-乙硫基硫醇；所述反应过程如下反应式(a)所示：
Figure BDA0001276886360000021
步骤(1-1)中，所述第一反应的温度为100℃-120℃；优选地，为120℃。
步骤(1-1)中，所述第一反应的时间为10h-12h；优选地，为12h。
步骤(1-1)中，所述第一反应优选地在氮气氛围下进行。
优选地，所述第一反应结束后，冷却至室温加入氢氧化钠进行过夜回流反应(第二反应)。
步骤(1-1)中，所述第二反应的温度为100℃-120℃；优选地，为120℃。
步骤(1-1)中，所述第二反应的时间为10h-12h；优选地，为12h。
步骤(1-1)中，所述第二反应优选地在氮气氛围下进行。
步骤(1-1)中，所述羟乙基硫醚、硫脲、氢溴酸、氢氧化钠的摩尔比为(4-5)：(4-5)：(7-8)：(8-10)；优选地，为5：5：8：10。
步骤(1-1)中，所述氢溴酸优选为48％的氢溴酸。
(1-2)在有机溶剂中，钠和式(2)2-乙硫基硫醇进行过夜回流(第三反应)，冷却至室温后，和双(2-氯乙基)胺盐酸盐回流反应(第四反应)，最终纯化后得到式(4)Cu+配体；所述反应过程如下反应式(b)所示：
Figure BDA0001276886360000022
步骤(1-2)中，所述有机溶剂选自乙醇、无水乙醇；优选地，为无水乙醇。
步骤(1-2)中，所述第三反应的温度为100℃-120℃；优选地，为120℃。
步骤(1-2)中，所述第三反应的时间为10h-12h；优选地，为12h。
步骤(1-2)中，所述第四反应的温度为100℃-120℃；优选地，为120℃。
步骤(1-2)中，所述第四反应的时间为3h-4h；优选地，为4h。
步骤(1-2)中，所述钠、式(2)2-乙硫基硫醇、双(2-氯乙基)胺盐酸盐的摩尔比为(23-24)： (2-3)：(4-5)；优选地，为23.3：2.8：4.66。
(2)石墨相氮化碳量子点(GCNQD)的制备
(2-1)式(4)三聚氰胺煅烧：氮气气氛下分段煅烧，得到块状石墨相氮化碳；式(4)三聚氰胺在煅烧过程中形成式(5)七嗪环，继续升温后得到式(6)块状石墨相氮化碳；所述反应过程如下反应式(c)所示；
(2-2)超声：将块状石墨相氮化碳在有机溶剂中超声，得到片状石墨相氮化碳；
(2-3)将片状石墨相氮化碳在高温下反应12h，然后溶于水，进行超声得到所述石墨相氮化碳量子点(GCNQD)；
步骤(2-1)中，所述煅烧的温度为350℃-600℃；优选地，所述分段煅烧的操作为：350℃下反应2h，升温至600℃，并在600℃下反应2h，升温速率为2.3℃/min，得到块状石墨相氮化碳。
步骤(2-2)中，所述有机溶剂为1,3-丁二醇。
步骤(2-2)中，所述超声的时间为12h-24h；优选地，为24h。
步骤(2-2)中，优选地，在超声后还包括离心的步骤，所述离心的条件可以但不限于10000 rpm下离心5min。
步骤(2-3)中，所述高温为140℃。
步骤(2-3)中，所述高温的操作时间为10h-12h；优选地，为12h。
步骤(2-3)中，所述超声的时间为0.5h-1h；优选地，为1h。
步骤(2-3)中，所述超声的目的是使样品破碎更完全，得到的量子点尺寸更小。
(3)Cu+荧光探针的制备
(3-1)步骤(2)制备的石墨相氮化碳量子点(GCNQD)和支化聚乙烯亚胺(PEI)进行反应，得到PEI包裹的石墨相氮化碳量子点；
(3-2)在有机溶剂中，PEI包裹的石墨相氮化碳量子点、乙醛酸、步骤(1)所制备的Cu+配体进行酰胺反应，得到所述Cu+荧光探针。
步骤(3-1)中，所述反应优选在黑暗条件下进行。
步骤(3-1)中，所述反应的温度为室温；
步骤(3-1)中，所述反应的时间为24h。
步骤(3-1)中，反应的溶剂为超纯水；
步骤(3-1)中，所述PEI在整个反应体系中的的浓度优选为70mg/mL。
步骤(3-1)中，所述石墨相氮化碳量子点(GCNQD)、支化聚乙烯亚胺(PEI)的摩尔比为20-25：0.9-1.2；优选地，为24：1。
步骤(3-2)中，所述PEI包裹的石墨相氮化碳量子点(GCNQD)、乙醛酸、Cu+配体的摩尔比为1：1：1。
