CN103320120A - 一种含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针，其结构如式(I)所示，同时本发明公开了所述探针作为活细胞内溶酶体pH荧光探针的应用。实验表明本发明的探针在中性和碱性条件下不发荧光，随着溶液pH值的降低，荧光强度迅速增强，在pH约为4.0时强度达到最大值，在pH7.51-3.53之间荧光强度大约增强150倍，且该探针在各种金属离子存在下具有很好的抗干扰能力和很好的可逆性。细胞内共定位实验及溶酶体内pH调节实验证明该探针能够特异性标记溶酶体并能够灵敏地监测到溶酶体内pH值的微小变化。细胞存活率实验表明该探针对细胞无毒。预示本发明的探针在细胞成像及监测溶酶体内pH值变化方面将具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种pH荧光探针及应用，尤其涉及一种含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针及其作为活细胞内溶酶体pH荧光探针的应用。
背景技术
人体细胞内pH值在细胞、酶和组织活动如细胞代谢、信号传导、细胞生长、细胞增殖、细胞凋亡、细胞自噬、多药耐药性、内吞作用和肌肉收缩等活动中起着非常关键的作用。监测活细胞内的pH值变化对于研究细胞内化途径如吞噬作用也是很重要的。异常的细胞内pH值会使细胞功能紊乱，影响人体生理过程从而导致一些严重的疾病如癌症和阿尔茨海默氏病等。
人体细胞内的pH值并不是均匀分布的。细胞质是弱碱性的，pH值约为7.2。而一些细胞器，如溶酶体和内质网，其内部pH值约为4.0-6.0，呈弱酸性。溶酶体内包含50余种酸性水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、磷酸酶、糖苷酶、脂肪酶、磷酸酯酶及硫酸脂酶等。溶酶体内的弱酸性环境(pH4.5-5.5)可以活化这些水解酶的功能，促进蛋白质在细胞代谢中的降解。细胞功能障碍往往与这些细胞器的异常酸化有关，特别是在细胞凋亡过程早期溶酶体内pH梯度会消失。因此监测活细胞内pH值的变化对于研究细胞功能及生理和病理过程具有重要意义。
目前用于测量细胞内pH值的方法很多，如核磁共振、微电极、吸收光谱和荧光光谱等。相比较而言，荧光光谱检测具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简单等优点，而且多数情况下可以对细胞进行无损检测。目前已开发出许多能够在复杂生命体系中检测阳离子、阴离子、活性氧及氨基酸等的荧光指示剂或传感器。
罗丹明类染料具有量子产率高、摩尔消光系数大、光稳定性好、背景干扰少等优点，其衍生物作为“关-开”型荧光探针被广泛应用于检测各种金属离子及生物相关物质。罗丹明类探针通常包含一个螺内酰胺或螺内酯结构。在中性及碱性溶液中，螺环结构保持不变，溶液为无色且不发荧光；在酸性溶液中，螺环结构打开，溶液呈现红色并发出强荧光。这些性质使罗丹明衍生物非常适合用来检测酸性pH。尽管目前已有部分报道的罗丹明类pH探针用于监测溶酶体中的pH值，但这些探针往往会引起“碱性效应”，即长时间孵化后会引起溶酶体内的pH值升高，影响监测结果。因此设计合成新型罗丹明类溶酶体pH荧光探针仍然具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种罗丹明B类pH荧光探针，可以快速响应、高选择性、高灵敏度检测酸性pH值并避免“碱性效应”；目的之二在于提供所述pH荧光探针的合成及其在检测活细胞溶酶体pH值方面的应用。
本发明所述的含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针，其结构如式（I）所示：
上述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针的合成方法是：
由罗丹明B与三氯氧磷反应生成罗丹明B酰氯，然后以三乙胺为缚酸剂，在二氯甲烷溶液中与半胱氨酸乙酯盐酸盐反应生成含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针，即化合物RCE。
上述合成路线反应式如下：
本发明所述的含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针作为活细胞内溶酶体pH荧光探针的应用。
其中：所述活细胞优选Hela细胞。
本发明所述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针对H+响应迅速，有很高的灵敏度和选择性，并且具有良好的可逆性。其作为活细胞内的pH荧光探针可以特异性标记溶酶体，并且在实验条件下对细胞没有毒性。具体测试方法及结果如下：
配制上述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针在不同pH值下的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比），通过紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试其对不同pH值的响应能力。
在酸性和弱碱性条件下向上述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针的溶液中分别定量加入NaNO3,KNO3,Mg(NO3)2·6H2O,Al(NO3)3·9H2O,Ca(NO3)2·4H2O,Fe(NO3)3·9H2O,Co(NO3)2·6H2O,Ni(NO3)2·6H2O,Cu(NO3)2·3H2O,Zn(NO3)2·6H2O,AgNO3,Cd(NO3)2·4H2O,Pb(NO3)2,HgCl2,组氨酸（Histidine）,酪氨酸（Tyrosine）,精氨酸（Arginine）,谷氨酸（Glutamic acid）,赖氨酸（Lysine）,苏氨酸（Threonine）,甘氨酸（Glycine）,葡萄糖（Glucose）,双氧水（H2O2）的水溶液，测试其抗干扰能力。