步骤(3-2)中，所述有机溶剂选自DMSO；优选地，为DMSO。
步骤(3-2)中，所述反应的温度为36℃-40℃；优选地，为40℃。
步骤(3-2)中，所述反应的时间为5h-6h；优选地，为6h。
在本发明的一个具体实施方式中，所述Cu+荧光探针的制备方法包括：
(1)铜离子配体的制备：2.12g羟乙基硫醚(20mmol)与1.52g硫脲(20mmol)在4.3mL48％的氢溴酸(32mmol)中混合反应，在氮气氛围下过夜回流。将反应冷却至25℃，慢慢加入氢氧化钠水溶液(40mmol)，将混合反应后的产物在氮气氛围下过夜回流。再将反应冷却至25℃，用浓盐酸中和，再用100mL乙酸乙酯进行萃取，将有机相分离出来，用100 mL水进行洗涤，然后用硫酸镁进行干燥，蒸干后得到无色、刺激性气味的油状物(1.7g，70％产率)。
然后，在氮气氛围下将0.56g钠(23.3mmol)和1.7g上述产物(2.8mmol)加入到60mL的无水乙醇中，将混合溶液加热回流。0.83g双(2-氯乙基)胺盐酸盐(4.66mmol)溶于20mL无水乙醇中，然后逐滴添加混合溶液，将混合物回流反应4h。通过旋蒸除去溶剂，旋蒸后的残留用200mL氯仿溶解，用水洗涤有机相后用硫酸钠干燥，然后通过旋蒸除去溶剂。通过快速柱层析进行纯化，最终得到浅棕色的油状物即为所要的铜离子配体。
(2)石墨相氮化碳量子点的制备：取6g三聚氰胺，氮气气氛下分段煅烧，350℃下反应2h，升温至600℃，反应2h，升温速率为2.3℃/min，取240mg样品，加入50ml 1,3- 丁二醇，室温下超声24h，10000rpm下离心5min，取上清液倒入容器中，140℃下烘12h，将10mg淡黄色粉末溶于10mL水中，400W超声1h，然后放入离心机中12000rpm下离心 10min，取上清液。经透析浓缩后得到石墨相氮化碳量子点(GCNQD)。
(3)铜离子探针的制备：取3mL步骤(2)所制量子点，加入200μL 70mg/mL的支化PEI，黑暗条件下反应24h；取0.5mL反应后的溶液、0.5mL 5％乙醛酸和0.5mL步骤(1) 所制铜离子配体，溶于2mL DMSO中40℃水浴反应6h，形成铜离子探针。
本发明还提供了一种如上所述方法制备得到的Cu+荧光探针，所述Cu+荧光探针由制备的GCNQD包裹PEI后与Cu+配体连接构成，所述Cu+荧光探针为turn off型探针，随Cu+浓度升高而发生猝灭，与其他探针相比，本发明所述Cu+荧光探针选择性强，生物相容性好，且具备双光子性质，并且具备荧光寿命分析能力，使检测更准确，在生物传感、成像等方面具有很大优势。
本发明还提供了一种所述Cu+荧光探针在体外和/或细胞内和/或活体内检测Cu+中的应用；通过单光子荧光检测、双光子荧光检测、双光子荧光寿命检测、双光子荧光成像、双光子FLIM成像等方法实现对Cu+的检测；其中，所述细胞包括但不限于神经瘤母细胞，嗜铬细胞等；所述活体不包括人。
本发明还提供了一种所述Cu+荧光探针在细胞成像与生物传感中的应用。
由于Cu+荧光探针可以与Cu+结合形成一种弱荧光的物质，导致探针荧光的猝灭。因此，本发明还提供了一种体外Cu+的荧光检测方法，所述方法包括以下步骤：在缓冲液中，将本发明所述Cu+荧光探针与Cu+混合摇匀进行反应，在激发波长405nm测定探针荧光强度，从而实现对Cu+的定量检测。
其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为100mM，pH为7.4。
其中，所述反应的温度为室温。
其中，所述反应的时间为30s-5min；优选地，为3min。
其中，所述方法的线性范围为5-80μM；最低检测限为0.60μM。
其中，单光子荧光强度与Cu+浓度的线性关系为R2＝0.997。
其中，所述方法可应用于细胞、活体中。
在本发明的一个具体实施方式中，所述体外Cu+的荧光检测方法具体包括：取1mL上述方法制备的Cu+荧光探针，用磷酸盐缓冲液稀释到2mL，每次加入10μL等浓度的Cu+溶液，然后以激发波长为405nm测量溶液的荧光强度；随着加入体积的增加，探针的荧光强度逐渐降低，并在5-80μM范围内展现良好线性，最低检测限为0.60μM，可用于Cu+有效检测(图 4)。
本发明还提供了一种体外Cu+的双光子检测方法，所述方法包括以下步骤：在缓冲液中，将本发明所述Cu+荧光探针与Cu+进行反应，然后用激发波长为800nm的双光子荧光激发，测量溶液的荧光强度；随着加入体积的增加，双光子荧光强度降低，并与单光子检测时相同，有良好的线性，从而实现对Cu+的定量检测。
其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为100mM，pH为7.4。
其中，所述反应的温度为室温。
其中，所述反应的时间为30s-5min；优选地，为3min。
其中，所述方法的线性范围为5-80μM；最低检测限为4.40μM。
其中，双光子荧光强度与Cu+浓度的线性关系为R2＝0.964。
其中，所述方法可应用于细胞、活体中。
在本发明的一个具体实施方式中，所述体外Cu+的双光子检测方法包括：取上述制备的 Cu+荧光探针，用磷酸盐缓冲稀释到2mL，每次加入10μL等浓度的Cu+溶液，然后利用荧光共聚焦显微镜，用激发波长为800nm的双光子荧光激发，测量溶液的荧光强度。随着加入体积的增加，双光子荧光强度降低，并与单光子检测时相同，有良好的线性，在5-80μM范围内展现良好线性，最低检测限为4.40μM,可用于Cu+有效检测(图7)。
本发明还提供了一种体外Cu+的荧光寿命检测方法，所述方法包括以下步骤：在缓冲液中，将本发明所述Cu+荧光探针与Cu+进行反应，然后用激发波长为800nm的双光子荧光激发，利用荧光寿命成像(FLIM)技术测量溶液的荧光寿命变化；随着加入体积的增加，探针荧光寿命呈现良好的线性变化，从而实现对Cu+的定量检测。
其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为100mM，pH为7.4。
其中，所述反应的温度为室温。
其中，所述反应的时间为30s-5min；优选地，为3min。
其中，所述荧光寿命由3.82ns降至3.30ns，并在5-80μM范围内展现良好线性。
其中，所述荧光寿命与Cu+浓度的线性关系为R2＝0.996。
其中，所述方法可应用于细胞、活体中。
在本发明的一个具体实施方式中，所述体外Cu+的荧光寿命检测方法包括：取上述制备的Cu+荧光探针，用磷酸盐缓冲稀释到2mL，每次加入10μL等浓度的Cu+溶液，然后
通过荧光寿命成像(FLIM)检测，同样在800nm激发下，随着Cu+的增加，探针的荧光寿命逐渐降低，并在5-80μM范围内展现良好线性，实现对Cu+更准确的定量分析。
本发明提供了一种在细胞内Cu+的双光子荧光成像方法，所述方法包括以下步骤：将培养好的细胞与所述Cu+探针共同孵育，之后加入缓冲液，然后利用共聚焦显微镜进行观察，用激发波长为800nm的双光子荧光激发，观察细胞在470nm左右发射双光子荧光，随着Cu+的不断增加，细胞中探针的荧光逐渐降低，从而实现对细胞内Cu+的双光子荧光变化进行成像分析。
其中，所述细胞包括但不限于是神经瘤母细胞。
其中，所述细胞与Cu+探针孵育的时间为30min-1h；优选地，为1h。
其中，所述孵育温度为37℃。
其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；优选地，磷酸盐缓冲液的浓度为50mM，pH为7.4。
在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞内Cu+的双光子荧光成像方法包括：将所述 Cu+荧光探针用于神经瘤母细胞中的Cu+的双光子检测，将细胞培养好后用Cu+荧光探针进行孵育1h，然后将细胞培养液吸净，加入PBS缓冲液。然后用共聚焦显微镜找好细胞形态，用激发波长为800nm的双光子荧光激发，观察到细胞在470nm左右发射双光子荧光，随着Cu+的不断增加，细胞中探针的荧光逐渐降低，由图8可知，本发明中的Cu+荧光探针可用于细胞内Cu+的双光子荧光成像。