测试上述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针在不同pH值的溶液中荧光强度随时间变化的曲线。
测试上述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针在pH4.05和7.50之间荧光变化的可逆性。
使用不同浓度的上述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针培养Hela细胞，分别在不同培养时间进行荧光成像，观察细胞内荧光强度变化。
使用上述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针与商品化的溶酶体探针
Green DND-189对活Hela细胞共染色，通过荧光成像进行染色定位。
使用上述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针与不同浓度的巴弗洛霉素A1共同培养Hela细胞并进行荧光成像，观察细胞内荧光强度变化。
使用上述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针37℃下培养Hela细胞12小时后，用MTT法检测Hela细胞存活率。
结果见图1～11。
本发明所述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针本身为螺环结构，其溶液为无色，不发荧光。随着溶液pH值的降低，螺环打开，溶液由无色变为红色并发出荧光，其荧光强度随pH值的降低逐渐增强。在其pH响应范围7.51-3.53内荧光强度大约增强150倍，pKa值为4.71，且在pH范围4.0-5.5之间荧光强度与pH值呈线性相关，有利于显微镜测量。探针在不同pH值的溶液中荧光强度都能够迅速达到最大值并保持稳定，适合实时监测pH值变化。在50μM金属离子（其中K+和Na+为1mM，Ca2+和Mg2+为0.1mM，）存在下，上述探针对pH的响应能力基本不受影响。细胞内实验证实：本发明所述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针使用浓度低，具有很好的透膜性，对细胞没有毒副作用，可以特异性标记溶酶体，并且能够灵敏地监测到溶酶体内pH值的变化。预示本发明所述探针在细胞成像及监测溶酶体内pH值变化方面将具有重要的应用价值。
附图说明
图1为探针RCE（10μM）在不同pH值的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比）中的颜色变化。
图2为探针RCE（10μM）在不同pH值的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比）中的荧光变化（在365nm紫外灯下）。
图3为探针RCE（10μM）在不同pH值的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比）中的紫外可见吸收光谱。
图4（a）为探针RCE（10μM）在不同pH值的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比）中的荧光发射光谱（激发波长：563nm）；（b）为584nm处荧光强度随pH值变化的曲线。
图5（a）为在pH=7.2时，向探针RCE（10μM）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比）中分别加入各种金属离子和生物相关物质后在584nm处的荧光强度变化；（b）为在pH=5.4时，向探针RCE（10μM）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比）中分别加入各种金属离子和生物相关物质后在584nm处的荧光强度变化。（激发波长：563nm；其中K+和Na+为1mM，Ca2+和Mg2+为0.1mM，其他离子为50μM，Histidine：0.2mM,Tyrosine：0.2mM,Arginine：0.2mM,Glutamic acid：0.2mM,Lysine：0.2mM,Threonine：0.2mM,Glycine：0.2mM,Glucose：1mM,H2O2：2mM）。
图6为探针RCE（10μM）在不同pH值的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比）中584nm处的荧光强度随时间变化的曲线。
图7为探针RCE（10μM）的荧光在pH值4.05和7.50之间的可逆变化。
图8为在37℃使用不同浓度的探针RCE分别培养Hela细胞，在不同培养时间时的活细胞荧光显微成像图。Ctr组未加RCE。
图9为使用1μM探针RCE和0.25μM
Green DND-189对Hela细胞共染色后的荧光显微成像图。（a）为探针RCE的红色发射荧光成像图；（b）为
Green的绿色发射荧光成像图；（c）为（a）和（b）的叠加图，黄色区域为共定位区域。
图10为在37℃，先用0～100nM巴弗洛霉素A1培养Hela细胞9小时，再加入5μM RCE继续培养3小时后的活细胞荧光显微成像图。
图11为在37℃使用5μM探针RCE培养Hela细胞12小时后的细胞存活率。
具体实施方式
实施例1：
含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针的合成
将1g（2.1mmol）罗丹明B，400mg（2.6mmol）POCl3和15mL干燥的1,2-二氯乙烷加入到50mL的反应瓶中，加热回流，反应4h。冷却后减压蒸出溶剂，得罗丹明B酰氯，直接用于下一步反应。