本发明提供了一种在细胞内Cu+的FLIM成像方法，所述方法包括以下步骤：将培养好的细胞与所述Cu+探针共同孵育，之后加入缓冲液，然后利用共聚焦显微镜进行观察，用激发波长为800nm的双光子荧光激发，通过FLIM软件进行检测，发现随着Cu+的不断增加，细胞中探针的荧光寿命发生变化，从而实现对细胞内Cu+的荧光寿命变化进行成像分析。
其中，所述细胞包括但不限于是嗜铬细胞。
其中，所述细胞与Cu+探针孵育的时间为30min-1h；优选地，为1h。
其中，所述孵育温度为37℃。
其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；优选地，磷酸盐缓冲液的浓度为100mM，pH为7.4。
在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞内Cu+的FLIM成像方法包括：所述Cu+荧光探针在嗜铬细胞中对Cu+的FLIM成像，将培养后的嗜铬细胞用Cu+荧光探针孵育1h，然后将细胞培养液吸净，加入PBS缓冲液。然后用共聚焦显微镜找好细胞形态，用激发波长为800nm的双光子荧光激发，通过FLIM软件进行检测，进行FLIM成像，随着Cu+的不断增加，细胞中探针的荧光寿命逐渐降低，由图9可知，说明本发明中的Cu+荧光探针可用于细胞内 Cu+的FLIM成像。
本发明的有益效果在于，本发明首先合成了一种对Cu+具有高选择性的铜配体，将铜配体偶联到石墨相氮化碳量子点表面，构建得到一种新型Cu+荧光探针。所述Cu+探针在双光子激发下具有明显的荧光信号发射，且具有线性的荧光寿命，可修正环境的干扰，提高了Cu+定量分析的精确性，丰富了检测手段。
附图说明
图1是石墨相氮化碳量子点的透射电镜图(A)和原子力图(B)。
图2是石墨相氮化碳量子点的紫外-可见吸收光谱(a)、荧光发射光谱(b)、PEI包裹的石墨相氮化碳量子点的荧光发射光谱(c)和Cu+荧光探针的荧光发射光谱(d)。
图3是石墨相氮化碳量子点(a)、PEI包裹的石墨相氮化碳量子点(b)和Cu+荧光探针(c) 傅立叶变换红外光谱图。
图4是Cu+荧光探针对不同浓度Cu+(0,20,40,60,80,100和120μM)响应的荧光发射光谱和校准曲线。
图5是Cu+荧光探针对不同浓度Cu+(0,20,40,60,80,100和120μM)响应的荧光寿命和校准曲线。
图6是Cu+荧光探针对Cu+检测的选择性和干扰实验；左边的柱状图为单独干扰金属离子存在时情况，右边的为Cu+与潜在干扰金属离子(A)、氨基酸(B)及活性氧/活性氮(C)共存时的情况。黑色柱状代表选择性实验，灰色柱状代表干扰实验。ΔR0代表Cu+加入前后的信号比值差，ΔR代表潜在干扰物质单独存在或与Cu+共存时是前后的信号比值差。
图7是Cu+荧光探针在800nm双光子激发下对不同浓度Cu+(0,20,40,60,80和100μM)响应的双光子荧光发射光谱。
图8是Cu+荧光探针用于神经瘤母细胞内不同浓度Cu+的双光子荧光成像(a:0μM,b:80 μM)。
图9是Cu+荧光探针用于嗜铬细胞内不同浓度Cu+的FLIM成像(a:0μM,b:80μM)。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1.Cu+荧光探针的制备
(1)铜离子配体的制备：2.12g羟乙基硫醚(20mmol)与1.52g硫脲(20mmol)在4.3mL48％的氢溴酸(32mmol)中混合反应，在氮气氛围下过夜回流。将反应冷却至25℃，慢慢加入氢氧化钠水溶液(40mmol)，将混合反应后的产物在氮气氛围下过夜回流。再将反 应冷却至25℃，用浓盐酸中和，再用100mL乙酸乙酯进行萃取，将有机相分离出来，用100 mL水进行洗涤，然后用硫酸镁进行干燥，蒸干后得到无色、刺激性气味的油状物(1.7g，70％ 产率)。
然后，在氮气氛围下将0.56g钠(23.3mmol)和0.34g上述产物(2.8mmol)加入到60mL的无水乙醇中，将混合溶液加热回流。0.66g双(2-氯乙基)胺盐酸盐(4.66mmol) 溶于20mL无水乙醇中，然后逐滴添加混合溶液，将混合物回流反应4h。通过旋蒸除去溶剂， 旋蒸后的残留用200mL氯仿溶解，用水洗涤有机相后用硫酸钠干燥，然后通过旋蒸除去溶剂。 通过快速柱层析进行纯化，最终得到浅棕色的油状物即为所要的铜离子配体。
(2)石墨相氮化碳量子点的制备：取6g三聚氰胺，氮气气氛下分段煅烧，350℃下反应2h，升温至600℃，反应2h，升温速率为2.3℃/min，取240mg样品，加入50ml 1,3- 丁二醇，室温下超声24h，10000rpm下离心5min，取上清液倒入容器中，140℃下烘12h， 将10mg淡黄色粉末溶于10mL水中，400W超声1h，然后放入离心机中12000rpm下离心 10min，取上清液。经透析浓缩后得到石墨相氮化碳量子点(GCNQD)。
(3)铜离子探针的制备：取3mL步骤(2)所制量子点，加入200μL 70mg/mL的支化PEI，黑暗条件下反应24h；取0.5mL反应后的溶液、0.5mL 5％乙醛酸和0.5mL步骤(1) 所制铜离子配体，溶于2mL DMSO中40℃水浴反应6h，形成铜离子探针。
图1A为石墨相氮化碳量子点的透射电镜图，证明成功合成了晶格明显的量子点，并有 薄层聚合物覆盖在上面。图1B表示原子力图表明量子点是单分散的，并且高度约为1.5nm。
图2结果表明石墨相氮化碳量子点在330nm出现宽的紫外-可见吸收峰，并且在405nm 激发状态下，单纯石墨相氮化碳量子点在430nm发射，PEI包裹的石墨相氮化碳量子点在440 nm发射，Cu+荧光探针在470nm发射。
从图3的傅里叶红外光谱表征结果可知，相比于单纯的石墨相氮化碳量子点，包裹了PEI 的石墨相氮化碳量子点在3340cm-1N-H的伸缩振动和弯曲振动，表面包裹后的氮化碳量子点 氨基更多。当铜配体与PEI包裹后的石墨相氮化碳量子点偶联形成铜探针后，在1650cm-1出现新的峰，这个峰属于C＝N的伸缩振动，证明本发明中包裹后的氮化碳量子点与铜配体之 间通过形成C＝N键而结合在一起。
实施例2.体外环境下检测Cu+
(1)荧光强度校准曲线的制作
取1mL实施例1制备的Cu+荧光探针，用磷酸盐缓冲液稀释到2mL，每次加入10μL等浓度的Cu+溶液，然后以激发波长为405nm测量溶液的荧光强度。随着加入体积的增加，探针的荧光强度逐渐降低，并在5-80μM范围内展现良好线性，最低检测线为0.60μM；线性关系为R2＝0.997(图4)。
(2)荧光寿命和校准曲线的制作
取1mL实施例1制备的Cu+荧光探针，用磷酸盐缓冲液稀释到2mL，每次加入10μL等浓度的Cu+溶液，然后以激发波长为405nm测量溶液的荧光强度，随着Cu+浓度的增加，Cu+荧光探针的荧光寿命也逐渐降低，由3.82ns降至3.30ns，并在5-80μM范围内展现良好线性，最低检测限为4.70μM；线性关系为R2＝0.996(图5)。
图4荧光强度校准曲线和图5荧光寿命校准曲线相对应，通过两条曲线中任意一种均可实现对Cu+的定量分析。
(3)体外样品检测
上述的“取1mL实施例1制备的Cu+荧光探针，用磷酸盐缓冲液稀释到2mL，每次加入10μL的10μM的Cu+溶液，然后以激发波长为405nm测量溶液的荧光强度，随着加入体积的增加，探针的荧光强度逐渐降低，并在5-80μM范围内展现良好线性，最低检测限为0.60 μM，说明本发明的Cu+荧光探针可用于Cu+有效检测。
实施例3.实施例1制备的Cu+荧光探针在体外对Cu+的双光子检测
(1)校准曲线的制作
取1mL实施例1制备的Cu+荧光探针，用磷酸盐缓冲稀释到2mL，每次加入10μL等浓度的Cu+溶液，然后用激发波长为800nm的双光子荧光激发，测量溶液的荧光强度。随着加入体积的增加，双光子荧光强度降低，并与单光子检测时相同，有良好的线性，在5-80μM 范围内展现良好线性，最低检测限为4.40μM(图7)。
本发明探针具备双光子性能，所以不但可以进行简单的单光子荧光检测，也可以进行双光子荧光检测，另外，由于荧光寿命呈线性变化，也可以通过荧光寿命的变化来进行定量分析。因此，通过单光子荧光强度变化、双光子荧光强度变化和荧光寿命变化(如细胞中荧光寿命变化)能够实现Cu+的精确定量检测。
实施例4.实施例1制备的Cu+荧光探针的选择性及抗干扰能力