将430mg（2.3mmol）L-半胱氨酸乙酯盐酸盐加入到10mL二氯甲烷中，加入2mL三乙胺，室温搅拌30min，过滤，得半胱氨酸乙酯的二氯甲烷溶液，冰浴冷却。将前面所得罗丹明B酰氯粗品溶于10mL二氯甲烷，滴入半胱氨酸乙酯的二氯甲烷溶液中，冰浴下搅拌4h，然后室温反应过夜。将反应液减压浓缩，柱层析（石油醚/乙酸乙酯=2/1）得含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针，即化合物RCE，白色固体。收率：19%，熔点：64-66℃。
红外光谱测定：IR(KBr)ν:3080,2970,2928,2665,2562,1739,1695,1614,1514,1219,1118,818,785,757cm-1。
核磁共振氢谱测定：1HNMR(d6-DMSO,400MHz))δ(ppm):0.98(t,3H,J=7.1Hz,CH3),1.08(t,12H,J=7.0Hz,CH3),2.00(t,1H,J=8.8Hz,SH),2.28-2.39(m,1H,CH),2.71-2.82(m,1H,CH),3.32(q,8H,J=7.0Hz,CH2),3.64-3.72(m,1H,CH),3.74-3.86(m,2H,CH2),6.30-6.40(m,6H,Xanthene-H),7.07(d,1H,J=6.5Hz,Ar-H),7.50-7.60(m,2H,Ar-H),7.80(d,1H,J=6.3Hz,Ar-H)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR(CDCl3,100MHz)δ(ppm):169.2,166.9,153.7,153.6,153.0,148.9,132.7,131.2,130.6,129.4,128.2,124.1,122.9,108.1,107.6,105.1,104.3,97.6,65.7,61.1,57.9,44.4,24.6,13.9,12.6。
高分辨质谱测定：HRMS calcd for[M+H]+C33H40N3O4S:574.2740,found574.2741。
实施例2
分别配制10mL不同pH值下的探针RCE（10μM）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比），分别进行紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试，并作出584nm处的荧光强度随pH值变化的曲线。
结果显示探针RCE对pH值有很好的响应，pH值从7.51变化到3.53后，溶液由无色变为红色并产生荧光，其荧光强度大约增强150倍，具有很好的荧光增强效应，可以提高信号的灵敏度和准确性（图1、2、3、4）。
实施例3
向pH值为7.2的探针RCE（10μM）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比）中分别加入各种金属离子后，测试其584nm处的荧光强度变化。（激发波长：563nm；K+和Na+为1mM，Ca2+和Mg2+为0.1mM，其他离子为50μM）〖图5（a）〗。
向pH值为5.4的探针RCE（10μM）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比）中分别加入各种金属离子和生物相关物质后，测试其584nm处的荧光强度变化。（激发波长：563nm；K+和Na+为1mM，Ca2+和Mg2+为0.1mM，其他离子为50μM，Histidine：0.2mM,Tyrosine：0.2mM,Arginine：0.2mM,Glutamic acid：0.2mM,Lysine：0.2mM,Threonine：0.2mM,Glycine：0.2mM,Glucose：1mM,H2O2：2mM）〖图5（b）〗。
结果表明探针RCE对pH值的响应基本不受各种金属离子的影响，具有很好的抗干扰能力（图5）。
实施例4
配制pH值分别为7.26、5.68和4.25的探针RCE（10μM）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比），测试溶液荧光强度随时间的变化曲线。结果表明该探针响应迅速，在很短的时间内荧光就能达到最大值，在连续照射15分钟后荧光强度基本不受影响（图6）。
实施例5
配制探针RCE（10μM）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,体积比），调节pH值在4.05和7.50循环变化，测试荧光强度的变化，结果表明该探针响应迅速，荧光强度变化规律而稳定（图7）。
实施例6
37℃下，加入不同浓度（0,1,3,5μM）的探针RCE培养Hela细胞分别在3小时、6小时和12小时后进行荧光显微成像，结果显示探针RCE具有很好的透膜性，可以进入细胞并在细胞中发出红色荧光，细胞中的荧光强度随探针浓度的增加和培养时间的延长而增强（图8）。
实施例7
37℃下，使用1μM的探针RCE和0.25μM的溶酶体探针
Green对Hela细胞共染色，分别得到探针RCE的红色荧光照片和
Green的绿色荧光照片，将两个照片叠加，红色和绿色重叠区域显示黄色。结果表明两张照片染色区域能够很好地重合，即探针RCE能够特异性标记溶酶体（图9），与商品化溶酶体探针相当。
实施例8
37℃下，使用0～100nM的巴弗洛霉素A1培养Hela细胞9小时后再加入5μM的探针RCE继续培养3小时，荧光成像显示细胞溶酶体内的pH值由于巴弗洛霉素A1的加入而升高，从而导致细胞内RCE的荧光强度明显减弱（图10）。
实施例9
37℃下，使用5μM的探针RCE培养Hela细胞12小时后，用MTT法检测Hela细胞存活率，结果表明在实验条件下探针RCE对细胞没有毒性（图11）。
Claims (2)
1.一种含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针，具有式（I）所示的结构：
2.权利要求1所述含半胱氨酸乙酯结构的罗丹明B类靶向溶酶体pH荧光探针作为活细胞内溶酶体pH荧光探针的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130925 |