为了评估本发明实施例1制备的Cu+荧光探针的选择性和抗干扰能力，分别考察了常见的金属离子Cu2+、Fe3+、Mg2+、Zn2+、Al3+、Ca2+、Cr3+、Cd2+、Pb2+、Hg2+；氨基酸Phe、Try、 Glu、Lys、His、Cys、Val、Arg、Thr、Pro、Leu、Met、Gly、Ser；及常见活性氧/活性氮1O2、 H2O2、O2 ·一、NO、ONOO一、ROO一、·OH单独存在以及与Cu+共存时，荧光信号的变化。
由图6可知，常见的金属离子、氨基酸和活性氧/活性氮均对Cu+检测没有明显影响(干扰<5％)，选择性和抗干扰干扰实验说明本发明中的Cu+荧光探针具有很好的选择性和抗干扰能力。
实施例5.细胞内Cu+的双光子荧光成像
将实施例1制备的Cu+荧光探针用于神经瘤母细胞中的Cu+的双光子检测，将细胞培养好后用Cu+荧光探针进行孵育1h，然后将细胞培养液吸净，加入PBS缓冲液。然后用共聚焦显微镜找好细胞形态，用激发波长为800nm的双光子荧光激发，观察到细胞在470nm左右发射双光子荧光，随着Cu+的不断增加，细胞中探针的荧光逐渐降低，由图8可知，加入80μM 的Cu+后，双光子荧光发生猝灭，因此，本发明中的Cu+荧光探针可用于细胞内Cu+的双光子荧光成像。
实施例6.细胞内Cu+的FLIM成像
Cu+荧光探针在嗜铬细胞中对Cu+的FLIM成像，将培养后的嗜铬细胞用Cu+荧光探针孵育1h，然后将细胞培养液吸净，加入PBS缓冲液。然后用共聚焦显微镜找好细胞形态，用激发波长为800nm的双光子荧光激发，进行FLIM成像，随着Cu+的不断增加，细胞中探针的荧光寿命逐渐降低，由图9可知，加入80μM Cu+后，反映寿命的颜色由红色变为绿色，与体外实验的寿命变化相对应，因此说明本发明中的Cu+荧光探针可用于细胞内Cu+的FLIM 成像。双光子具有穿透性强的优势，但信号仍旧为荧光信号，不能更加准确的反应探针的变化。而根据Cu+探针的FLIM特性，通过寿命信号来进行的测定则更加准确。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (15)

1.一种Cu+荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)Cu+配体的制备
(1-1)在氢溴酸中，式(1)羟乙基硫醚与硫脲进行过夜回流，即第一反应；然后加入氢氧化钠进行过夜回流，即第二反应，得到油状物式(2)2-乙硫基硫醇；所述反应过程如下反应式(a)所示：
Figure FDA0002113669490000011
(1-2)在有机溶剂中，钠和式(2)2-乙硫基硫醇进行过夜回流，即第三反应；冷却至室温后，和双(2-氯乙基)胺盐酸盐回流反应，即第四反应，最终纯化后得到式(3)Cu+配体；所述反应过程如下反应式(b)所示：
Figure FDA0002113669490000012
(2)石墨相氮化碳量子点GCNQD的制备
(2-1)式(4)三聚氰胺煅烧：氮气气氛下分段煅烧，得到块状石墨相氮化碳；式(4)三聚氰胺在煅烧过程中形成式(5)七嗪环，继续升温后得到式(6)块状石墨相氮化碳；所述反应过程如下反应式(c)所示；
(2-2)超声：将块状石墨相氮化碳在有机溶剂中超声，得到片状石墨相氮化碳；
(2-3)将片状石墨相氮化碳在高温下反应12h，然后溶于水，进行超声得到所述石墨相氮化碳量子点GCNQD；
Figure FDA0002113669490000021
(3)Cu+荧光探针的制备
(3-1)步骤(2)制备的石墨相氮化碳量子点GCNQD和支化聚乙烯亚胺PEI进行反应，得到PEI包裹的石墨相氮化碳量子点；
(3-2)在有机溶剂中，PEI包裹的石墨相氮化碳量子点、乙醛酸、步骤(1)所制备的式(3)Cu+配体进行反应，得到所述Cu+荧光探针。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1-1)中，所述第一反应的温度为100℃-120℃；所述第二反应的温度为100℃-120℃；所述羟乙基硫醚、硫脲、氢溴酸、氢氧化钠的摩尔比为(4-5)：(4-5)：(7-8)：(8-10)；
步骤(1-2)中，所述第三反应的温度为100℃-120℃；所述第四反应的温度为100℃-120℃；所述钠、式(2)2-乙硫基硫醇、双(2-氯乙基)胺盐酸盐的摩尔比为(23-24)：(2-3)：(4-5)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2-1)中，所述煅烧的温度为350℃-600℃；
步骤(2-2)中，所述超声的时间为12h-24h；
步骤(2-3)中，所述高温为140℃；所述高温的操作时间为10h-12h；所述超声的时间为0.5h-1h；
步骤(3-1)中，所述反应的温度为室温；所述石墨相氮化碳量子点GCNQD、支化聚乙烯亚胺PEI的摩尔比为20-25：0.9-1.2；
步骤(3-2)中，所述反应的温度为36℃-40℃；所述PEI包裹的石墨相氮化碳量子点GCNQD、乙醛酸、Cu+配体的摩尔比为1：1：1。
4.一种如权利要求1～3之任一项所述的方法制备得到的Cu+荧光探针。
5.将如权利要求4所述的Cu+荧光探针用于在体外和/或细胞内检测Cu+中的应用；其中，所述细胞不包括来源于人的细胞。
6.如权利要求4所述的Cu+荧光探针在细胞成像与生物传感中的应用。
7.一种体外Cu+的荧光检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在缓冲液中，将权利要求4所述的Cu+荧光探针与Cu+混合摇匀进行反应，在激发波长405nm下测定探针荧光强度，从而实现对Cu+的定量检测。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述反应的温度为室温；所述反应的时间为30s-5min。
9.一种体外Cu+的双光子检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在缓冲液中，将权利要求4所述的Cu+荧光探针与Cu+进行反应，然后用激发波长为800nm的双光子荧光激发，测定溶液的荧光强度，随着加入体积的增加，双光子荧光强度降低，并与单光子检测时相同，有良好的线性，从而实现对Cu+的定量检测。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述反应的温度为室温；所述反应的时间为30s-5min。
11.一种体外Cu+的荧光寿命检测方法，所述方法包括以下步骤：在缓冲液中，将权利要求4所述的Cu+荧光探针与Cu+进行反应，然后用激发波长为800nm的双光子荧光激发，利用荧光寿命成像FLIM技术测量溶液的荧光寿命变化；随着加入体积的增加，探针荧光寿命呈现良好的线性变化，从而实现对Cu+的定量检测。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述反应的温度为室温；所述反应的时间为30s-5min。
13.一种在细胞内Cu+的双光子荧光成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将细胞与权利要求4所述的Cu+探针共同孵育，之后加入缓冲液，然后利用共聚焦显微镜进行观察，用激发波长为800nm的双光子荧光激发，观察细胞在470nm左右发射双光子荧光，随着Cu+的不断增加，细胞中探针的荧光逐渐降低，从而实现对细胞内Cu+的双光子荧光变化进行成像分析。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述孵育温度为37℃；所述细胞与Cu+探针孵育的时间为30min-1h。
15.一种在细胞内Cu+的FLIM成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将细胞与所述Cu+探针共同孵育，之后加入缓冲液，然后利用共聚焦显微镜进行观察，用激发波长为800nm的双光子荧光激发，通过FLIM软件进行检测，发现随着Cu+的不断增加，细胞中探针的荧光寿命发生变化，从而实现对细胞内Cu+的荧光寿命变化进行成像分析。
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